CN111454855B - 一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α‑左旋乙基甾烯二酮中的应用，属于发酵工程技术领域；本发明以毕赤酵母为宿主，首次以胞内产酶方式同时诱导15α‑甾体羟化酶和葡糖‑6‑磷酸脱氢酶，采用毕赤酵母全细胞边诱导边催化的方式实现左旋乙基甾烯二酮转化高投料量和高转化率。

Description

一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基 甾烯二酮中的应用

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用。

背景技术

甾体类药物是一类重要的，具有广泛的药理和生理活性的药物，在抗炎、抗过敏、抗肿瘤和生育控制等方面具有极其重要的作用。孕二烯酮是第三代强效避孕药主要成分之一，是迄今为止最为理想的口服避孕药。

孕二烯酮的化学合成需要利用昂贵的催化剂Pb(OAc)₂和Bu₃SnOMe，成本较高且污染较大。微生物转化因其高区域性、立体选择性以及环境友好性在甾体化合物工业中得以广泛应用。15α-左旋乙基甾烯二酮是合成孕二烯酮的关键中间体，目前工业上主要利用雷斯青霉(Penicillium raistrckii)甾体羟基化酶的特异性酶促反应，在左旋乙基甾烯二酮的C15位引入羟基来获得15α-左旋乙基甾烯二酮。

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯二酮的15α-羟基化反应在实际工业生产中存在投料量偏低(2g/L)，转化时间(72h)长等问题，严重限制了15α-左旋乙基甾烯二酮的转化率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母及利用重组毕赤酵母高效转化左旋乙基甾烯二酮的方法，本发明解决了左旋乙基甾烯二酮投料量低的技术问题，实现了孕二烯酮中间体15α-羟基左旋乙基甾烯二酮的高效生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入毕赤酵母基因组His4位点；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入毕赤酵母基因组5’AOX1位点；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：

S1.将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；

S2.将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；

S3.将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；

所述步骤S1和S2之间没有时间顺序限制。

优选的，所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH在pPIC3.5K中的插入位点为EcoR I和NotI；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1在pPICZ中的插入位点为EcoR I和Xba I。

优选的，步骤S3中所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：

1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，进行种子培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，得到种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基，于28～30℃、溶解氧含量高于20％的条件下，进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；

3)在所述发酵体系中甘油耗尽后，以19.92mL/(L·h)的速率向发酵体系中流加微量元素甘油水溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，继续进行发酵培养至甘油耗尽，在甘油耗尽的条件下，菌体保持饥饿状态1h；所述微量元素甘油水溶液包括体积百分含量为45％～55％的甘油和12mL/L的微量元素水溶液；

4)在所述菌体保持饥饿状态1h后，溶解氧含量为100％，以3.61mL/(L·h)的速率向发酵体系中第一次流加微量元素甲醇溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，于28～30℃的条件下，进行第一诱导培养2h；以7.22mL/(L·h)的速率向发酵体系中第二次流加微量元素甲醇溶液2h；

5)在第二次流加微量元素甲醇溶液2h后，以10.89mL/(L·h)的速率流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液，至发酵体系中左旋乙基甾烯二酮的浓度为8g/L，控制溶解氧含量始终高于20％，于28～30℃的条件下反应直至左旋乙基甾烯二酮完全转化；

步骤2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：85％磷酸26.7mL/L、CaSO₄0.93 g/L、K₂SO₄18.2 g/L、MgSO₄7.27 g/L、KOH 4.13g/L、Tween800.6 mL/L、甘油40g/L和体积百分含量为0.43％的微量元素水溶液；所述发酵培养基的pH值为5.0；

步骤4)中所述微量元素甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液；

步骤5)中所述左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液和4～5g/L的左旋乙基甾烯二酮；

所述微量元素水溶液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：CuSO₄·5H₂O6.0g/L，NaI0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L、FeSO₄·7H₂O 65.0g/L、生物素0.2g/L和硫酸5.0mL/L。

优选的，步骤1)中所述种子培养基为YPG液体培养基。

优选的，步骤2)中所述种子液的初始接种量以接种后的OD₆₀₀为准；所述OD₆₀₀为0.8～1.0。

本发明的有益效果：本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1。本发明的重组毕赤酵母以毕赤酵母为宿主，能够以胞内产酶方式同时诱导15α-甾体羟化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶；利用本发明的重组毕赤酵母能够高效转化左旋乙基甾烯二酮，进而高效制备15α-羟基左旋乙基甾烯二酮。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：重组毕赤酵母种子培养、菌体生长、菌体补料生长、诱导产酶和左旋乙基甾烯二酮转化；本发明采用毕赤酵母全细胞边诱导边催化的方式实现左旋乙基甾烯二酮转化高投料量，达到8g/L，转化率高达98％，制备效率高，比目前工业上雷斯青霉转化效率高了3倍。

