CN107488638B - 一种15α-羟化酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种15α-羟化酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种15α‑羟化酶及其制备方法和应用。所述突变体是借助易错PCR和定点突变的方法对目标基因进行突变，筛选获得的，突变体Kcat值为原始15α‑羟化酶的2.5倍，该突变体在30m3转化体系下对甾体的转化率高于95％，转化速率为工业生产现有水平的两倍。

Description

一种15α-羟化酶及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种15α-羟化酶及其制备方法和甾体转化新技术。
背景技术：
甾体激素类药物是临床上一类重要的药物，常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。甾体类药物孕二烯酮是新一代强效避孕药的主要成分之一，而15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体。工业上，甾体转化有两种实施方式：化学法和微生物转化法。
微生物甾体转化法是经微生物细胞的酶系对底物某一特定部位进行生化反应形成的，其与化学方法相比具有以下优点：(1)合成步骤少，生产周期短。如，用微生物法一步可将19-羟基-雄甾-4-烯-3，17-二酮转化成雌酚酮，而化学法至少需三步才能完成。(2)收率高，副反应少。多数情况下，微生物法得率达80％以上，而化学合成法收率仅为15％-20％。微生物法生产炔诺酮的得率可由化学法的3％-4％提高到40％-70％。(3)较复杂和难以进行的化学反应采用微生物转化法往往可专一、迅速地完成。(4)反应具有区域选择性和立体选择性。如羟化反应可专一的在C11、C15等位置上进行羟化，α位或β位上的羟化也可以选择合适的微生物进行。(5)可避免或减少强酸、强碱和一些有毒原料的使用，改善操作条件，对环境友善。
目前工业上主要采用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)在左旋乙基甾烯双酮的C15位上特异引入羟基，但现有的工业生产工艺投料量偏低，从而限制了C15α的转化效率。已有的研究表明参与雷斯青霉C15α甾体羟化反应的酶属于P450酶系，但编码该15α-羟化酶的基因尚不清楚，因此无法利用基因工程手段对生产菌种进行定向遗传改造。
发明内容：
本发明解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的15α-羟化酶突变体。所述突变体是在受甾体底物高度诱导的目标基因的基础上借助易错PCR和定点突变的方法对目标基因进行突变，筛选获得的最优突变体，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、15α-羟化酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示15α-羟化酶突变体中突变的氨基酸。如Ala376Glu，表示位置376位的氨基酸由原始15α-羟化酶的Ala替换成Glu，位置的编号对应于SEQ ID No.3中15α-羟化酶的氨基酸序列编号。如Ala376Glu/Phe382Gln，表示位置376和位置382的氨基酸都发生了突变。
在本发明中，ahdA表示原始15α-羟化酶(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)，ahdA’表示15α-羟化酶的突变体(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)。
15α-羟化酶/突变体 氨基酸
ahdA Ala 376Phe 382
ahdA’ Glu 376Gln 382
用于表达所述的15α-羟化酶及其突变体的克隆载体和表达载体为pET22b；用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21。
本技术方案的实验步骤概述如下：
(1)采用PCR技术以雷斯青霉ATCC10490(ATCC10490菌株已公开在非专利文献《15a-Hydroxylation of a steroid(13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione)by Penicilliumraistrickii in an ionic liquid/aqueous biphasic system》Biotechnol Lett(2012)34:2113-2117中)总RNA为模板，逆转录合成第一链cDNA，并以第一链cDNA为模板设计引物，扩增获取15α-羟化酶基因，插入pET22b克隆载体上构建重组质粒，转入E.coli JM109，测序鉴定15α-羟化酶基因adhA；
(2)以上述构建正确的重组质粒为基础优化15α-羟化酶编码基因adhA,并通过全基因合成技术获得密码子优化的15α-羟化酶编码基因adhA-1(SEQ ID No.2)；
(3)在体外利用易错PCR技术向15α-羟化酶基因adhA-1引入核苷酸突变；
(4)将易错PCR产物及pET22b表达载体用EcoR I和Not I双酶切后连接，连接产物转入E.coli JM109构建易错PCR突变体库，采用抗生素筛选突变质粒；
(5)将突变质粒CaCl2化学转化法转入E.coli BL21感受态细胞，构成突变文库；
(6)采用96孔板和TLC板筛选15α-羟化酶活性较高的菌株；
(7)通过定点突变的方法，对上述酶活较高菌株的突变位点进行组合，将含有上述突变位点组合的基因与载体pET22b连接，CaCl2化学转化法转入E.coli BL21，以获得15α-羟化酶高效诱导表达的菌株及15α-羟化酶adhA’。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之二，是提供一种技术方案一所述15α-羟化酶突变体的生产方法，具体如下：
