WO2015188244A1

WO2015188244A1 - Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica, processo para a transformação de célula eucariótica, micro-organismo geneticamente modificado, processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímico assim produzidos

Info

Publication number: WO2015188244A1
Application number: PCT/BR2015/050075
Authority: WO
Inventors: Leandro Vieira DOS SANTOS; Gonçalo Amarante Guimarães PEREIRA
Original assignee: Biocelere Agroindustrial Ltda.
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2015-12-17
Also published as: PT3165609T; SI3165609T1; US20170114350A1; BR112016028778A2; BR102014014407A2; HUE048401T2; EP3165609A4; HRP20200240T1; EP3165609A1; PL3165609T3; DK3165609T3; ES2773639T3; EP3165609B1; RS59923B1; US10155953B2; BR112016028778B1

Abstract

A presente invenção descreve um cassete de expressão para transformar célula eucariótica que compreende a sequência não natural de nucleotídeos codificadora de peptídeo com característica xilose isomerase (SEQ ID NO:1), opcionalmente compreendendo também outros genes da via das pentose fosfato. Adicionalmente, é descrito micro-organismo depositado sob número DSM28739, que, além das modificações acima descritas, apresenta também modificações genéticas provenientes de evolução adaptativa. O micro-organismo descrito apresenta eficiente consumo de xilose e conversão de etanol quando comparado ao seu correspondente sem as ditas modificações genéticas e mutações provenientes de evolução. Descreve-se também processo para produção de biocombustíveis e bioquímicos, preferencialmente etanol, a partir principalmente da porção lignocelulósica da biomassa vegetal. São descritos também biocombustíveis, preferencialmente etanol, e bioquímicos produzidos pelo processo da invenção.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

CASSETE DE EXPRESSÃO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA EUCARIÓTICA, PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA EUCARIÓTICA, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEL E/OU BIOQUÍMICO ASSIM PRODUZIDOS CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se relaciona a biocombustíveis, bioquímicos e a processos para sua obtenção. Mais especificamente, a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, preferencialmente a partir de polímeros da parede celular vegetal. Dentre outros objetos, a presente tecnologia descreve um cassete de expressão para transformação de células eucarióticas e um micro-organismo geneticamente modificado, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis. O micro-organismo da presente invenção passou por processo de melhoramento por engenharia evolutiva de modo a ampliar seu consumo de xilose, favorecendo assim seu desempenho em escala industrial. São também descritos um processo para a obtenção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A necessidade da substituição da matriz mundial de combustíveis baseada em fontes fósseis por alternativas renováveis tornou a produção de combustíveis de segunda geração, por exemplo, etanol, uma das mais promissoras tecnologias em fase de desenvolvimento. Este processo consiste na conversão de polímeros que formam a biomassa vegetal, principalmente aqueles presentes na parede celular como celulose, hemicelulose e lignina, em biocombustíveis e/ou bioquímicos. [0003] A biomassa vegetal é uma mistura complexa de compostos quimicamente distintos que podem ser fracionados gerando componentes com aplicações específicas. Assim, do mesmo modo que uma refinaria petroquímica produz uma grande variedade de produtos derivados do petróleo bruto, os mesmos princípios podem ser aplicados a biorrefinarias, ou seja, refinarias baseadas em biomassa (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquímica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).

[0004] A utilização da biomassa vegetal como fonte de açúcares fermentescíveis é uma alternativa promissora e sustentável, entretanto, alguns desafios ainda precisam ser superados, como a disponibilização dos açúcares da parede celular vegetal. Esse procedimento pode ser feito através da ação de enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases), as quais disponibilizam os monômeros de açúcares (hexoses e pentoses) que, por sua vez, são posteriormente metabolizados por micro-organismos para geração de bioquímicos e biocombustíveis.

[0005] Entretanto, micro-organismos naturalmente capazes de consumir açúcares presentes nas cadeias de celulose e hemi-celulose, não são geralmente passíveis de utilização em escala industrial de forma eficiente. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento de micro-organismos com capacidade de utilizar esses açúcares da parede celular vegetal de forma eficiente em escala industrial, como o descrito na presente invenção.

[0006] A utilização de micro-organismos como plataformas eficientes na conversão de açúcares da biomassa em produtos de alto valor agregado é amplamente descrita. Nesse contexto, a levedura Saccharomyces cerevisiae tem recebido papel de destaque devido sua robustez e tolerância em condições de fermentação industriais. A facilidade de manipulação genética desse organismo e o uso de ferramentas de engenharia metabólica, em sinergia com biologia de sistemas e biologia sintética tem possibilitado a inclusão de novas rotas metabólicas para a produção de combustíveis e químicos como etanol, biobutanol, biodiesel, 1 ,2-propanediol, ácido succínico, ácido pirúvico, entre outros [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671 -90, 2012].

[0007] Linhagens selvagens de S. cerevisae não são naturalmente capazes de fermentar pentoses, como, por exemplo, a xilose, presente na biomassa. Entretanto, diversos trabalhos já realizaram procedimentos de engenharia metabólica em S. cerevisiae através da introdução nesses organismos de vias metabólicas para consumo de xilose, tendo como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI).

[0008] Dentre os trabalhos realizados, a introdução de gene que codifica a enzima xilose isomerase (XI) permite que a cepa apresente maior rendimento na produção de álcool e/ou ácidos do que quando ela é modificada com outros genes, como por exemplo, gene que codifica xilose redutase ou xilitol desidrogenase, visto que ocorre um menor acúmulo de subprodutos não desejáveis, como xilitol e glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664].

[0009] A via XR-XDH, presente em micro-organismos eucariotos, consiste em duas reações de oxi-redução, onde a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em uma reação mediada por NADPH/NADH e em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD⁺. O cofator NADPH é principalmente regenerado na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, com produção de CO₂. Porém, NAD⁺ é regenerado principalmente na cadeia respiratória, com o O₂ como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigénio, não ocorre a completa reoxidação de NAD⁺, resultando em um desbalanço redox e no acúmulo de xilitol, o que impacta diretamente no rendimento final de etanol [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1 , p.49-59, 2002]. Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol, devido à reoxidação do excesso de NADH via XDH [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004]. [0010] A via xilose isomerase (XI), mais comum em procariotos, ocorre em um único passo, evitando o desbalanço redox e a formação de subprodutos que diminuem o rendimento de etanol. Por várias décadas, tentativas de expressão heteróloga de XI bacterianas em S. cerevisiae não foram bem sucedidas [Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v.32, n.2, p.252-259, 2003]. Em 2003, a expressão funcional em S. cerevisiae de uma xilose isomerase do fungo anaeróbio Piromyces sp. [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.1 , p.69-78, 2003] e em 2009 do fungo Orpiromyces sp. [Applied Microbiology and Biotechnology, Heidelberg, v.82, n.6, p. 1067-1078, 2009], resultou em mutantes capazes de crescer em xilose como única fonte de carbono, com altas atividades dessas enzimas, maior rendimento na produção de etanol, menor produção e acúmulo de metabolitos intermediários e com menor repressão catabólica em meio contendo glicose e xilose [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.4, p.399-409, 2005a; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.10, p.925- 934, 2005b]. A via XR-XDH tem maior produtividade inicial por produzir etanol mais rapidamente, apenas com a inserção dos genes responsáveis pela conversão da xilose, porém a via XI tem um maior rendimento por não acumular subprodutos [Microbial Celi Factories, Londres, v.6, n.5, p.1 -10, 2007].

[0011] Diversos documentos, como, por exemplo, WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 e WO2014018552 descrevem micro-organismos capazes de utilizar pentoses, mais especificamente xilose, como fonte de carbono. Para que seja capaz de consumir xilose, é necessário que o micro-organismo seja geneticamente modificado no mínimo com a adição do gene que codifica a xilose isomerase. Como estratégia de melhorar a produtividade da levedura, pode-se superexpressar os genes que codificam a Xiluloquinase e os genes da via das pentoses fosfato: Transcetolase, ribose 5- fosfato isomerase, ribose 5-fosfato epimerase e Transaldolase. Além disso, pode ser realizada a inativação do gene que codifica uma aldose redutase {GRE3), visando um menor acúmulo de xilitol e um maior rendimento de etanol.

[0012] Dessa forma, a literatura mostra que o aumento da expressão dos genes descritos acima que favorecem a conversão de xilose a etanol é necessário para que o consumo desse açúcar seja eficiente. Assim, os microorganismos descritos no estado da técnica, que foram geneticamente modificados para consumo de xilose, podem possuir (porém não necessariamente) as modificações genéticas descritas acima. O que basicamente diferencia a eficiência e produtividade na conversão anaeróbia de xilose em biocombustíveis e/ou bioquímicos apresentada por cada um desses micro-organismos é a forma e local como esses genes são incorporados ao genoma do micro-organismo, considerando a melhor combinação possível entre esses genes e respectivos promotores pelos quais estão regulados, bem como a adequada escolha pela sequência de nucleotídeos que codifica a xilose isomerase, sendo esse o principal gene que quando expresso possibilita o consumo de xilose por cada micro-organismo modificado, além de adaptação do micro-organismo por meio de evolução. Assim, a presente invenção nos mostra vantajosamente melhor rendimento e produtividade frente aos microorganismos previamente descritos no estado da técnica.

[0013] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado para inclusão dos genes da via das pentose fosfato, bem como o da Xiluloquinase, e inativação do gene da aldose redutase, como descrito nos documentos WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 e WO2014018552. O micro-organismo modificado geneticamente da presente invenção difere vantajosamente dos anteriores pelo fato de os genes terem sido mais eficientemente combinados com seus promotores, bem como inseridos em localização mais conveniente no genoma do micro-organismo, quando comparado com os documentos previamente sitados. Adicionalmente, o gene que codifica xilose isomerase aqui inserido ter sido otimizado, pelos inventores, para os códons preferenciais do micro- organismo no qual foi primeiramente inserido, no caso o micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae. No presente documento os genes são inseridos do micro-organismo através de recombinação homóloga, passando, então a integrar seu genoma.