附图说明

图1为重组质粒pPIC3.5K-PRH结构示意图；

图2为重组质粒pPICZ-ZWF1结构示意图；

图3为重组质粒pPIC3.5K-PRH，pPICZ-ZWF1转化毕赤酵母GS115基因组示意图

图4为重组质粒pPIC3.5K-PRH，pPICZ-ZWF1转化毕赤酵母GS115基因组PCR鉴定图，其中M：1kb DNAladder；1：ZWF1基因验证；2：PRH基因验证；

图5为重组毕赤酵母转化左旋乙基甾烯二酮TLC图；

图6为重组毕赤酵母转化左旋乙基甾烯二酮HPLC图，其中a：左旋乙基甾烯二酮；b：15α-左旋乙基甾烯二酮。

具体实施方式

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1；所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入毕赤酵母基因组His4位点；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入毕赤酵母基因组5’AOX1位点；所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGGCTGTCCTCACCGAATTGTTCCATAGTCCTTATGTGGTTCAGGGGGTGTGCGTTGCCTTGCTGGCTGTTTTCATAACAAGCATTTGGGGCGATATAGTGGATGAAATCCCCCACCGTCGTATACCTTTAGTTGGCAAAACTGGCTGGGAGTTCACCAACAAAAAGGCAAAGTCGCGATTTACTGAGTCATGCCGCGATCTGATCGCCGAAGGGTTTGCAAAGGGAGCCAGCGCTTTTCAAATCATTGGAGCAACACAACCGATCATTGTTCTGCACCCGAAGTATATCGATGAAATCAAGAGCCACCCAGACTTGAGTTTTGCCGATGCCGTCAAAAAGATGTTCTTCTCTAACCGTGTTCCGGGCTTTGAGCCATTCCACAGTGGAACGGCGATGAATGTTACCGTCGAGGTTGTGCGCACCAAGCTGACCCAAGCGCTTGGATATTTGTCAATCCCGCTTTCAAAAGAATCATCTTTGACCTTGAAAGAAGCCTTGCCTCCCACTGACGATTGGACTCCATACAACTTTGCGCACAAGATTCCGTATATGGTGGCCCGTGTCTCATCATTAGTATTCGTAGGTGAGACCATCTGCCACAACGATGAATGGATCGATGTGTCAGTCAACTACGCCCTTGACTCCTTTAAGGCCATGCGCGAGCTACGAACATGGCCATCTGTCCTCCGCCCAATTGTTCATTGGTTTTTGCCTTCTACTCAAAAGCTGCGCAGTCACTTAAAGAAAGCCAACAGTCTCATCAGCCACGAGATTGACAGACGAGCGTTGATTCGGGAAGGCAAACTCCCAGCCGAAAACCCGCCACACAAGCCTGATGCATTGGACTGGTTTCGGGAGACTGCGGAGGCCCAGAGCAACTTCACTATTGACCAGGCCCGCTCTCAGGTCGGACTGGCCTTGGCAGCCATTCATACTACGTCCAACTTGATCACTAATGTTATGTATGATCTCGCCGCATACCCAGAGTATTTCCAGCCACTACGTGATGAGATCCAAGCGGTTGCTGCCGAGGATGGCGTACTCAAGAAGACTAGCTTGCTTAAGTTCAAACTGATGGATAGTATCATGAAGGAGTCGCAGAGAACTCATCCATTATCATTGATCTCCTTGAACCGCGTCACTCATCAGAAGGTTGTTCTTTCCGACGGCACCGTGCTTCCCAAAGGCGCAAATGTCGCTATTTCTACAAGCCCTCTGGAAGACGATAATGTATACCCCAACGCCGCCACCTATGATGGCTACCGGTTCTTGAAGAAACGTCAGGCACCAGGAAACGAGCACAAACATCAATTTGTCACAACGACCAAGGAACACTTCGTCTTCGGCCACGGTGTCCACGCCTGCCCGGGTCGTTTCTTCGCTGCCAATGAAACCAAAATCCTACTCCTTCATCTGCTGTTGAAGTACGACTGGAAATTGCAGAGTGGTGGACGACCGAAAAATTTTAGCAATGGCACCGAGTCTATTACCGACCCCACGGTTGAACTACTGTTCCGGTCTCGTGAACCCGAGATTGACTTGAGTTTCTTGGGAGAGTAG。

