JP2009502191A

JP2009502191A - 遺伝子組み換え酵母におけるキシロース能動輸送体の発現

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Publication number: JP2009502191A
Application number: JP2008524925A
Authority: JP
Inventors: トラヴァッソス・レアンドロ、マリア・ジョゼ; テリアガ・メンデス・ベルナルド・ゴンサウヴェス・デ・ゾエテン、パウラ・マリア; スペンサー・ヴィエイラ・マルティンス、イサベル・マリア
Original assignee: FUNDACAO DA FACULDADE DE CIENCIAS E TECNOLOGIA
Current assignee: FUNDACAO DA FACULDADE DE CIENCIAS E TECNOLOGIA
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2006-08-04
Publication date: 2009-01-29
Also published as: WO2007018442A2; US20090053784A1; PT103331A; CA2618273A1; WO2007018442A3; EP1960424A2

Abstract

本発明は、キシロース及びグルコース能動輸送体をコードする核酸配列を挿入することで遺伝子組み換えされ、キシロースと高い親和性を示すプロトンを用いた共輸送機構でキシロースを同化することができる発酵性酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供する。本発明は、産業的に関心が持たれている原材料から生じるヘキソース及びペントースの混合物中のキシロースを同化し、発酵することができる遺伝子組み換え微生物を用いて、植物性バイオマス及び他のリグノセルロース物質からバイオエタノールを製造するために有益である。

Description

本発明は、キシロース能動輸送体に対応する新規遺伝子を導入した改質酵母、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関するものである。本発明の目的は、グルコースの存在下、キシロース／プロトンの共輸送をする酵母を提供することである。本発明のもう一つの目的は、リグノセルロース加水分解物の発酵において、同じキシロース輸送系を有する組み換え酵母の使用方法を提供することである。

本発明の目的は、グルコース混合物中のキシロースをより早く同化し、より生産性が高く、より効率的にキシロースを発酵させることができるバイオエタノール燃料製造用酵母を提供する。

世界的な行動計画は、再生可能な代替エネルギーとして、バイオエタノールに関連するバイオ燃料を製造することを目標とする。前記行動計画の指針は、石油への依存を減少させ、ガスの放出を抑制し、結果として気候の変動を防ぐことに向けられている。現時点では、グルコースに富む農業由来の作物及び他の基質が、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたエタノールの工業的製造に用いられている。リグノセルロース物質は、植物バイオマスの最も豊富な構成要素である。前記リグノセルロースは、主な林産物と、農業によって生じる残余物のかなりの部分を占めている。前記リグノセルロースのエタノールへのバイオ変換は、重要な可能性を有しており、かつ、強い刺激となる。

前記リグノセルロース物質中のセルロースは、グルコースのみからなる高分子であり、一方、ヘミセルロース画分は、ヘキソース（グルコース、ガラクトース及びマンノース）及びペントース（キシロース、アラビノース及びリボース）の混合物を含む高分子で構成される。前記キシロースは、前記ヘミセルロース中に存在する主要なペントースであり、乾燥重量で１７〜３１％を構成する。全キシロースの略８０％は、前記ヘミセルロース加水分解物中の発酵性の糖として回収される。リグノセルロース物質を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより経済的にエタノールを製造するためには、キシロースを全て発酵させる必要がある。しかしながら、この酵母は、自然にはキシロースをエタノールに変換する能力を備えていない。他の種類の酵母には、キシロース発酵可能なものが存在するが、ヘミセルロース加水分解物は、発酵工程を阻害するフランやフェノール等の有機酸である化合物をいくつか含んでいる。そのため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、このような厳しい環境中で効果的に発酵することができると唯一知られている微生物である（例えば、非特許文献１参照）。