[0014] No que se refere especificamente à produção de etanol, a obtenção de algumas linhagens aptas a atuarem em escala industrial foi bem sucedida. Porém, tais cepas ainda são susceptíveis a ter seu desempenho fermentativo comprometido ou mesmo serem substituídas por linhagens selvagens quando submetidas às condições estressantes do processo brasileiro de produção de etanol.

[0015] No processo fermentativo brasileiro para produção de etanol é usual que as usinas façam a reutilização intensiva de células de levedura utilizadas na fermentação, processo esse conhecido como reciclagem. Nesse processo até 90% das leveduras podem ser reutilizadas de uma fermentação para outra, resultando em densidades celulares muito elevadas no interior do fermentador e fazendo com que o tempo de fermentação seja muito curto [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008].

[0016] Em algumas plantas industriais, a reciclagem pode ocorrer durante todo o período da safra, durando até nove meses. Assim, o período prolongado de reciclagem somado à contínua entrada de contaminantes microbianos no sistema, torna o ambiente da fermentação altamente competitivo, impondo severas tensões bióticas e abióticas sobre as cepas de leveduras utilizadas no processo [International Sugar Journal, Londres, v.112, p.86-89, 2010]. Este ambiente competitivo resulta na substituição das leveduras que iniciaram o processo de fermentação por leveduras selvagens. Esse fato acontece, pois as leveduras selvagens ocorrem naturalmente na cana-de-açúcar e, portanto, são inseridas juntamente com ela no processo de fermentação, acabando, assim, por contaminar todo o processo industrial [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008]. [0017] Adicionalmente, alguns trabalhos já demonstraram que aquelas leveduras que iniciam o processo de fermentação, e acabam sendo substituídas pelas selvagens, também não são capazes de sobreviver às situações estressantes do processo industrial de fermentação, como alta concentração de etanol, alta temperatura, estresse osmótico em decorrência de sais e açúcares, acidez, sulfitos e contaminação bacteriana [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008]. Assim, a obtenção de linhagem com eficiente capacidade de resistência ao agressivo processo de fermentação industrial, bem como passível de modificações genéticas para aquisição de características de interesse, como consumo de pentoses, mais especificamente xilose, não é um processo trivial.

[0018] O micro-organismo descrito na presente invenção, portanto, é vantajosamente adaptado ao processo brasileiro de fermentação industrial e mostra-se diferencialmente eficiente na conversão de açúcares da biomassa vegetal, principalmente material lignocelulósico, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, ou seja, com rendimento suficiente para ser aplicado em escala industrial, mesmo sob as condições estressantes do processo de fermentação brasileiro. Adicionalmente, o micro-organismo descrito na presente invenção apresenta características de interesse industrial como: ser uma cepa não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, entre outros.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0019] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica caracterizado por compreender:

a) pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de: xilose isomerase (SEQ ID NO:1 ), transaldolase (SEQ ID NO:5), ribose 5-fosfato isomerase (SEQ ID NO:7), xiluloquinase (SEQ ID NO:9), transcetolase (SEQ ID NO:1 1 ) e ribose 5-fosfato epimerase (SEQ ID NO:12); b) pelo menos uma sequência nucleotídica promotora selecionada do grupo consistindo de: promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:2), promotor 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:6), promotor da enzima álcool desidrogenase 1 (SEQ ID NO:8);

c) pelo menos uma sequência nucleotídica terminadora selecionada do grupo consistindo de: terminador gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:3), terminador de álcool desidrogenase (SEQ ID NO:10), terminador 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:13);

e em que a sequência nucleotídica definida em a) está funcionalmente ligada à sequência nucleotídica promotora definida em b) e à sequência nucleotídica terminadora definida em c), sendo heteróloga qualquer das referidas sequências.

[0020] É um outro objeto da presente invenção um processo para a transformação de célula eucariotica compreendendo a introdução, na célula a ser transformada, de pelo menos um cassete de expressão conforme definido pela presente invenção.

[0021] É um outro objeto da presente invenção um micro-organismo geneticamente modificado compreendendo pelo menos um cassete de expressão conforme definido pela presente invenção.

[0022] É um outro objeto da presente invenção o micro-organismo geneticamente modificado Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0023] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos que compreende a etapa de cultivo do micro-organismo conforme definido pela presente invenção.

[0024] É um outro objeto da presente invenção o biocombustível que é obtido pelo processo conforme definido pela presente invenção.

[0025] É um outro objeto da presente invenção o bioquímico que é obtido pelo processo conforme definido pela presente invenção.

[0026] A presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento. Mais especificamente, o microorganismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a qualquer célula eucariótica passível de transformação genética, podendo consistir de leveduras ou fungos filamentosos, preferencialmente uma levedura do género Saccharomyces.

[0027] O micro-organismo da invenção proporciona eficiente performance na conversão de açúcares presentes na biomassa vegetal, preferencialmente material lignocelulósico, em bioquímicos e/ou biocombustíveis. Portanto, em uma concretização a presente invenção descreve um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente que seu correspondente sem as modificações genéticas na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2- propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto se restringir a esses, sendo xilose a pentose preferencial para conversão, sem entretanto restringir-se a ela.

[0028] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase. Essa sequência foi originalmente descrita em Orpinomyces sp. [Appl Microbiol Biotechnol, 82:1067-1078, 2009] {XI, EC 5.3.1 .5) e manualmente otimizada pelos presentes inventores para os códons preferencialmente utilizados por Saccharomyces cerevisiae. A otimização compreende comparação entre códons presentes na sequência de Orpinomyces com aqueles preferencialmente usados por Saccharomyces visando a substituição dos mesmos mantendo, entretanto, a proporção de códons presentes em Saccharomyces. A sequência otimizada de xilose isomerase descrita na presente invenção (representada em SEQ ID NO:1 ) é, portanto, não natural e diferente de sequências naturais de xilose isomerase já descritas. A SEQ ID N0:1 pode ser também útil para inserção em célula eucariótica e expressa em sua forma ativa. A sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1 pode apresentar- se em cópia única ou em múltiplas cópias no genoma.

[0029] A célula eucariótica hospedeira (célula-alvo) geneticamente modificada pode, adicionalmente, conter genes da via das pentose fosfato, visando um aumento na velocidade de conversão da xilose. Portanto, adicionalmente à inserção de SEQ ID NO:1 na célula hospedeira, a presente invenção descreve modificações genéticas nessa mesma célula que visem o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentose fosfato, não sendo essas modificações, entretanto, um fator restritivo para transformação da célula hospedeira com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO:1.

[0030] Para aumento do fluxo da via das pentoses fosfato na célula hospedeira, são inseridas novas cópias dos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase {XKS1, EC 2.7.1 .17), cuja sequência de nucleotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:9, a Transaldolase { TAL 1, EC 2.2.1 .2), representada por SEQ NO ID:5, Transcetolase ( TKL 1, EC 2.2.1 .1 ), representada por SEQ ID NO:11 , Ribose 5-Fosfato Isomerase {RKI1, EC 5.3.1 .6), representada por SEQ ID NO:7; e Ribose 5-Fosfato Epimerase {RPE1, EC 5.1 .3.1 ), representada por SEQ ID NO:12.

[0031] Dentre as enzimas apresentadas e que constituem a via das pentose-fosfato, ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, preferencialmente, ligado a promotores constitutivos, ou seja, aqueles que são constantemente expressos, independente da condição à que a célula é submetida, ou promotores naturalmente induzíveis. No presente documento promotores são definidos como uma região reguladora, localizado na região 5' do gene sob sua ação e responsável pelo início da transcrição, enquanto terminadores são definidos como uma sequência que determina o final do gene durante o processo de transcrição. [0032] A presente invenção adicionalmente descreve cassetes de expressão contendo um ou mais genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, para transformação de células eucarióticas. Tais cassetes de expressão ou construções gênicas preferencialmente compreendem promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos. Especificamente, são descritas no presente relatório quatro concretizações de cassetes de expressão integrativos construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.

[0033] Um dos cassetes descritos contém o gene que codifica xilose isomerase, SEQ ID NO:1 e é inserido na célula hospedeira funcionalmente ligado e/ou flanqueado, preferencialmente, pela região promotora e terminadora do gene Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 {TDH1). Um segundo cassete descrito, contém gene que codifica a enzima Xiluloquinase (SEQ ID NO:9) é, preferencialmente, construído utilizando-se promotor e terminador do gene que codifica enzima álcool desidrogenase (ADH1 ). Um terceiro cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transaldolase (SEQ NO ID:5) e Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e é construído, preferencialmente utilizando-se promotores e terminadores do gene que codifica a enzima Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1) para flanquear o gene da Transaldolase e promotores e terminadores da enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1) para flanquear o gene de Ribose 5-Fosfato Isomerase. Um último cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transcetolase (SEQ ID NO:11 ) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7). É construído, preferencialmente, sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1), flanqueando o gene de Transcetolase e promotor e terminador do gene que codifica a enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1). [0034] Os referidos cassetes de expressão com os genes da via metabólica das pentose fosfato que favorecem o consumo de xiiose são introduzidos na célula eucariótica e os respectivos genes são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, preferencialmente na região dos 5 mil primeiro pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

[0035] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção do gene GRE3 da célula eucariótica hospedeira, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14.

[0036] Adicionalmente, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1 ) no genoma da célula hospedeira. No presente documento, é considerado alto número de cópias a inserção de, no mínimo 5 cópias do gene em questão, sendo preferencial a inserção de pelo menos 20 cópias.

[0037] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, preferencialmente micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentose fosfato, inseridos preferencialmente em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.