在本发明中，重组毕赤酵母提供雷斯青霉15α羟基化功能，催化左旋乙基甾烯二酮生成15α-羟基左旋乙基甾烯二酮；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

ATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTCGAAAAAAATACCGTCATATCTGTCTTTGGTGCGTCAGGTGATCTGGCAAAGAAGAAGACTTTTCCCGCCTTATTTGGGCTTTTCAGAGAAGGTTACCTTGATCCATCTACCAAGATCTTCGGTTATGCCCGGTCCAAATTGTCCATGGAGGAGGACCTGAAGTCCCGTGTCCTACCCCACTTGAAAAAACCTCACGGTGAAGCCGATGACTCTAAGGTCGAACAGTTCTTCAAGATGGTCAGCTACATTTCGGGAAATTACGACACAGATGAAGGCTTCGACGAATTAAGAACGCAGATCGAGAAATTCGAGAAAAGTGCCAACGTCGATGTCCCACACCGTCTCTTCTATCTGGCCTTGCCGCCAAGCGTTTTTTTGACGGTGGCCAAGCAGATCAAGAGTCGTGTGTACGCAGAGAATGGCATCACCCGTGTAATCGTAGAGAAACCTTTCGGCCACGACCTGGCCTCTGCCAGGGAGCTGCAAAAAAACCTGGGGCCCCTCTTTAAAGAAGAAGAGTTGTACAGAATTGACCATTACTTGGGTAAAGAGTTGGTCAAGAATCTTTTAGTCTTGAGGTTCGGTAACCAGTTTTTGAATGCCTCGTGGAATAGAGACAACATTCAAAGCGTTCAGATTTCGTTTAAAGAGAGGTTCGGCACCGAAGGCCGTGGCGGCTATTTCGACTCTATAGGCATAATCAGAGACGTGATGCAGAACCATCTGTTACAAATCATGACTCTCTTGACTATGGAAAGACCGGTGTCTTTTGACCCGGAATCTATTCGTGACGAAAAGGTTAAGGTTCTAAAGGCCGTGGCCCCCATCGACACGGACGACGTCCTCTTGGGCCAGTACGGTAAATCTGAGGACGGGTCTAAGCCCGCCTACGTGGATGATGACACTGTAGACAAGGACTCTAAATGTGTCACTTTTGCAGCAATGACTTTCAACATCGAAAACGAGCGTTGGGAGGGCGTCCCCATCATGATGCGTGCCGGTAAGGCTTTGAATGAGTCCAAGGTGGAGATCAGACTGCAGTACAAAGCGGTCGCATCGGGTGTCTTCAAAGACATTCCAAATAACGAACTGGTCATCAGAGTGCAGCCCGATGCCGCTGTGTACCTAAAGTTTAATGCTAAGACCCCTGGTCTGTCAAATGCTACCCAAGTCACAGATCTGAATCTAACTTACGCAAGCAGGTACCAAGACTTTTGGATTCCAGAGGCTTACGAGGTGTTGATAAGAGACGCCCTACTGGGTGACCATTCCAACTTTGTCAGAGATGACGAATTGGATATCAGTTGGGGCATATTCACCCCATTACTGAAGCACATAGAGCGTCCGGACGGTCCAACACCGGAAATTTACCCCTACGGATCAAGAGGTCCAAAGGGATTGAAGGAATATATGCAAAAACACAAGTATGTTATGCCCGAAAAGCACCCTTACGCTTGGCCCGTGACTAAGCCAGAAGATACGAAGGATAATTAG。本发明利用6-磷酸脱氢酶基因ZWF1将重组毕赤酵母中的NADP⁺还原为NADPH，为重组毕赤酵母催化左旋乙基甾烯二酮提供充足的NADPH。

在本发明中，所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1采用本领域常规PCR扩增方法扩增得到，所述重组毕赤酵母采用本本领域常规毕赤酵母筛选方法得到阳性菌株。

在本发明中，重组质粒pPIC3.5K-PRH结构示意图参见图1；重组质粒pPICZ-ZWF1结构示意图参见图2。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母的构建方法，参见示意图3，包括以下步骤：

S1.将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；

S2.将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；

S3.将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；

所述步骤S1和S2之间没有时间顺序限制。

本发明将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；所述雷斯青霉PRH基因外源表达优选毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K，其中pPIC3.5K携带遗传霉素抗性便于筛选高拷贝PRH重组菌株；所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH在pPIC3.5K中的插入位点优选为EcoRI和NotI。具体操作为：