以技术方案一所得菌株为生产菌株；
种子培养：二级种子培养OD600测定为6时，用于发酵罐接种；
发酵罐准备：以M9培养基为发酵培养基，接种量2％～10％,pH 6.5～7.5；
所述M9培养基组成为：15.113g/L Na2HPO4·12H2O,3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，MgSO4 1mM，甘油50g/L，微量元素0.1％；
所述微量元素组成为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4，CoCl2·6H2O 0.3，CuCl2·2H2O0.15，ZnCl2 0.3，Na2MoO4·H2O 0.3，H3BO3 0.07，MnCl2·4H2O 0.49。
菌体生长阶段：发酵温度为35～42℃，DO维持20％以上，当发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长及诱导产酶阶段；
补料生长及诱导产酶阶段：流加50％甘油(含5％的IPTG或乳糖)，初始流加速度为5.0mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后诱导产酶阶段结束，收集细胞用于甾体转化；
甾体转化阶段：流加底物至终浓度0.5％，底物转化60～72h直至底物完全转化完成。
有益效果：
1、本发明中采用密码子优化、易错PCR及定点突变技术在体外对15α-羟化酶编码基因adhA进行定向进化，筛选出15α-羟化酶活性显著提高的突变体，突变体Kcat值为原始15α-羟化酶的2.5倍。
2、本发明所述酶的制备过程易于实施且产酶效率高，30m3体系下发酵液酶活达3000U/mL。
3、本发明所述的甾体高效转化过程，30m3体系下转化率高于95％，转化速率为工业生产现有水平的两倍。
具体实施方式：
实施例中涉及到的培养基配方如下：
(1)LB液体培养基(w/v)：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。
(2)M9培养基：15.113g/L Na2HPO4·12H2O,3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，MgSO4 1mM，甘油50g/L，微量元素0.1％；
微量元素(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4，CoCl2·6H2O 0.3，CuCl2·2H2O 0.15，ZnCl20.3，Na2MoO4·H2O 0.3，H3BO3 0.07，MnCl2·4H2O 0.49。
(4)转化产物的硅胶薄层层析(TLC)分析
样品处理：取500μL菌体发酵液，加入200μL的乙酸乙酯混匀，12000r/min离心10min，取上层乙酸乙酯层20μL，用直径为0.5mm的毛细管在硅胶层析板上进行TLC实验。点样位于在距层析板下底边约1cm处，样点间距0.5cm。TLC展开剂：石油醚、乙酸乙酯。
层析：将点样好的硅胶板放入层析缸中展开，加盖，密封，待展开剂前沿距顶端1-2cm时，取出点样板，烘干，在紫外检测仪下观察层析结果。
(5)转化产物的高效液相色谱(HPLC)分析
样品制备：取50mL培养48h的转化培养基，加入20mL的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，通过旋转蒸发仪将乙酸乙酯除去，用10mL的乙腈将残余物重新溶解，离心除去沉淀，过0.45μm微孔滤膜后，以备HPLC分析。
色谱条件：检测器：Shimadau SPD型UV-VIS检测器；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm i.d,Du pon)；流动相：乙腈：水(80：20)；流速1mL/min；检测波长241nm；进样量10μL。
转化率的计算：以转化产物的峰面积与所有物质(包括底物和产物)峰面积总和之比来表示。
实施例1：adhA基因的克隆及密码子优化
重组质粒的构建：采用TRNzol总RNA提取试剂提取雷斯青霉ATCC10490的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然后分别以第一链cDNA为模板，以引物adhA-F1(SEQ ID No.6)和adhA-R1(SEQ ID No.7)进行PCR扩增出15α-羟化酶基因adhA。将PCR产物与质粒pET22b分别用EcoR I和Not I进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escherichia coli JM109感受态细胞。筛选阳性转化子，并提取其质粒进行酶切验证。再将酶切验证正确的重组质粒进行测序(序列SEQ ID No.1)，构建正确的重组质粒命名为pET22b-adhA。
密码子优化：以上述构建正确的重组质粒pET22b-adhA为基础，通过网站http://www.jcat.de/，优化15α-羟化酶编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报，2007,13(4)：515-518)，获得密码子优化的编码15α-羟化酶的新基因adhA-1(序列SEQ ID No.2)，其氨基酸序列与SEQ ID No.3相同。
实施例2：利用易错PCR方法构建15α-羟化酶突变文库
在体外利用易错PCR技术向15α-羟化酶基因adhA-1引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：
Figure BDA0001410085830000051
其中，引物为adhA-F2(SEQ ID No.8)和adhA-R2(SEQ ID No.9)。