[0038] Adicionalmente, é descrito um micro-organismo que em adição à manipulação genética acima apresentada, foi submetido a procedimento de engenharia evolutiva de forma a gerar mutações aleatórias que favorecem maior consumo de porção lignocelulósica da biomassa vegetal, preferencialmente xilose em meio anaeróbio e, consequentemente, maior taxa de crescimento e maior produção de compostos bioquímicos e/ou biocombustíveis, preferencialmente etanol, por faixa de tempo, quando comparado com o micro-organismo antes do processo de evolução. O microorganismo geneticamente modificado descrito na presente invenção apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, além eficiente capacidade de resistência ao agressivo processo de fermentação. Esse micro-organismo evoluído foi depositado pelos inventores na Coleção Alemã de Microorganismos e Cultura de Células - Leibniz-lnstitut DSMZ, tendo recebido o número DSM28739.

[0039] O micro-organismo DSM28739 descrito na presente invenção apresenta características de interesse industrial como: ser uma cepa não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, entre outros.

[0040] Adicionalmente, a presente invenção descreve processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal. Mais especificamente, o processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos utiliza preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção, preferencialmente o DSM28739, para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0041] Na Figura 1 observa-se o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentose fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1 , e antes do processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em gramas por Litro (g/L) e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■). [0042] Na Figura 2 observa-se o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentose fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1 , e após processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em g/L e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■).

[0043] Na Figura 3 é possível observarmos a cinética da fermentação do micro-organismo DSM28739 em meio sintético que compreende xilose como uma de suas fontes de carbono, como o YEPX (20 g/L de xilose, 10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de peptona bacteriológica). Na figura, o símbolo (■) representa Xilose, (♦) representa crescimento celular expresso em densidade ótica (DO), ( A) representa etanol e (·) representa glicerol. Na figura apresentada, o eixo vertical à esquerda representa a concentração (g/L) de cada um dos compostos analisados. O eixo vertical à direita, representa a Densidade Óptica (DO) medida em 600 nm de absorbância. O eixo horizontal, por sua vez, representa o tempo de fermentação, expresso em horas.

[0044] Na Figura 4 observa-se a cinética de fermentação do micro- organismo DSM28739 em hidrolisado de palha de cana, sendo a concentração representada no eixo vertical (g/L) e o tempo em horas no eixo horizontal. A concentração de xilose por tempo é representada por (■), a de glicose por (♦), a concentração de etanol é representada por (A ), glicerol por (·) e ácido acético.

[0045] Na Figura 5, é apresentada a sequência de nucleotídeos representada como SEQ ID NO:17, sendo indicada a região que codifica LEU2 (sublinhada), juntamente com seu promotor e terminador (não sublinhado).

[0046] Na Figura 6, mostra-se o gel de eletroforese obtido a partir da amplificação das regiões externas aos cassetes inseridos, comprovando a integração às leveduras. Na presente figura, M representa o marcador 1 kb ladder; 1 a, o cassete do gene XKS1 inserido próximo ao centrômero 2; 1 b, o branco da reação 1 ; 2a é o cassete do gene XKS1 inserido próximo ao centrômero 8; 2b é o branco da reação 2; 3a é o cassete dos genes TAL1 e RKI1 inseridos próximo ao centrômero 12; 3b é o branco da reação 3; 4a é o cassete dos genes TKL1 e RKI1 inseridos próximo ao centrômero 13; 4b é o branco da reação 4; 5a é o cassete do gene XI inserido próximo ao centrômero 5; e 5b é o branco da reação 5.

[0047] Na Figura 7, extraído de Matsushika et ai, [Applied Microbiology and Biotechnology, 84:37-53, 2009], podem ser visualizadas as modificações feitas em S. cerevisiae através de engenharia metabólica para a fermentação de xilose. Os genes marcados com asterisco foram superexpressados; os genes cruzados foram deletados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0048] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica que compreende:

a) pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de: xilose isomerase (SEQ ID NO:1 ), transaldolase (SEQ ID NO:5), ribose 5-fosfato isomerase (SEQ ID NO:7), xiluloquinase (SEQ ID NO:9), transcetolase (SEQ ID NO:1 1 ) e ribose 5-fosfato epimerase (SEQ ID NO:12);

b) pelo menos uma sequência nucleotídica promotora selecionada do grupo consistindo de: promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:2), promotor 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:6), promotor da enzima álcool desidrogenase 1 (SEQ ID NO:8);

[0049] Em uma concretização, o cassete de expressão é selecionado do grupo consistindo de:

a) cassete de expressão que compreende gene que codifica xilose isomerase de sequência SEQ ID NO:1 , promotor TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, e terminador TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:3;

b) cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado pela sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:10;

c) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de sequência SEQ ID NO:6, de gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de sequência nucleotídica SEQ ID NO:13;

d) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência SEQ ID NO:02, gene TKL1 de sequência SEQ ID NO:11 , gene codificador de Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7), terminador TDH1 de sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de sequência SEQ ID NO:6, gene RPE1 de sequência SEQ ID NO:12 e terminador PGK1 de sequência SEQ ID NO:13; e

combinações de pelo menos dois cassetes de expressão conforme descritos acima;

e em que o(s) dito(s) cassete(s) de expressão é(são) funcional(is) na(s) célula(s) eucariótica(s).

[0050] Em uma concretização, o(s) referido(s) promotor(es) é(são) constitutivo(s) ou naturalmente induzível(is). [0051] É um outro objeto da presente invenção, um processo para a transformação de célula eucariotica compreendendo a introdução, na célula a ser transformada, de pelo menos um cassete de expressão conforme revelado pela presente invenção. Em uma concretização, a introdução é no genoma da célula a ser transformada.

[0052] Em uma concretização, o cassete de expressão adicionalmente compreende a inativação ou deleção do gene GRE3 (SEQ ID NO:14) no genoma da referida célula eucariotica.

[0053] É um outro objeto da presente invenção, um micro-organismo geneticamente modificado compreendendo pelo menos um cassete de expressão conforme definido no presente pedido de patente.

[0054] Em uma concretização, um ou mais dos referidos cassetes de expressão é(são) presente(s) na região dos 5 mil primeiro pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

[0055] Em uma concretização, as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo e/ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo.

[0056] Em uma concretização, o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) é inativado ou deletado em/de seu genoma.

[0057] Em uma concretização, o micro-organismo é uma levedura do género selecionado do grupo consistindo de: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.

[0058] Em uma concretização, o micro-organismo é Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0059] É um outro objeto da presente invenção o micro-organismo geneticamente modificado Saccharomyces cerevisiae DSM28739. [0060] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreendendo uma etapa de cultivo do micro-organismo conforme definido na presente invenção.

[0061] Em uma concretização, o rendimento do processo é de pelo menos 0,45 gramas de etanol produzido por grama de xilose consumida pelo micro-organismo em meio sintético que compreende xilose como fonte de carbono.

[0062] Em uma concretização, a produtividade volumétrica é de pelo menos 0,67 gramas de etanol produzido por litro a cada hora, quando em meio sintético que compreende xilose como fonte de carbono.

[0063] Em uma concretização, o micro-organismo é o micro-organismo Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0064] É um outro objeto da presente invenção um biocombustível obtido pelo processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreendendo uma etapa de cultivo do micro-organismo conforme definido na presente invenção.

[0065] É um outro objeto da presente invenção um bioquímico obtido pelo processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreendendo uma etapa de cultivo do micro-organismo conforme definido na presente invenção.

[0066] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.

[0067] Mais especificamente, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se uma célula eucariotica transformada geneticamente, preferencialmente uma levedura ou fungo filamentoso.

[0068] Nesta invenção, leveduras são consideradas como qualquer indivíduo do grupo Eumycotina, ou seja, fungos verdadeiros, que crescem de modo unicelular e que façam preferencialmente fermentação anaeróbia, como por exemplo, Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.

[0069] Fungos filamentosos, por sua vez, são aqueles caracterizados por apresentarem micélio vegetativo e crescerem a partir da elongação das hifas, além de realizarem respiração aeróbia, como por exemplo, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora e Acremonium.

[0070] De forma ainda mais específica, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, preferencialmente uma levedura do género Saccharomyces.

[0071] O micro-organismo descrito apresenta eficiente performance na conversão de açúcares presentes na biomassa vegetal, preferencialmente material lignocelulosico, em bioquímicos ou biocombustíveis. Uma concretização da invenção descreve um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente na conversão de pentoses presentes no material lignocelulosico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto restringir-se a eles, quando comparado com sua versão sem as modificações genéticas contidas no presente documento.

[0072] A pentose preferencialmente utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose, sem entretanto restringir-se a ela.

[0073] Na presente invenção são feitas referências a diversas sequências gênicas, todas listadas na seção Listagem de Sequências. Para breve referência e facilidade de compreensão, suas funções ou genes respectivos são indicados na tabela 1 a seguir. Tabela 1 - Sequências referidas na presente invenção e respectivos genes/funções.

[0074] A sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO:1 , a qual codifica um peptídeo com caracerística de xilose isomerase, quando inserida em célula eucariótica, proporciona a expressão de uma enzima que favorece a isomerisação de xilose em xilulose.

[0075] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase. Essa sequência de nucleotídeos, originalmente descrita em Orpinomyces sp. {XI, EC 5.3.1 .5), foi manualmente otimizada pelos inventores para os códons preferencialmente utilizados por Saccharomyces cerevisiae. A sequência otimizada de xilose isomerase utilizada na presente invenção é, portanto, não natural e diferente de sequências naturais de xilose isomerase já descritas em bancos públicos e encontra-se representada em SEQ ID NO:1.

[0076] Após otimização da sequência representada em SEQ ID NO:1 , o CAI (Codon Adaptation Index), índice que determina a possibilidade de altos níveis de expressão de proteína, foi de 0,79 para 0,91 , indicando a obtenção de uma eficiente expressão dessa proteína em S. cerevisiae. O índice CAI é a média geométrica dos valores relativos de adaptação e para seu cálculo são excluídos códons não sinónimos e, em alguns casos, também os de terminação. Os valores variam entre 0 e 1 , sendo que os maiores indicam maior proporção dos códons mais abundantes [Nucleic Acids Research 15: 1281-1295].

