CN105199976B - 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105199976B
CN105199976B CN201510747241.7A CN201510747241A CN105199976B CN 105199976 B CN105199976 B CN 105199976B CN 201510747241 A CN201510747241 A CN 201510747241A CN 105199976 B CN105199976 B CN 105199976B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
xylose
saccharomyces cerevisiae
gene
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510747241.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105199976A (zh
Inventor
鲍晓明
沈煜
李洪兴
侯进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201510747241.7A priority Critical patent/CN105199976B/zh
Publication of CN105199976A publication Critical patent/CN105199976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105199976B publication Critical patent/CN105199976B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11331。本发明还公开了所述重组酿酒酵母菌株在以葡萄糖和木糖为碳源的混合糖培养基或在木质纤维素水解液中发酵生产乙醇的应用。实验证实，本发明的重组酿酒酵母菌株LF1具有较强的葡萄糖木糖共发酵能力，在发酵12小时，葡萄糖完全耗尽，同时有约77.6％(33.24g L‑1)的木糖同时被利用，预示所述菌株LF1已基本具备利用木质纤维素原料发酵生产燃料乙醇的实际产业化潜力。

Description

一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
当前，开发利用可再生能源已成为世界各国保障能源安全、加强环境保护、应对气候变化的重要措施。生物燃料乙醇，由于其独特的车用属性，是公认的很有发展前景的可再生生物能源之一。由于以玉米、小麦、木薯、红薯等粮食及非粮淀粉为原料的第1代、1.5代燃料乙醇的生产不可避免地存在“与人争粮”、“与粮争地”的问题，均不能得到大规模发展，因此以储量丰富且廉价的可再生木质纤维素生物质为原料进行第二代燃料乙醇的生产被认为是燃料乙醇可持续发展的必然选择。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株，也是二代燃料乙醇生产的首选发酵微生物。然而，其真正用于二代燃料乙醇的生产需要解决两方面的难题：首先是木糖代谢问题，木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖，对其有效的代谢和发酵可以显著降低二代燃料乙醇的生产成本从而提高其经济竞争力，然而，由于缺乏木糖代谢相关基因，天然酿酒酵母并不能很好的代谢木糖；其二是抑制物问题，木质纤维素原料在预处理及酶解过程中，会产生大量对微生物生长及发酵有抑制作用的化合物，故增加酿酒酵母自身对这些抑制物的耐受性可以提高发酵过程中乙醇的生成速率。因此，开发一株能共发酵葡萄糖和木糖同时也具有较高抑制物耐受性的酿酒酵母是目前重点研究的课题，共发酵葡萄糖和木糖的酿酒酵母菌株也是第二代燃料乙醇经济有效生产的必要条件。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用。
本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No.11331。
上述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株构建的主要技术思路是：将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到酿酒酵母菌株BSIF染色体的PHO13基因座位；进而将含有非氧化磷酸戊糖途径四个基因串联表达框的两个相应DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体的GRE3基因座位的一部分；进而将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体上的逆转录转座子Ty1上的δ-sequence区域；进而用含有TEF1启动子的DNA序列转化上述操作获得的菌株，将该菌株染色体中XKS1基因的启动子替换为TEF1启动子；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行长期驯化培养；进而将上述操作获得的菌株在预处理玉米秸秆沥出液中进行长期驯化培养；进而用含有木糖专一性转运蛋白基因Mgt05196(N360F)表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株GRE3基因座位剩余的另一部分；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养。
具体的，上述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是：
构建质粒PXIP1和PXIP2，用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切上述质粒，得到含有异源木糖异构酶(XI,xylose isomerase)基因Ru-xylA(专利公开号为US20120225452A1)表达框的两个相应整合片段，将两个整合片段依次转化野生型二倍体酿酒酵母菌株BSIF，得到重组菌株并命名为B-XI-6，其基因型为pho13::XI；用限制性内切酶SmiI分别消化处理质粒pJPPP3和pJPPP4，得到含有非氧化磷酸戊糖途径四个基因(RPE1，RKI1，TAL1以及TKL1)串联表达框的两个相应整合片段，将两个整合片段依次转化菌株B-XI-6，得到重组菌株并命名为B-XI-6P，其基因型为pho13::XI，gre3::PPP；通过融合PCR构建整合片段RA1-KanMX-TEF1p-RA3和RA2-KanMX-TEF1p-RA3，将两个整合片段依次转化菌株B-XI-6P，得到重组菌株并命名为BSN0(其两条同源染色体上木酮糖激酶基因XKS1的启动子替换为组成型强启动子TEF1promoter)，其基因型为pho13::XI，gre3::PPP，XK；构建质粒pXIδ，用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切质粒得到含有两个串联异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的整合片段，以菌株BSN0为基础，将此片段进行三轮整合，得到菌株并命名为BSN3，其基因型为pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK；以菌株BSN3为基础，对其在木糖为唯一碳源培养基中进行长期驯化培养，筛选得到菌株并命名为XH7，其基因型为pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK，AE；以菌株XH7为基础，对其在预处理玉米秸秆沥出液中进行长期驯化培养，筛选得到菌株并命名为XHR11，其基因型为pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK，AE-PCS；构建重组质粒pUC-N360F，用限制性内切酶SwaI线性化所述质粒，所得整合片段转化菌株XHR11，得到整合异源糖转运蛋白基因N360F(专利申请公开号CN104263739A)的重组酿酒酵母菌株并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XHR11-N360F，其基因型为pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK，AE-PCS，N360F；以菌株XHR11-N360F为基础，对其在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养，筛选得到菌株并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，其基因型为pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK，AE-PCS，N360F，AE。