PCR扩增条件：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
易错PCR扩增产物经DNA纯化回收试剂盒纯化后，用限制性内切酶EcoR I和Not I对其进行酶切，并与经过相应酶切的质粒pET22b进行连接，转化至E.coli JM109感受态细胞，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上。37℃培养12h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得突变质粒。
将突变质粒CaCl2法转化E.coli BL21感受态细胞。涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上，构成突变文库。
按照上述的方法，进行多轮易错PCR，构建突变文库获得多株初筛目的菌株。
实施例3：高酶活15α-羟化酶突变体的筛选
用灭菌牙签将含100μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上生长出的突变菌株点种至96孔板复筛：向1.8mL/孔(平底)的96孔板中加入300μL M9培养基，121℃灭菌20min。向其中接入保藏于LB平板上的初筛目的菌株(同时接入出发菌株作对照)，37℃100r/min振荡培养至OD600为2～6(约16～18h)。加入1％(wt/vol)IPTG或乳糖诱导15α-羟化酶表达。4h后加入底物1％(wt/vol)甾体双酮，诱导3～4天。将诱导表达96h的96孔板发酵液，3000r/min离心10min，收集上清。根据TLC板的方法筛选底物消耗快产物积累多，即产物形成显色圈尺寸大的菌株为复筛目的菌株。
以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得11株产物显色圈尺寸明显提高的菌株，产物形成显色圈尺寸大小如表1所示。
表1突变体的产物积累结果
Figure BDA0001410085830000061
实施例4：15α-羟化酶突变体的Kcat值测定
摇瓶发酵：将出发菌株以及7个产物显色圈尺寸较出发菌株提高到两倍以上的突变体菌株，接种至25mL M9培养基中，37℃震荡培养至OD600为2～6(约16～20h)，离心收集菌体。
分离纯化：将突变菌株的细胞破碎液经过30kDa超滤膜浓缩、DEAE sepharose FF阴离子交换层析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和SephadexTM 200PG凝胶过滤层析后得到纯化的突变15α-羟化酶活性组分。具体操作参考文献Bo Yuan,et al.ApplMicrobiol Biotechnol.2012,96:1517-1526.
测定方法：15α-羟化酶酶活力的测定方法为HPLC法：取酶液1mL加9mL2％双酮溶液，在37℃、pH＝5.0的条件下，反应10min，取反应液0.5mL沸水浴加热10min灭活，用流动相进行适当稀释，用HPLC测定15α羟化甾体生成量，利用标准曲线计算，获得15α-羟化酶的酶活及动力学参数Kcat。
酶活力单位定义：在37℃、pH＝5.0的条件下，1mL酶液在1min内转化底物双酮产生1μmol的15α羟化甾体定义为一个酶活力单位(U)。
突变体测序结果及产物积累结果见表2。
表2突变体的测序结果及产物积累结果
Figure BDA0001410085830000071
实施例5：定点突变组合15α-羟化酶突变体的基因突变位点
经过多轮易错PCR进行突变文库构建，得到包含有氨基酸突变位点的7个突变菌株(见实施例3，4)。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对15α-羟化酶突变株活力的影响，对这些突变位点进行定点突变组合(用TaKaRa公司的MutanBEST Kit进行定点突变)，获得多个15α-羟化酶突变体。
将含有上述突变位点组合(包含氨基酸突变位点Arg206Leu、Tyr250Arg、Asn251Glu、Thr331His、His343Arg、Ala376Glu、Phe382Gln以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合)的基因与载体pET22b连接，CaCl2法转化大肠杆菌BL21，以获得15α-羟化酶突变体的重组菌株BL21/pET22b-X(X表示不同的突变体)。以与实施例4相同的方法测定15α-羟化酶突变体的Kcat值。各突变体酶的组合位点及其Kcat提高的倍数如表3所示。
表3突变体的测序结果及其Kcat提高的倍数
Figure BDA0001410085830000081
其中，以376位和308位氨基酸发生突变的组合(突变体2-2-7)Kcat最高，改造效果最好。雷斯青霉ATCC10490菌株15α-羟化酶原始氨基酸序列为：SEQ ID No.3；突变体2-2-7的氨基酸序列为：SEQ ID No.5，该突变体对应的核苷酸序列为：SEQ ID No.4，包含突变体2-2-7和/或其基因的菌株命名为BL21/pET22b-227。
实施例6：BL21/pET22b-227菌株30L发酵系统发酵工艺和酶的制备工艺的建立
将保存有BL21/pET22b-227菌株的甘油管接种LB平板，37℃培养12h；单菌落接种于含有30mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃培养温度下200r/min摇床培养12h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体M9)，500mL三角瓶装液量100mL，37℃培养温度下200r/min摇床培养10h，OD600测定为6时，600mL用于发酵罐接种；
发酵罐准备：按照15L初始装液量配制发酵培养基(M9)，氨水调节pH至7.0,搅拌充分后，121℃30min灭菌。