将扩增得到的PRH基因和pPIC3.5K分别经EcoR I和NotI酶切，用T4连接酶连接，连接体系为：2μL目的片段；1μLpPIC3.5K片段，1μL 10×T4DNALigase buffer；1μLT4DNALigase；ddH₂O补加至10μL，将上述混合物于22℃水浴连接1～2h，转化大肠感受态E.coli JM109，提取质粒，酶切验证，酶切体系为：

a)单酶切验证

反应体系为10μL，各组分为：2μL重组质粒；1μL 10×Buffer；0.5μL酶EcoR I；6.5μL ddH₂O。37℃反应2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

b)双酶切验证

反应体系10μL，各组分为：2μL重组质粒；1μL 10×Buffer；0.5μL酶EcoR I；0.5μL酶NotI；6μL ddH₂O。37℃反应2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1外源表达优选毕赤酵母胞内表达载体pPICZ，其中，pPICZ携带博来霉素抗性基因便于筛选阳性菌株；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1在pPICZ中的插入位点优选为EcoR I和Xba I。具体操作为：

将扩增得到的ZWF1基因和pPICZ分别经EcoR I和Xba I酶切，用T4连接酶连接，连接体系为：2μL目的片段ZWF1；1μLpPICZ片段，1μL 10×T4DNALigasebuffer；1μLT4DNALigase；ddH₂O补加至10μL，将上述混合物于22℃水浴连接1～2h，转化大肠感受态E.coliJM109，提取质粒，酶切验证，酶切体系为：

a)单酶切验证

反应体系为10μL，各组分为：2μL重组质粒；1μL 10×Buffer；0.5μL酶EcoR I；6.5μL ddH₂O。37℃反应2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

b)双酶切验证

反应体系10μL，各组分为：2μL重组质粒；1μL 10×Buffer；0.5μL酶EcoR I；0.5μL酶Xba I；6μL ddH₂O。37℃反应2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

得到第一重组质粒和第二重组质粒后，本发明将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：

1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，进行种子培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，得到种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基，于28～30℃、溶解氧含量高于20％的条件下，进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；

3)在所述发酵体系中甘油耗尽后，以19.92mL/(L·h)的速率向发酵体系中流加微量元素甘油水溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，继续进行发酵培养至甘油再次耗尽，在甘油耗尽的条件下，菌体保持饥饿状态1h；所述微量元素甘油水溶液包括体积百分含量为45％～55％的甘油和12mL/L的微量元素水溶液；

4)在所述菌体保持饥饿状态1h后，溶解氧含量为100％，以3.61mL/(L·h)的速率向发酵体系中第一次流加微量元素甲醇溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，于28～30℃的条件下，进行第一诱导培养2h；以7.22mL/(L·h)的速率向发酵体系中第二次流加微量元素甲醇溶液2h；

5)在第二次流加微量元素甲醇溶液2h后，以10.89mL/(L·h)的速率向流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液，至发酵体系中左旋乙基甾烯二酮的浓度为8g/L，控制溶解氧含量始终高于20％，于28～30℃的条件下反应直至左旋乙基甾烯二酮完全转化；

步骤2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：85％磷酸26.7mL/L、CaSO₄0.93 g/L、K₂SO₄18.2 g/L、MgSO₄7.27 g/L、KOH 4.13g/L、Tween800.6 mL/L、甘油40g/L和体积百分含量为0.43％的微量元素水溶液；所述发酵培养基的pH值为5.0；其中，Tween80能够活化细胞表面，降低表面张力以及释放反应液的能量，通过破坏磷脂双分子层和与膜组分形成混合微粒增溶细胞膜，从而加快甾体分子从细胞表面进入细胞内部。

步骤4)中所述微量元素甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液；

步骤5)中所述左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液和4～5g/L的左旋乙基甾烯二酮，其中，左旋乙基甾烯二酮难溶于水，溶于甲醇中以提高其溶解性；

所述微量元素水溶液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：CuSO₄·5H₂O6.0g/L，NaI0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L、FeSO₄·7H₂O 65.0g/L、生物素0.2g/L和硫酸5.0mL/L。

本发明首先将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，置于30℃，200～220r/min下培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，优选为12，得到种子液；所述种子培养基优选YPG液体培养基；所述YPG液体培养基包括以下质量份的组分：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油20g，pH自然，定容至1L，115℃灭菌20min。