本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在以葡萄糖和木糖为碳源的混合糖培养基中发酵生产乙醇的应用。
本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在木质纤维素水解液中发酵生产乙醇的应用。
上述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在以混合糖(80g L-1葡萄糖、40gL-1木糖)为碳源、YEP(20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母提取物)为氮源、初始接种量为0.5g drycell weight L-1及摇瓶限氧条件下发酵，16小时即可耗尽培养基中全部葡萄糖及绝大部分木糖(95.35％)，发酵液中乙醇浓度达到58.74g L-1，同时乙醇得率达到0.472g g- 1consumed sugars，为最大理论乙醇得率的93％；在以木质纤维素为原料，5g L-1尿素为氮源、初始接种量为0.5g dry cell weight L-1及摇瓶限氧条件下发酵生产乙醇时，本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株LF1同样具有较好表现，其中在泉林水解液原料中，菌株LF1发酵20小时消耗约86.8％木糖，糖醇转化率为0.480，达到理论值的94.1％。
本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株LF1无论在没有抑制物的混合糖培养基或是含有多种抑制物的多种木质纤维素水解液中，都具有提高的木糖发酵能力。菌株LF1比文献报道的工程菌株具有更优的发酵能力，在相同发酵条件下，已报道的Diao等的研究中，最优菌株CIBTS0735需要20小时才能代谢培养基中所有的80g L-1葡萄糖和40g L-1木糖，乙醇得率为0.454g g-1consumed sugars，且其对葡萄糖和木糖的利用具有明显的时间先后顺序(Diao et al.,2013)。而本发明所述的重组酿酒酵母菌株LF1具有较强的葡萄糖木糖共发酵能力，在发酵12小时，葡萄糖完全耗尽，同时有约77.6％(33.24g L-1)的木糖同时被利用。预示本发明公开的重组酿酒酵母菌株LF1已基本具备利用木质纤维素原料发酵生产燃料乙醇的实际产业化潜力。
附图说明
图1质粒YEp-CH的构建示意图及特征图。
其中：GAL1p，GAL1启动子；CYCl t，CYCl终止子；TEF1p，TEF1启动子；TEF1t，TEF1终止子。
图2同源臂片段PHO13-B1、B2、B3在酵母两条染色体上的相对位置。
图3质粒pJFE3-XIH的构建流程图。
图4质粒pUC-KanMXH-XI-3的构建流程图。
图5质粒PXIP1和PXIP2的构建流程图。
图6质粒pJPPP3和pJPPP4特征图。
其中：TPI1p，TPI1启动子；PGK1p，PGK1启动子；FBA1p，FBA1启动子；ADH1p，ADH1启动子。
图7同源臂片段GRE3-RA1、RA2及RA3在酵母两条染色体上的相对位置。
图8同源臂片段XKS1-RA1、RA2和RA3在酵母两条染色体上的相对位置。
图9整合片段RA1-KanMX-TEF1p-RA3和RA2-KanMX-TEF1p-RA3的构建过程。
图10质粒pXIδ的构建示意图。
图11菌株BSN3在YEPX培养基中驯化过程中细胞量倍增时间(T)变化。
图12菌株XH7在预处理玉米秸秆沥出液培养基中驯化过程中细胞量倍增时间(T)变化。
图13菌株XH7及其驯化培养物在预处理玉米秸秆沥出液固体平板上生长情况对比。
其中：(A)菌株XH7在预处理玉米秸秆沥出液固体平板上的生长情况；(B)驯化培养物在预处理玉米秸秆沥出液固体平板上生长情况。
图14同源臂片段GRE3-RA4及RA3’在酵母两条染色体上的相对位置。
图15GRE3-targeting同源臂整合片段的构建流程图。
图16质粒pUC19-CLB(3x)和pUC19-CLB(3x)-pTDH3-CYC1t的构建流程图。
图17质粒pUC-N360F的构建流程图。
图18菌株LF1在混合糖培养基中的限氧摇瓶发酵。
其中：Symbols:■,glucose；◆,xylose；▲,xylitol；和●,ethanol；○,glycerol；★,acetic acid；─,OD600。
图19菌株XH7、XHR11在混合糖培养基中的限氧摇瓶发酵。
其中：
(A)菌株XH7在混合糖培养基中的限氧摇瓶发酵；
(B)菌株XHR11在混合糖培养基中的限氧摇瓶发酵。
Symbols:■,glucose；◆,xylose；▲,xylitol；和●,ethanol；○,glycerol；★,acetic acid；─,OD600。
图20菌株LF1在不同木质纤维素原料水解液中的限氧分批发酵。
其中：
(A)菌株LF1在泉林水解液原料中限氧分批发酵；
(B)菌株LF1在龙力水解液原料中限氧分批发酵；
(C)菌株LF1在天冠水解液原料中限氧分批发酵；
Symbols:■,glucose；◆,xylose；▲,xylitol；●,ethanol；○,glycerol；★,acetic acid；─,OD600。
图21菌株XHR11在不同木质纤维素原料水解液中的限氧分批发酵。
其中：
(A)菌株XHR11在泉林水解液原料中限氧分批发酵；
(B)菌株XHR11在龙力水解液原料中限氧分批发酵；
(C)菌株XHR11在天冠水解液原料中限氧分批发酵；
Symbols:■,glucose；◆,xylose；▲,xylitol；●,ethanol；○,glycerol；★,acetic acid；─,OD600。
具体实施方式
实施例1培养基、酶与试剂及相关微生物及分子生物学技术
(1)培养基
大肠杆菌(Escherichia coli)培养使用的LB培养基：10g L-1蛋白胨，5g L-1酵母提取物，10g L-1NaCl；固体培养基添加20g L-1琼脂粉；灭菌条件：115℃，30min；使用时，添加氨苄青霉素(Amp)至100μg mL-1用于筛选E.coli转化子。
酿酒酵母培养使用的YEP培养基：20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉；固体培养基添加20g L-1琼脂粉；灭菌条件：115℃，30min。使用时，添加不同浓度的葡萄糖或木糖做为碳源分别制成YEPD或YEPX培养基，或同时添加葡萄糖和木糖做为碳源制成混合糖培养基，用于菌株生长及发酵性能的检测。必要时添加400-800μg mL-1G418或200μg mL-1Hygromycin B用于相应重组酿酒酵母菌株筛选及培养。
半乳糖培养基：20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉，20g L-1半乳糖。灭菌条件：115℃，30min。