接种：接种时，将600mL种子悬液加入罐中并开始发酵，发酵温度为37℃，pH维持7.0，DO维持20％以上。
菌体生长阶段：发酵培养基中的甘油可以用于菌体生长约10h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长及诱导产酶阶段。
补料生长及诱导产酶阶段：流加50％甘油(含5％的IPTG)，初始流加速度为5.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后诱导产酶阶段结束，收集细胞。
发酵液经板框过滤或陶瓷膜过滤收集菌体，收集的细胞即为高活性15α-羟化酶成品，酶活不低于3000U/mL，细胞破碎后喷雾干燥制备粉末剂型15α-羟化酶成品，酶活不低于4000U/g。
实施例7：30m3体系下15α-羟化酶的制备
将实施例6的工艺调整为30m3发酵体系对应的比例，同步换算补料速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。
菌体生长阶段：发酵培养基中的甘油可以用于菌体生长约10h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。
补料生长及诱导产酶阶段：流加50％甘油(含5％的乳糖)，初始流加速度为5.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后诱导产酶阶段结束，收集细胞。
发酵液经板框过滤或陶瓷膜过滤收集菌体，收集的细胞即为高活性15α-羟化酶成品，酶活不低于4000U/mL，细胞破碎后喷雾干燥制备粉末剂型15α-羟化酶成品，酶活不低于5000U/g。
实施例8：30m3体系下15α羟化甾体的制备
采用实施例7制备的高活性细胞，15m3起始装液量按照3％的添加量添加细胞和0.5％的添加量添加底物双酮。转化约60h，底物消耗完成后陶瓷膜过滤收集菌体，重复投料进行二次转化，反复五次后数据如表4。
表4批次转化产物积累情况
批次 底物投料量(kg) 细胞投料量(L) 产物积累量(kg) 转化率(％)
起始转化批次 75 450 73.5 98.0
第二批转化 75 450 73.0 97.3
第三批转化 75 450 73.2 97.6
第四批转化 75 450 72.8 97.1
第五批转化 75 450 72.4 96.5
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种15α-羟化酶及其制备方法和应用
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<400> 2
atggttctgg ctctggctat ggctcgttct gctaacttcg actctatccc gccgatgcgt 60
gctgcttctt gcctggctgg ttgccacaac aaacacctgg gtcgttactc tggtaccttc 120
aaaaccggtt gggaatttac caacaaaaaa gctaaatctc gtttcaccga atcttgccgt 180
gacctgatcg ctatgccgcg ttctgaccgt cgtggtgttt gcaaaggtat gccgccggaa 240
aaacgtgctg aagttgctcg tgctacccag ccgatcatcg ttctgcaccc gaaatacatc 300
gacgaaatca aatctcaccc ggacctgtct ttcgctgacg ctgttaaaaa agttgacacc 360
cagccggaaa tgtctggtac ccgtgaaggt ttcgctaaat gctctggtct gtctgcttct 420
ccgcagtgga acggtgacga atgctaccgt gttgcttctc tgaccgtttt ccgtgctctg 480
tctcactcta ccgttgaacg tcgttaccag gctgaacgtc tggttacccc ggacctgccg 540
aaagacaccc tgcaccgtat gatcctgggt ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac 600
aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac gaactgtctc gtaccggtca cggtcagaaa 660
cgtaaactgc gtttctaccc gccgaacgct tctcgtgaaa tgcgtatgat cctgggtgac 720
ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac 780
gaactgtctt tcacctctgg tgaagcgtgg aaaccgatca ccctgcacct gcagtggcgt 840
ggttcttctc actgcccgcg tcgtaccttc ctgtacgaat ggcgtggtct ggaagctaac 900
ctgtggtact ctcactggcc gtggccggaa gctcagacct ctatcctgtc tccgcagtgc 960
gaaccgcgtg ttgctctgct ggctgttatc acctctatct ggggtgacat cgttgacgaa 1020
atcccgcacc gtcgtatccc gctggttggt aacggttggg aatttaccaa caaaaaagct 1080
aaatctcgtt tcaccgaatc ttgccgtgac ctgatcgctg aatttgctaa aggtgcttct 1140
gctttccaga tcatcgctac ccagccgatc atcgttctgc acccgaaata catcgacgaa 1200