[0077] Assim, a presente invenção descreve também um cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO:1 , que codifica o peptídeo do tipo xilose isomerase e que, opcionalmente, pode ser inserido em uma célula eucariótica para a expressão da referida isomerase em sua forma ativa. No presente documento os genes são inseridos do micro-organismo através de recombinação homóloga, passando, então a integrar seu genoma. O cassete de expressão da invenção é caracterizado por compreender: - uma sequência (SEQ ID NO:1 ) de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase; - ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante; e - uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas. Um ou mais cassetes de expressão podem ser usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.

[0078] Opcionalmente, o cassete de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:9), Transaldolase (SEQ NO ID:5), Transcetolase (SEQ ID NO:11 ), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:12).

[0079] Em uma concretização, a célula hospedeira eucariótica/micro- organismo é uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, porém salienta-se que qualquer célula eucariotica pode ser transformada com um ou mais cassetes de expressão da invenção, que compreende a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO:1.

[0080] Portanto, a presente invenção proporciona uma célula eucariotica, leveduras ou fungos filamentosos, sendo preferencialmente uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 1 , a qual pode apresentar-se em cópia única ou, preferencialmente, múltiplas cópias dessa sequência de nucleotídeos podem ser inseridas no genoma.

[0081] Em uma concretização, a célula hospedeira geneticamente modificada adicionalmente compreende genes da via das pentose fosfato, para que a inserção de SEQ ID NO:1 , que codifica xilose isomerase, favoreça a isomerização de xilose em xilulose. Portanto, adicionalmente à inserção de SEQ ID NO:1 na célula hospedeira, a presente invenção descreve modificações genéticas nessa mesma célula que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentose fosfato, não sendo essas modificações, entretanto, um fator restritivo para transformação da célula hospedeira com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO:1.

[0082] Para aumento de fluxo da via das pentose fosfato na célula hospedeira, são inseridos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase {XKS1, EC 2.7.1 .17), cuja sequência de nucleotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:9, a Transaldolase { TAL1, EC 2.2.1 .2), representada pela sequência SEQ NO ID:5, Transcetolase { TKL1, EC 2.2.1 .1 ), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:11 , Ribose 5- Fosfato Isomerase {RKI1, EC 5.3.1 .6), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:7; e Ribose 5-Fosfato Epimerase {RPE1, EC 5.1 .3.1 ), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:12.

[0083] Dentre as enzimas apresentadas, e que constituem a via das pentose-fosfato, assim como a xilose isomerase representada por SEQ ID NO:1 , ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, preferencialmente, ligado a promotores constitutivos, ou seja, aqueles que são constantemente expressos, independente da condição à que a célula é submetida, ou promotores naturalmente induzíveis. No presente documento promotores são definidos como uma região reguladora, localizado na região 5' do gene sob sua ação e responsável pelo início da transcrição, enquanto terminadores são definidos como uma sequência que determina o final do gene durante o processo de transcrição.

[0084] A superexpressão dos genes que codificam essas enzimas pode ser em decorrência do aumento do número de cópias da sequência de nucleotídeos que as codifica, expressão de genes epissomais presentes em vetores que podem ser inseridos na célula eucariótica hospedeira, através do uso de promotores heterólogos àquela sequência na qual ele encontra-se operativamente ligado, ou mesmo homólogos da célula onde foram inseridos, ou como endógenos na célula hospedeira, desde que eles sejam capazes de produzir um estado estável de transcrição mais elevado do que seria realizado pela célula em sua versão sem as presentes modificações genéticas, nas situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio. Esses promotores podem ser constitutivos ou naturalmente induzíveis.

[0085] Em uma concretização, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, preferencialmente, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos. Especificamente, a presente invenção descreve quatro concretizações de cassetes de expressão integrativos, que foram construídos utilizando-se promotores de alta expressão e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.

[0086] Um dos cassetes descritos contém o gene que codifica xilose isomerase, SEQ ID NO:1. Neste cassete, cópia de SEQ ID NO:1 é inserida na célula hospedeira flanqueado, preferencialmente, pela região promotora e terminadora do gene Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 {TDH1). Assim, de forma resumida, o cassete que contém o gene que codifica xilose isomerase e que foi inserido no genoma da célula hospedeira é formado pelo promotor TDH1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:2, gene XI (SEQ ID NO:1 ) e terminador TDH1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:3.

[0087] Um segundo cassete descrito na presente invenção, contém gene que codifica a enzima Xiluloquinase (SEQ ID NO:9). A presente descrição indica que o cassete é, preferencialmente, construído utilizando-se promotor e terminador do gene que codifica enzima álcool desidrogenase (ADH1 ). Assim, descreve-se que o cassete que contém o gene codificador de Xiluloquinase é constituído pelo promotor ADH1 , representado por SEQ ID NO:8, gene XKS1 (SEQ ID NO:9) e terminador ADH1 , representado por SEQ ID NO:10.

[0088] Mais um cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transaldolase (SEQ NO ID:5) e Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7). Este cassete é construído, preferencialmente utilizando-se promotores e terminadores do gene que codifica a enzima Gliceraldeído 3- Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1) para flanquear o gene da Transaldolase e promotores e terminadores da enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1) para flanquear o gene de Ribose 5-Fosfato Isomerase. Assim, de forma resumida, o cassete de expressão é constituído, preferencialmente, de promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TAL1 (SEQ ID NO:5) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:6, gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e terminador, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:13.

[0089] Um último cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transcetolase (SEQ ID NO:11 ) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7), preferencialmente, com função associada aos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 {TDH1), flanqueando o gene de Transcetolase e promotor e terminador do gene que codifica a enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1). Assim, de forma resumida, o cassete de expressão que foi inserido no genoma da célula hospedeira e contém os genes de Transcetolase e Ribose 5-Fosfato Epimerase, é constituído preferencialmente por promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TKL1 (SEQ ID NO:11 ) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1 (SEQ ID NO:6), gene RPE1 (SEQ ID NO:12) e terminador PGK1 (SEQ ID NO:13).

[0090] Todos os cassetes de expressão com os genes da via metabólica das pentose fosfato que favorecem o consumo de xilose são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, preferencialmente na região dos 5 mil primeiro pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

[0091] Direção upstream é considerada aquela localizada anteriormente ao ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA, a qual se inicia no promotor e encerra no terminador. Por sua vez, downstream ê considerada a região localizada após o ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA.

[0092] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14. A produção de xilitol diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.

[0093] Quando realizadas em Saccharomyces cerevisiae, as modificações genéticas acima citadas favorecem o fluxo da parte não oxidativa da via das pentose-fosfato.

[0094] Assim, o Exemplo 4, nos mostra que a simples inserção dos genes que favorecem o fluxo metabólico pela via das pentose fosfato, bem como o gene que codifica peptídeo do tipo xilose isomerase na célula hospedeira, não garante o eficiente consumo de pentoses presentes no meio.

[0095] Dessa maneira, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1 ) no genoma da célula hospedeira. No presente documento, é considerado alto número de cópias a inserção de, no mínimo 5 cópias do gene em questão, sendo preferencial a inserção de pelo menos 20 cópias.

[0096] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, preferencialmente micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentose fosfato, inseridos preferencialmente em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de consumir a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.

[0097] Na presente invenção é adicionalmente descrito um processo de evolução dirigida a partir do qual se obtém um micro-organismo com maior capacidade de consumo de xilose em condições anaeróbicas e, consequentemente, maior taxa de crescimento e maior produção de compostos bioquímicos e biocombustíveis por faixa de tempo, quando comparado com o micro-organismo que não foi submetido ao referido processo. No referido processo, um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae foi submetido a pressões evolutivas que consistiram de progressivos aumentos de concentração de xilose como única fonte de carbono, de forma a selecionar micro-organismos com mutações aleatórias que favorecem maior consumo de xilose em condições anaeróbicas e, consequentemente, maior taxa de crescimento e maior produção de compostos bioquímicos e biocombustíveis, preferencialmente etanol. O exemplo 4 mostra os resultados comparativos entre o micro-organismo resultante deste processo e o micro-organismo antes do processo de evolução dirigida. O micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, além de eficiente capacidade de resistência ao estressante processo de fermentação industrial. Esse micro-organismo encontra-se depositado na Coleção Alemã de Micro-organismos e Cultura de Células - Leibniz-lnstitut DSMZ, sob número DSM28739.

[0098] O micro-organismo DSM28739 descrito na presente invenção apresenta características de interesse industrial como: ser uma cepa não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, entre outros.

[0099] Adicionalmente, a presente invenção descreve um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.

[0100] Em uma concretização, o processo consiste nas seguintes etapas:

- colocar o micro-organismo DSM28739 em contato com material lignocelulósico; e

- opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado. [0101] Em uma outra concretização, o referido material lignocelulósico é obtido por pré-tratamento de biomassa vegetal lignocelulosica, seguido de hidrólise.

[0102] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).

[0103] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, preferencialmente etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o DSM28739.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - CONSTRUÇÃO DOS CASSETES PARA DE EXPRESSÃO E INSERÇÃO DOS MESMOS NO GENOMA

[0104] Para construção de cada um dos cassetes que continham genes da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, incluindo gene da Xilose Isomerase, cada um dos genes foi amplificado por PCR do genoma de S. cerevisiae e clonado em cassetes de expressão integrativos.

[0105] Adjacente ao terminador de cada cassete, foi clonado o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação, permitindo que essa região pudesse ser retirada pela expressão da recombinase Cre e o marcador auxotrófico URA3 pudesse ser utilizado em todos os cassetes de expressão com os genes descritos.