(2)酶与试剂
T4DNA连接酶(New England Biolabs(Beijing)LTD.)；Restriction Enzymes,FastDigest enzymes,GeneRuler 1kb DNA Ladder(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Antibiotic G418 sulfate (Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd.)；山梨醇脱氢酶SDH：Sorbitol Dehydrogenase(Roche Diagnostics)；潮霉素B：Hygromycin B(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉(购自OXOID公司)；葡萄糖、木糖和木糖醇(上海生工生物工程有限公司)；其它化学试剂均为国产分析纯。真菌和酵母用蛋白酶抑制剂复合物(上海生工生物工程有限公司)；
Figure GDA0001595513470000041
Cycle-Pure Kit，
Figure GDA0001595513470000042
Plasmid Mini Kit I，
Figure GDA0001595513470000043
GelExtraction kit(Omega Bio-Tek Inc.)；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(宝生物工程(大连)有限公司)；荧光定量试剂盒Realtime PCRMaster Mix(SYBR Green)(购自东洋纺上海生物科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；相应的实验操作按产品说明书进行。
Trans5αChemically Competent Cell，Trans110Chemically Competent Cell，Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell,pEASY-Blunt Simple CloningKit购于北京全式金生物技术有限公司并按说明书进行操作。
PCR使用的TransStart FastPfu DNA Ploymerase购于北京全式金生物技术有限公司，反应体系按说明书进行添加，PCR反应程序设置如下：95℃2min，1个循环；95℃20s，Tm-5℃20s，72℃2kb/min，30-35个循环；72℃5min，1个循环；4℃保温。PCR使用的EasyTaqDNA Ploymerase购于北京全式金生物技术有限公司，反应体系按说明书进行添加，PCR反应程序设置如下：94℃2-5min，1个循环；94℃30s，50-60℃30s，72℃1-2kb/min，30-35个循环；72℃5-10min，1个循环；4℃保温。
(3)引物及测序
相关引物和基因的合成及DNA的序列测定委托上海博尚生物技术有限公司或苏州金唯智生物科技有限公司进行。
(4)酵母转化
酿酒酵母转化通过醋酸锂/聚乙二醇/单链DNA共转化方法(Daniel Gietz &Woods,2002)进行转化。
实施例2质粒YEp-CH的构建
(1)普通PCR扩增DNA片段
以下片段通过PCR进行扩增：片段GAL1p-Cre-CYC1t(Cre酶基因在GAL1启动子和CYC1终止子控制下)，TEF1启动子，TEF1终止子，潮霉素B抗性基因(hygB)。
以质粒pSH47为模板，用引物1和引物2扩增片段GAL1p-Cre-CYC1t；以质粒pUG6为模板，用引物3和引物4扩增TEF1启动子；以质粒pUG6为模板，引物5和引物6扩增TEF1终止子；以质粒pUCATPH(Lu et al.,1994)为模板，用引物7和引物8扩增片段hygB。
(2)融合PCR扩增DNA片段
通过融合PCR扩增片段TEF1p-hygB-TEF1t：将步骤(1)中得到的DNA片段TEF1启动子，TEF1终止子和片段hygB同时作为PCR使用的模板，用引物3和引物6进行PCR扩增；
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用TransStart FastPfu DNAPloymerase.
(3)质粒构建(见图1)
①将NcoI酶切的片段GAL1p-Cre-CYC1t克隆到质粒YEp24的NcoI位点，得到重组质粒；
②将KpnI酶切的片段TEF1p-hygB-TEF1t克隆到步骤①中所得重组质粒的KpnI位点得到质粒YEp-CH。
质粒YEp-CH中片段GAL1p-Cre-CYC1t和片段TEF1p-hygB-TEF1t的插入方向以XbaI酶切进行确认。
实施例3通过Cre-loxP重组去除筛选标记基因
将实施例2中所得质粒Yep-CH转入含有筛选标记基因(两端带有loxP位点)的重组酵母菌株，在含有潮霉素B的YEPD平板上筛选转化子。
用含潮霉素B的液体YEPD培养基过夜培养所得转化子，之后离心收集菌体并用无菌水洗涤两次，将菌体用半乳糖培养基重悬，30℃振荡培养两小时诱导Cre重组酶表达，然后将菌液划线于YEPD平板，30℃培养两天分离单菌落，将单菌落分别点滴于无G418的YEPD平板和含G418的YEPD平板，30℃培养两天后选择无G418抗性的菌落，通过PCR验证后得到正确发生Cre-loxP重组的重组子。
将所得重组子在液体YEPD中转接培养5次，然后将菌液划线于YEPD平板30℃培养两天分离单菌落，将单菌落分别点滴于无潮霉素B的YEPD平板和含潮霉素B的YEPD平板，30℃培养两天后选择无潮霉素B抗性的菌落为丢失质粒YEp-CH的菌落。
实施例4PHO13位点多拷贝整合木糖异构酶基因Ru-xylA
(1)PCR扩增DNA片段
以下片段通过PCR进行扩增：本实验室具有自主知识产权的来源于牛瘤胃液宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA片段(GenBank JF496707)(Bao et al.,2012)；两端带有loxP位点的G418抗性筛选标记片段loxP-KanMX-loxP；木糖异构酶基因表达框片段TEF1p-Ru-xylA-PGK1t；PHO13基因同源臂片段PHO13-B1、PHO13-B2和PHO13-B3；
以质粒pJX7(Hou et al.,2014)为模板，使用引物xylAs/xylAa扩增本实验室具有自主知识产权的来源于牛瘤胃液宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA(GenBank JF496707，专利公开号为US20120225452A1)，同时在Ru-xylA结构基因两端引入酶切位点BglII和NsiI；以质粒pUG6为模板，使用引物pXIPkans/pXIPkana扩增得到loxP-KanMX-loxP片段，并在片段上下游分别引入EcoRI/SbfI/BamHI酶切位点和BclI/SphI酶切位点；以质粒pJFE3-XIH为模板，使用引物pXIPxylAs/pXIPxylAa扩增得到木糖异构酶基因表达框片段Ru-xylAcassette，并在片段上下游分别引入SbfI/BamHI酶切位点和BglII酶切位点；以菌株BSIF基因组为模板，分别以引物RAPHO131s/RAPHO131a、RAPHO132s/RAPHO132a和RAPHO133s/RAPHO133a经PCR扩增得到PHO13基因同源臂片段PHO13-B1、PHO13-B2和PHO13-B3，同时在各自的上下游分别引入EcoRI/BamHI、BclI/SphI和BclI/SphI酶切位点。三条同源臂片段在酿酒酵母两条染色体上的相对位置如图2所示。
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用TransStart FastPfu DNAPloymerase.