atcaaacacc cggacctgtc tttcgctgac gctgttaaaa aaatgttctt ctctaaccgt 1260
gttccggttg aaccgttcca ctctggtacc gctatgaacg ttaccgttga agttgttcgt 1320
accaaactga cccaggctcg ttacctgtct 1350
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 雷斯青霉ATCC10490
<400> 3
Met Val Leu Ala Leu Ala Met Ala Arg Ser Ala Asn Phe Asp Ser Ile
1 5 10 15
Pro Pro Met Arg Ala Ala Ser Cys Leu Ala Gly Cys His Asn Lys His
20 25 30
Leu Gly Arg Tyr Ser Gly Thr Phe Lys Thr Gly Trp Glu Phe Thr Asn
35 40 45
Lys Lys Ala Lys Ser Arg Phe Thr Glu Ser Cys Arg Asp Leu Ile Ala
50 55 60
Met Pro Arg Ser Asp Arg Arg Gly Val Cys Lys Gly Met Pro Pro Glu
65 70 75 80
Lys Arg Ala Glu Val Ala Arg Ala Thr Gln Pro Ile Ile Val Leu His
85 90 95
Pro Lys Tyr Ile Asp Glu Ile Lys Ser His Pro Asp Leu Ser Phe Ala
100 105 110
Asp Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Gln Pro Glu Met Ser Gly Thr Arg
115 120 125
Glu Gly Phe Ala Lys Cys Ser Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Trp Asn
130 135 140
Gly Asp Glu Cys Tyr Arg Val Ala Ser Leu Thr Val Phe Arg Ala Leu
145 150 155 160
Ser His Ser Thr Val Glu Arg Arg Tyr Gln Ala Glu Arg Leu Val Thr
165 170 175
Pro Asp Leu Pro Lys Asp Thr Leu His Arg Met Ile Leu Gly Leu His
180 185 190
Asn Arg Gln Arg His Ser Ile Tyr Asn Gly Glu Val Val Arg Ile Ala
195 200 205
Pro Asp Glu Leu Ser Arg Thr Gly His Gly Gln Lys Arg Lys Leu Arg
210 215 220
Phe Tyr Pro Pro Asn Ala Ser Arg Glu Met Arg Met Ile Leu Gly Asp
225 230 235 240
Leu His Asn Arg Gln Arg His Ser Ile Tyr Asn Gly Glu Val Val Arg
245 250 255
Ile Ala Pro Asp Glu Leu Ser Phe Thr Ser Gly Glu Ala Trp Lys Pro
260 265 270
Ile Thr Leu His Leu Gln Trp Arg Gly Ser Ser His Cys Pro Arg Arg
275 280 285
Thr Phe Leu Tyr Glu Trp Arg Gly Leu Glu Ala Asn Leu Trp Tyr Ser
290 295 300
His Trp Pro Trp Pro Glu Ala Gln Thr Ser Ile Leu Ser Pro Gln Cys
305 310 315 320
Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ala Val Ile Thr Ser Ile Trp Gly Asp
325 330 335
Ile Val Asp Glu Ile Pro His Arg Arg Ile Pro Leu Val Gly Asn Gly
340 345 350
Trp Glu Phe Thr Asn Lys Lys Ala Lys Ser Arg Phe Thr Glu Ser Cys
355 360 365
Arg Asp Leu Ile Ala Glu Phe Ala Lys Gly Ala Ser Ala Phe Gln Ile
370 375 380
Ile Ala Thr Gln Pro Ile Ile Val Leu His Pro Lys Tyr Ile Asp Glu
385 390 395 400
Ile Lys His Pro Asp Leu Ser Phe Ala Asp Ala Val Lys Lys Met Phe
405 410 415
Phe Ser Asn Arg Val Pro Val Glu Pro Phe His Ser Gly Thr Ala Met
420 425 430
Asn Val Thr Val Glu Val Val Arg Thr Lys Leu Thr Gln Ala Arg Tyr
435 440 445
Leu Ser
450
<210> 4
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggttctgg ctctggctat ggctcgttct gctaacttcg actctatccc gccgatgcgt 60