[0106] Em relação à construção do cassete de expressão contendo gene que codifica xilose isomerase, adicionalmente à construção acima descrita, nas extremidades do cassete foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região. [0107] Para a construção do cassete de expressão com gene que codifica xiluloquinase, por exemplo, amplificou-se esse gene por PCR do genoma de S. cerevisiae e ele foi clonado adjacente ao promotor e terminador do gene que codifica Álcool desidrogenase {ADH1). Após o terminador, foi inserido o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação. Na extremidade do cassete foi clonado regiões de homologia próximas ao centromero dois e oito de S. cerevisiae. Foram realizadas duas transformações para inserir os cassetes expressando o gene XKS1 a 288 pb do centromero dois e a 228 pb do centromero oito. Dessa maneira, além da cópia endógena, o transformante tem mais duas cópias do gene XKS1 sob a ação de um promotor constitutivo de alta expressão.

[0108] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transaldolase { TAL 1) e Ribose 5-Fosfato Isomerase {RKI1), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 {TDH1) e 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.

[0109] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transcetolase (TKL1 ) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1 ), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 {TDH1) e 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.

[0110] A transformação da célula hospedeira com cada um dos cassetes contendo genes da fase não oxidativa da via das pentose fosfato seguiu o protocolo de Gietz e Schiestl [Nature Protocols 2, 31 - 34; 2007], via acetato de lítio, e cada um dos genes, flanqueados por promotores e terminadores forte e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, foi estavelmente integrado ao cromossomo da célula hospedeira. A correta integração foi confirmada por PCR. Após a confirmação, a região URA3 foi excisada do genoma pela expressão transiente da recombinase Cre, deixando apenas um sítio loxP no local, após o terminador do gene inserido.

[0111] Nas extremidades do cassete da Xilose Isomerase, foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região.

Exemplo 2 - INSERÇÃO DO CASSETE DE XILOSE ISOMERASE NO GENOMA EM ALTO NÚMERO DE CÓPIAS

[0112] Para garantir a integração estável e em alto número de cópias na célula hospedeira, o cassete que expressa a Xilose Isomerase representada por SEQ ID NO:1 foi modificado com a inclusão, nas extremidades do cassete, de elementos delta do retrotransposon Ty1 (elemento presente em alto número de cópias no genoma de S. cerevisiae).

[0113] O marcador URA3 flanqueado pelas regiões loxP é substituído nesse plasmídeo pelo marcador LEU2. Previamente, o gene LEU2 é deletado em uma etapa de manipulação genética. Nessa etapa, integra-se o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador de LEU2, resultando na deleção desse gene. Em seguida, é inserido o cassete da XI, flanqueado pelos elementos Ty1 e usando o marcador auxotrófico LEU2 para seleção dos transformantes.

[0114] A deleção do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14, foi realizado em duas etapas através de manipulação genética, visando a diminuição da produção de xilitol a partir de xilose. Na primeira etapa, foi integrado o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador do gene GRE3, resultando na deleção dessa região. Na segunda etapa, após confirmada a deleção, o marcador URA3 foi retirado pela expressão transiente da recombinase Cre.

Exemplo 4 - EVOLUÇÃO ADAPTATIVA E CONSUMO DE XILOSE

[0115] Após de ser manipulado geneticamente com a inserção de todos os genes da via metabólica necessária para conversão de xilose e antes de ser submetido à evolução adaptativa, o micro-organismo geneticamente modificadoquando em condições anaeróbias, consumia a xilose presente no meio de cultivo de forma lenta e com baixa geração de biocombustível, no caso etanol, como pode ser observado na Figura 1.

[0116] O referido micro-organismo foi submetido a um processo de engenharia evolutiva que consistiu de repicagens sucessivas em meio contendo 50 g/L de xilose em condições semi-anaeróbicas. O inoculo era iniciado com densidade óptica (OD) de -1 ,0. Devido a um baixo crescimento inicial, nos dois primeiros experimentos foi adicionado uma baixa quantidade de glicose (0,5%) ao meio visando um crescimento mais rápido da cultura. Após 48 horas de cultivo, uma alíquota era transferida para um novo frasco com meio de cultura e o experimento era repetido. Na terceira transferência, não foi necessária a adição de glicose ao meio de cultivo por notar-se um aumento na velocidade de crescimento do micro-organismo em xilose como única fonte de carbono. Foram isoladas e analisadas 20 colónias da mistura de células evoluídas. O micro-organismo DSM28739 foi selecionado pelo seu desempenho superior quanto à capacidade de conversão de xilose a etanol, como pode ser observado na Figura 2.

Exemplo 5 - CRESCIMENTO DO MICRO-ORGANISMO DSM28739 UTILIZANDO XILOSE COMO FONTE DE CARBONO

Preparação do Inoculo

[0117] Uma alíquota de cultura do micro-organismo DSM28739 previamente criopreservada a -85°C (em solução de glicerol 20%w/v) foi reativada em meio YEPD (20 g/L de glicose, 10 g de extrato de levedura e 20 g/l de peptona), durante 6 horas em um erlenmeyer de 100 mL contendo 50 mL de meio YEPD 20 g/L de glicose em um agitador orbital a 200 rpm e 30 °C. Posteriormente uma alíquota desta cultura foi transferida para um erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de meio YEPD 40 g/l de glicose.

[0118] A cultura foi iniciada com uma Densidade Óptica (DO) igual a 0,1 , quando auferida em 600nm de comprimento de onda e incubada a 200 rpm a 30 °C durante 16 horas. Um volume desta cultura foi transferido para um tubo de fundo cónico de 50 ml e centrifugado a 4000 rpm por 10 min. As células do pellet foram lavadas em água destilada 3 vezes por centrifugação e ressuspendidas no meio de cultura adequado para transferência no biorreator (descrito abaixo).

Cultivo em biorreator

[0119] Em garrafa de 1 L foram preparados 600ml_ de meio de cultura sintético compreendendo xilose como uma das fontes de carbono, como o meio YEPX (20 g/L de xilose, 10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de peptona bacteriológica). O biorreator com volume de trabalho de 1 L foi preparado com 500mL deste meio de cultura.

[0120] O biorreator foi, então, esterilizado em autoclave a 121 °C e 1 atm de pressão por 20 minutos. Os 100 mL restantes foram transferidos para uma garrafa de 250 mL e também foram autoclavados. A fonte de carbono foi dissolvida em 100 mL de água destilada e autoclavada em uma garrafa de 250 mL. Após a autoclavagem os 100 mL contendo a fonte de carbono foram transferidos para o biorreator.

[0121] O inoculo foi preparado a partir das células obtidas por centrifugação do inoculo previamente preparado com cultura do micro- organismo DSM28739. As células foram, então, ressupendidas nos 100 mL de meio sem fonte de carbono e imediatamente inoculadas no biorreator. A cultura foi iniciada com DO=3.

[0122] Durante o crescimento celular o pH foi mantido em uma faixa de pH entre 3 e 7, mediante a adição de ácidos e/ou bases. A temperatura e a velocidade de agitação também foram mantidas constantes em 30 °C e 200 rpm, respectivamente.

[0123] Para garantir o estado de anaerobiose, antes da inoculação, o meio de cultivo e a atmosfera do biorreator foram saturados com um fluxo de nitrogénio gasoso de 2 LN/min (litros normais por minuto) durante 10 minutos. Duas amostras de 1 ,5 mL foram coletadas, a aproximadamente cada três horas. Uma amostra foi utilizada para medir a DO, enquanto a outra foi analisada por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC).

Quantificação dos produtos da fermentação

[0124] A quantificação da xilose, etanol e glicerol foram realizados por cromatografia liquida de alta eficiência HPLC e utilizando o cromatógrafo Alliance HT (Waters) com detector de índice de refração (Waters 2414). As corridas foram realizadas utilizando uma coluna HPX-87H (BioRad) mantida a 35 °C, com ácido sulfúrico 4 mM como fase móvel e um fluxo de 0,6 mL/min.

[0125] Observando a Figura 3, é possível verificar que o microorganismo DSM28739 consumiu 20 g/L de xilose em aproximadamente 18 horas. O principal produto da fermentação foi o etanol atingindo aproximadamente 9 g/L. Glicerol também foi observado mas em baixa concentração. A produção de glicerol é observada em baixa concentração.

[0126] Na Tabela 2 são mostrados rendimento de etanol e produtividade volumétrica do micro- DSM28739.

Tabela 2: Rendimento e produtividade volumétrica do micro-organismo DSM28739 em meio sintético compreendendo xilose como uma das fontes de carbono, como o meio YEPX (20 g/L de xilose, 10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de peptona bacteriológica).

Rendimento g/g

Produtividade volumétrica de

Linhagem (gramas de etanol

etanol g/Lh (gramas de etanol produzido por grama

produzido por litro e por hora) de xilose consumida)

DSM28739 0,46 + 0,01 0,69+ 0,02 Exemplo 6 - FERMENTAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO DSM28739 UTILIZANDO HIDROLISADO DE PALHA DE CANA.

Meio de cultivo

[0127] O meio de cultivo foi preparado utilizando hidrolisado de palha de cana contendo, entre 20 a 60 g/L de xilose e/ou 20 a 60 g/L de glicose. O hidrolisado foi suplementado com uréia, de forma a suportar o crescimento da levedura.

Preparação do Inoculo

[0128] Alíquota de cultura do micro-organismo DSM28739 previamente criopreservada a -85°C (em solução de glicerol 20%w/v) foi reativada durante 6 horas em um erlenmeyer de 100 mL contendo 50 mL de meio YEPD 20 g/L de glicose em um agitador orbital a 200 rpm e 30 °C. Posteriormente alíquota desta cultura foi transferida para um erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de meio YEPD 40 g/l de glicose. A cultura foi iniciada com uma DO= 0,1 (densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda), incubada a 200 rpm e 30 °C durante 16 horas. Um volume desta cultura foi transferido para um tubo de fundo cónico de 50 ml e centrifugado a 4000 rpm por 10 min. As células do pellet foram lavadas em agua destilada 3 vezes por centrifugação e ressuspendidas no meio cultivo (hidrolisado).