(2)质粒的构建
①将BglII/NsiI酶切纯化后的Ru-xylA基因片段克隆到质粒pJFE3的BamHI/SbfI位点，得到重组质粒pJFE3-XIH，并将质粒TEF1启动子和PGK1终止子之间的限制性酶切位点BamHI和SbfI消除，方便后续操作(见图3)；
②将EcoRI/SphI酶切纯化后的loxP-KanMX-loxP片段克隆到质粒pUC19的EcoRI/SphI位点，得到重组质粒pUC-KanMXH(见图4)；
③将SbfI/BglII酶切纯化后的TEF1p-Ru-xylA-PGK1t片段克隆到质粒pUC-KanMXH的SbfI/BamHI位点，得到重组质粒pUC-KanMXH-XI-1，同时消除质粒原本带有的BamHI酶切位点(见图4)；
④将SbfI/BglII酶切纯化后的TEF1p-Ru-xylA-PGK1t片段克隆到质粒pUC-KanMXH-XI-1的SbfI/BamHI位点，得到重组质粒pUC-KanMXH-XI-2，同时消除质粒原本带有的BamHI酶切位点(见图4)；
⑤将SbfI/BglII酶切纯化后的TEF1p-Ru-xylA-PGK1t片段克隆到质粒pUC-KanMXH-XI-2的SbfI/BamHI位点，同时消除质粒原本带有的BamHI酶切位点，得到重组质粒pUC-KanMXH-XI-3，其中含有三个串联的木糖异构酶表达框及两端带有loxP位点的G418抗性筛选标记基因表达框KanMX(见图4)；
⑥将EcoRI/BamHI酶切纯化后的PHO13基因同源臂片段PHO13-B1克隆到质粒pUC-KanMXH-XI-3的EcoRI/BamHI位点，得到重组质粒P-K-XI-3-PHO13-B1(见图5)；
⑦将BclI/SphI酶切纯化后的PHO13基因同源臂片段PHO13-B3克隆到质粒P-K-XI-3-PHO13-B1的BclI/SphI位点，得到重组质粒PXIP1(见图5)；
⑧将BclI/SphI酶切纯化后的PHO13基因同源臂片段PHO13-B2克隆到质粒P-K-XI-3-PHO13-B1的BclI/SphI位点，得到重组质粒PXIP2(见图5)；
(3)PHO13位点多拷贝整合木糖异构酶基因Ru-xylA
EcoRI/SphI酶切质粒PXIP1后纯化回收8519bp目的片段，将此片段转化酿酒酵母菌株BSIF，预培养后涂布于含有400μg mL-1G418的YEPD固体平板上，培养三天后挑选菌落并培养后提取基因组，使用引物RAPHO131s/RAPHO133a/pXIPkans进行PCR验证，正确转化子扩增出494bp和1745bp两条带，出发菌仅扩增出494bp单条带。
所述酿酒酵母菌株BSIF，为经过综合评价后选择的分离自泰国热带水果的二倍体野生型酿酒酵母菌株，在所有评价的菌株中，BSIF具有最高的葡萄糖发酵乙醇得率(限氧摇瓶发酵中，乙醇得率为0.451g g-1消耗葡萄糖)；对多种单一抑制因素(高温、高渗透压、氧化性胁迫等)及玉米秸秆预处理液具有较高耐受性；同时具有较好的本底代谢木糖的能力，因此，选用菌株BSIF作为本发明工作的出发菌株(Li et al.,2015)。
按照实施例3进行操作，去除上述正确转化子基因组内的G418筛选标记，并使用引物RAPHO131s/RAPHO133a/pXIPkans进行PCR验证，得到抗生素筛选标记KanMX去除的菌株，正确转化子扩增出494bp和235bp两条带。如实施例3所述，上述正确转化子在无选择性压力的YEPD液体培养基中转接5次后涂布平板挑选去除质粒Yep-CH的菌落，最终得到的酿酒酵母菌株B-XI-3，其一条染色体的PHO13-B1和PHO13-B3(如图2所示)之间序列替换为三个串联的木糖异构酶基因表达框TEF1p-Ru-xylA-PGK1t。
EcoRI/SphI酶切质粒PXIP2后纯化回收8499bp目的片段，将此片段转化上述重组酿酒酵母菌株B-XI-3，经PCR验证后挑取正确转化子。随后如上步骤所述，去除筛选标记KanMX及质粒Yep-CH，最终得到菌株B-XI-6(pho13::XI)，其两条染色体的PHO13-B1/PHO13-B3和PHO13-B1/PHO13-B2(如图2所示)之间序列均被替换为三个串联的木糖异构酶基因表达框TEF1p-Ru-xylA-PGK1t。
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR验证使用EasyTaq DNA Ploymerase.