得到种子液后，本发明将所述种子液接种至发酵培养基，于28～30℃、溶解氧含量高于20％的条件下，进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；所述种子液的初始接种量以接种后的OD₆₀₀为准；所述OD₆₀₀优选为0.8～1.0，更优选0.9；所述发酵培养的温度优选为30℃，本发明设置溶解氧含量高于20％的条件的作用是保证充足的氧，以维持重组酿酒的生长及左旋乙基甾烯二酮的转化。

在所述发酵体系中甘油耗尽后，本发明以19.92mL/(L·h)(这一速率使加入的甘油控制在4h内消耗完成)的速率向发酵体系中流加微量元素甘油水溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，继续进行发酵培养至甘油再次耗尽，在甘油耗尽的条件下，菌体保持饥饿状态1h，使甘油完全耗尽，便于甲醇诱导；所述微量元素甘油水溶液包括体积百分含量为45％～55％的甘油和12mL/L的微量元素水溶液，所述微量元素甘油水溶液中甘油的体积百分含量优选为50％。

在所述菌体保持饥饿状态1h后，本发明以3.61mL/(L·h)的速率向发酵体系中第一次流加微量元素甲醇溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，于28～30℃的条件下，进行第一诱导培养2h；以7.22mL/(L·h)的速率向发酵体系中第二次流加微量元素甲醇溶液2h。

在第二次流加微量元素甲醇溶液2h后，以10.89mL/(L·h)的速率向流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液，至发酵体系中左旋乙基甾烯二酮的浓度为8g/L，于28～30℃的条件下反应，每隔8h取样检测，直至左旋乙基甾烯二酮完全转化。

在本发明中，采用甲醇作为左旋乙基甾烯二酮的溶剂，其中甲醇能够诱导重组毕赤酵母产生15α羟化酶和葡糖6-磷酸脱氢酶，同时能够提高左旋乙基甾烯二酮的溶解性；左旋乙基甾烯二酮随甲醇流加进入发酵体系能够实现边诱导边转化，能够明显提高转化效率。

在本发明中，以10.89mL/(L·h)的速率向流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液的作用：一是维持生长所需，二是甲醇诱导产酶所需，三是能够以最佳状态转化左旋乙基甾烯二酮。

在本发明中，通过TLC或HPLC检测左旋乙基甾烯二酮是否完全转化。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中涉及到的引物序列如下：

PRH-F：GGAATTCATGGCTGTCCTCACCGAATTG，如SEQ ID NO.3所示；

PRH-R：ATAAGAATGCGGCCGCCTACTCTCCCAAGAAAC，如SEQ ID NO.4所示

ZWF1-F：GGAATTCAGTAGTGAAGGCCCCGTCAAATTC，如SEQ ID NO.5所示；

ZWF1-R：GCTCTAGACTAATTATCCTTCGTATCTTGTGGC，如SEQ ID NO.6所示；

下划线部分代表加入的酶切位点

实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB固体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，去离子水溶解后，定容至1L，调节pH至7.0，加入18g琼脂粉，121℃灭菌20min。

LLB固体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水溶解后，定容至1L，调节pH至7.0，加入18g琼脂粉，121℃灭菌20min。

YPD固体培养基：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，pH自然，定容至1L，115℃灭菌20min。

YPG培养基：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油20g，pH自然，定容至1L，115℃灭菌20min。

MD固体培养基：20g葡萄糖，18g琼脂粉，加水900mL，pH自然，115℃高压灭菌20min。冷却至60℃，加入13.4％YNB(100mL)，0.02％生物素(2mL)。

YPDS固体培养基：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，山梨醇18g，琼脂粉18g，定容至1L，pH自然，115℃灭菌20min。

发酵培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄0.93 g/L，K₂SO₄18.2 g/L，MgSO₄7.27 g/L，KOH 4.13g/L，Tween800.6mL/L，甘油40g/L，微量元素10.8mL；其中微量元素组成为：CuSO₄·5H₂O 6.0g，NaI 0.08g，MnSO₄·H₂O3.0g，NaMoO₄·2H₂O 0.2g，H₃BO₃0.02 g，CoCl₂0.5g，ZnCl₂20.0 g，FeSO₄·7H₂O 65.0g，生物素0.2g，硫酸5.0mL，定容至1L。

实例中所用左旋乙基甾烯二酮购自北京紫竹药业有限公司，乙酸乙酯、氯仿等有机试剂购自天津市化学试剂六厂，TLC硅胶板购自烟台德信生物技术有限公司，分子克隆试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司，其他试剂未特别注明来源的，均购自上海生工生物工程股份有限公司。

