CN114507686B

CN114507686B - 一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建及应用

Info

Publication number: CN114507686B
Application number: CN202210142171.2A
Authority: CN
Inventors: 杨艳会; 杨大帅; 陈佳怡; 董柯炜; 吴梦杰; 谭曦; 王驰; 李瑞芳; 伊艳杰; 张长付
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114507686A

Abstract

本发明公开了一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建及应用，属于合成生物学技术领域。产地黄源红景天苷酵母工程菌，以酵母BY4741为原始菌株，表达SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示基因。以酪氨酸为底物，利用该工程菌进行发酵，可实现地黄源红景天苷的高效异源合成，且发酵产物易于分离纯化。

Description

一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建及应用

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建及应用。

背景技术

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为多年生玄参科草本植物，其块根中含有许多糖苷类物质，其中，红景天苷(salidroside)是从地黄块根鉴定的一种糖苷类化合物，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、抗代谢失调、保护神经等多种生物活性，且毒副作用小，在癌症预防，抗衰老和增强机体免疫力等方面有广泛应用，具有广阔的市场发展潜力。

目前，天然的红景天苷的主要生产方式是从药用植物体内直接提取，但天然产物含量低且差异大，植物生长周期长，类似物复杂导致产品纯化难，并且会对生物资源尤其是野生植物资源造成严重破坏。随着市场需求的日益增大，目前的植物资源供给已经难以为继。在化学合成方面，由于天然产物结构复杂，具有较多的手性中心，合成过程中容易形成无活性甚至有毒的、难以分离的旋光异构体；并且合成过程步骤繁琐，转化率低，能耗高，所用有机溶剂易造成污染，难以满足工业化需求。而植物组织细胞培养法操作较复杂、周期长，且由于生产成本过高，不易实现工业化。

微生物发酵生产植物天然产物具有生产周期短、不受时节和原料供应的限制、发酵产物比较单一、易于分离纯化等优点，容易实现大规模工业化生产。通过发掘目标化合物生物合成途径的关键基因，利用合成生物学技术，异源构建微生物菌株来生产天然产物被认为是一种最有潜力的资源获取方法。

目前的生物合成红景天苷方法尚处于基础研发阶段，合成工程中通常需要引入1种或2种外源的催化酶，成本较高，产量低；利用细菌底盘细胞，外源基因表达容易形成包涵体，影响了外源基因表达蛋白酶的生物活性，而且异源表达多个基因的蛋白较为困难。

另外，毛蕊花糖苷(acteoside)是地黄体内一种重要的糖苷类化合物，具有许多药理活性。红景天苷可作为毛蕊花糖苷合成的前体物之一，它可与羟基酪醇(hydroxytyrosol)和咖啡酰辅酶A(caffeoyl-CoA)经莽草酸酯-氧-羟基肉桂酰转移酶(shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase，HCT)和UGT进一步催化生成毛蕊花糖苷，故红景天苷的异源合成对于毛蕊花糖苷的生物合成具有重要意义。

因此，如何提供一种操作简单、产量高的红景天苷生物合成方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建方法，以酪氨酸为底物，利用该工程菌进行发酵，可实现地黄源红景天苷的高效异源合成。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种地黄源红景天苷表达载体，

包括酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块，铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块，乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块，UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块和f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块；

酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块包括组合型启动子、RgTyDC基因和终止子；RgTyDC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块包括组合型启动子、RgCuAO基因和终止子；RgCuAO基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块包括组合型启动子、RgADH基因和终止子；RgADH基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块包括组合型启动子、RgUGT基因和终止子；RgUGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块包括f1 ori、2μori、URA3基因、氨苄青霉素抗性基因和pUC ori。

本发明利用RgTyDC、RgCuAO、RgADH和RgUGT四个基因构建表达载体，底物酪氨酸可在酪氨酸脱羧酶(Tyrosine decarboxylase)下催化产生酪胺(tyramine)，酪胺再在铜胺氧化酶(copper amine oxidase)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)催化下产生酪醇(Tyrosol)，最后酪醇在UDP-葡萄糖糖基转移酶(UDP-glucose glucosyltransferase)的催化下生成红景天苷。即酵母游离型表达载体的构建，可用于在酿酒酵母细胞体内创建地黄红景天苷的生物合成途径，发酵生产红景天苷，为实现红景天苷的工业化生产提供技术支撑。

此外，上述表达载体的构建进一步为在酵母细胞中合成毛蕊花糖苷提供前体物质及其搭建毛蕊花糖苷的异源合成途径奠定基础。

优选地，用组成型启动子P_TEF启动RgTyDC基因的表达；P_TEF核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

用组成型启动子P_PGI启动RgCuAO基因的表达；P_PGI核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