实施例5GRE3位点超表达非氧化磷酸戊糖途径相关基因
超表达非氧化磷酸戊糖途径增强木糖代谢下游途径使用质粒pJPPP3和pJPPP4(Peng et al.,2012)，质粒物理图谱如图6所示，其中含有L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因RPE1表达框，核糖-5-磷酸异构酶基因RKI1表达框，转醛酶基因TAL1以及转酮酶基因TKL1表达框。
①限制性内切酶SmiI消化处理质粒pJPPP3，回收10620bp目的片段，片段中含有GRE3基因同源臂片段GRE3-RA1和GRE3-RA2，同源臂片段在酿酒酵母染色体上的相对位置如图7所示。此片段用于转化实施例4所得重组酿酒酵母菌株B-XI-6。PCR验证后挑取正确转化子并按照实施例3步骤去除筛选标记KanMX及质粒Yep-CH后的到重组菌株，其一条同源染色体的GRE3-RA1和GRE3-RA2之间序列被替换为非氧化磷酸戊糖途径的四个基因串联表达框。
②限制性内切酶SmiI消化处理质粒pJPPP4，回收10610bp目的片段，片段中含有GRE3基因同源臂片段GRE3-RA1和GRE3-RA3，同源臂片段在酿酒酵母染色体上的相对位置如图7所示。此片段用于转化步骤①中所得重组酿酒酵母菌株。按照实施例3步骤去除筛选标记KanMX及质粒Yep-CH后的到重组菌株B-XI-6P(pho13::XI,gre3::PPP)，其两条染色体的GRE3-RA1/GRE3-RA2和GRE3-RA1/GRE3-RA3之间序列分别被替换为非氧化磷酸戊糖途径的四个基因串联表达框同时使基因GRE3失去功能。
实施例6通过启动子替换适度超表达酵母自身木酮糖激酶基因XKS1的启动子
(1)PCR扩增启动子置换片段
启动子替换所需整合片段为RA1-KanMX-TEF1p-RA3和RA2-KanMX-TEF1p-RA3，整合片段的两端分别含有木酮糖激酶基因XKS1-targeting同源臂片段XKS1-RA1/XKS1-RA3和XKS1-RA2/XKS1-RA3。三条XKS1-targeting同源臂片段在酿酒酵母两条染色体上的相对位置如图8所示。整合片段的构建流程如图9所示，具体步骤如下所述：
①以质粒pUG6为模板，使用引物XKkans1/XKkana经PCR扩增得到上游带有40bpXKS1-targeting同源臂RA1的loxP-KanMX-loxP片段XKS1-RA1-KanMX；
②以质粒pUG6为模板，使用引物XKkans2/XKkana经PCR扩增得到上游带有40bpXKS1-targeting同源臂RA2的loxP-KanMX-loxP片段XKS1-RA2-KanMX；
③以菌株BSIF基因组为模板，以引物XKTEFs/XKTEFa经PCR扩增得到下游带有39bpXKS1-targeting同源臂RA3的TEF1启动子片段TEF1p-XKS1-RA3；
④将步骤①中的DNA片段XKS1-RA1-KanMX和步骤③中的DNA片段TEF1p-XKS1-RA3同时作为模板，用引物XKkans1/XKTEFa进行融合PCR扩增，得到整合片段RA1-KanMX-TEF1p-RA3；
⑤将步骤②中的DNA片段XKS-RA2-KanMX和步骤③中的DNA片段TEF1p-XKS1-RA3同时作为模板，用引物XKkans2/XKTEFa进行融合PCR扩增，得到整合片段RA2-KanMX-TEF1p-RA3；
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用TransStart FastPfu DNAPloymerase.
(2)启动子替换适度超表达酵母自身木酮糖激酶基因XKS1启动子
①利用整合片段RA1-KanMX-TEF1p-RA3转化实施例5所得重组酿酒酵母菌株B-XI-6P(pho13::XI,gre3::PPP)，PCR验证后挑取正确转化子并按照实施例3步骤去除筛选标记KanMX及质粒Yep-CH后得到重组菌株，其一条同源染色体的XKS1-RA1/XKS1-RA3之间序列(见图8)被替换为组成型强启动子TEF1promoter。
②利用整合片段RA2-KanMX-TEF1p-RA3转化步骤①所得重组酿酒酵母菌株，PCR验证后挑取正确转化子并按照实施例3步骤去除筛选标记KanMX及质粒Yep-CH后的到重组菌株BSN0(pho13::XI,gre3::PPP,XK)，其两条染色体的XKS1-RA1/XKS1-RA3和XKS1-RA2/XKS1-RA3之间序列(见图8)分别被替换为组成型强启动子TEF1promoter。
实施例7δ-sequence位点多拷贝整合木糖异构酶基因Ru-xylA
(1)PCR扩增DNA片段
以菌株BSIF基因组为模板，以引物RAδ1s和RAδ1a扩增得到δ-sequence同源臂片段δ1，同时在其上下游引入EcoRI/BamHI酶切位点；
以菌株BSIF基因组为模板，以引物RAδ2s和RAδ2a扩增得到δ-sequence同源臂片段δ2，同时在其上下游引入ApaI/SphI酶切位点；
以质粒pUG6为模板，使用引物kans和kana扩增得到loxP-KanMX-loxP片段，并在片段上下游分别引入SalI和ApaI/SphI酶切位点。
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用TransStart FastPfu DNAPloymerase.