实施例1

1、重组质粒pPIC3.5K-PRH的构建

从雷斯青霉中提取RNA，经反转录获得cDNA文库，以PRH-F/R为引物，PCR扩增得到带有EcoR I/Not I酶切位点的PRH目的基因片段，经限制性内切酶EcoR I/NotI酶切，同时以相同酶切质粒pPIC3.5K(Invitrogen)，将得到的PRH目的基因片段与质粒pPIC3.5K骨架置于22℃连接2h，划转至大肠杆菌感受态JM109中，涂布于LB平板上，经Amp抗性筛选，成功获得重组质粒pPIC3.5K-PRH。

2、重组质粒pPICZ-ZWF1的构建

从酿酒酵母INVSc1(Invitrogen)中提取基因组DNA，以ZWF1-F/R为引物，PCR扩增得到带有EcoR I/Xba I酶切位点的ZWF1目的基因片段，经限制性内切酶EcoR I/Xba I酶切，同时以相同酶切质粒pPICZ(Invitrogen)，将得到的ZWF1目的基因片段与质粒pPICZ骨架置于22℃连接2h，划转至大肠杆菌感受态JM109中，涂布于LLB平板上，经zeocin抗性筛选，成功获得重组质粒pPICZ-ZWF1。

3、重组毕赤酵母15α-羟化酶工程菌的构建

将步骤1中的重组质粒pPIC3.5K-PRH经限制性内切酶SalI线性化，电转至毕赤酵母GS115(Invitrogen)感受态中，按照常规方法培养，G418遗传霉素筛选高拷贝PRH菌株，将步骤2中重组质粒pPICZ-ZWF1经限制性内切酶Sac I线性化，电转至获得的PRH高拷贝菌株制成的感受态中，按照常规方法培养，经zeocin抗性筛选，最终获得重组毕赤酵母15α-羟化酶工程菌。图3是重组毕赤酵母构建图，图4是最终获得重组毕赤酵母15α-羟化酶工程菌基因组PCR鉴定图。

4、重组毕赤酵母15α-羟化酶工程菌株5L发酵系统转化左旋乙基甾烯二酮高投料工艺的建立

1)种子悬液培养：将重组毕赤酵母15α-羟化酶工程菌株接种在含有2mg/mLG418和800μg/mL博来霉素的YPD平板，30℃培养36h；挑取单菌落接种于含有50mLYPG液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，220r/min摇床培养24h，菌悬液为一级种子；吸取5mL上述菌悬液接种于含有100mL YPG液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，220r/min摇床培养18h，至OD₆₀₀测定为12；

2)发酵罐准备：按照2.5L初始装液量配制发酵培养基，搅拌充分后，121℃，灭菌30min，待温度降至30℃，氨水调节pH至5.0；

3)接种：取200mL种子悬液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0，DO维持20％以上；

4)菌体生长阶段：发酵温度为30℃，DO维持20％以上，当发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长阶段；

5)补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12ml微量元素母液)，初始流加速度为19.92mL/(L·h)，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后,使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。

6)诱导产酶及左旋乙基甾烯二酮转化阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12ml微量元素母液)。初始流加速率为3.61mL/(L·h)，当DO低于20％时停止流加，待DO快速上升后，重新开始流加，2h后流加速率提高至7.22mL/(L·h)，继续诱导2h后流加甲醇速率提高至10.89mL/(L·h)，同时流加左旋乙基甾烯二酮(溶于甲醇中)至终浓度8g/L，转化110～130h直至左旋乙基甾烯二酮完全转化完成。

5、TLC薄层层析检测产物

样品处理：取1mL步骤4转化完成获得的发酵液于1.5mL离心管，用200μL乙酸乙酯萃取，剧烈震荡，使其与发酵液充分混合，12000r/min离心5min分层。用内径为0.3mm的毛细吸管(长10cm)吸取约2～4cm上层乙酸乙酯层点样于硅胶层析板上。在距层析板边缘1cm处点样，样点间距0.5cm。在展开之前需要用展开剂将层析缸饱和30min。

层析：将点有样品的硅胶板放入层析缸中展开，加盖，密封，待展开剂前沿快到顶端时，取出点样板，烘干。采用紫外检测仪观察层析斑点的颜色和大小。展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5.5：4.5。