用组成型启动子P_TPI1启动RgADH基因的表达；P_TPI1核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

用组成型启动子P_PHX7启动RgUGT基因的表达；P_PHX7核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选地，酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块的终止子为T_TEF，核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块的终止子为T_GAL2，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块的终止子为T_PKF1，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块的终止子为T_PGI，核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

上述地黄源红景天苷表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)将启动子、目的基因与终止子连接成表达模块，分别形成酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块、铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块、乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块和UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块；

(2)以pYES-DEST52载体为模板，克隆f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块；

(3)酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块、铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块、乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块、UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块与f1ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块利用缝克隆酶完成连接；；

(4)连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选并验证阳性克隆，提取质粒。

一种产地黄源红景天苷酵母工程菌：

以酵母BY4741为原始菌株，表达SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4基因。

一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建上述地黄源红景天苷表达载体；

(2)步骤(1)构建的表达载体转化酵母BY4741感受态，筛选阳性转化子。

上述地黄源红景天苷表达载体或上述方法或上述产地黄源红景天苷酵母工程菌在生产地黄源红景天苷中的应用。

一种生产地黄源红景天苷的方法，利用上述酵母工程菌或上述方法构建的酵母工程菌进行发酵。

优选地，发酵培养基为YPD培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH。

优选地，酪氨酸在发酵培养基中的添加浓度为0-10μg/100mL；

发酵时间为168-216h。

综上所述，本发明在酵母中首次构建了地黄天然产物的生物合成途径，为地黄其他重要活性物质的异源合成提供了成功的范例；并且为其后期在酵母中合成毛蕊花糖苷提供了前提条件。

相较于植物材料直接生产红景天苷的方法，本发明利用酿酒酵母作为底盘细胞异源合成植物源的天然产物，生产周期短、不受时节和原料供应的限制、发酵产物比较单一、易于分离纯化，容易实现大规模工业化生产。

相较于化学合成法生产红景天苷，本发明产物结构单一，易于分离；生物合成过程简单，成本低；环境污染少，容易实现工业化生产。

相较于现有的微生物法合成红景天苷，本发明直接导入了地黄体内由酪氨酸起始的一个完整的红景天苷生物合成途径。以酪氨酸为底物性质比较稳定，可以酵母体内酪氨酸为底物，直接生产红景天苷，降低生产成本；并且酪氨酸市场价格较低，加入外源酪氨酸，可提高红景天苷的产量，成本低，产量高。

附图说明

图1所示为重组表达载体pTCAU图谱；

图2所示为工程菌BY4741-pTCAU及空载菌BY4741-pYES-DEST52的HPLC检测图；

其中，A：L-酪氨酸标品HPLC检测，保留时间：2.9min；B：酿酒酵母BY4741发酵液HPLC检测；C：酿酒酵母BY4741-pTCAU胞外发酵液HPLC检测；D：酿酒酵母BY4741-pTCAU菌体胞内代谢物的HPLC检测；E：红景天苷标品HPLC检测，保留时间：10.6min。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(一)目的基因的获取

以Trizol法提取实验室种植地黄“温85-5”根系总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA做模板，按照表1所示引物，利用PCR技术，克隆红景天苷生物合成途径中关键催化酶RgTyDC，RgCuAO，RgADH和RgUGT基因，其序列见表1。

表1本发明所用引物序列

表2本发明所用地黄基因序列

(二)酵母启动子和终止子的获得

设计引物(表1)，提取酿酒酵母菌株BY4741基因组DNA，利用PCR方法，克隆4个酵母基因组中的组成型启动子(即P_TEF、P_PGI、P_TPI1、P_PHX7)和4个终止子(即TEF终止子(T_TEF)、GAL2终止子(T_GAL2)、PKF1终止子(T_PKF1)和PGI终止子(T_PGI))基因，其序列见表3。

表3启动子/终止子序列

(三)表达载体的构建

利用PCR技术，以pYES-DEST52载体为模板，克隆1个f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块；利用OE-PCR方法，获得P_TEF-RgTyDC-T_TEF、P_PGI-RgCuAO-T_GAL2、P_TPI1-RgADH-T_PKF1和P_PHX7-RgUGT-T_PGI基因表达模块；利用多片段的同源重组技术、转化质粒、PCR检测、质粒DNA提取等分子生物学技术，获得4个基因的共表达载体并命名为p-TCAU载体，为实现红景天苷合成途径中4个催化酶基因在酵母中共同表达提供完整的基因信息。

1、利用SnapGene 4.3软件构建电子载体图谱(图1)，根据载体图谱设计含22-27bp同源区段的引物，利用OE-PCR法分别将启动子、目的基因与终止子连接成表达模块，形成4个P_TEF-RgTyDC-T_TEF、P_PGI-RgCuAO-T_GAL2、P_TPI1-RgADH-T_PKF1和P_PHX7-RgUGT-T_PGI基因表达模块，长度分别为2077bp、3156bp、2075bp、2434bp。