(2)质粒的构建
δ-sequence位点多拷贝整合木糖异构酶基因Ru-xylA所需质粒为pXIδ，其构建流程如图10所示，具体步骤如下所述：
①将EcoRI/BamHI酶切纯化后的同源臂片段δ1克隆到质粒pUC-KanMXH-XI-2的EcoRI/BamHI位点，得到重组质粒pUC-KanMXH-XI-2-δ1；
②将SalI/SphI酶切纯化后与的loxP-KanMX-loxP片段克隆到质粒pUC19的SalI/SphI位点，得到重组质粒pUC-KanMX42；
③将ApaI/SphI酶切纯化后的同源臂片段δ2克隆到步骤②所得重组质粒pUC-KanMX42的ApaI/SphI位点，得到重组质粒pUC-KanMX42-δ2；
④将SalI/SphI酶切步骤③所得重组质粒pUC-KanMX42-δ2并纯化后获得的1758bp片段克隆到步骤①所得重组质粒pUC-KanMXH-XI-2-δ1的SalI/SphI位点，得到重组质粒pXIδ；
(3)δ-sequence位点多拷贝整合木糖异构酶基因Ru-xylA
①EcoRI/SphI酶切质粒pXIδ后纯化回收6320bp片段，将此片段转化实施例6所得重组酿酒酵母菌株BSN0(pho13::XI,gre3::PPP,XK)，在含有G418的YEPD选择性平板上挑取十个菌落进行酶活测定，选择木糖异构酶比酶活最大的菌株，随后按照实施例3步骤将抗性筛选标记KanMX及质粒Yep-CH后去除后，挑选菌落并进行酶活测定，选择木糖异构酶比酶活最大的菌株命名为BSN1(pho13::XI,δ::XI,gre3::PPP,XK)；
②将步骤①所得片段继续转化步骤①所得重组酿酒酵母菌株BSN1(pho13::XI,δ::XI,gre3::PPP,XK)，并重复步骤①中所述抗性筛选标记及质粒去除操作以及酶活测定，选择木糖异构酶比酶活最大的菌株命名为BSN2(pho13::XI,2δ::XI,gre3::PPP,XK)；
③将步骤①所得片段继续转化步骤②所得重组酿酒酵母菌株BSN2(pho13::XI,2δ::XI,gre3::PPP,XK)，并重复步骤①中所述抗性筛选标记及质粒去除操作以及酶活测定，选择木糖异构酶比酶活最大的菌株命名为BSN3(pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK)。
实施例8进化工程增强酿酒酵母的木糖代谢能力
进化工程是一种获得预期表型的有效策略。为了进一步提高重组菌株对木糖的发酵能力，以菌株BSN3为出发菌对其在木糖唯一碳源培养基上进行长期驯化培养。具体步骤如下：将菌株BSN3接入YEPX培养基(20g L-1木糖为唯一碳源)中进行连续转接驯化培养，随着转接次数的增加，菌株在木糖上生长的代时逐渐降低，经过大约350h的转接培养，细胞生物量倍增时间(doubling time，T)逐渐缩短(Peng et al.,2012)，由180min逐渐降低并稳定在大约120min(见图11)，将倍增时间稳定的菌株培养液涂布平板进行单菌落分离，挑取单菌落并在YEPX液体培养基中测定其最大比生长速率μmax，选择具有最大μmax的菌株并将其命名为XH7(pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK,AE)。
实施例9进化工程增强酿酒酵母的抑制物耐受能力
考虑到水解液中抑制物组分及其相互作用的复杂性以及酵母对其耐受性机制了解的不够透彻(Ling et al.,2014；Smith et al.,2014)，继续选择利用进化工程手段以试图提高菌株XH7对水解液中抑制物的耐受性及提高其发酵水平。
驯化培养基采用预处理玉米秸秆沥出液(PCS liquor)，添加5g L-1尿素为氮源；PCS liquor中抑制物成分与PCS水解液中类似，但是含有较少量的葡萄糖，这样在菌株耗尽葡萄糖后可以继续利用木糖，从而在驯化培养过程中在逐渐提高其抑制物耐受性基础上又不至于损害其对木糖的代谢能力。经过约600小时的转接驯化培养，细胞生物量倍增时间(doubling time，T)逐渐缩短，由最初的约7小时缩短并多次转接仍维持在约3.9小时(见图12)。之后将代时稳定批次的培养液涂布平板(PCS liquor-琼脂平板)分离单菌落，同时以XH7为对照。培养四天后，XH7仅有少量很小的菌落在平板上长出(见图13A)，而经在PCSliquor中驯化的培养物长出大量生长良好的菌落(见图13B)。挑取平板上菌落，利用BioScreen system(Oy Growth Curves Ab Ltd,Helsinki,Finland)对其生长进行测定并选择比生长速率最大的菌株，命名为XHR11(pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK,AE-PCS)。
实施例10异源糖转运蛋白重组酿酒酵母菌株的构建
(1)PCR扩增DNA片段
以下片段通过PCR进行扩增：上游激活序列UASCLB(upstream activationsequence,activated gene CLB2)元件(Blazeck et al.,2012)；TDH3p-CYC1t片段，TDH3p为TDH3启动子，CYC1t为CYC1终止子；GRE3-targetting同源臂片段GRE3-B3′和GRE3-B4；KanMX-loxP片段；同源臂整合片段GRE3-B4B3′-KanMX-loxP；异源糖转运蛋白基因片段N360F。
以菌株BSIF基因组为模板，以引物CLBs/CLBa扩增得到UASCLB片段，同时上下游分别引入BamHI和SbfI酶切位点；以质粒pJFE3为模板，以引物TDH3ps/CYC1ta扩增得到TDH3p-CYC1t片段；以菌株BSIF基因组为模板，分别以引物RAGRE33′s/RAGRE33′a和RAGRE34s/RAGRE34a扩增得到GRE3-targetting同源臂片段GRE3-B3′和GRE3-B4，同源臂片段在酿酒酵母两条染色体上的相对位置如附图14所示；以质粒pUG6为模板，使用引物KanloxPs/KanloxPa经PCR扩增得到KanMX-loxP片段；以同源臂片段GRE3-B4、GRE3-B3′以及KanMX-loxP片段同时作为模板，用引物RAGRE34s/KanloxPa进行融合PCR扩增，得到同源臂整合片段GRE3-B4B3′-KanMX-loxP(见图15)；以质粒pJFE3-Mgt05196(N360F)为模板(Wang etal.,2015)，以引物Mgt05196s/Mgt05196a扩增得到转运蛋白基因片段N360F；
上述步骤中所述引物的序列见表1，PCR使用TransStart FastPfu DNAPloymerase.