前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組み換え型は、キシロース異化のための遺伝子２つが挿入されることで作成された。前記遺伝子は、キシロースを還元してキシリトールにするキシリトールリラクダーゼ（ＸＲ）、及びキシリトールを酸化してキシルロースにするキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）である。これらは、エタノールを製造するため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるペントースリン酸経路及び解糖系を経て、自然に代謝される。前記ＸＲ及びＸＤＨの遺伝子は、自然にキシロースを発酵するＰｉｃｈｉｓｓｔｉｐｉｔｉｓ酵素から得られる。しかしながら、これらの遺伝子を有し、キシロースを代謝するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、有意な濃度のエタノールを製造しない。この酵母において、前記キシルロースは、キシルロースキナーゼ（ＸＫ）によりリン酸化され、キシルロース−５−リン酸となる。本来のＸＫ遺伝子は、異種起源のＸＲ及びＸＤＨを備えるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ系統中において過剰発現される。遺伝子の新規組合せは、染色体統合により、表現型が安定して、かつ工業用基質での培養が容易な系統を生成することを目的として行われた（例えば、特許文献１参照）。前記生成された系統は、有意な濃度のエタノールを製造することができるが、その生産力は低い。

組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ系統を用いて、キシロース由来のエタノール製造の生産性を向上させるいくつかの計画が進められている。これらの計画のうち３つは成功した。一つは、突然変異原としてＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをランダムに突然変異させ、その後、得られた変異体から、より効率的な発酵を行うものを選択する方法である（例えば、特許文献２参照）。もう一つとして、組み換え株に強い選択的応力を与え、ケモスタット及び嫌気条件下で連続培養し、キシロース発酵に最も適切なものを選択する方法である（例えば、特許文献３参照）。第３には、細菌で通常行われているキシロース異化経路を用いる方法である。このグループの微生物では、前記キシロースは、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）によって直接キシルロースに変換される。細菌由来のＸＩをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に発現させる一連の試みは失敗した。近年、菌類由来のＸＩを単離し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させることに成功した（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、利用できる最良の系統を用いても、キシロース由来のエタノール製造で得られる生産性は、グルコース発酵する酵母を用いて得た場合と比較して、まだ劣っている。より高い生産性を得る障壁となっている可能性の一つとして、キシロースが細胞に流入することが発見された（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。

キシロースは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグルコース及び他のヘキソースの細胞内への早い流入を仲介する輸送体の弱い基質である。ＨＸＴ輸送体は、グルコースに対するより、キシロースに対して１倍または２倍低い親和性を示す。従って、グルコースの存在下では、キシロースは同化されない。グルコースがない場合に、キシロースが同化されるので、従って、発酵性能はまた、減少している。キシロースに対して、より高い親和性を有する輸送体の発現、即ち、プロトン共輸送型の能動輸送機構を介してキシロースを輸送する輸送体は、エタノールのより効率的な生産が可能である。キシロース／プロトン共輸送を行う系統において、細胞内へのキシロースの輸送のためのエネルギー消費は、より低いバイオマス収率に翻訳され、付随してエタノール製造に対する生産率が上昇する。

キシロースで自然増殖することができる酵母のうち、ＣａｎｄｉｄａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａＰＹＣＣ４７１５は、その高い比成長率という点で傑出している。この酵母は、キシロースに対する２つの輸送機構を有しており、一つは促進拡散型の輸送機構で、もう一つは、キシロース／プロトン共輸送型の輸送機構である。後者の輸送機構は、キシロースに対する高い親和性を示し、該キシロースの濃度が比較的に低いときにのみエタノールを製造する（非特許文献４参照）。この酵母は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に発現させる活性キシロース輸送体（ＧＸＳＩ）の単離する遺伝子として適切であると考えられている。