分别将4个模块连接至克隆载体pMD-18中，并转化到大肠杆菌DH5α，提取质粒并送至上海生工测序。以测序成功后的克隆的载体质粒为模板，进行PCR扩增，克隆4个模块片段，PCR产物回收并纯化，-20℃保存。

2、以酵母表达载体pYES-DEST52为模板，以表1中pYES-DEST52-F、pYES-DEST52-R为引物，PCR克隆得f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块，其中包含f1 ori、2μori、URA3基因、氨苄青霉素抗性基因和pUC ori，长度4761bp，将其连接至克隆载体pMD-18中，并转化到大肠杆菌DH5α，提取质粒并送至上海生工测序。经上海生工克隆测序后的质粒进行PCR扩增，并将其产物回收与纯化，-20℃保存。

3、采用无缝克隆技术，将P_TEF-RgTyDC-T_TEF、P_pgi-RgCuAO-T_gal2、P_tpi1-RgADH-T_pkf1、P_hx7-RgUGT-T_pgi四个基因元件与f1 ori-2μori-URA-Amp-ori组合元件线性模块按摩尔比为1：1：1：1：1混合，利用NEBuilder无缝克隆酶完成连接反应，立即转化大肠杆菌DH5α，涂布于含50mmol·L^-1氨苄青霉素的LB培养基，37℃倒置平板培养12h。

4、挑取平板单菌落为模板，以P_TEF-F、T_PGI-R引物(序列见表1)，PCR检测得长度为9742bp，符合P_TEF-RgTyDC-T_TEF-P_PGI-RgCuAO-T_GAL2-P_TPI1-RgADH-T_PKF1-P_PHX7-RgUGT-T_PGI基因总长度。

5、利用质粒提取试剂盒获得重组质粒，经PCR检测为阳性，命名重组载体为pCAUT，-20℃保存。

(四)重组质粒酵母菌株的获得

1.质粒转化酵母：选择酿酒酵母BY4741为宿主菌，以醋酸锂法处理获得BY4741感受态；取50μL感受态，加入500ng pCAUT质粒及50ng鲑鱼精DNA混合，在500μL 50％PEG3350催化下融合；取转化混合液100μL，涂布于SD-U筛选培养基(尿嘧啶缺陷型培养基：SD-U干粉8g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L)；29℃倒置培养48h出现转化子。

2.转化子检测

选取平板转化子于200μL SD-U液体培养基，在29℃，200rpm下震荡培养12h，取2μL为模板，以P_TEF-F、T_PGI-R引物进行PCR检测，筛选阳性菌株进行后续实验。

(五)酵母发酵及其代谢物的初步检测

1.发酵：把挑取阳性的菌株转接入5mL SD-U液体培养基(SD-U干粉8g/L，葡萄糖20g/L)，在26℃，200rpm下震荡培养12h，取4mL菌液加甘油保存，命名为酿酒酵母BY4741-pTCAU；剩余1mL菌液作为发酵母液，具体操作为：取100μL发酵母液加入密封完好的100mL不含抗生素YPD液体培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH)，于29℃，200rpm下震荡培养120h，每24h拧松盖子放气一次。

2.发酵产物的提取：室温下8000rpm离心10min，收集上清液及菌体细胞分别进行红景天苷的提取。具体步骤如下：

(1)胞外发酵液(上清液)粗提：上清液于真空冷冻干燥机冻干至粉状，加10mL乙酸乙酯：丙酮＝75：25溶液，涡旋震荡5min后，在400W功率下超声10s，间隔15s，重复25次，至干粉充分萃取，于12000rpm下离心5min收集上清，于真空冷冻干燥机冻干至粉状，重复萃取2次；收集的上清液冷冻干燥后，加入2mL甲醇，涡旋震荡5min，于12000rpm离心5min收集上清；重复浓缩步骤，后加入1mL甲醇涡旋5min，于12000rpm离心5min收集上清，用0.22μm滤膜过滤后即得上清粗提液。

(2)胞内代谢物(酵母菌体)的粗提：酵母细胞加入10mL乙酸乙酯：丙酮＝75：25溶液，在400W功率下超声10s，间隔15s，重复45次至细胞破碎，12000rpm离心5min收集上清，于真空冷冻干燥机冻干至粉状，重复萃取2次后，将冷冻干燥后干粉加2mL甲醇，涡旋震荡5min，于12000rpm离心5min收集上清，加1mL甲醇抽提，涡旋震荡5min，12000rpm，5min离心收集上清，用0.22μm滤膜过滤后即得胞内代谢物粗提液。