TLC薄层层析检测产物结果如图4所示。结果显示该菌株几乎完全转化左旋乙基甾烯二酮。

6、高效液相色谱分析转化产物

在50mL离心管中加入步骤4转化完成获得的发酵液30mL，再向其中加入10mL的乙酸乙酯，充分振荡萃取，12000r/min离心2min收集乙酸乙酯有机相，将剩下的菌液重复两次，合并有机相，HPLC检测，HPLC色谱图如图5所示，HPLC结果进一步表明该菌株的高转化率。

色谱条件：色谱柱为C₁₈柱(4.6mmDL×250Lmm，5μm)，乙腈-水为流动相，流动相比为80：20，流速0.8mL/min，柱温25℃，进样量10μL，采用紫外检测器，检测波长241nm。本方法中所用乙腈为色谱纯，水为去离子水经过滤超声处理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgtcc tcaccgaatt gttccatagt ccttatgtgg ttcagggggt gtgcgttgcc 60

ttgctggctg ttttcataac aagcatttgg ggcgatatag tggatgaaat cccccaccgt 120

cgtatacctt tagttggcaa aactggctgg gagttcacca acaaaaaggc aaagtcgcga 180

tttactgagt catgccgcga tctgatcgcc gaagggtttg caaagggagc cagcgctttt 240

caaatcattg gagcaacaca accgatcatt gttctgcacc cgaagtatat cgatgaaatc 300

aagagccacc cagacttgag ttttgccgat gccgtcaaaa agatgttctt ctctaaccgt 360

gttccgggct ttgagccatt ccacagtgga acggcgatga atgttaccgt cgaggttgtg 420

cgcaccaagc tgacccaagc gcttggatat ttgtcaatcc cgctttcaaa agaatcatct 480

ttgaccttga aagaagcctt gcctcccact gacgattgga ctccatacaa ctttgcgcac 540

aagattccgt atatggtggc ccgtgtctca tcattagtat tcgtaggtga gaccatctgc 600

cacaacgatg aatggatcga tgtgtcagtc aactacgccc ttgactcctt taaggccatg 660

cgcgagctac gaacatggcc atctgtcctc cgcccaattg ttcattggtt tttgccttct 720

actcaaaagc tgcgcagtca cttaaagaaa gccaacagtc tcatcagcca cgagattgac 780

agacgagcgt tgattcggga aggcaaactc ccagccgaaa acccgccaca caagcctgat 840

gcattggact ggtttcggga gactgcggag gcccagagca acttcactat tgaccaggcc 900

cgctctcagg tcggactggc cttggcagcc attcatacta cgtccaactt gatcactaat 960

gttatgtatg atctcgccgc atacccagag tatttccagc cactacgtga tgagatccaa 1020

gcggttgctg ccgaggatgg cgtactcaag aagactagct tgcttaagtt caaactgatg 1080

gatagtatca tgaaggagtc gcagagaact catccattat cattgatctc cttgaaccgc 1140

gtcactcatc agaaggttgt tctttccgac ggcaccgtgc ttcccaaagg cgcaaatgtc 1200

gctatttcta caagccctct ggaagacgat aatgtatacc ccaacgccgc cacctatgat 1260

ggctaccggt tcttgaagaa acgtcaggca ccaggaaacg agcacaaaca tcaatttgtc 1320

acaacgacca aggaacactt cgtcttcggc cacggtgtcc acgcctgccc gggtcgtttc 1380

ttcgctgcca atgaaaccaa aatcctactc cttcatctgc tgttgaagta cgactggaaa 1440

ttgcagagtg gtggacgacc gaaaaatttt agcaatggca ccgagtctat taccgacccc 1500

acggttgaac tactgttccg gtctcgtgaa cccgagattg acttgagttt cttgggagag 1560

tag 1563

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtgaag gccccgtcaa attcgaaaaa aataccgtca tatctgtctt tggtgcgtca 60