開発が進められているにもかかわらず、組み換え酵母は、いまだキシロースからのエタノール製造に十分な効率を得るに至っていない。リグノセルロース物質の発酵技術の状況を向上させ、産業レベルでバイオエタノールを製造する必要がある。
国際公開第９７／４２３０７号パンフレット米国特許出願公開第２００３／０１５７６７５号明細書国際公開第０３／０７８６４３号パンフレット国際公開第０３／０６２４３０号パンフレット Olsson and Hahn-Hagerdal, 'Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production', Enzyme Microbial Technol. 18: 312-331, 1996 Hahn-Hagerdal et al, 'Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization', Adv Biochem. Eng/ Biotechnol. 73: 53-84, 2001 Jeffries and Jin, 'Metabolic engineering for improved fermentation of pentose by yeasts', Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 495-509, 2004 Gardony et al, 'High capacity xylose transport in Candida intermedia PYCC 4715', FEMS Yeast Res. 3: 45-52, 2003

本発明の目的は、リグノセルロース物質からバイオエタノールを、より効率的かつ経済的に製造する方法を提供することである。

かかる問題を解決するため、本発明者らは、発酵性の酵母に自然に備わっている輸送体と比較して、キシロースに対する非常に高い親和性を有するＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから、キシロース／グルコースを対象とする能動輸送体をコードする遺伝子を同定し、単離することができ、それに基づいて本発明を成すに至った。前記遺伝子を宿主細胞に挿入することで、潜在的により効率的に、産業的に関心が持たれている原材料から生じたヘキソース及びペントースの混合物中に存在するキシロースを消費し、発酵させて、バイオエタノールを製造することができる。

従って、本発明の第１の態様は、キシロース／グルコース能動輸送体をコードする単離されたＤＮＡ断片において、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または、ｂ）配列番号１の＋１１３８から＋１３１５の断片の少なくとも８０％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはその相補的な配列を備えることを特徴とするｃＤＮＡ分子である。

本発明の第２の態様は、ｃＤＮＡ分子において、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または、ｂ）配列番号１の＋１１３８から＋１３１５の断片の少なくとも８０％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはその相補的な配列を備えることを特徴とする。

本発明の第３の態様は、請求項１記載のＤＮＡ断片を備えることを特徴とするプラスミドである。

本発明の第４の態様は、宿主細胞が、前記キシロース／グルコース能動輸送体を発現するため、請求項３記載のプラスミドで形質転換されていることを特徴とする宿主細胞である。

本発明の最後の態様は、請求項４〜６のいずれか１項記載の形質転換宿主細胞を用いて、培地に含まれるキシロースから、キシロース発酵によってエタノールを製造する方法である。

本発明の好ましい実施形態によると、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシロース能動輸送体を発現する工程は発展した。この工程は、酵母に異種のＤＮＡを挿入し、そこにキシロース／グルコース共輸送型の新規キシロース輸送機構の遺伝子を一体化させるものである。

本発明において、前記遺伝子を分離、複製及び発現させる工程は、以下のように行った。しかしながら、当業者によって別の方法で行われてもよい。

［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、キシロース／グルコース−Ｈ^＋能動輸送体の同定］
Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの前記キシロース／グルコース−Ｈ^＋能動輸送体は、誘導条件及び抑制条件下で培養されたＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ細胞から分離された形質膜中に存在する比較的豊富なタンパク質と比較することによって同定された。この目的のために、形質膜及びミトコンドリア膜を、単一の炭素源及びエネルギー源として、選択的に０．５％キシロース、２％グルコース、または４％キシロースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９２）で培養された細胞から分離した。前記分離された細胞を、増殖の指数増殖期（ＤＯ_６４０＝０．８〜２．０）に収集し、氷冷蒸留水で２回洗浄して、続いて緩衝液Ａ（０．１Ｍグリシン、０．３ＭＫＣＬ、ｐＨ７．０）で１回洗浄した。１０〜１５ｇの細胞を、その後、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ１５ｍｌで再懸濁した。前記膜の分離は、ＶａｎＬｅｅｕｗｅｎらによって説明された方法（１９９１）で行われた。得られた試料を分取（２０μｇ）し、トリシンの存在下、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動が行われた（トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｓｃｈｌａｇｇｒｅｒ，１９９４）。前記ゲルに用いられるアクリルアミド及びビスアクリルアミドの濃度は、１０％Ｔ及び３％Ｃであった（％Ｔはアクリルアミド及びビスアクリルアミドの総濃度、％Ｃは全タンパク質に対するビスアクリルアミドの割合）。前記形質膜の試料を示すバンドパターンは、対応するミトコンドリア膜の試料を示すものと明らかに異なっている（図１）。これは、２つの膜型の効果的な分離が行われていることを示す。従って、形質膜試料のバンドパターン間の観察された相違（異なる炭素源に対応する）は、ミトコンドリアのタンパク質の混入による結果物ではないことが分かる。