(2)质粒的构建
在GRE3位点整合异源糖转运蛋白基因所需质粒为pUC-N360F，其构建流程如图16-17所示，具体步骤如下所述：
①将BamHI/SbfI酶切纯化后的上游激活序列UASCLB片段克隆到质粒pUC19的BamHI/SbfI位点，得到重组质粒pUC19-CLB(1x)；
②将BamHI/SbfI酶切纯化后的上游激活序列UASCLB片段克隆到步骤①所得重组质粒pUC19-CLB(1x)的BglII/SbfI位点，得到重组质粒pUC19-CLB(2x)；
③将BamHI/SbfI酶切纯化后的上游激活序列UASCLB片段克隆到步骤②所得重组质粒pUC19-CLB(2x)的BglII/SbfI位点，得到重组质粒pUC19-CLB(3x)，其中含有三个串联排列的UASCLB，如图16所示；
④将TDH3p-CYC1t片段通过Gibson Assembly克隆到步骤③所得重组质粒pUC19-CLB(3x)的BglII位点，得到重组质粒pUC19-CLB(3x)-pTDH3-CYC1t，如图16所示；
⑤将转运蛋白基因片段N360F通过Gibson Assembly克隆到步骤④所得重组质粒pUC19-CLB(3x)-pTDH3-CYC1t的XhoI/XbaI位点，得到重组质粒pUC19-CLB(3x)-N360F；
⑥将同源臂整合片段GRE3-B4B3′-KanMX-loxP通过Gibson Assembly克隆到步骤⑤所得重组质粒pUC19-CLB(3x)-N360F的NdeI/BamHI位点，得到重组质粒pUC-N360F(见图17)；
(3)GRE3位点整合异源糖转运蛋白基因
质粒pUC-N360F经限制性内切酶SwaI酶切纯化后的片段转化实施例9所得酿酒酵母菌株XHR11，挑取转化子并PCR验证正确后得到整合异源糖转运蛋白基因的重组酿酒酵母菌株并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XHR11-N360F(pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK,AE-PCS,N360F)。以此菌株为基础，对其在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养(如实施例8所述)，筛选得到菌株并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1(pho13::XI，3δ::XI，gre3::PPP，XK，AE-PCS，N360F，AE)。菌株LF1已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11331。
实施例11异源糖转运蛋白重组酿酒酵母菌株LF1在混合糖培养基中限氧摇瓶发酵
使用的YEP培养基(20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母提取物)，添加混合糖(80g L-1葡萄糖、40g L-1木糖)为碳源在摇瓶限氧条件下测试异源糖转运蛋白重组酿酒酵母菌株LF1对木糖的利用及发酵能力，并以菌株XH7和XHR11作为对照。发酵条件如下所述：培养温度为30℃，130mL摇瓶中装有50mL YEP培养基，摇床转速为200rpm，摇瓶塞有橡胶塞且其上插有针头来控制限氧条件，初始接种量为0.5g dry cell weight L-1。发酵实验重复三次，数据取平均值进行计算。菌株LF1发酵过程代谢物的变化如图18所示，对照菌株XH7和XHR11发酵过程代谢物的变化如图19所示。
在混合糖发酵中，本发明的菌株LF1具有较好表现，在发酵16小时基本耗尽所有木糖(95.35％)，同时乙醇得率达到0.472g g-1consumed sugars。而对照菌株XH7和XHR11(见图19)发酵24小时分别消耗84.12％和59.22％的木糖。
本发明的菌株LF1比文献报道工程菌株具有更优的发酵能力，在相同发酵条件下，Diao等的研究中，最优菌株CIBTS0735需要20小时才能代谢培养基中所有的80g L-1葡萄糖和40g L-1木糖，乙醇得率为0.454g g-1consumed sugars，且其对葡萄糖和木糖的利用具有明显的时间先后顺序(Diao et al.,2013)。而菌株LF1具有较强的葡萄糖木糖共发酵能力，如图18所示，在发酵12小时，葡萄糖完全耗尽，同时有约77.6％(33.24g L-1)的木糖同时被利用。菌株LF1增强的葡萄糖木糖共发酵能力与其染色体整合的糖转运蛋白的木糖转运偏好性有关(Mgt05196p的木糖转运偏好性相比酵母自身转运蛋白Gal2p提高50％，且突变子N360F只能转运木糖而不能转运葡萄糖：见汪城墙学位论文，2013)。
实施例12异源糖转运蛋白重组酿酒酵母菌株LF1在木质纤维素原料水解液中限氧摇瓶发酵
为了进一步验证本发明的菌株LF1在木质纤维素原料水解液中的发酵能力，以来源于不同公司(山东龙力生物科技股份有限公司、山东泉林集团和河南天冠集团)的水解液原料为培养基对菌株LF1及对照菌株XHR11进行测试。发酵条件如下所述：培养温度为30℃，130mL摇瓶中装有50mL YEP培养基，摇床转速为200rpm，摇瓶塞有橡胶塞且其上插有针头来控制限氧条件，初始接种量为0.5g dry cell weight L-1。发酵实验重复三次，数据取平均值进行计算。发酵过程代谢物的变化如图20所示，对照菌株XHR11发酵过程代谢物的变化如图21所示。
在不同水解液中，菌株LF1相比菌株XHR11发酵都有明显的提升，在泉林水解液原料中(见图20A)，LF1发酵20小时消耗约86.8％木糖，糖醇转化率为0.480，达到理论值的94.1％，而相同时间XHR11仅消耗约66.4％的木糖(见图21A)；在龙力水解液原料中(见图20B)，LF1发酵48小时消耗约91.3％木糖，而相同时间XHR11仅消耗约69.9％的木糖(见图21B)；在天冠水解液原料中，XHR11发酵48小时仅消耗约47.8％葡萄糖和很少量的木糖(见图21C)，而LF1发酵48小时几乎耗尽所有葡萄糖(98.3％)及约50.8％的木糖的木糖(见图20C)；
整合糖转运蛋白基因突变子N360F并经过驯化后所得菌株LF1无论在没有抑制物的混合糖培养基或是含有多种抑制物的多种木质纤维素水解液中，都具有提高的木糖发酵能力。预示本发明的菌株LF1已基本具备利用木质纤维素原料发酵生产燃料乙醇的实际产业化潜力。
表1：实施例中PCR所用引物列表
Figure GDA0001595513470000121
Figure GDA0001595513470000131
Figure IDA0000840200030000011
Figure IDA0000840200030000021

Claims (1)

1.一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在木质纤维素水解液中发酵生产乙醇的应用；其中：所述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ） LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11331；所述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株的构建方法是将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到酿酒酵母菌株BSIF染色体的PHO13基因座位；进而将含有非氧化磷酸戊糖途径四个基因串联表达框的两个相应DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体的GRE3基因座位的一部分；进而将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体上的逆转录转座子Ty1上的δ-sequence区域；进而用含有TEF1启动子的DNA序列转化上述操作获得的菌株，将该菌株染色体中XKS1基因的启动子替换为TEF1启动子；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行长期驯化培养；进而将上述操作获得的菌株在预处理玉米秸秆沥出液中进行长期驯化培养；进而用含有木糖专一性转运蛋白基因Mgt05196表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株GRE3基因座位剩余的另一部分；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养获得。
CN201510747241.7A 2015-11-05 2015-11-05 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用 Active CN105199976B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510747241.7A CN105199976B (zh) 2015-11-05 2015-11-05 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510747241.7A CN105199976B (zh) 2015-11-05 2015-11-05 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105199976A CN105199976A (zh) 2015-12-30
CN105199976B true CN105199976B (zh) 2020-12-18

Family

ID=54947939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510747241.7A Active CN105199976B (zh) 2015-11-05 2015-11-05 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105199976B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267559A (zh) * 2017-07-25 2017-10-20 广西大学 一种提高酿酒酵母蔗糖发酵性能的方法及其应用
KR102133193B1 (ko) * 2017-12-01 2020-07-13 지에스칼텍스 주식회사 혼합당 동시발효능을 갖는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법
CN108504584A (zh) * 2018-05-24 2018-09-07 齐鲁工业大学 一种适于提高葡萄糖木糖共发酵酿酒酵母耐受多种预处理抑制物的培养基及应用
CN111100801B (zh) * 2019-09-09 2024-02-23 四川农业大学 一种糠醛等抑制物耐受酵母工程菌株及其构建方法与应用
CN112852650B (zh) * 2019-11-27 2023-04-14 暨南大学 一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
CN112375694B (zh) * 2020-11-18 2021-06-18 齐鲁工业大学 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用