gctgcttctt gcctggctgg ttgccacaac aaacacctgg gtcgttactc tggtaccttc 120
aaaaccggtt gggaatttac caacaaaaaa gctaaatctc gtttcaccga atcttgccgt 180
gacctgatcg ctatgccgcg ttctgaccgt cgtggtgttt gcaaaggtat gccgccggaa 240
aaacgtgctg aagttgctcg tgctacccag ccgatcatcg ttctgcaccc gaaatacatc 300
gacgaaatca aatctcaccc ggacctgtct ttcgctgacg ctgttaaaaa agttgacacc 360
cagccggaaa tgtctggtac ccgtgaaggt ttcgctaaat gctctggtct gtctgcttct 420
ccgcagtgga acggtgacga atgctaccgt gttgcttctc tgaccgtttt ccgtgctctg 480
tctcactcta ccgttgaacg tcgttaccag gctgaacgtc tggttacccc ggacctgccg 540
aaagacaccc tgcaccgtat gatcctgggt ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac 600
aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac gaactgtctc gtaccggtca cggtcagaaa 660
cgtaaactgc gtttctaccc gccgaacgct tctcgtgaaa tgcgtatgat cctgggtgac 720
ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac 780
gaactgtctt tcacctctgg tgaagcgtgg aaaccgatca ccctgcacct gcagtggcgt 840
ggttcttctc actgcccgcg tcgtaccttc ctgtacgaat ggcgtggtct ggaagctaac 900
ctgtggtact ctcactggcc gtggccggaa gctcagacct ctatcctgtc tccgcagtgc 960
gaaccgcgtg ttgctctgct ggctgttatc acctctatct ggggtgacat cgttgacgaa 1020
atcccgcacc gtcgtatccc gctggttggt aacggttggg aatttaccaa caaaaaagct 1080
aaatctcgtt tcaccgaatc ttgccgtgac ctgatcgctg aatttgaaaa aggtgcttct 1140
gctcagcaga tcatcgctac ccagccgatc atcgttctgc acccgaaata catcgacgaa 1200
atcaaacacc cggacctgtc tttcgctgac gctgttaaaa aaatgttctt ctctaaccgt 1260
gttccggttg aaccgttcca ctctggtacc gctatgaacg ttaccgttga agttgttcgt 1320
accaaactga cccaggctcg ttacctgtct 1350
<210> 5
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Val Leu Ala Leu Ala Met Ala Arg Ser Ala Asn Phe Asp Ser Ile
1 5 10 15
Pro Pro Met Arg Ala Ala Ser Cys Leu Ala Gly Cys His Asn Lys His
20 25 30
Leu Gly Arg Tyr Ser Gly Thr Phe Lys Thr Gly Trp Glu Phe Thr Asn
35 40 45
Lys Lys Ala Lys Ser Arg Phe Thr Glu Ser Cys Arg Asp Leu Ile Ala
50 55 60
Met Pro Arg Ser Asp Arg Arg Gly Val Cys Lys Gly Met Pro Pro Glu
65 70 75 80
Lys Arg Ala Glu Val Ala Arg Ala Thr Gln Pro Ile Ile Val Leu His
85 90 95
Pro Lys Tyr Ile Asp Glu Ile Lys Ser His Pro Asp Leu Ser Phe Ala
100 105 110
Asp Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Gln Pro Glu Met Ser Gly Thr Arg
115 120 125
Glu Gly Phe Ala Lys Cys Ser Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Trp Asn
130 135 140
Gly Asp Glu Cys Tyr Arg Val Ala Ser Leu Thr Val Phe Arg Ala Leu
145 150 155 160
Ser His Ser Thr Val Glu Arg Arg Tyr Gln Ala Glu Arg Leu Val Thr
165 170 175
Pro Asp Leu Pro Lys Asp Thr Leu His Arg Met Ile Leu Gly Leu His
180 185 190
Asn Arg Gln Arg His Ser Ile Tyr Asn Gly Glu Val Val Arg Ile Ala