前記形質膜試料の３例において、最も顕著な相違点を、図１において矢印で示す。これは、０．５％キシロース中で培養した形質膜の細胞のみ似存在すると思われる分子量が略４０ｋＤａのタンパク質に対応する。このタンパク質は、分子量から予測される範囲では、糖輸送体であり、前記バンドは、おそらくＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａにおいて速度論的に特徴付けられる前記キシロース／グルコース能動輸送体に対応すると考えられる。

［前記キシロース／グルコース能動輸送体をコードするｃＤＮＡの複製］
上述したように同定された膜タンパク質は、０．５％キシロース中で培養されたＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ細胞の全膜タンパク質のうち２５０μｇを予め作製したゲルに装填し、分離を行った。電気泳動後、前記膜タンパク質は、ＰＶＤＦ膜（商品名：Ｓｅｑｕｉ−ｂｌｏｔ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）に転写した。前記電気泳動は、製造業者によって提供される使用法に従って行われた。関心のある前記膜タンパク質を含む膜断片は、分離され、該膜タンパク質のＮ末端の配列決定に用いられた（ＰｒｏｔｅｉｎＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ、コロンビア大学、米国）。これによって得られた１５アミノ酸の配列を図２に示す。前記配列より、縮重プライマーが設計された（図２）。前記設計された縮重プライマーは、０．５％キシロース中で培養された細胞の全ＲＮＡから、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA Ends）によって、前記ｃＤＮＡが増幅された。この目的のために、製造業者により提供される使用法に従って、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（アンビオン株式会社製）を用いた。前記ＲＮＡは、Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎらによって説明された方法（１９９６）に従って抽出され、次に、該抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ洗浄プロトコル（ＲＮｅａｓｙキット、株式会社キアゲン製）によって精製した。前記精製されたＲＮＡ試料は、ＣｉＧＸＳＬ１プライマー（５’−ＧＡＲＧＡＹＡＡＹＭＧＩＡＴＧＧＴＩＡＡＲＭＧ−３’）と、ＣｉＧＸＳＬ２プライマー（５’−ＡＡＲＭＧＩＴＴＹＧＴＩＡＡＹＧＴＮＧＧ−３’）とを組み合わせて、３’ＲＡＣＥ法の鋳型として用いた（Ｉ＝イノシン、Ｙ＝ＣＴＴ、Ｋ＝ＡＪＧ、Ｍ＝ＡＪＧ及びＮ＝Ａ／Ｔ／またはＣ）。前記プライマーの設計は、前記膜タンパク質の第１アミノ酸の配列に基づいているので、前記３’ＲＡＣＥ法の反応によってほとんど完全な前記ｃＤＮＡを製造することができると予測される。実際、この反応で、約１．７ｋｂの産物が得られ、該産物は、ｐＭＯＳＢｌｕｅベクター中で複製され、自動シークエンサーＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）及び該ベクターの配列に対して特異的なＣｙ５で標識化されたプライマーを用いて部分的に配列を決定した。この分子によってコードされたタンパク質は、糖輸送体の特徴的な特性を示した。次に、ノーザンブロット解析を行った。これにより、０．５％キシロース中で培養された細胞には、前記ｍＲＮＡ夫々が豊富に含まれているが、２％グルコース中で培養された細胞からは検出されないことが示された。