Cultivo em biorreator

[0129] Em garrafa de 1 L foram autoclavados 700 mL de hidrolisado de palha de cana. No biorreator com volume de trabalho de 1 L (previamente autoclavado) foram transferidos 600 mL do hidrolisado e os 100 mL restantes foram transferidos para uma garrafa de 250 mL (previamente autoclavada) para posterior ressuspensão do inoculo. O inoculo foi preparado a partir das células obtidas por centrifugação no item anterior. As células para o inoculo foram ressupendidas nos 100 mL do hidrolisado e imediatamente inoculadas no biorreator. A cultura foi iniciada com uma DO=1 . Durante o crescimento celular, o pH foi mantido entre 3 e 7 pela adição automática de solução aquosa de ácidos ou bases, como, por exemplo, KOH 3 mol/L ou de H₂SO₄ 1 mol/L. A temperatura e a velocidade de agitação foram mantidas constantes em 30 °C e 200 rpm respectivamente. Para garantir o estado de anaerobiose, antes da inoculação, o meio de cultivo e a atmosfera do biorreator foram saturados com um fluxo de nitrogénio gasoso de 2 LN/min (litros normais por minuto) durante 10 minutos. Amostras foram coletadas em intervalos adequados, imediatamente congeladas em nitrogénio líquido e mantidas congeladas a -20 °C para posterior análise por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC). Quantificação dos produtos da fermentação

[0130] A quantificação da xilose, etanol e glicerol foram realizados por cromatografia liquida de alta eficiência HPLC e utilizando o cromatógrafo Alliance HT (Waters) com detector de índice de refração (Waters 2414). As corridas foram realizadas utilizando uma coluna HPX-87H (BioRad) mantida a 35 °C, com ácido sulfúrico 4 mM como fase móvel e um fluxo de 0,6 mL/min. A cinética de fermentação do micro-organismo DSM28739 em hidrolisado de palha de cana, pode ser observada na Figura 4.

[0131] O micro-organismo DSM28739 consumiu glicose rapidamente em aproximadamente 30 horas. Após 70 horas, a maior parte da xilose foi também consumida. O principal produto da fermentação foi o etanol, atingindo aproximadamente 37 g/L. A produção de glicerol é também observada em baixa concentração. O principal inibidor no hidrolisado, o ácido acético, foi mantido constante durante toda a fermentação (ao redor de 5 g/L).

[0132] Na Tabela 3 são mostrados o rendimento de etanol e a produtividade volumétrica de DSM28739 em hidrolisado de palha de cana. Tabela 3: Rendimento e produtividade volumétrica do micro-organismo DSM28739 em hidrolisado de palha de cana.

Rendimento g/g Produtividade volumétrica (gramas de etanol de etanol g/Lh (gramas de

Linhagem

produzido por grama de etanol produzido por litro açúcares consumidos) e por hora)

DSM28739 0,44 ± 0,009 0,64+ 0,005 Exemplo 7 - COMPROVAÇÃO DA INSERÇÃO DOS CASSETES NO MICROORGANISMO DSM28739 GENETICAMENTE MODIFICADO

[0133] O DNA da linhagem DSM28739 foi utilizado como modelo para a reação de polimerase em cadeia utilizando oligonucleotídeos que anelam em uma região externa ao local de inserção dos cassetes de expressão gênica. Para cada reação foi utilizado um par de oligos específicos para a região externa de cada cassete inserido.

[0134] Após experimento de reação em cadeira da polimerase (PCR), uma alíquota foi aplicada em gel de agarose 0,8%, corado com Gel Red, e submetido a eletroforese para a separação dos fragmentos amplificados.

[0135] A Figura 6 mostra o gel de eletroforese obtido a partir da amplificação das regiões externas aos cassetes inseridos, comprovando a integração às leveduras. Nessa figura, M representa o marcador 1 kb ladder; 1 a, o cassete do gene XKS1 inserido próximo ao centromero 2; 1 b, o branco da reação 1 ; 2a é o cassete do gene XKS1 inserido próximo ao centromero 8; 2b é o branco da reação 2; 3a é o cassete dos genes TAL1 e RKI1 inseridos próximo ao centromero 12; 3b é o branco da reação 3; 4a é o cassete dos genes TKL1 e RKI1 inseridos próximo ao centromero 13; 4b é o branco da reação 4; 5a é o cassete do gene XI inserido próximo ao centromero 5; e 5b é o branco da reação 5.

[0136] Dessa maneira, é possível observar na Figura 6 que os cassetes foram inseridos corretamente no local pretendido. Esse resultado é observado deviso à amplificação de bandas com tamanho similar ao cassete construído.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

A Requerente informa que a "Listagem de Sequências" apresentada em formato impresso é idêntica àquela contida no formato de arquivo eletrônico, exceto quanto à numeração de suas respectivas páginas.

<1 10> BioCelere

<120> CASSETE DE EXPRESSÃO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA EUCARIOTICA, PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA EUCARIOTICA, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEL E/OU BIOQUÍMICO ASSIM PRODUZIDOS

<130> BioCelere Patente L1

<150> BR102014014407-2

<151 > 12-06-2014

<160> 17

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<21 1 > 1314

<212> DNA

<213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência codificadora de peptídeo com característica de xilose isomerase

<400> 1

atgactaaag aatattttcc aactattggt aaaattagat ttgaaggtaa agattctaag 60 aatccaatgg ccttccatta ctatgatgct gaaaaagaag tcatgggtaa gaaaatgaaa 120 gattggttaa gatttgccat ggcctggtgg catactttgt gcgccgatgg tgctgaccaa 180 ttcggtgttg gtactaagtc ttttccatgg aatgaaggta ctgacccaat tgctattgcc 240 aaacaaaagg ttgatgctgg ttttgaaatt atgaccaaat tgggtattga acattattgt 300 ttccacgatg ttgatttagt ttctgaaggt aattctattg aagaatatga atctaacttg 360 aaacaagttg ttgcttactt gaaacaaaag caacaagaaa ctggtattaa attattgtgg 420 tctactgcca atgtttttgg taatccaaga tatatgaacg gtgcctctac taatccagac 480 tttgatgtcg tcgccagagc tattgttcaa attaagaacg ccatggacgc cggtattgaa 540 ttgggtgctg aaaactacgt cttctggggt ggtagagaag gttatatgtc attgttaaac 600 actgaccaaa aaagagaaaa ggaacatatg gctactatgt tgactatggc tagagattac 660 gctagatcta aaggttttaa gggtactttc ttaattgaac caaaaccaat ggaaccaacc 720 aagcatcaat atgacgttga tactgaaact gttattggtt tcttgagagc tcacaattta 780 gacaaagact ttaaggtcaa cattgaagtt aatcacgcta ctttagctgg tcatactttc 840 gaacacgaat tggcctgtgc tgttgatgct ggtatgttag gttctattga tgctaacaga 900 ggtgactatc aaaatggttg ggacactgat caattcccaa ttgatcaata tgaattggtc 960 caagcttgga tggaaattat cagaggtggt ggttttgtta ctggtggtac caacttcgat 1020 gccaaaacta gaaggaactc taccgattta gaagatatta tcattgctca tatttctggt 1080 atggatgcca tggctagagc tttggaaaat gctgccaagt tattgcaaga atctccatat 1140 tgtaatatga aaaaggaaag atacgcttct tttgactctg gtattggtaa agactttgaa 1200 gatggtaagt taactttgga acaagtttac gaatatggta aaaagaatgg tgaaccaaaa 1260 gttacttctg gtaagcaaga attatatgaa gctattgttg ccatgtacca ataa 1314

<210> 2

<21 1 > 742

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Promotor Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogensase, isoenzima 1 (TDH1 )

<400> 2

aatgtatatg ctcatttaca ctccatatca ccatatggag gataagttgg gttgagcttc 60 tgatccaatt tattctatcc attagttgct gatatgtccc accagccaac acttgatagt 120 atctactcgc cattcacttc cagcagcgcc agtagggttg ttgagcttag taaaaatgtg 180 cgcaccacaa gcctacatgt ctccacgtca catgaaacca caccgtgggg ccttgttgcg 240 ctaggaatag gatatgcgac gaagacgctt ctgcttagta accacaccac attttcaggg 300 ggtcgatctg cttgcttcct ttactgtcac gagcggccca taatcgcgct ttttttttaa 360 aagacgcgag acagcaaaca ggaagctcgg gtttcaacct tcggagtggt cgcagatctg 420 gagactggat ctttacaata cagtaaggca agccaccatc tgcttcttag gtgcatgcga 480 cggtatccac gtgcagaaca acatagtctg aagaaggggg gaggagcatg ttcattctct 540 gtagcagtaa gagcttggtg ataatgacca aaactggagt ctcgaaatca tataaataga 600 caatatattt tcacacaatg agatttgtag tacagttcta ttctctctct tgcataaata 660 agaaattcat caagaacttg gtttgatatt tcaccaacac acacaaaaaa cagtacttca 720 ctaaatttac acacaaaaca aa 742

<210> 3

<21 1 > 305

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Terminador Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1

(TDH1 )

<400> 3

ataaagcaat cttgatgagg ataatgattt ttttttgaat atacataaat actaccgttt 60 ttctgctaga ttttgtaaag acgtaaataa gtacatatta ctttttaagc caagacaaga 120 ttaagcatta actttaccct tttctcttct aagttttaac actagttatc actgttaaaa 180 aattatggcg agaacgtcgg cggttaaaat atattaccct gaatgtggtg aattgaagtt 240 cttggatggt ttaaagattt ttcctttttg ggaaataagt aaacaatata ttgctgcctt 300 tgcaa 305