195 200 205
Pro Asp Glu Leu Ser Arg Thr Gly His Gly Gln Lys Arg Lys Leu Arg
210 215 220
Phe Tyr Pro Pro Asn Ala Ser Arg Glu Met Arg Met Ile Leu Gly Asp
225 230 235 240
Leu His Asn Arg Gln Arg His Ser Ile Tyr Asn Gly Glu Val Val Arg
245 250 255
Ile Ala Pro Asp Glu Leu Ser Phe Thr Ser Gly Glu Ala Trp Lys Pro
260 265 270
Ile Thr Leu His Leu Gln Trp Arg Gly Ser Ser His Cys Pro Arg Arg
275 280 285
Thr Phe Leu Tyr Glu Trp Arg Gly Leu Glu Ala Asn Leu Trp Tyr Ser
290 295 300
His Trp Pro Trp Pro Glu Ala Gln Thr Ser Ile Leu Ser Pro Gln Cys
305 310 315 320
Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ala Val Ile Thr Ser Ile Trp Gly Asp
325 330 335
Ile Val Asp Glu Ile Pro His Arg Arg Ile Pro Leu Val Gly Asn Gly
340 345 350
Trp Glu Phe Thr Asn Lys Lys Ala Lys Ser Arg Phe Thr Glu Ser Cys
355 360 365
Arg Asp Leu Ile Ala Glu Phe Glu Lys Gly Ala Ser Ala Gln Gln Ile
370 375 380
Ile Ala Thr Gln Pro Ile Ile Val Leu His Pro Lys Tyr Ile Asp Glu
385 390 395 400
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405 410 415
Phe Ser Asn Arg Val Pro Val Glu Pro Phe His Ser Gly Thr Ala Met
420 425 430
Asn Val Thr Val Glu Val Val Arg Thr Lys Leu Thr Gln Ala Arg Tyr
435 440 445
Leu Ser
450
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctactcaaaa gctgcgcagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccggaattcc tactcaaaag ctgcgcagt 29
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ataagaatgc ggccgcggac gtagtatgaa tggctg 36

Claims (9)

1.一种15α-羟化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.权利要求1所述的一种15α-羟化酶突变体的编码基因。
3.权利要求2所述一种15α-羟化酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ IDNo.4所示。
4.权利要求1所述一种15α-羟化酶突变体或权利要求2所述基因在C15α甾体羟化中的用途。
5.一种包含权利要求3所述的基因的重组载体或重组菌。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，表达载体为pET22b。
7.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21，表达载体为pET22b。
8.权利要求1所述15α-羟化酶突变体的生产方法，其特征在于，具体如下：
采用权利要求7所述重组菌为生产菌株；
种子培养：二级种子培养，OD600测定为6时，用于发酵罐接种；
发酵罐准备：以M9培养基为发酵培养基，接种量2％～10％,pH 6.5～7.5；
菌体生长阶段：发酵温度为35～42℃，DO维持20％以上，当发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长及诱导产酶阶段；
补料生长及诱导产酶阶段：流加50％甘油，含5％的IPTG或乳糖，初始流加速度为5.0mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后诱导产酶阶段结束，收集细胞用于甾体转化；
甾体转化阶段：流加底物至终浓度0.5％，转化60～72h直至底物完全转化完成。
9.如权利要求7所述15α-羟化酶突变体的生产方法，其特征在于，所述M9培养基组成为：15.113g/L Na2HPO4·12H2O,3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，MgSO4 1mM，甘油50g/L，微量元素0.1％；
微量元素组成为：FeCl3·6H2O 2.4g/L，CoCl2·6H2O 0.3g/L，CuCl2·2H2O 0.15g/L，ZnCl20.3g/L，Na2MoO4·H2O 0.3g/L，H3BO3 0.07g/L，MnCl2·4H2O 0.49g/L。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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