3.红景天苷HPLC检测：

(a)使用岛津高效液相色谱系统测定。HPLC条件：色谱柱：ZORBAXSB-C184.6×250nmcolumn；流动相A，0.1％磷酸水溶液；流动相B，乙腈；流动相比例，A：B＝30％：70％；保留时间：10min；流速：0.6mL·min^-1；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：285nm。

(b)取0.02mg红景天苷溶解于甲醇中得浓度为0.02mg·mL^-1红景天苷标准液，依次2倍稀释做7个梯度，绘制红景天苷HPLC标准曲线。

(c)利用HPLC进行样品检测分析，胞外发酵液及菌体胞内均产生了红景天苷(图2)，发酵液中红景天苷产量为16.7mg·L^-1，胞内红景天苷产量为4.0mg·L^-1。表明胞外发酵液中红景天苷的产量高，以下发酵条件的优化用发酵液样品进行分析。

(六)酵母产红景天苷发酵条件的优化及产量分析：

在试验(五)基础上，通过优化外源酪氨酸底物的量与发酵的时间，获得pTCAU酵母工程菌生产红景天苷的最佳条件。

在29℃，200rpm条件下，设置不同底物浓度与不同发酵时间的组合实验(见表4)，分别转接活化后的发酵母液1mL于100mLYPD培养基，培养大约12h(OD600＝0.6)，底物浓度组：设置添加5种浓度梯度(0μg、2μg、4μg、8μg和10μg)的酪氨酸和6个发酵时间(96h、120h、144h、168h、192h和216h)共30个实验组合进行发酵。其发酵液经粗提后进行HPLC分析。

如表4所示，结果表明：当在不加酪氨酸底物的条件(即以葡萄糖为底物)，发酵时间196h时，红景天苷产量达最高值(16.6mg·L^-1)；当添加酪氨酸底物时，随着底物浓度的增加，红景天苷含量逐渐增加，当10μg酪氨酸的酵母发酵液红景天苷产量最大；且随着发酵时间的增加，红景天苷产量出现先增加后稳定的趋势，发酵168h产物量达到最高值，综合分析当添加酪氨酸10μg、发酵时间168h时，发酵液红景天苷产量达最大值(947.7mg·L^-1)。

表4底物浓度、发酵时间优化的实验设计及红景天苷产量的检测

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> Rehmannia glutinosa Libosch