<210> 4

<21 1 > 1349

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica

<220>

<223> Sequência codificadora dos genes URA3 e loxp

<400> 4

cactataggg cgaattgggc ccgacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga 60 attcgatata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggtccataa agcttttcaa 120 ttcatctttt ttttttttgt tctttttttt gattccggtt tctttgaaat ttttttgatt 180 cggtaatctc cgagcagaag gaagaacgaa ggaaggagca cagacttaga ttggtatata 240 tacgcatatg tggtgttgaa gaaacatgaa attgcccagt attcttaacc caactgcaca 300 gaacaaaaac ctgcaggaaa cgaagataaa tcatgtcgaa agctacatat aaggaacgtg 360 ctgctactca tcctagtcct gttgctgcca agctatttaa tatcatgcac gaaaagcaaa 420 caaacttgtg tgcttcattg gatgttcgta ccaccaagga attactggag ttagttgaag 480 cattaggtcc caaaatttgt ttactaaaaa cacatgtgga tatcttgact gatttttcca 540 tggagggcac agttaagccg ctaaaggcat tatccgccaa gtacaatttt ttactcttcg 600 aagacagaaa atttgctgac attggtaata cagtcaaatt gcagtactct gcgggtgtat 660 acagaatagc agaatgggca gacattacga atgcacacgg tgtggtgggc ccaggtattg 720 ttagcggttt gaagcaggcg gcggaagaag taacaaagga acctagaggc cttttgatgt 780 tagcagaatt gtcatgcaag ggctccctag ctactggaga atatactaag ggtactgttg 840 acattgcgaa gagcgacaaa gattttgtta tcggctttat tgctcaaaga gacatgggtg 900 gaagagatga aggttacgat tggttgatta tgacacccgg tgtgggttta gatgacaagg 960 gagacgcatt gggtcaacag tatagaaccg tggatgatgt ggtctctaca ggatctgaca 1020 ttattattgt tggaagagga ctatttgcaa agggaaggga tgctaaggta gagggtgaac 1080 gttacagaaa agcaggctgg gaagcatatt tgagaagatg cggccagcaa aactaaaaaa 1140 ctgtattata agtaaatgca tgtatactaa actcacaaat tagagcttca atttaattat 1200 atcagttatt acccgggaat ctcggtcgta atgatttcta taacttcgta tagcatacat 1260 tatacgaagt tatatcacta gtgaattcgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1320 ctcccaacgc gttggatgca tagcttgag 1349 <210> 5

<21 1 > 1008

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Transaldolase (TAL1 )

<400> 5

atgtctgaac cagctcaaaa gaaacaaaag gttgctaaca actctctaga acaattgaaa 60 gcctccggca ctgtcgttgt tgccgacact ggtgatttcg gctctattgc caagtttcaa 120 cctcaagact ccacaactaa cccatcattg atcttggctg ctgccaagca accaacttac 180 gccaagttga tcgatgttgc cgtggaatac ggtaagaagc atggtaagac caccgaagag 240 caagtcgaaa atgctgtgga cagattgtta gtcgaattcg gtaaggagat cttaaagatt 300 gttccaggca gagtctccac cgaagttgat gctagattgt cttttgacac tcaagctacc 360 attgaaaagg ctagacatat cattaaattg tttgaacaag aaggtgtctc caaggaaaga 420 gtccttatta aaattgcttc cacttgggaa ggtattcaag ctgccaaaga attggaagaa 480 aaggacggta tccactgtaa tttgactcta ttattctcct tcgttcaagc agttgcctgt 540 gccgaggccc aagttacttt gatttcccca tttgttggta gaattctaga ctggtacaaa 600 tccagcactg gtaaagatta caagggtgaa gccgacccag gtgttatttc cgtcaagaaa 660 atctacaact actacaagaa gtacggttac aagactattg ttatgggtgc ttctttcaga 720 agcactgacg aaatcaaaaa cttggctggt gttgactatc taacaatttc tccagcttta 780 ttggacaagt tgatgaacag tactgaacct ttcccaagag ttttggaccc tgtctccgct 840 aagaaggaag ccggcgacaa gatttcttac atcagcgacg aatctaaatt cagattcgac 900 ttgaatgaag acgctatggc cactgaaaaa ttgtccgaag gtatcagaaa attctctgcc 960 gatattgtta ctctattcga cttgattgaa aagaaagtta ccgcttaa 1008 <210> 6

<21 1 > 873

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Promotor 3-Fosfato Quinase (PGK1 )

<400> 6

tactgtaatt gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt 60 tttttttctt tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc 120 aagacgcaca gatattataa catctgcata ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta 180 aggaaagagt gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc 240 ctttattttg gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc 300 cttcttgaat tgatgttacc ctcataaagc acgtggcctc ttatcgagaa agaaattacc 360 gtcgctcgtg atttgtttgc aaaaagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt 420 cctgtcttcc tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc 480 tcacaggttt tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca 540 catgctatga tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct 600 ctctctttca aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc 660 ttttcttcta accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca 720 tatatataaa cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt 780 cttagttttt caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag 840 taattatcta ctttttacaa caaatataaa aca 873

<210> 7

<21 1 > 777

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1 )

<400> 7

atggctgccg gtgtcccaaa aattgatgcg ttagaatctt tgggtaatcc tttggaggat 60 gccaagagag ctgcagcata cagagcagtt gatgaaaatt taaaatttga tgatcacaaa 120 ataattggaa ttggtagtgg tagcacagtg gtttatgttg ccgaaagaat tggacaatat 180 ttgcatgacc ctaaatttta tgaagtagcg tctaaattca tttgcattcc aacaggattc 240 caatcaagaa acttgatttt ggataacaag ttgcaattag gctccattga acagtatcct 300 cgcattgata tagcgtttga cggtgctgat gaagtggatg agaatttaca attgattaaa 360 ggtggtggtg cttgtctatt tcaagaaaaa ttggttagta ctagtgctaa aaccttcatt 420 gtcgttgctg attcaagaaa aaagtcacca aaacatttag gtaagaactg gaggcaaggt 480 gttcccattg aaattgtacc ttcctcatac gtgagggtca agaatgatct attagaacaa 540 ttgcatgctg aaaaagttga catcagacaa ggaggttctg ctaaagcagg tcctgttgta 600 actgacaata ataacttcat tatcgatgcg gatttcggtg aaatttccga tccaagaaaa 660 ttgcatagag aaatcaaact gttagtgggc gtggtggaaa caggtttatt catcgacaac 720 gcttcaaaag cctacttcgg taattctgac ggtagtgttg aagttacgga aaagtga 777

<210> 8

<21 1 > 702

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Promotor da enzima Álcool Desidrogenase 1 (ADH1 )

<400> 8

ttccgggtgt acaatatgga cttcctcttt tctggcaacc aaacccatac atcgggattc 60 ctataatacc ttcgttggtc tccctaacat gtaggtggcg gaggggagat atacaataga 120 acagatacca gacaagacat aatgggctaa acaagactac accatttaca ctgcctcatt 180 gatggtggta cataacgaac taatactgta gccctagact tgatagccat catcatatcg 240 aagtttcact accctttttc catttgccat ctattgaagt aataataggc gcatgcaact 300 tcttttcttt tttttttttt ctctctcccc cgttgttgtc tcaccatatc cgcaatgaca 360 aaaaaatgat ggaagacact aaaggaaaaa attaacgaca aagacagcac caacagatgt 420 cgttgttcca gagctgatga ggggtatctc gaagcacacg aaactttttc cttccttcat 480 tcacgcacac tactctctaa tgagcaacga tatacggcct tccttccagt tacttgaatt 540 tgaaataaaa aaagtttgct gtcttgctat caagtataaa tagacctgca attattaatc 600 ttttgtgttc tcgtcattgt tctcgttccc tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata 660 tttcaagcta taccaagcat acaatcaact atctcatata ca 702

<210> 9

<21 1 > 1803

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica

<220>

<223> Xiluloquinase (XKS1 )

<400> 9

atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60 tcatactatc ttgggtttga tctttcgacc caacaactga aatgtctcgc cattaaccag 120 gacctaaaaa ttgtccattc agaaacagtg gaatttgaaa aggatcttcc gcattataac 180 acaaagaagg gtgtctatat acacggcgac actatcgaat gtcccgtagc catgtggtta 240 gaggctctag atctggttct ctcgaaatat cgcgaggcta aatttccatt gaacaaagtt 300 atggccgtct cagggtcctg ccagcagcac gggtctgtct actggtcctc ccaagccgaa 360 tctctgttag agcaattgaa taagaaaccg gaaaaagatt tattgcacta cgtgagctct 420 gtagcatttg caaggcaaac cgcccccaat tggcaagacc acagtactgc aaagcaatgt 480 caagagtttg aagagtgcat aggtgggcct gaaaaaatgg ctcaattaac agggtccaga 540 gcccatttta gatttactgg tcctcaaatt ctgaaaattg cacaattaga accagaagct 600 tacgaaaaaa caaagaccat ttctttagtg tctaattttt tgacttctat cttagtgggc 660 catcttgttg aattagagga ggcagatgcc tgtggtatga acctttatga tatacgtgaa 720 agaaaattca gtgatgagct gctacatcta attgatagtt cttctaagga taaaactatc 780 agacaaaaat taatgagagc acccatgaaa aatttgatag cgggtaccat ctgtaaatat 840 tttattgaga agtacggttt caatacaaac tgcaaggtct ctcccatgac tggggataat 900 ttagccacta tatgttcttt acccctgcgg aagaatgacg ttctcgtttc cctaggaaca 960 agtactacag ttcttctggt caccgataag tatcacccct ctccgaacta tcatcttttc 1020 attcatccaa ctctgccaaa ccattatatg ggtatgattt gttattgtaa tggttctttg 1080 gcaagggaga ggataagaga cgagttaaac aaagaacggg aaaataatta tgagaagact 1140 aacgattgga ctctttttaa tcaagctgtg ctagatgact cagaaagtag tgaaaatgaa 1200 ttaggtgtat attttcctct gggggagatc gttcctagcg taaaagccat aaacaaaagg 1260 gttatcttca atccaaaaag gggtatgatt gaaagagagg tggccaagtt caaagacaag 1320 aggcacgatg ccaaaaatat tgtagaatca caggctttaa gttgcagggt aagaatatct 1380 ccactgcttt cggattcaaa cgcaagctca caacagagac tgaacgaaga tacaatcgtg 1440 aagtttgatt acgatgaatc tccgctgcgg gactacctaa ataaaaggcc agaaaggact 1500 ttttttgtag gtggggcttc taaaaacgat gctattgtga agaagtttgc tcaagtcatt 1560 ggtgctacaa agggtaattt taggctagaa acaccaaact catgtgccct tggtggttgt 1620 tataaggcca tgtggtcatt gttatacgac tctaataaaa ttgcagttcc ttttgataaa 1680 tttctgaatg acaattttcc atggcatgta atggaaagca tatccgatgt ggataatgaa 1740 aattgggatc gctataattc caaaattgtc cccttaagcg aactggaaaa gactctcatc 1800 taa 1803