前記ｃＤＮＡの５’末端は、ＣｉＧＸＳＲ３（５’−ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＧ−Ｓ’）プライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法により得られた。前記得られた断片は、複製され、上述した方法と同様に配列が決定され、付加的なアミノ酸（開始メチオニン）及び２８または３１アミノ酸のリーダー配列がコードされていること示しており、翻訳開始の２つの活性部位が存在していることを示唆する。この新規遺伝子を、ＧＸＳ１（ＧｌｕｃｏｓｅＸｙｌｏｓｅＳｙｍｐｏｒｔ１）とした。対応するヌクレオチド配列（配列番号１）を、図４に示す。

［Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能発現］
前記ＧＸＳ１遺伝子によってコードされた新規輸送体が、グルコース及びキシロースに対する輸送体であることを確認するため、いくつかのプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でｃＤＮＡが発現するように設計した。前記ＰＧＫ１遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含む高コピー数ベクター（ｐＭＡ９１；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、１９９０）を、次の方法でＧＸＳ１からｃＤＮＡの複製に用いた。まず、前記ＧＸＳ１遺伝子の全コード領域を、ＧＸＳ１Ｐ１プライマー（５’−ＡＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＡＧＡＡＴＧ−３’）及びＧＸＳ１Ｐ２プライマー（５’−ＡＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＲＲＣＴＴＣＡＧＡＣ−３’）を用いたＰＣＲによって増幅した。前記両プライマーは、５’末端にＢｇｌＩＩに対する認識領域を有しており、また、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩに対する認識領域も有している。前記ｐＭＡ９１プラスミドを、その後ＢｇｌＩＩにより消化し、同酵素で消化されたＧＸＳ１由来のコード領域を含む断片と連結して、ｐＰＧＫ−ＧＸＳ１プラスミドとした。

異なるキメラ遺伝子が、切り取られたＨＸＴ７遺伝子のプロモーターを用いて設計され、ＹｐＬａｃ１９５ベクター（多複製）及びＹＣｐＬａｃ１１１ベクター（単一複製）中で複製された（Ｇｉｅｔｚら、１９８８）。ＨＸＴ７プロモーターの−３９２から−１ヌクレオチドを備えるＤＮＡ断片は、ＨＸＴ４ｐｒｏｍ１プライマー（５’−ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＧＧ−３’）、ＨＸＴ７ｐｒｏｍ２プライマー（５’−ＧＧＡＣＧＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴ−３’）、及び、鋳型としてＹＥｐｋＨＸＴ７プラスミドを用いたＰＣＲによって増幅された（Ｋｒａｍｐｅら、１９９８）。次に、前記断片を、ＰｓｔＩ及びＮｄｅＩを用いて消化し、その後、前記プライマーはこれらの酵素の認識部位を含んでいるので、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化されたＹＥｐＬａｃ１９５プラスミドと連結し、ｐＨＧＸＳ１プラスミドとした。その後、前記ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を含む０．３ｋｂ断片を、ＰＧＫＩｔｅｒｍ１プライマー（５’−ＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧ−３’）、ＰＧＫＩｔｅｒｍ２プライマー（５’−ＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧＡＡＣＧＣＡＧＡＡ−３’）、及び鋳型としてｐＭＡ９１プラスミドを用いて増幅した。前記プライマーは、それぞれ、５’末端に前記ＸｂａＩ及びＳａｃＩ酵素の認識部位を有する。次に、前記ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を含む断片を、これらの酵素で消化し、前記ｐＨＧＸＳ１プラスミドの前記ＸｂａＩ部位及び前記ＳａｃＩ部位間を連結し、ｐＨＸＴ７−ＧＸＳ１プラスミドとした。

最後に、前記ｐＨＸＴ７−ＧＸＳ１プラスミドを、前記キメラ遺伝子全てを含む断片を作るＰｓｔＩ及びＳａｃＩを用いて消化し、次に、該消化物を同酵素によって消化されたＹＣｐｌａｃ１１１ベクター（Ｇｉｅｔｚら、１９８８）に挿入して、ｐＨＸＴ７−ＧＸＳ１プラスミドとした。