<400> 1

atggagggtg atttgaagcc aatggacgca gagcaattga gggagtacgc ccacaagatg 60

gtggacttca ttgctgatta ttacaagaac attgagaact tccctgttct tagccaagtt 120

cagcctggat atctgcgtga gcttttacca gattcggcac ctgctaaacc cgaatcgttg 180

caagatgttt tggatgatgt tcaggcaaaa atattaccag gagtaaccca ttggcaaagc 240

ccggattatt ttgcatattt tccatcgaat agcagtgttg ctggattttt gggggaaatg 300

cttagtgctg gcataaacat ggtgggattt agttggataa cgtctcctgc tgccacagaa 360

ctcgaaatga tagttttgga ttggcttgct aaggcactta agctacctga tgaattcctt 420

tcaacaggac aaggtggcgg agtaatacaa ggaactgcaa gtgaagcagt attggttgtg 480

cttttggctg ctcgtgacaa agtcctgaga agggttggga aagatgccct tggaaagctt 540

gtggcctata gttctgatca aactcattct gctctacaga aagcctgcaa gataggagga 600

attcaccctg aaaattgtcg agtgctgaaa acagattctt caactgaata tgctctttct 660

cctgaatcac tcagcgaagc aatctcacgg gacatagcct ctggtttaat tcccttcttc 720

ttgtgtgcta ctgttggtac tacatcatca acggctgttg atcctctttc tgctctgggg 780

aagatttcaa gtagtaatgg actgtggttt catattgatg ctgcttatgc tggaagtgct 840

tgtatatgtc cagaatttcg ccactatatt gatggcgtcg aagaagccaa ctcatttaac 900

atgaatgcac acaagtggtt tttgacgaac tttgattgtt cggctctttg ggtgaaggag 960

agaaatgcac tcatcgaatc attgtcaacg aatcctgagt ttcttaaaaa caaagcgtcc 1020

caaggtaaca tggttgtaga ttataaagac tggcaaatcc cattaggacg caggttcaga 1080

tctctgaaac tgtggatggt gttgagactt tatgggctgg aaaacctgca ggcttacata 1140

agaaaccaca ttgaattggc taagaaattt gaagaacttg tgaagctaga cccaagattt 1200

gaggttgctg cccctcggaa tttttcttta gtttgctttc gcctgttgcc tacggagaac 1260

aatgtagagt gtgctaacag attgaaccgc gagttgctgg atgctgtaaa ctcaactggg 1320

aaactcttca tttctcacac agtcctgtca aacaagtatg tgctacgatt tgcagtgggg 1380

gcgccactga ctgaagagag gcatgtgttt gcagcttgga agactttaca agaaaaggct 1440

tctgctttac taaggaaatc atagagtaag tctgttgtaa ttctttatta caagtgcaaa 1500

gatgttgttc agtctttgcc aatattcata tgctgc 1536

<210> 2

<211> 2361

<212> DNA

<213> Rehmannia glutinosa Libosch

<400> 2

atggccacaa ctgcgaaaaa ggcgacgctt cctgctccga agacggctgc ttgttgcgct 60

cccgcggccg ccggcgattc agccgccgta gtccgccgtg agtctgcatc tgccaccgct 120

gctgcagact ggaaggtttc acccgtcgcc gcggaagatc agcagagcaa gaaagctgct 180

gccgttgcgt ccttaattag accggagcct tcttccaatg ccaccactaa agggatccag 240

atcatgacaa gggcgcaaac gaaacatcct ttggatcctt tatctgctac tgaaatctct 300

gtggctgtgg gaacagttag agcagctgga gccacccctg aggtcagaga tagcatgaga 360

tttattgaag ttgttctgtt ggaaccagag aagaatgtgg tggcactggc agatgcttat 420

ttctttcccc cttttcaacc atcattgttg cttagaacga aaggaggacc ttcaattcct 480

agcaagctcc caccgaggag agccagacta gttgtctaca ataagaagtc caatgagact 540

agtttgtgga ttgttgagtt gacggaagta catgcaacaa cacgaagtgg acatcatcga 600

ggaaaagtca tttcctctac aattgtccct gatgttcagc caccaatgga tgctgcagaa 660

tatgccgaat gtgaagctgt tgtcaaagat taccctccat ttattgaggc aatgaagaag 720

aggggtattg atgatatgga cttagtcatg gttgatcctt ggtgtgttgg ttaccacagt 780

gaggctgatg ctcctagtcg cagacttgca aaaccactta tattttgccg gacggagagt 840