ggtgatctgg caaagaagaa gacttttccc gccttatttg ggcttttcag agaaggttac 120

cttgatccat ctaccaagat cttcggttat gcccggtcca aattgtccat ggaggaggac 180

ctgaagtccc gtgtcctacc ccacttgaaa aaacctcacg gtgaagccga tgactctaag 240

gtcgaacagt tcttcaagat ggtcagctac atttcgggaa attacgacac agatgaaggc 300

ttcgacgaat taagaacgca gatcgagaaa ttcgagaaaa gtgccaacgt cgatgtccca 360

caccgtctct tctatctggc cttgccgcca agcgtttttt tgacggtggc caagcagatc 420

aagagtcgtg tgtacgcaga gaatggcatc acccgtgtaa tcgtagagaa acctttcggc 480

cacgacctgg cctctgccag ggagctgcaa aaaaacctgg ggcccctctt taaagaagaa 540

gagttgtaca gaattgacca ttacttgggt aaagagttgg tcaagaatct tttagtcttg 600

aggttcggta accagttttt gaatgcctcg tggaatagag acaacattca aagcgttcag 660

atttcgttta aagagaggtt cggcaccgaa ggccgtggcg gctatttcga ctctataggc 720

ataatcagag acgtgatgca gaaccatctg ttacaaatca tgactctctt gactatggaa 780

agaccggtgt cttttgaccc ggaatctatt cgtgacgaaa aggttaaggt tctaaaggcc 840

gtggccccca tcgacacgga cgacgtcctc ttgggccagt acggtaaatc tgaggacggg 900

tctaagcccg cctacgtgga tgatgacact gtagacaagg actctaaatg tgtcactttt 960

gcagcaatga ctttcaacat cgaaaacgag cgttgggagg gcgtccccat catgatgcgt 1020

gccggtaagg ctttgaatga gtccaaggtg gagatcagac tgcagtacaa agcggtcgca 1080

tcgggtgtct tcaaagacat tccaaataac gaactggtca tcagagtgca gcccgatgcc 1140

gctgtgtacc taaagtttaa tgctaagacc cctggtctgt caaatgctac ccaagtcaca 1200

gatctgaatc taacttacgc aagcaggtac caagactttt ggattccaga ggcttacgag 1260

gtgttgataa gagacgccct actgggtgac cattccaact ttgtcagaga tgacgaattg 1320

gatatcagtt ggggcatatt caccccatta ctgaagcaca tagagcgtcc ggacggtcca 1380

acaccggaaa tttaccccta cggatcaaga ggtccaaagg gattgaagga atatatgcaa 1440

aaacacaagt atgttatgcc cgaaaagcac ccttacgctt ggcccgtgac taagccagaa 1500

gatacgaagg ataattag 1518

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattcatg gctgtcctca ccgaattg 28

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataagaatgc ggccgcctac tctcccaaga aac 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattcagt agtgaaggcc ccgtcaaatt c 31

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctagact aattatcctt cgtatcttgt ggc 33

Claims (7)

1.一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入毕赤酵母基因组His4位点；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入毕赤酵母基因组5’AOX1位点；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：

S1.将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；

S2.将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；

S3.将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；

所述步骤S1和S2之间没有时间顺序限制。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH在pPIC3.5K中的插入位点为EcoR I和Not I；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1在pPICZ中的插入位点为EcoR I和Xba I。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

5.权利要求1所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：

1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，200r/min，28～30℃下进行种子培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，得到种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基，于28～30℃、溶解氧含量值高于20％的条件下，进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；

3)在所述发酵体系中甘油耗尽后，以19.92mL/(L·h)的速率向发酵体系中流加微量元素甘油水溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，继续进行发酵培养至甘油再次耗尽，在甘油耗尽的条件下，菌体保持饥饿状态1h；所述微量元素甘油水溶液包括体积百分含量为45％～55％的甘油和12mL/L的微量元素水溶液；

4)在所述菌体保持饥饿状态1h后，溶解氧含量为100％，以3.61mL/(L·h)的速率向发酵体系中第一次流加微量元素甲醇溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，于28～30℃的条件下，进行第一诱导培养2h；以7.22mL/(L·h)的速率向发酵体系中第二次流加微量元素甲醇溶液2h；

5)在第二次流加微量元素甲醇溶液2h后，以10.89mL/(L·h)的速率向流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液，至发酵体系中左旋乙基甾烯二酮的浓度为8g/L，控制溶解氧含量始终高于20％，于28～30℃的条件下反应直至左旋乙基甾烯二酮完全转化；

步骤2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：85％磷酸26.7mL/L、CaSO₄ 0.93g/L、K₂SO₄ 18.2 g/L、MgSO₄ 7.27 g/L、KOH 4.13g/L、Tween80 0.6mL/L、甘油40g/L和体积百分含量为0.43％的微量元素水溶液；所述发酵培养基的pH值为5.0；

步骤4)中所述微量元素甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液；

步骤5)中所述左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液和4～5g/L的左旋乙基甾烯二酮；

所述微量元素水溶液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，NaI0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L、FeSO₄·7H₂O 65.0g/L、生物素0.2g/L和硫酸5.0mL/L。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述种子培养基为YPG液体培养基。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述种子液的初始接种量以接种后的OD₆₀₀为准；所述OD₆₀₀为0.8～1.0。

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