上記で得られた３種のプラスミドは、その後Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＭＢ３２０１を形質転換するために用いられた（MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δstl１ Δagt１ Δmph2 Δmph3 Ieu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ １:: YIpXR/XDH/XK MAL2-8^C SUC2; Hamacher ら, 2002）。前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＭＢ３２０１は、グルコースまたはキシロースに対する輸送機構を全く発現しないので、炭素源及びエネルギー源として該グルコースまたは該キシロースを用いることができない。前記形質転換により、ＭＪＹ２−４系統としてＭＪＹ２（ＴＭＢ３２０１＋ｐＨＸＴ７−ＧＸＳ１）、ＭＪＹ３（ＴＭＢ３２０１＋ｐＰＧＫ−ＧＸＳ１）及びＭＪＹ４（ＴＭＢ３２０１＋ｐＨＸＴ７−ＧＸＳ１−ｓ）を得た。

グルコースまたはキシロース中での成長能力の欠如は、高コピー数プラスミドを含むＭＪＹ２及びＭＪＹ３の両系統により補完されることで克服されたが、単一の炭素源及びエネルギー源としてキシロースのみで育てる場合は、非常に弱く、そして固体培地でのみ培養することができた。低コピー数プラスミドを含むＭＪＹ４系統は、グルコース中での成長が非常に弱く、そしてキシロース中では成長できない。これは、前記低コピー数プラスミドにより得られる可能性よりも、遺伝子がより強く発現することに依存して、補完が生じることを示唆する。

前記ＭＪＹ２系統はキシロース及びグルコース能動輸送体の存在を調べるために用いられた。２％（ｗ／ｖ）のグルコース、ロイシン、及びトリプトファンを付加されたＹＮＢ培地（Yeast Nitrogen Base）で培養された前記ＭＪＹ２系統の細胞の水性懸濁液へのＤ−グルコースまたはＤ−キシロースの添加は、いずれの場合も細胞外ｐＨの増大を引き起こす。これは、前記輸送体に関連して、プロトンが流入し、従って、能動輸送機構として、糖及びプロトンの共輸送が生じていることを示している（図４）。この分析は、前記ＧＸＳ１遺伝子が能動輸送機構の輸送体をコードし、該輸送体は、グルコース及びキシロースの両方を基質として受容することを示す。

［Ｇｘｓ１ｐによる糖輸送の動態（kinetic）］
Ｇｘｓ１ｐによって伝達された輸送体の反応速度定数は、前記能動輸送機構のみを発現するＭＪＹ２系統で決定された。しかしながら、その高親和性にもかかわらず、この輸送体の性能は、促進拡散機構と比較して、高い輸送速度とはならない。そのため、２種類の輸送型の親和力が、基質としてキシロースを用いる場合（促進拡散：Ｋｍ＝４９ｍＭ；共輸送：Ｋｍ＝０．４ｍＭ；２５℃、ｐＨ５）に代えて、ちょうど一桁異なる親和力となる基質として、^１４Ｃ−Ｄ−グルコースを用いた場合（促進拡散：Ｋ_ｍ＝２〜４ｍＭ；共輸送：Ｋ_ｍ＝０．２ｍＭ；２５℃、ｐＨ５）の反応速度分析(Spencer-Martins ら, １９８５)によって得られる値の意義を検討するために、Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ中に存在する前記２種類の輸送型を発現するＭＪＹ５系統が用いられた。図５によると、グルコースに対して明らかに２相の動態が観察され、これは、促進拡散型、及び本発明において同定し、複製した、高い親和率を有する前記キシロース／グルコース−Ｈ^＋能動輸送体が同時に存在することを表わしている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中にこれらの条件で決定された前記動態のパラメータは、前記ＧＸＳ１遺伝子の起源であるＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａにおいて得られたものと近似していた。