gactgcccac tggaaaatgg ttatgcgcga cccgttgaag gaatttatgt gcttgttgat 900

atgcagaata tggtggtaat tgagtttgaa gatcgtaagc ttgttccttt gccgccagct 960

gatccactga gaaattatac tcctggtgaa acaaggggag gggtagatag aagtgatgtg 1020

aaaccccttc aaattattca gcctgaaggt ccaagctttc gaatcaacgg acattatgtt 1080

gagtggcaga agtggaactt tcgcattggc ttcactccga gggagggttt ggtcatccat 1140

tctgttgcct atgttgatgg cagtcggggt aggagaccta tagcccatag gttgagtttc 1200

gtggagatgg ttgtgcccta tggggatcct aatgaacctc attacaggaa aaatgcattt 1260

gatgctgggg aagatggatt ggggaaaaat gctcattctc ttaagaaggg atgtgattgt 1320

ttgggttata taaaatactt cgatgctcat tttacaaact tcactggagg agttgaaact 1380

attgaaaact gtgtatgctt gcatgaagaa gattatggaa ttctatggaa gcatcaagac 1440

tggagaactg gcctcgctga agttcgaaga tcaaggcgtc tcactgtttc tttcatttgc 1500

actgtggcta attatgaata tggattttac tggcactttt atcaggatgg gaaaattgaa 1560

gcggaagtta aacttactgg aattcttagt ttaggggctc tgcaacctgg agaatataga 1620

aaatatggta caacaattgc accaggacta tatgccccag ttcatcaaca cttttttgtt 1680

gctcgcatgg atatgtcagt cgactgtaaa cctggagaaa tgcacaatca ggttgttgaa 1740

gtgaatgtta gaatcgaaga acctggaaag gacaatgttc acaataatgc attctatgct 1800

gaggaaactt tacttagatc tgaattagaa gccatgcgtg attgtgatcc gttatcagcc 1860

cgtcattgga ttataaggaa cactagaacc gtcaatcgga gtggacaact gacaggctac 1920

aaattggtac ctggttcgaa ttgtttgccg ttggctggtc ccgaggctaa atttctgaga 1980

agagctgcct ttttgaagca taatctatgg gttacacaat atgcacgcgg ggaggatttt 2040

cctggaggag agtttcccaa tcagaatcca cgtgctgggg aagggttggt ttcatgggtg 2100

aaacagaatc gccctctcga agaaaatgac atagttctct ggtatgtttt tggcattaca 2160

catgttcctc gactggaaga ctggcctgtt atgcccgttg aacacatagg gtttgtgctt 2220

cagccgcatg gattcttcaa ttgttctcct gctgttgatg ttccgccgag tacttgcgac 2280

atggatgcaa aagagaatga tgtgaaagag aatggggtcg ccaagccgag ttcgtctggt 2340

ctaatagcaa agctctgaag g 2361

<210> 3

<211> 1153

<212> DNA

<213> Rehmannia glutinosa Libosch

<400> 3

gctaatacaa gatgtcaagc actgctggtc aagtcatcaa atgcaaagct gctgttgcat 60

gggaagccgg gaagccactg gtgattgaag aggtggaggt ggcgccgccg cagaaaatgg 120

aggtccgatt gaagattctt ttcacctcac tttgccacac tgatgtttac ttctgggaag 180

ctaaggctca agattctgtc tttcctcgaa ttctcggaca tgaagcagca gggattgtgg 240

agagcattgg agagggtgtg acggaactcg ccccgggcga tcatgtactt cctgtattca 300

caggggaatg tggagactgt gctcattgca aatccgaaga aagcaatatg tgtagccttc 360

tgaggatcaa cactgatagg ggagttatga ttaacgacaa aaaaccgaga ttttcgatca 420

acggaaagcc gatttaccat tttgttggga catccacatt tagtgaatac actgtggttc 480

atgctggttg tgttgccaaa atcaatcctc ttgctccttt ggataaagtt tgtgtactaa 540

gctgcgggat ttctacaggc cttggagcta cattgaatgt tgccaaaccg aagaagggtt 600

cgtcggttgc tattttcgga cttggagctg tgggacttgc ggctgcagaa ggagccagat 660

tggctggtgc ttcaagagta attggtgtgg acttgaatcc tagcagattt gaagaagcaa 720

agagatttgg tgtgactgaa tttgtgaacc caaaagacca taacaagcca gttcaagagg 780