CN113025642B (zh) * 2021-03-30 2024-01-02 安琪酵母股份有限公司 一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用
CN114540429A (zh) * 2022-01-26 2022-05-27 四川大学 基于浓酸低温水解及酸循环的秸秆化学品生产方法
CN115232757B (zh) * 2022-06-22 2023-05-23 首都师范大学 酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法
CN116496917A (zh) * 2023-03-24 2023-07-28 湖北大学 一种高效共利用木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母及其应用
CN116042730B (zh) * 2023-03-24 2023-06-16 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法
CN116590165B (zh) * 2023-07-10 2023-09-26 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一株利用木糖生产香叶醇的酿酒酵母菌株及其应用
CN118638664A (zh) * 2024-08-13 2024-09-13 北京化工大学 基于木质纤维水解糖制备乙醇的基因工程菌及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100558882C (zh) * 2007-12-05 2009-11-11 南京工业大学 一种利用木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母
CN102174549A (zh) * 2011-02-22 2011-09-07 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
WO2012154626A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
CN104263739A (zh) * 2014-10-08 2015-01-07 山东大学 一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白
US9102931B1 (en) * 2012-08-01 2015-08-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Yeast strains and method for lignocellulose to ethanol production
CN104830705A (zh) * 2015-05-08 2015-08-12 黑龙江省科学院微生物研究所 一株葡萄糖/木糖共代谢酿酒酵母菌株及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8440449B2 (en) * 2008-09-30 2013-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformed Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose utilization
CN101942435B (zh) * 2009-12-16 2013-01-09 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母及其构建方法
DK2877576T3 (da) * 2012-07-24 2019-08-12 Bp Corp North America Inc Xyloseisomeraser og anvendelser deraf

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100558882C (zh) * 2007-12-05 2009-11-11 南京工业大学 一种利用木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母
CN102174549A (zh) * 2011-02-22 2011-09-07 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
WO2012154626A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
US9102931B1 (en) * 2012-08-01 2015-08-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Yeast strains and method for lignocellulose to ethanol production
CN104263739A (zh) * 2014-10-08 2015-01-07 山东大学 一种编码木糖转运蛋白的核酸分子及其编码的木糖转运蛋白
CN104830705A (zh) * 2015-05-08 2015-08-12 黑龙江省科学院微生物研究所 一株葡萄糖/木糖共代谢酿酒酵母菌株及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation of industrial Saccharomyces cerevisiae strains as the chassis cell for second-generation bioethanol production;Hongxing Li 等;《Microbial Biotechnology》;20150331;第8卷(第2期);摘要，第269页左栏第1段，第270页左栏第2 段和右栏第1段，第271页右栏第1段 *
Improvement of xylose fermentation in respiratory-deficient xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae;Bingyin Peng 等;《Metabolic Engineering》;20120131;第14卷(第1期);第9-18页 *
利用不同启动子控制木糖代谢关键酶_省略_建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母;金怡 等;《生物技术通报》;20140226(第2期);第153-160页 *
稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建;杨忞 等;《应用与环境生物学报》;20090425;第15卷(第2期);第258-261页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105199976A (zh) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105199976B (zh) 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
Krishnan et al. Fermentation kinetics of ethanol production from glucose and xylose by recombinant Saccharomyces 1400 (pLNH33)
Jeffries et al. Pichia stipitis genomics, transcriptomics, and gene clusters
Levin et al. Challenges for biohydrogen production via direct lignocellulose fermentation
WO1995028476A1 (en) Recombinant zymomonas for pentose fermentation
CN101781634B (zh) 能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法
US12012604B2 (en) Acetate consuming yeast cell
WO2011123715A1 (en) Metabolically engineered yeasts for the production of ethanol and other products from xylose and cellobiose
Ha et al. Continuous co-fermentation of cellobiose and xylose by engineered Saccharomyces cerevisiae
WO2015100856A1 (zh) 一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母
JP2016513457A (ja) 酵母細胞中において活性な雌ウシの第一胃のキシロースイソメラーゼ
MX2012011872A (es) Levadura industrial capaz de producir etanol a partir de por lo menos una pentosa.
CN107384815A (zh) 一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用
CN105368731B (zh) 一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法
CN108823113B (zh) 高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法
CN104328061A (zh) 利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用
CN106434402B (zh) 一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及其构建方法
CN109609540B (zh) 重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用
CN114957413A (zh) 一种大肠杆菌全局调控因子环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用
CN106554924B (zh) 生产乙醇的重组酿酒酵母菌株、其构建方法以及利用该菌株生产乙醇的方法
EP2643466B1 (en) Yeast cells and process for converting acetaldehyde to ethanol
CN106929530A (zh) 一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法
CN112011472A (zh) 一株具有xr-xdh途径的可快速发酵木糖的酿酒酵母菌株及构建方法
JP6697780B2 (ja) ストレス応答プロモーター
CN110591933A (zh) 一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant