CN110591933A - 一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株，是将半乳糖透过酶N376F突变体基因在耐热酵母菌株中进行多份表达；其中耐热酵母菌株是敲除了木糖还原酶基因NcXR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1的马克思克鲁维酵母。本发明获得的可高效利用农业废物玉米芯水解液发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株，可以将水解产物里的所有葡萄糖和木糖完全转化成乙醇和木糖醇，将葡萄糖和木糖的利用率做到最大化。制备的重组工程菌株可以在高温下同时利用发酵葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产乙醇和木糖醇，并在不影响乙醇产量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生产速率。

Description

一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株
技术领域
本发明属于生物工程菌株构建技术领域，具体涉及一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株，即一种在高温下，以甘油为辅助底物，能够高效利用农业废物玉米芯水解液发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株。
背景技术
木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物(Vandeska et al.,1996)，它的性质决定了它在食品、医药等方面具有重要的应用价值，乙醇是醇类的一种，俗称酒精。乙醇的用途很广，在生物能源方面，由于它存在作为化石燃料的替代者的潜力，因此在近年受到了很大的关注。
农业废物玉米芯的水解液中可以水解出用于制备木糖醇和乙醇的原料木糖和葡萄糖，由于葡萄糖抑制效应会使K.marxianus工程菌株对木糖利用效率不高，之前报道的K.marxianus工程菌株YZJ119葡萄糖抑制效应减缓，从而可以同时利用葡萄糖和木糖发酵生产木糖醇。由于农业废物玉米芯水解液中葡萄糖和木糖的比例是在一定范围内，而现有的用于制备乙醇和木糖醇的工程菌株对于底物中葡萄糖和木糖的比例要求极高，因此不能充分利用农业废物玉米芯水解液中的木糖，导致底物有残留，这不仅不能充分利用水解液，而且对于产物木糖醇的提纯提供了瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株，所构建的工程菌株不仅可以充分利用农业废物水解液里的葡萄糖，还可以将副产物甘油转化为可利用的底物，最重要的是可以将木糖高效率的转化成木糖醇，最大程度的充分利用了农业废物水解液。
本发明所提供的马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus(K.marxianus)工程菌株，是将半乳糖透过酶N376F突变体基因在耐热酵母菌株中进行多份表达；其中耐热酵母菌株是敲除了木糖还原酶基因NcXR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1的马克思克鲁维酵母；
其中N376F突变体基因，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述的木糖还原酶基因NcXR，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
所述的葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:3；
本发明的工程菌株的构建方法，具体的步骤如下：
1)在K.marxianu中敲除木糖还原酶基因XR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXF1，构建获得了耐热酵母菌株；
所述的木糖还原酶基因NcXR的拷贝数为四个；
2)将多拷贝的酿酒酵母半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述的耐热酵母菌株中重组表达；
首先将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒转化进耐热酵母菌株中，获得第一轮转化菌株；
将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒再次转化进第一轮转化酵母菌株中，获得第二轮转化菌株；
将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒再次转化进第二轮转化酵母菌株中，发明的可高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株。
作为优选，所述的马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus(K.marxianus)YQDJL004株的保藏编号为CGMCC NO：18006；于2019年6月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的工程菌株利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇；
本发明提供一种制备乙醇和木糖醇的方法，是使用本发明的工程菌株来发酵木质纤维素水解液来制备的，所述的木质纤维素水解液，为玉米芯水解液。
本发明获得的可高效利用农业废物玉米芯水解液发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株，可以将水解产物里的所有葡萄糖和木糖完全转化成乙醇和木糖醇，将葡萄糖和木糖的利用率做到最大化。制备的重组工程菌株可以在高温下同时利用发酵葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产乙醇和木糖醇，并在不影响乙醇产量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生产速率，解除了马克斯克鲁维酵母本身存在的葡萄糖抑制效应，并可以将农业废物玉米芯水解液利用率做到最大化，在利用木质纤维素物质水解产物高效生物转化生产木糖醇和乙醇工业上有巨大的应用前景。
附图说明
图1：YQD005,YQDL001,YQDL002和YQDL004的发酵结果图，其中图1-a为乙醇生产量；图1-b为木糖醇生产量；图1-c为葡萄糖的消耗；图1-d为木糖的消耗；图1-e为甘油的消耗；
图2：YQDL004在不同浓度的甘油中发酵结果图，其中图2-a为5g/L甘油中各菌株的发酵结果；图2-b为10g/L甘油中各菌株的发酵结果；图2-c为15g/L甘油中各菌株的发酵结果。
图3：YQDJL004菌株利用玉米芯水解液发酵结果图。
具体实施方式
本发明构建的工程菌株可以充分利用农业废物玉米芯水解液中的木糖和葡萄糖，将利用率达到最大值。
本发明所使用的试剂均是市场购买的试剂，其中木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，Ligation high购自TOYOBO公司，Solution I连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福利亚Stratagene公司)，包含100g/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(YNB葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml)主要用于转化。质粒YEGAP,YELGAP,YEUGAP由本实验室提供(Honget al.,2007)。YPD培养基(10g/l酵母提取物,20g/l细菌学蛋白胨,20g/l葡萄糖)用于酵母的前培养。YPX(10g/l酵母提取物，20g/l细菌学蛋白胨，40g/l木糖，80g/l葡萄糖)用于发酵培养基。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1构建耐热酵母菌株
在K.marxianu中敲除木糖还原酶基因XR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXF1，构建获得了耐热酵母菌株；
下面对构建耐热酵母菌株的具体步骤进行描述。
1、提取酵母基因组
①马克思克鲁维酵母NBRC177菌株，在YPD平板上划线，挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。
②常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
③500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
④取200μl实验室自配1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。
⑤加入200μl氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl 1x TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)。轻微震荡。
⑥12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。
⑦12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl 1x TE重悬沉淀。
⑧加入2μl RNase(RNA水解酶,中国上海生工生物)，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。
⑨取40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。
⑩12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。
2、构建过程中所使用的基因的信息
其中N376F突变体基因，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR，其编码基因的核苷酸序列为SEQID NO:2；
所述的葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:3。
3、构建质粒载体：
1)、质粒pZJ002的构建：
以质粒pMD18-T-NcXR-ORF为模板，以10μM NcXR-ECORI-F和10μM NcXR-NOTI-R为引物扩增得到SEQ ID No：2基因，将SEQ ID No：2扩增产物与yEUGAP载体分别用EcoR I和Not I双酶切，连接，将NcXR编码序列插入到yEUGAP载体中，获得质粒pZJ002(说明书中所用引物的具体序列详见表1)。
具体操作如下：
⑴以pMD18-T-NcXR-ORF质粒为模板扩增NcXR编码序列(SEQ ID NO:2)的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM NcXR-ECORI-F 4μl
10μM NcXR-NOTI-R 4μl
pMD18-T-NcXR-ORF质粒 0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR扩增反应的程序如下：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将扩增产物NcXR编码序列与yEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pZJ002。
①NcXR基因的酶切体系：
②yEUGAP载体的酶切体系：
yEUGAP载体 1pmol
10x buffer O 10μl
EcoR I 5μl
Not I 5μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
③NcXR编码序列和yEUGAP载体的连接体系：
NcXR编码序列 0.3pmol
yEUGAP载体 0.03pmol
Solution I连接酶(大连宝生物) 5μl
16过夜
④将获得的插入了NcXR编码序列的yEUGAP质粒，命名为pZJ002。
2).质粒pZJ005的构建：
将启动子PKmGAPDH以K.marxianus为模板进行扩增，插入pMD18-T载体，获得pMD18-T-PKmGAPDH质粒。然后分别以质粒pMD18-T-PKmGAPDH和质粒pZJ002为模板对PKmGAPDH基因与NcXR-TScGAPDH基因分别进行PCR扩增和融合，融合产物PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因与yEUGAP载体分别利用Hind III进行单酶切和连接，最后将连接产物PKmGAPDH-NcXR-TSCGAPDH基因转入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ005。
具体操作如下：
⑴将PKmGAPDH以YHJ010的基因组DNA为模板进行扩增，然后插入pMD18-T载体。
①PKmGAPDH基因的PCR体系：
PCR反应程序如下：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②得到PKmGAPDH基因后，将此PKmGAPDH基因的末端加“A”碱基后，将PKmGAPDH基因插入pMD18-T载体中。
加A体系：
TA克隆连接体系：
⑵分别以pMD18-T-PKmGAPDH载体和pZJ002质粒为模板对PKmGAPDH基因与NcXR-TScGAPDH基因分别进行PCR扩增，融合。
①以pMD18-T-PKmGAPDH载体为模板扩增PKmGAPDH启动子的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM KmGAP-HINDIII-F 4μl
10μM KmGAP-R 4μl
pMD18-T-PKmGAPDH质粒 0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR反应程序如下:
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②以pZJ002质粒为模板扩增NcXR-TScGAPDH基因的PCR体系：
PCR反应程序如下：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
④PKmGAPDH与NcXR-TScGAPDH基因的融合体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM KmGAP-HINDIII-F 4μl
10μM TER-HINDIII-R 4μl
NcXR-TScGAPDH，PKmGAPDH 各0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序:
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 2min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑶融合产物PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因与yEUGAP载体分别利用Hind III进行单酶切，连接，最后将连接产物PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因插入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ005。
①PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因酶切体系：
PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因 1pmol
10x buffer R 10μl
Hind III 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
②yEUGAP载体的酶切体系：
yEUGAP载体 1pmol
10x buffer R 10μl
Hind III 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
③PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因和yEUGAP载体的连接体系：
PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因 0.3pmol
yEUGAP载体 0.03pmol
Solution I连接酶(大连宝生物) 5μl
16℃过夜
④将获得的插入了PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因的yEUGAP质粒，命名为pZJ005。
3).质粒pZJ011的构建：
将TScGAPDH基因,PKmGAPDH基因,NcXR基因分别以yEGAP载体，pMD18-T-PKmGAPDH载体，pMD18-T-NcXR-ORF载体为模板进行PCR扩增，融合，然后将融合产物TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因与pZJ002质粒分别利用Not I进行酶切，连接，最后将连接产物TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因转入pZJ002质粒中，从而构建质粒pZJ011。
⑴将TScGAPDH基因,PKmGAPDH基因,NcXR基因分别以yEGAP载体，pMD18-T-PKmGAPDH载体，pMD18-T-NcXR-ORF载体为模板进行PCR扩增，融合。
TScGAPDH基因(Hong et al.,2007)的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM TER-NOTI-F 4μl
10μM TER-R 4μl
yEGAP载体 0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 30sec
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②PKmGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
④NcXR基因的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM KmGAP-NcXR-F 4μl
10μM NcXR-NOTI-R 4μl
pMD18-T-NcXR-ORF载体 0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
⑤TScGAPDH基因,PKmGAPDH基因与NcXR基因融合的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM TER-NOTI-F 4μl
10μM NcXR-NOTI-R 4μl
TScGAPDH,PKmGAPDH,NcXR 各0.4pmol
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 2min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将融合产物TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因与pZJ002质粒分别利用Not I进行酶切，连接，最后将连接产物TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因转入pZJ002质粒中，从而构建质粒pZJ011。
①TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因酶切体系：
②pZJ002质粒酶切体系：
pZJ002质粒 1pmol
10x buffer O 10μl
Not I 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
③TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因和pZJ002质粒的连接体系：
TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因 0.3pmol
pZJ002质粒 0.03pmol
Solution I连接酶 5μl
16℃过夜
④将获得的插入了TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR基因的pZJ002质粒，命名为pZJ011。
4)质粒pZJ012的构建
将PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因以pZJ011质粒为模板通过PCR扩增出来，然后将扩增产物PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因和yELGAP载体分别利用Hind III进行单酶切，连接，最后将连接产物PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因转入yELGAP载体中，从而构建质粒pZJ012。
⑴将PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因以pZJ011质粒为模板通过PCR扩增出来。
PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 4min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因和载体yELGAP分别利用Hind III进行单酶切后，连接，最后将连接产物PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScG APDH基因转入yELGAP载体中，从而构建质粒pZJ012。
①PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因酶切体系：
②yELGAP酶切体系：
yELGAP 1pmol
10x buffer R 10μl
Hind III 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
③PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因和yELGAP载体的连接体系：
④将获得的插入了PScGAPDH-NcXR-TScGAPDH-PKmGAPDH-NcXR-TScGAPDH基因的yELGAP质粒，命名为pZJ012。
5)质粒pZJ039的构建
以质粒pMD18-T-CiGXF和为模板对CiGXF基因进行PCR扩增，扩增产物产物CiGXF基因与yEUGAP载体分别利用Not I进行单酶切和连接，最后将连接产物CiGXF基因转入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ039。具体操作如下：
⑴将CiGXF基因以质粒pMD18-T-CiGXF为模板进行扩增，然后插入yEUGAP载体。
①CiGXF基因基因的PCR体系：
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②得到CiGXF基因后，将此CiGXF基因与yEUGAP载体分别利用Not I进行单酶切，连接，最后将连接产物CiGXF基因插入yEUGAP载体中，从而构建质粒pZJ039。
①CiGXF基因酶切体系：
CiGXF基因 1pmol
10x buffer O 10μl
Not I 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
②yEUGAP载体的酶切体系：
yEUGAP载体 1pmol
10x buffer O 10μl
Not I 10μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃过夜
③CiGXF基因和yEUGAP载体的连接体系：
CiGXF基因 0.3pmol
yEUGAP载体 0.03pmol
Solution I连接酶(大连宝生物) 5μl
16℃过夜
④将获得的插入了CiGXF基因的yEUGAP质粒，命名为pZJ039。
6)pMD18-T-ScURA3-ZJ敲除片段质粒的构建：
以yEUGAP为模板，通过PCR扩增出ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段，再通过融合PCR获得ORF缺失了165bp的ScURA3敲除框，并将其插入pMD18-T载体构建而成。再以pMD18-T载体为模板，A8486-194-F和A8486-219-R为正反引物，进行整质粒扩增后转入大肠杆菌XL-10Gold中，获得质粒pMD18-T-ScURA3-ZJ。
4、将构建的载体转入改造后的耐热酵母：
1)同时敲除了木糖还原酶基因(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)基因的YQD001宿主菌株的制备：
①YZB001菌株的构建：将trp1基因的完整表达框从yEGAP里PCR扩增出来，插入pET21XR的Sal I位点得到pET21XR-TRP。然后将包含trp1基因的整个XR基因片段用PCR扩增出来，转化YHJ010菌株，用含有尿嘧啶和亮氨酸的合成培养基平板筛选获得XR敲除的菌株。
②YQD001菌株的构建:
将trp1基因的完整表达框从yEGAP里PCR扩增出来，插入XDH基因的EcoR I位点。然后将包含trp1基因的整个XDH基因片段用PCR扩增出来，转化YZB001菌株，用含有尿嘧啶和亮氨酸的合成培养基平板筛选XDH敲除的菌株，从而获得XR和XDH同时敲除的菌株YQD001。
2)构建耐热酵母XR表达菌株的具体过程:
用Sma I酶切pZJ011载体。将酶切产物转化至YQD001，同源重组后，将使菌株恢复Ura 3基因的功能，并新增NcXR的功能。在仅含有Leu的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，命名为YQD002。
用Sma I酶切pZJ012载体。将酶切产物转化至YQD002，同源重组后，将使菌株恢复Leu 2基因的功能，并新增NcXR的功能。在仅含有Ura的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，命名为YQD003。
以pMD18T-ScURA3敲除片段质粒为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YQD003中，同源重组后，使菌株YQD003内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YQD004。
用Sma I酶切pZJ039载体。将酶切产物转化至YQD004，同源重组后，将使菌株恢复Ura 3基因的功能，并新增CiGXF的功能。在仅含有Ura的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，命名为YQD005。
3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。
⑴耐热酵母基因组提取步骤:
①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。
②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
④.取200μl实验室自配1xbreaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，
SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1
mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。
⑤.加入200μl氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl 1x TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)。轻微震荡。
⑥.12000rpm，5min，离心，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。
⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl 1x TE重悬沉淀。
⑧.加入2μl RNase(RNA水解酶，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。
⑨.取40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。
⑩.12000rpm，4℃，30min，离心，弃上清室温下干燥。用合适体积重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。
⑵鉴定酵母转化的阳性菌株的PCR体系：
包含NcXR的基因组的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 3μl
2.5mM dNTP混合液 1μl
10μM NcXR-F1 1μl
10μM NcXR-R2 1μl
基因组DNA(1μg/μl) 1μl
PrimeSTAR DNA聚合酶 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 7.5μl
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②包含CiGXF的基因组的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 3μl
2.5mM dNTP混合液 1μl
10μM CiGXF-NOT-F 1μl
10μM CiGXF-NOT-R 1μl
基因组DNA(1μg/μl) 1μl
PrimeSTAR DNA聚合酶 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 7.5μl
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1.5min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
分别以NcXR和CiGXF基因的特异性引物作为引物，以基因组为模板，PCR扩增后，能特异性的扩增出NcXR和CiGXF基因条带的菌株，阳性菌株中NcXR基因的大小为969bp，CiGXF基因的大小为1644bp。获得为阳性菌株为耐热酵母菌株。
实施例2将多拷贝的酿酒酵母半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述的耐热酵母菌株中重组表达
1、质粒构建：
1)pQDJL001的构建：
提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303的基因组，并将提取的酿酒酵母的基因组稀释100倍作为模板，以SCGAL2-ECORI-F和SCGAL2-NOTI-R为引物，使用PrimeSTARHS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR，得到的产物即为ScGAL2,并将ScGAL2基因和YEUGAP载体利用EcoR I和Not I双酶切，连接，从而获得质粒pQDJL001。
具体的操作如下：
⑴ScGAL2的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM SCGAL2-ECORI-F 4μl
10μM SCGAL2-NOTI-R 4μl
酿酒酵母基因组DNA 2μl
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
Step1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将扩增产物ScGAL2与YEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pQDJL001。
①ScGAL2的酶切体系：
②YEUGAP载体的酶切体系：
YEUGAP载体 5μg
10x buffer O 10μl
EcoR I 5μl
Not I 5μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至100μl
37℃over night
③ScGAL2和YEUGAP载体的连接体系：
ScGAL2 250ng
YEUGAP载体 50ng
Ligation high(TOYOBO) 5μl
16℃over night 5μl
④将获得的插入了ScGAL2的YEUGAP质粒，命名为pQDJL001。
2)质粒pQDJL002的构建：
以pQDJL001作为模板，SCGAL2-ECORI-F,SGN376F-R；SGN376F-F,SCGAL2-NOTI-R作为引物，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2-F1，ScGAL2-F2两个基因片段，将两个基因片段融合，并将融合的基因片段ScGAL2-N376F与YEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pQDJL002。
具体的操作如下：
⑴以pQDJL001作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2-F1，ScGAL2-F2两个基因片段，并将两个基因片段融合。
①ScGAL2-F1基因片段的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM SCGAL2-ECORI-F 4μl
10μM SGN376F-R 4μl
pZYDB0 2μl
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②ScGAL2-F2基因片段的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM SGN376F-F 4μl
10μM SCGAL2-NOTI-R 4μl
pZJ050 2μl
PrimeSTAR DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至200μl
PCR程序：
③基因片段的融合PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM SCGAL2-ECORI-F 4μl
10μM SCGAL2-NOTI-R 4μl
ScGAL2-F1，ScGAL2-F2 各2μl
PrimeSTAR HS DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O to 200μl
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 2min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵融合的基因片段ScGAL2-N376F与YEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pQDJL002。
①ScGAL2-N376F基因片段的酶切体系：
②YEUGAP载体的酶切体系：
YEUGAP载体 5μg
10x buffer O 10μl
EcoR I 5μl
Not I 5μl
ddH<sub>2</sub>O to 100μl
37℃over night
③ScGAL2-N376F基因片段和YEUGAP载体的连接体系：
ScGAL2-N376F基因片段 250ng
YEUGAP载体 50ng
Ligation high 5μl
16℃over night
④将获得的插入了ScGAL2-N376F基因片段的YEUGAP质粒，命名为pQDJL002。
3).pQDJL003的构建：
将启动子KmGAPDHp，ScGAL2-N376F基因和终止子ScGAPDHt分别以pMD18-T-KmGAPDHp载体，pQDJL002载体，YEGAP载体为模板，KMGAP-ECORI-F，KMGAP-R；KMGAP-SCGAL2-F，SCGAL2-R；SCGAL2-TER-F，TER-NOTI-R为引物进行PCR扩增，融合，然后将融合产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因与YEUGAP载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pQDJL003。
具体的操作如下：
⑴将启动子KmGAPDHp，ScGAL2-N376F基因和终止子ScGAPDHt分别以pMD18-T-KmGAPDHp载体(Zhang et al.,2014)，pQDJL002载体和YEGAP载体为模板进行PCR扩增，融合。
①KmGAPDHp的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM KMGAP-ECORI-F 4μl
10μM KMGAP-R 4μl
YEGAP载体 2μl
PrimeSTAR HS DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O to 200μl
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
②ScGAL2-N376F基因片段的PCR体系：
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 1min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
③ScGAPDHt的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 40μl
2.5mM dNTP混合液 16μl
10μM SCGAL2-TER-F 4μl
10μM TER-NOTI-R 4μl
YEGAP载体 2μl
PrimeSTAR HS DNA聚合酶 2μl
ddH<sub>2</sub>O to 200μl
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 30sec
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
④融合PCR体系：
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 3.5min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将融合产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376Ft-ScGAPDHt基因与YEUGAP质粒分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而构建质粒pQDJL003。
①KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的酶切体系：
②YEUGAP载体的酶切体系：
YEUGAP载体 5μg
10x buffer O 10μl
EcoR I 5μl
Not I 5μl
ddH<sub>2</sub>O to 100μl
37℃over night
③KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段和YEUGAP载体的连接体系：
④将获得的插入了KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的YEUGAP载体，命名为pQDJL003。
4)pQDJL004的构建：
将KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因以pQDJL003载体为模板，KMGAP-XBALI-F，TER-XBALI-R为引物进行PCR扩增，然后将扩增产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因与pPICZB质粒分别利用Xba I进行酶切，连接，从而构建质粒pQDJL004。
具体的操作如下：
⑴将KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因以pQDJL003载体为模板，KMGAP-XBALI-F和TER-XBALI-R为引物，进行PCR扩增。
①KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因的PCR体系：
PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 3.5min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
⑵将扩增产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376Ft-ScGAPDHt基因与pPICZB质粒分别利用Xba I进行酶切，连接，从而构建质粒pQDJL004。
②KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的酶切体系：
KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段 5μg
10x buffer Tango 10μl
Xba I 10μl
ddH<sub>2</sub>O to 100μl
37℃over night
②pPICZB质粒的酶切体系：
③KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段和pPICZB质粒的连接体系：
KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段 250ng
pPICZB质粒 50ng
Ligation high 5μl
16℃over night
④将获得的插入了KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的pPICZB质粒，命名为pQDJL004。
2.将构建的载体转入改造后的耐热酵母：
1)酵母化学转化步骤:
①.各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。
②.取5ml液体YPD,并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。
③.取1ml培养物转接与装入9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。
④.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。
⑤.配制1ml转化缓冲液：800μl 50％PEG4000；50μl 4M醋酸锂；50μl ddH2O；100μl1M DTT(溶于10mM醋酸钠,pH 5.2)。
⑥.使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。
⑦.用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μl(1-10μg)线性化的质粒,轻微震荡30sec。
⑧.在47℃条件下水浴15min。
⑨.将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。
⑩.挑取板上克隆在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。
2)构建各种耐热酵母表达菌株的具体过程:
以pMD18T-ScURA3敲除片段质粒为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YQD005中，同源重组后，使菌株YQD005内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YQD006。
用Sma I酶切pQDJL003载体。将酶切产物转化至YQD006，使菌株获得Ura 3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因表达框。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的批次阳性菌株命名为YQDJL001。
用Pme I酶切pQDJL004载体。将酶切产物转化至YQDJL001，使菌株获得博来霉素(Zeocin)抗性，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因。在含有200mg/ml的博来霉素抗性的YPDS培养基(配方：葡萄糖20g/l，1M山梨醇，酵母提取物10g/l，细菌学蛋白胨20g/l)上筛选阳性克隆，获得的批次阳性菌株命名为YQDJL002。
以pMD18T-ScURA3敲除片段质粒为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YQDJL002中，同源重组后，使菌株YQDJL002内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的批次阳性菌株命名为YQDJL003。
用Sma I酶切pQDJL003载体。将酶切产物转化至YQDJL003，使菌株获得Ura 3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，
3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。
鉴定重组酵母的ScGAL2N376F基因重组表达的阳性菌株的PCR体系：
5x PrimeSTAR聚合酶缓冲液 2μl
2.5mM dNTP混合液 0.8μl
SCGAL-F 0.2μl
SCGAL-R 0.2μl
重组酵母菌株的基因组 1μl
PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl) 2μl
ddH2O 补足至10μl
对应PCR程序：
Step 1：98℃ 5min
Step 2：98℃ 15sec
Step 3：55℃ 15sec
Step 4：72℃ 2min
Step 5：go to step 2 30cycles
Step 6：72℃ 10min
Step 7：4℃ hold on
通过PCR检测结果鉴定，有1720bp条带的为阳性菌株为本发明的目的重组工程菌株，本实施例获得的阳性菌株命名为YQDJL004，按照顺序进行编号。
最终获得的马克思克鲁维酵母工程菌株，是将半乳糖透过酶的N376F突变体基因在耐热酵母菌株中进行多份表达；其中耐热酵母菌株是敲除了木糖还原酶基因XR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1的马克思克鲁维酵母。
实施例3本发明所构建的重组菌株的共发酵效果
比较构建的各种过程菌株在葡萄糖和木糖比一致的情况下，是否可以通过调节甘油的添加，来使葡萄糖和木糖可以同时彻底被利用。结果表明，ScGAL2-N376F基因过表达构建的菌株，木糖可以在葡萄糖存在的状态下被利用，葡萄糖抑制效应部分解除。而且，通过添加甘油，底物里的所有葡萄糖和木糖全部被利用(图1)。
1.在YPD培养基平板上复苏菌株。对照株：YQD005；实验株：YQDJL001，YQDJL002，YQDJL003、YQDJL004。37℃培养1天。
2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
3.配制12瓶30ml发酵培养基分装于50ml发酵瓶中。发酵培养基配方：50g/l木糖，15g/l葡萄糖，15g/l甘油，10g/l酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。灭菌待用。
4.取适量过夜培养物接入30ml发酵培养基中，使他们的初始OD600达到1.0,42℃,250rpm培养。
6.在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h取样，并取上清通过HPLC检测分析。
从图1可知，在葡萄糖、甘油和木糖培养基的培养条件下，结果表明，原始对照菌株，在葡萄糖存在的情况下，由于葡萄糖抑制效应，木糖利用受到抑制，因而木糖不能被完全利用，随着ScGAL2-N376F基因过表达构建的菌株，木糖可以在葡萄糖存在的状态下被利用，葡萄糖抑制效应部分解除。在图1-a中YQD005，YQDJL001，YQDJL002和YQDJL004产生的乙醇含量相差不大，但YQDJL004产生的乙醇量明显优于其他菌株；在图1-b中对照菌株YQD005，YQDJL001，YQDJL002分别在24h转化了10g/L，17.2g/L和37.1g/L木糖醇，明显低于重组菌株YQDJL004在24h内转化50.1g/L木糖醇；而在图1-c和1-d中构建的重组菌株YQDJL004在甘油的辅助下，葡萄糖和木糖可以全部被利用，而YQD005，YQDJL001和YQDJL002不能将木糖完全消耗。在图1-d中，YQDJL004对甘油的消耗量依次大于YQDJL002，YQDJL001和YQD005。从图1整体来看，YQDJL004将50.6g/l木糖和15.2g/l葡萄糖，在15g/l甘油辅助下，在24h内转化成50.1g/l木糖醇和6.32g/l乙醇，乙醇生产、木糖生产、葡萄糖消耗、木糖消耗以及甘油的消耗均优于其他菌株。
实施例4本发明的最终重组菌株的共发酵时甘油添加量的调节
比较构建的各种过程菌株在葡萄糖和木糖比一致的情况下，如何通过调节甘油的添加，来使葡萄糖和木糖可以同时彻底被利用。结果表明，当甘油为10g/L时，可以将15g/L的葡萄糖和50g/L的木糖彻底被利用(图2-b)；低于10g/L甘油时，木糖不能被充分利用(图2-a)；高于10g/L甘油时，会有甘油剩余积累(图2-c)。
1.在YPD培养基平板上复苏菌株。实验株：YQDJL004。37℃培养1天。
2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
3.配制9瓶30ml发酵培养基分装于50ml发酵瓶中。发酵培养基配方：50g/L木糖，15g/L葡萄糖，5g/L甘油(或10g/L甘油或15g/L甘油)，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。灭菌待用。
4.取适量过夜培养物接入30ml发酵培养基中，使他们的初始OD600达到1.0,42℃,250rpm培养。
6.在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图2)。
7.从图2可知，当甘油为10g/L时，可以将15g/L的葡萄糖和50g/L的木糖彻底被利用。低于10g/L甘油时，木糖不能被充分利用，高于10g/L甘油时，会有甘油剩余积累(图2)。
按照实施例1方法构建的其它重组工程菌株，使用效果与YQDJL004株类似；证明本发明方法构建的重组菌株都具有相类似的效果。
实施例5本发明的最终重组菌株利用农业废物水解液的效果
该实施例用于验证本发明构建的最终菌株YQDJL004彻底利用农业废物水解液发酵生产木糖醇和乙醇的效果。结果表明，本发明的YQDJL004利用农业废物水解液的能力极高，可以将木糖全部转化成木糖醇，葡萄糖全部转化成乙醇。可以用此菌株直接应用于利用农业废物玉米芯等水解液发酵生产高附加值产品木糖醇和乙醇。
1.在YPD培养基平板上复苏菌株。实验株：YQDJL004。37℃培养1天。
2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
3.配制3瓶30ml发酵培养基分装于50ml发酵瓶中。配方：玉米芯水解液(43.75g/l木糖和13.21g/l葡萄糖)，9.21g/l甘油，10g/l酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。灭菌待用。
4.取适量过夜培养物接入30ml发酵培养基中，使他们的初始OD600达到1.0,42℃,250rpm培养。
6.在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图3)。
7.从图3可知，在葡萄糖和木糖培养基的培养条件下，结果表明本发明构建的菌株YQDJL004利用玉米芯水解液的能力极高，可以将木糖全部转化成木糖醇，葡萄糖全部转化成乙醇，可以彻底利用农业废物玉米芯水解液发酵生产木糖醇和乙醇。
结果表明，在42℃条件下，能够将玉米芯水解液水解出43.75g/l木糖和13.21g/l葡萄糖，并且在9.21g/l甘油辅助下，在24h内生产43.43g/l木糖醇和5.56g/l乙醇，其生产速率分别为1.81g/l/h(木糖醇)和0.93g/l/h(乙醇)，得率分别为0.99g/g(木糖醇)和0.42g/g(乙醇)(这里的葡萄糖和木糖浓度为实测浓度)。
本发明方法所制备的重组菌株与目前世界上利用酵母发酵农业废物同时生产木糖醇和乙醇的所有菌株进行比较，转化率最高，农业废物水解液利用率可以做到最大化，这个结果是已报道的高温下能够利用农业废物发酵生产木糖醇的最佳结果。这将对实现利用农业废物发酵生产木糖醇与乙醇提供鉴定的基石。
表1：本发明实施例中所使用的引物的序列信息
序列表
<110> 张佳
<120> 一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcagttg aggagaacaa tatgcctgtt gtttcacagc aaccccaagc tggtgaagac 60
gtgatctctt cactcagtaa agattcccat ttaagcgcac aatctcaaaa gtattctaat 120
gatgaattga aagccggtga gtcagggtct gaaggctccc aaagtgttcc tatagagata 180
cccaagaagc ccatgtctga atatgttacc gtttccttgc tttgtttgtg tgttgccttc 240
ggcggcttca tgtttggctg ggataccggt actatttctg ggtttgttgt ccaaacagac 300
tttttgagaa ggtttggtat gaaacataag gatggtaccc actatttgtc aaacgtcaga 360
acaggtttaa tcgtcgccat tttcaatatt ggctgtgcct ttggtggtat tatactttcc 420
aaaggtggag atatgtatgg ccgtaaaaag ggtctttcga ttgtcgtctc ggtttatata 480
gttggtatta tcattcaaat tgcctctatc aacaagtggt accaatattt cattggtaga 540
atcatatctg gtttgggtgt cggcggcatc gccgtcttat gtcctatgtt gatctctgaa 600
attgctccaa agcacttgag aggcacacta gtttcttgtt atcagctgat gattactgca 660
ggtatctttt tgggctactg tactaattac ggtacaaaga gctattcgaa ctcagttcaa 720
tggagagttc cattagggct atgtttcgct tggtcattat ttatgattgg cgctttgacg 780
ttagttcctg aatccccacg ttatttatgt gaggtgaata aggtagaaga cgccaagcgt 840
tccattgcta agtctaacaa ggtgtcacca gaggatcctg ccgtccaggc agagttagat 900
ctgatcatgg ccggtataga agctgaaaaa ctggctggca atgcgtcctg gggggaatta 960
ttttccacca agaccaaagt atttcaacgt ttgttgatgg gtgtgtttgt tcaaatgttc 1020
caacaattaa ccggtaacaa ttattttttc tactacggta ccgttatttt caagtcagtt 1080
ggcctggatg attcctttga aacatccatt gtcattggtg tagtcaactt tgcctccact 1140
ttctttagtt tgtggactgt cgaaaacttg ggacatcgta aatgtttact tttgggcgct 1200
gccactatga tggcttgtat ggtcatctac gcctctgttg gtgttactag attatatcct 1260
cacggtaaaa gccagccatc ttctaaaggt gccggtaact gtatgattgt ctttacctgt 1320
ttttatattt tctgttatgc cacaacctgg gcgccagttg cctgggtcat cacagcagaa 1380
tcattcccac tgagagtcaa gtcgaaatgt atggcgttgg cctctgcttc caattgggta 1440
tgggggttct tgattgcatt tttcacccca ttcatcacat ctgccattaa cttctactac 1500
ggttatgtct tcatgggctg tttggttgcc atgttttttt atgtcttttt ctttgttcca 1560
gaaactaaag gcctatcgtt agaagaaatt caagaattat gggaagaagg tgttttacct 1620
tggaaatctg aaggctggat tccttcatcc agaagaggta ataattacga tttagaggat 1680
ttacaacatg acgacaaacc gtggtacaag gccatgctag aataa 1725
<210> 2
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggttcctg ctatcaagct caactccggc ttcgacatgc cccaggtcgg cttcggcctc 60
tggaaggtcg acggctccat cgcttccgat gtcgtctaca acgctatcaa ggcaggctac 120
cgcctcttcg atggtgcctg cgactacggc aacgaggttg agtgcggcca gggtgtagcc 180
cgcgccatca aggagggcat cgtcaagcgc gaggagctct tcatcgtctc caagctctgg 240
aacaccttcc acgacggcga ccgcgtcgag cccatcgtcc gcaagcagct tgccgactgg 300
ggtctcgagt acttcgatct ctacctgatc cacttccccg tcgccctcga gtacgtcgac 360
ccctcggtcc gctaccctcc cggctggcac tttgatggca agagcgagat ccgcccctca 420
aaggccacca tccaagagac ctggacggcc atggagtcgc tcgtcgagaa gggtctctcc 480
aagagcattg gcgtctccaa cttccaggcc cagctcctgt acgacctcct gcgctacgcc 540
aaggtccgcc ccgccactct ccagatcgag caccacccct acctcgtcca gcagaacctc 600