［他の輸送体との相同性］
ＧＸＳ１の特徴付けは、Ｇｘｓ１ｐに対するいくつかの相同性を有するタンパク質ファミリーを発見し、そして、それは他の酵母にも存在することが分かった（Debaiyomyces hansenii、 Yarrowia lipolytica 及びCandida albicans、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：各々ＣＡＧ８６６６４、ＥＡＬ０１５４１及びＣＡＧＳ１８１９）。これらタンパク質はいずれも、その機能は知られていない（糖輸送体であるとの推定のもと、データバンクに登録されている）。

０．５％キシロース（Ｘ）、２％グルコース（Ｇ）及び４％キシロース（４Ｘ）中で培養されたＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ細胞から分離された形質膜及びミトコンドリア膜の全タンパク質２０μgの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％Ｔ）。前記ゲルは、クマシーブルーで染色された。Ｍ：シグママーカー（広範囲）、p：形質膜、ｍ：ミトコンドリア膜。Ｇｘｓ１ｐタンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列、及び該領域から設計された変性プライマー。ＧＸＳ１遺伝子発現のノーザンブロット解析。全ＲＮＡは、単一炭素源及びエネルギー源として、０．５％キシロース（Ｘ）、２％グルコース（Ｇ）及び４％キシロース（４Ｘ）を含むＶｅｒｄｕｙｎ培地で培養されたＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａＰＹＣＣ４７１５から分離された。各試料は、全ＲＮＡ１０μgを含み、変性１．２％アガロースゲルで分離され、次に、ナイロン膜（商品名：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に転写した。ＣｉＧＸＳＬ１プライマー及びＣｉＧＸＳＲ３プライマーで増幅された３００ｂｐ断片は、ＧＸＳ１遺伝子に対する特異的なプローブとして用いられた。アクチン遺伝子由来の１７２ｂｐ断片は、ＡｃｔＣｉＬ１プライマー（５’−ＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡ）及びＡｃｔＣｉＲ１プライマー（５’−ＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＡ）並びに、鋳型として、Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａＰＹＣＣ４７１５由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅された。これらのプローブは、Ｐｒｉｍｅ−ａ−ＧｅｎｅＬａｂｅｌｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社製）を用いて、［α−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）で標識化された。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎらによって説明された方法に従って行われた。開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドン（ＴＡＡ）までのＧＸＳ１遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド配列。前記配列の＋１１３８から＋１３１５までを陰付きで示す。２％（ｗ／ｖ）グルコースを有する無機培地で培養されたＭＪＹ２系統の細胞の水性懸濁液に、キシロース（Ｘ）又はグルコース（Ｇ）を添加することによって誘導された細胞外アルカリ化を示すグラフ。２％（ｗ／ｖ）グルコースを有する無機培地で培養されたＭＪＹ２系統の細胞内へのＤ−［^１４Ｃ］キシロースの初期輸送速度（◆）と、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び０．０５％マルトースを有する無機培地で培養されたＭＪＹ５系統の細胞内へのＤ−［^１４Ｃ］グルコースの初期輸送速度（□）とを表すＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロット。

Claims

キシロース／グルコース能動輸送体をコードする単離されたＤＮＡ断片において、
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または、
ｂ）配列番号１の＋１１３８から＋１３１５の断片の少なくとも８０％の相同性を有するヌクレオチド配列、若しくはその相補的な配列
を備えることを特徴とするＤＮＡ断片。
ｃＤＮＡ分子において、
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または、
ｂ）配列番号１の＋１１３８から＋１３１５の断片の少なくとも８０％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはその相補的な配列
を備えることを特徴とするｃＤＮＡ分子。
請求項１記載のＤＮＡ断片を備えることを特徴とするプラスミド。
前記キシロース／グルコース能動輸送体を発現するため、請求項３記載のプラスミドで形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
酵母であることを特徴とする請求項４記載の宿主細胞。
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることを特徴とする請求項５記載の宿主細胞。
請求項４〜６のいずれか１項記載の形質転換宿主細胞を用いて、培地に含まれるキシロースから、キシロース発酵によってエタノールを製造することを特徴とする方法。