tcatagctga gatgactgat ggaggagtcg accgtagcgt tgagtgtacc ggaaacgttg 840

acgccatgat ctctgcattt gaatgtgttc atgatggatg gggtgttgct gttcttgttg 900

gtgtgcctca taaagatgcc atcttcaaga ctcctccaat gaacttcttg aatgagagga 960

ctttaaaggg tactttcttt gggaactata aaccgcgctc tgatcttcca tcggttgttg 1020

aaatgtacat gaacaaggag cttgaagtgg agaagtttat tactcatgaa gtgccatttg 1080

ctgagattaa caaggccttt gagctgatgc tgaaaggtga aggccttcgt tgtatcatcc 1140

gaatggagtg aag 1153

<210> 4

<211> 1609

<212> DNA

<213> Rehmannia glutinosa Libosch

<400> 4

gctcactcag caataaacag gggcaaaaaa taaaaagaaa agaaaacacc tccagaatgg 60

caatccatga aaaacaacct cactttgttc tttttccttt catggcccaa ggccatacga 120

ttcccatagt agacattgca agattgctag ccaaacgagg cgtaaccgtc acgcttttag 180

tcactcccta taatcataac agattcaaaa cggttatcga tcgtgcaatc gcctctggac 240

tgaacattca tatttcccac ctcaaattat ccactgctga actcggcctg ccagaaggat 300

gcgagaattt cgatatgctc gcttcgctcg acgaagcatt aaagtttttc aaagccacct 360

ccatgttaga acagcaggtc gaagaaattc tccaaaatct gaaaccctcg ccgagctgct 420

taatttccga tatgtgttat ccatggacga cgagtgtttc cgtcaaattg caaatcccta 480

gactcgtgtt tcacggcacg agttgttttt ccctgatttg tatgcacatg gtagggattt 540

caaaggattt cgaagctata gcttccgata cagagtattt tgtggtgcct gatttgcctg 600

acagaattga aatcacaaaa gctcaaatca taggcacaag tcaaatccct cacgattggg 660

ttgaaattcg tgaacagatg cgtgatgctg aaatggaagc tttcggaaca gtggcgaaca 720

ctttcgaaga gctggaacct gaatacgtca aacaatacgc gaaagtgaag gggaaaaaag 780

tatggtgtat cggtccagtt tcgctctgca acgaaaatga gctagataaa gctgaaagag 840

gtaacaaggc ttccattgat gaacacgaat gcttgaaatg gctcgagtcg caggaatcga 900

gctctgttat ttacgtttgc ctcggaagct tatcgcgtct agcggcttca cagcttatag 960

agcttggctt ggggttagaa gcttcgaatc gccctttcgt gtgggttatc agaaacgctt 1020

cagacgattt caaaaaatgg ctagcggagg aaaattttga ggagaggatt aatggcaggg 1080

gcattttggt ccacggttgg gccccacaag tgctgatact ttcccatccg tctgtgggag 1140

gctttttgac acactgtggg tggaattcgt cgctggaagg gataacggcc ggtgtgccta 1200

tgctgacgtg gccggttttc gcggaccagt tttgcaatga gaagtttgtt gtgaatgtga 1260

tcaggacagg aataagagtg ggagttgaag tgcctgttat ttttggggag gaagaaaatg 1320

tgggagttca ggttaagagt gatgatatta agaaggttat tgatgagttg atggatggtg 1380

gagaagaagg ggaagagagg agagagagag ctcgaaagct cggggaaatg gcgaaaagtg 1440

caccggagga aggtggttcg tcgtacctta acatgacgca gcttatacaa gacatcgtca 1500

attatggaaa caaatttgga aatgatgcga agttggatga tgaaaattgt tctaaaattg 1560

taatccagta aaagatatag cagttttatg ttcctcttat gttattggc 1609

<210> 5

<211> 343

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 5

acatggaggc ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat 60

gtgactgtcg cccgtacatt tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac 120

attttgatgg ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc 180

agggaaacgc tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa 240

atataaaagg ttaggatttg ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct 300