ctcaaccttg ccaaggctga gggcatcgcc gtgaccgcct actcctcctt cggccctgct 660
tctttccgcg agttcaacat ggagcacgcc cagaagctcc agcctctcct cgaggacccc 720
accatcaagg ctattggtga caagtacaac aaggatcctg cccaggtcct cctccgttgg 780
gccacccagc gcggcctggc catcatcccc aagtctagcc gcgaggccac catgaagtcc 840
aacctcaact ctcttgattt cgatctctcc gaggaggaca tcaagaccat ctctggtttc 900
gaccgcggca tccgcttcaa ccagcccacc aactacttct ccgctgagaa cctctggatt 960
ttcggttag 969
<210> 3
<211> 1569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggtttgg aggacaatag aatggttaag cgtttcgtca acgttggcga gaagaaggct 60
ggctctactg ccatggccat catcgtcggt ctttttgctg cttctggtgg tgtccttttc 120
ggatacgata ctggtactat ttctggtgtg atgaccatgg actacgttct tgctcgttac 180
ccttccaaca agcactcttt tactgctgat gaatcttctt tgattgtttc tatcttgtct 240
gttggtactt tctttggtgc actttgtgct ccattcctta acgacaccct cggtagacgt 300
tggtgtctta ttctttctgc tcttattgtc ttcaacattg gtgctatctt gcaggtcatc 360
tctactgcca ttccattgct ttgtgctggt agagttattg caggttttgg tgtcggtttg 420
atttctgcta ctattccatt gtaccaatct gagactgctc caaagtggat cagaggtgcc 480
attgtctctt gttaccagtg ggctattacc attggtcttt tcttggcctc ttgtgtcaac 540
aagggtactg agcacatgac taactctgga tcttacagaa ttccacttgc tattcaatgt 600
ctttggggtc ttatcttggg tatcggtatg atcttcttgc cagagactcc aagattctgg 660
atctccaagg gtaaccagga gaaggctgct gagtctttgg ccagattgag aaagcttcca 720
attgaccacc cagactctct cgaggaatta agagacatca ctgctgctta cgagttcgag 780
actgtgtacg gtaagtcctc ttggagccag gtgttctctc acaagaacca ccagttgaag 840
agattgttca ctggtgtggc tatccaggct ttccagcaat tgaccggtgt taacttcatt 900
ttctactacg gtactacctt cttcaagaga gctggtgtta acggtttcac tatctccttg 960
gccactaaca ttgtcaatgt cggttctact attccaggta ttcttttgat ggaagtcctc 1020
ggtagaagaa acatgttgat gggtggtgct actggtatgt ctctttctca attgatcgtt 1080
gccattgttg gtgttgctac ctcggaaaac aacaagtctt cccagtccgt ccttgttgct 1140
ttctcctgta ttttcattgc cttcttcgct gccacctggg gtccatgtgc ttgggttgtt 1200
gttggtgagt tgttcccatt gagaaccaga gctaagtctg tctccttgtg tactgcttcc 1260
aactggttgt ggaactgggg tattgcttac gctactccat acatggtgga tgaagacaag 1320
ggtaacttgg gttccaatgt gttcttcatc tggggtggtt tcaacttggc ttgtgttttc 1380
ttcgcttggt acttcatcta cgagaccaag ggtctttctt tggagcaggt cgacgagttg 1440
tacgagcatg tcagcaaggc ttggaagtct aagggcttcg ttccatctaa gcactctttc 1500
agagagcagg tggaccagca aatggactcc aaaactgaag ctattatgtc tgaagaagct 1560
tctgtttaa 1569

Claims (10)

1.一种马克思克鲁维酵母工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株是将半乳糖透过酶N376F突变体基因在耐热酵母菌株中进行多份表达；其中耐热酵母菌株是敲除了木糖还原酶基因NcXR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1的马克思克鲁维酵母。
2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的N376F突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的木糖还原酶基因NcXR的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXS1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
5.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株的构建方法的步骤如下：
1)在K.marxianu中敲除木糖还原酶基因XR和木糖醇脱氢酶基因XDH，同时过表达了多个拷贝的Neurospora crassa木糖还原酶基因NcXR和葡萄糖/木糖同向转运体基因CiGXF1，构建获得了耐热酵母菌株；
2)将多拷贝的酿酒酵母半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述的耐热酵母菌株中重组表达；
首先将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒转化进耐热酵母菌株中，获得第一轮转化菌株；
将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒再次转化进第一轮转化酵母菌株中，获得第二轮转化菌株；
将含有K.marxianus来源的启动子控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组质粒再次转化进第二轮转化酵母菌株中，发明的可高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的K.marxianus工程菌株。
6.如权利要求5所述的工程菌株，其特征在于，所述的木糖还原酶基因NcXR的拷贝数为四个。
7.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株的保藏编号为CGMCCNO：18006。
8.权利要求1-7任一项所述的工程菌株在利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇中的应用。
9.一种制备乙醇和木糖醇的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1-7任一项所述的工程菌株来发酵木质纤维素水解液来制备乙醇和木糖醇。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的木质纤维素水解液为玉米芯水解液。
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