tgctaggata cagttctcac atcacatccg aacataaaca acc 343

<210> 6

<211> 198

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6

actgacaata aaaagattct tgttttcaag aacttgtcat ttgtatagtt tttttatatt 60

gtagttgttc tattttaatc aaatgttagc gtgatttata ttttttttcg cctcgacatc 120

atctgcccag atgcgaagtt aagtgcgcag aaagtaatat catgcgtcaa tcgtatgtga 180

atgctggtcg ctatactg 198

<210> 7

<211> 450

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 7

cgttctgtca ccgtcagaaa aatatgtcaa tgaggcaaga accgggatgg taacaaaaat 60

cacgatctgg gtgggtgtgg gtgtattgga ttataggaag ccacgcgctc aacctggaat 120

tacaggaagc tggtaatttt ttgggtttgc aatcatcacc atctgcacgt tgttataatg 180

tcccgtgtct atatatatcc attgacggta ttctattttt ttgctattga aatgagcgtt 240

ttttgttact acaattggtt ttacagacgg aattttccct atttgtttcg tcccattttt 300

ccttttctca ttgttctcat atcttaaaaa ggtcctttct tcataatcaa tgctttcttt 360

tacttaatat tttacttgca ttcagtgaat tttaatacat attcctctag tcttgcaaaa 420

tcgatttaga atcaagatac cagcctaaaa 450

<210> 8

<211> 345

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 8

tgcgtttgaa gtgagacgct ccatcatctc tcttaatttt tcatgactga cgttttttct 60

tcattttaat tatcatagta tttgtttgaa aaaaaaaaaa aaaaatttcc cttatcaatg 120

atatccttac gattatataa attccttacc taaacctatt atttgtgtac atatatcaga 180

gtattattac atatataacc tttttctcta aaacaggaaa aaaaaaagaa aacgataaca 240

tgctctgcca tcctttgttc accgagcaaa attaaaaacg caaaatgaat tgtccctatg 300

aaattattaa aggaccacat caccagactt atctctgggg ggtcc 345

<210> 9

<211> 586

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 9

tagtgtttaa agattacgga tatttaactt acttagaata atgccatttt tttgagttat 60

aataatccta cgttagtgtg agcgggattt aaactgtgag gaccttaata cattcagaca 120

cttctgcggt atcaccctac ttattccctt cgagattata tctaggaacc catcaggttg 180

gtggaagatt acccgttcta agacttttca gcttcctcta ttgatgttac acctggacac 240

cccttttctg gcatccagtt tttaatcttc agtggcatgt gagattctcc gaaattaatt 300

aaagcaatca cacaattctc tcggatacca cctcggttga aactgacagg tggtttgtta 360

cgcatgctaa tgcaaaggag cctatatacc tttggctcgg ctgctgtaac agggaatata 420

aagggcagca taatttagga gtttagtgaa cttgcaacat ttactatttt cccttcttac 480

gtaaatattt ttctttttaa ttctaaatca atctttttca attttttgtt tgtattcttt 540

tcttgcttaa atctataact acaaaaaaca catacataaa ctaaaa 586

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 10

atgattgcaa tgaaaagttt aagttaagca aaaggaggta aaaatggcat gcactttaat 60

ttttatacaa tcgttttttt gtcataagac ttatttatgt atctgttgtt tttctttttc 120

tatcctctat ttttgtctat ttgtctttgt tttactcttt ttcattatta tttctttata 180

taatttttgt acgatatgat acacataaca atgagcaatg aacatatttc taatcctaac 240

cattagatat acttttcaac tgaggaataa tggcgccttg attaaactaa gctatggaat 300

ttgcattatt caagttttag ggtgtgctta atctgc 336

<210> 11

<211> 390

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 11

tcgtaggaac aatttcgggc ccctgcgtgt tcttctgagg ttcatctttt acatttgctt 60

ctgctggata attttcagag gcaacaagga aaaattagat ggcaaaaagt cgtctttcaa 120

ggaaaaatcc ccaccatctt tcgagatccc ctgtaactta ttggcaactg aaagaatgaa 180

aaggaggaaa atacaaaata tactagaact gaaaaaaaaa aagtataaat agagacgata 240

tatgccaata cttcacaatg ttcgaatcta ttcttcattt gcagctattg taaaataata 300

aaacatcaag aacaaacaag ctcaacttgt cttttctaag aacaaagaat aaacacaaaa 360

acaaaaagtt tttttaattt taatcaaaaa 390

<210> 12

<211> 435

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 12

acaaatcgct cttaaatata tacctaaaga acattaaagc tatattataa gcaaagatac 60

gtaaattttg cttatattat tatacacata tcatatttct atatttttaa gatttggtta 120

tataatgtac gtaatgcaaa ggaaataaat tttatacatt attgaacagc gtccaagtaa 180

ctacattatg tgcactaata gtttagcgtc gtgaagactt tattgtgtcg cgaaaagtaa 240

aaattttaaa aattagagca ccttgaactt gcgaaaaagg ttctcatcaa ctgtttaaaa 300

ggaggatatc aggtcctatt tctgacaaac aatatacaaa tttagtttca aagatgaatc 360

agtgcgcgaa ggacataact catgaagcct ccagtatacc catcgatttg caagaaagat 420

actcgcactg gaaga 435

Claims

1.一种地黄源红景天苷表达载体，其特征在于，

所述表达载体包括酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块，铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块，乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块，UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块和f1 ori-2µori-URA-Amp-ori组合元件线性模块；

所述酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块包括组成型启动子、RgTyDC基因和终止子；RgTyDC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块包括组成型启动子、RgCuAO基因和终止子；RgCuAO基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块包括组成型启动子、RgADH基因和终止子；RgADH基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块包括组成型启动子、RgUGT基因和终止子；RgUGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述f1 ori-2µori-URA-Amp-ori组合元件线性模块包括f1ori、2µ ori、URA3基因、氨苄青霉素抗性基因和pUC ori。

2.根据权利要求1所述的一种地黄源红景天苷表达载体，其特征在于，

用组成型启动子P_TEF启动RgTyDC基因的表达；P_TEF核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

3.根据权利要求1所述的一种地黄源红景天苷表达载体，其特征在于，

所述酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块的终止子为T_TEF，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块的终止子为T_GAL2，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块的终止子为T_PKF1，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块的终止子为T_PGI，核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

4.权利要求1-3任一项所述的一种地黄源红景天苷表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将启动子、目的基因与终止子连接成表达模块，分别形成所述酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块、所述铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块、所述乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块和所述UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块；

（2）以pYES-DEST52载体为模板，克隆f1 ori-2µ ori-URA-Amp-ori组合元件线性模块；

（3）所述酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC表达模块、所述铜胺氧化酶基因RgCuAO表达模块、所述乙醇脱氢酶基因RgADH表达模块、所述UDP-葡萄糖糖基转移酶基因RgUGT表达模块与所述f1 ori-2µori-URA-Amp-ori组合元件线性模块利用缝克隆酶完成连接；

（4）连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选并验证阳性克隆，提取质粒。

5.一种产地黄源红景天苷酵母工程菌，其特征在于，

以酵母BY4741为原始菌株，表达SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示基因。

6.一种产地黄源红景天苷酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建权利要求1-3任一项所述的地黄源红景天苷表达载体；

（2）步骤（1）构建的表达载体转化酵母BY4741感受态，筛选阳性转化子。

7.权利要求1-3任一项所述的地黄源红景天苷表达载体或权利要求4所述方法或权利要求5所述产地黄源红景天苷酵母工程菌或权利要求6所述方法在生产地黄源红景天苷中的应用。

8.一种生产地黄源红景天苷的方法，其特征在于，

利用权利要求5所述酵母工程菌或权利要求6所述方法构建的酵母工程菌进行发酵。

9.根据权利要求8所述一种生产地黄源红景天苷的方法，其特征在于，

发酵培养基为YPD培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH。

10.根据权利要求9所述一种生产地黄源红景天苷的方法，其特征在于，

酪氨酸在发酵培养基中的添加浓度为0-10μg/100mL；

发酵时间为168-216h。