<210> 10

<21 1 > 236

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Terminador de Álcool Desidrogenase (ADH1 ) <400> 10

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60 tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120 ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacatc 180 tctaccggca tgccgagcaa atgcctgcaa atcgctcccc atttcaccca attgta 236

<210> 1 1

<21 1 > 2043

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Transcetolase (TKL1 )

<400> 1 1

atgactcaat ttactgacat tgataagcta gccgtctcca ccataagaat tttggctgtg 60 gacaccgtat ccaaggccaa ctcaggtcac ccaggtgctc cattgggtat ggcaccagct 120 gcgcacgttc tatggagtca aatgcgcatg aacccaacca acccagactg gatcaacaga 180 gatagatttg tcttgtctaa cggtcacgcg gtcgctttgt tgtattctat gctacatttg 240 actggttacg atctgtctat tgaagacttg aaacagttca gacagttggg ttccagaaca 300 ccaggtcatc ctgaatttga gttgccaggt gttgaagtta ctaccggtcc attaggtcaa 360 ggtatctcca acgctgttgg tatggccatg gctcaagcta accttgctgc cacttacaac 420 aagccaggct ttaccttgtc tgacaactac acctatgttt tcttgggtga cggttgtttg 480 caagaaggta tttcttcaga agcttcctcc ttggctggtc atttgaaatt gggtaacttg 540 attgccatct acgatgacaa caagatcact atcgatggtg ctaccagtat ctcattcgat 600 gaagatgttg ctaagagata cgaagcctac ggttgggaag ttttgtacgt agaaaatggt 660 aacgaagatc tagccggtat tgccaaggct attgctcaag ctaagttatc caaggacaaa 720 ccaactttga tcaaaatgac cacaaccatt ggttacggtt ccttgcatgc cggctctcac 780 tctgtgcacg gtgccccatt gaaagcagat gatgttaaac aactaaagag caaattcggt 840 ttcaacccag acaagtcctt tgttgttcca caagaagttt acgaccacta ccaaaagaca 900 attttaaagc caggtgtcga agccaacaac aagtggaaca agttgttcag cgaataccaa 960 aagaaattcc cagaattagg tgctgaattg gctagaagat tgagcggcca actacccgca 1020 aattgggaat ctaagttgcc aacttacacc gccaaggact ctgccgtggc cactagaaaa 1080 ttatcagaaa ctgttcttga ggatgtttac aatcaattgc cagagttgat tggtggttct 1140 gccgatttaa caccttctaa cttgaccaga tggaaggaag cccttgactt ccaacctcct 1200 tcttccggtt caggtaacta ctctggtaga tacatcagat acggtattag agaacacgct 1260 atgggtgcca tcatgaacgg tatttcagct ttcggtgcca actacaaacc atacggtggt 1320 actttcttga acttcgtttc ttatgctgct ggtgccgtta gattgtccgc tttgtctggc 1380 cacccagtta tttgggttgc tacacatgac tctatcggtg tcggtgaaga tggtccaaca 1440 catcaaccta ttgaaacttt agcacacttc agatccctac caaacattca agtttggaga 1500 ccagctgatg gtaacgaagt ttctgccgcc tacaagaact ctttagaatc caagcatact 1560 ccaagtatca ttgctttgtc cagacaaaac ttgccacaat tggaaggtag ctctattgaa 1620 agcgcttcta agggtggtta cgtactacaa gatgttgcta acccagatat tattttagtg 1680 gctactggtt ccgaagtatc tttgagtgtt gaagctgcta agactttggc cgcaaagaac 1740 atcaaggctc gtgttgtttc tctaccagat ttcttcactt ttgacaaaca acccctagaa 1800 tacagactat cagtcttacc agacaacgtt ccaatcatgt ctgttgaagt tttggctacc 1860 acatgttggg gcaaatacgc tcatcaatcc ttcggtattg acagatttgg tgcctccggt 1920 aaggcaccag aagtcttcaa gttcttcggt ttcaccccag aaggtgttgc tgaaagagct 1980 caaaagacca ttgcattcta taagggtgac aagctaattt ctcctttgaa aaaagctttc 2040 taa 2043

<210> 12

<21 1 > 717

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica

<220>

<223> Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1 )

<400> 12

atggtcaaac caattatagc tcccagtatc cttgcttctg acttcgccaa cttgggttgc 60 gaatgtcata aggtcatcaa cgccggcgca gattggttac atatcgatgt catggacggc 120 cattttgttc caaacattac tctgggccaa ccaattgtta cctccctacg tcgttctgtg 180 ccacgccctg gcgatgctag caacacagaa aagaagccca ctgcgttctt cgattgtcac 240 atgatggttg aaaatcctga aaaatgggtc gacgattttg ctaaatgtgg tgctgaccaa 300 tttacgttcc actacgaggc cacacaagac cctttgcatt tagttaagtt gattaagtct 360 aagggcatca aagctgcatg cgccatcaaa cctggtactt ctgttgacgt tttatttgaa 420 ctagctcctc atttggatat ggctcttgtt atgactgtgg aacctgggtt tggaggccaa 480 aaattcatgg aagacatgat gccaaaagtg gaaactttga gagccaagtt tccccatttg 540 aatatccaag tcgatggtgg tttgggcaag gagaccatcc cgaaagccgc caaagccggt 600 gccaacgtta ttgtcgctgg taccagtgtt ttcactgcag ctgacccgca cgatgttatc 660 tccttcatga aagaagaagt ctcgaaggaa ttgcgttcta gagatttgct agattag 717

<210> 13

<21 1 > 189

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Terminador 3-Fosfato Quinase (PGK1 ) <400> 13

attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60 gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120 ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180 taatgcctt 189

<210> 14

<21 1 > 984

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> Aldose Redutase (GRE3)

<400> 14

atgtcttcac tggttactct taataacggt ctgaaaatgc ccctagtcgg cttagggtgc 60 tggaaaattg acaaaaaagt ctgtgcgagt caaatttatg aagctatcaa attaggctac 120 cgtctattcg atggtgcttg cgactacggc aacgaaaagg aagttggtga aggtatcagg 180 aaagccatct ccgaaggtct tgtttctaga aaggatatat ttgttgtttc aaagttatgg 240 aacaattttc accatcctga tcatgtaaaa ttagctttaa agaagacctt aagcgatatg 300 ggacttgatt atttagacct gtattatatt cacttcccaa tcgccttcaa atatgttcca 360 tttgaagaga aataccctcc aggattctat acgggcgcag atgacgagaa gaaaggtcac 420 atcaccgaag cacatgtacc aatcatagat acgtaccggg ctctggaaga atgtgttgat 480 gaaggcttga ttaagtctat tggtgtttcc aactttcagg gaagcttgat tcaagattta 540 ttacgtggtt gtagaatcaa gcccgtggct ttgcaaattg aacaccatcc ttatttgact 600 caagaacacc tagttgagtt ttgtaaatta cacgatatcc aagtagttgc ttactcctcc 660 ttcggtcctc aatcattcat tgagatggac ttacagttgg caaaaaccac gccaactctg 720 ttcgagaatg atgtaatcaa gaaggtctca caaaaccatc caggcagtac cacttcccaa 780 gtattgctta gatgggcaac tcagagaggc attgccgtca ttccaaaatc ttccaagaag 840 gaaaggttac ttggcaacct agaaatcgaa aaaaagttca ctttaacgga gcaagaattg 900 aaggatattt ctgcactaaa tgccaacatc agatttaatg atccatggac ctggttggat 960 ggtaaattcc ccacttttgc ctga 984 <210> 15

<21 1 > 1032

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica de bacteriófago

<220>

<223> Recombinase CRE

<400> 15

ctaatcgcca tcttccagca ggcgcaccat tgcccctgtt tcactatcca gggtacggat 60 atagttcatg acaatattta cattggtcca gccaccagct tgcatgatct ccggtattga 120 aactccagcg cgggccatat ctcgcgcggc tccgacacgg gcactgtgtc cagaccaggc 180 caggtatctc tgaccagagt catccttagc gccgtaaatc aatcgatgag ttgcttcaaa 240 aatcccttcc agggcgcgag ttgatagctg gctggtggca gatggcgcgg caacaccatt 300 ttttctgacc cggcaaaaca ggtagttatt cggatcatca gctacaccag agacggaaat 360 ccatcgctcg accagtttag ttacccccag gctaagtgcc ttctctacac ctgcggtgct 420 aaccagcgtt ttcgttctgc caatatggat taacattctc ccaccgtcag tacgtgagat 480 atctttaacc ctgatcctgg caatttcggc tatacgtaac agggtgttat aagcaatccc 540 cagaaatgcc agattacgta tatcctggca gcgatcgcta ttttccatga gtgaacgaac 600 ctggtcgaaa tcagtgcgtt cgaacgctag agcctgtttt gcacgttcac cggcatcaac 660 gttttctttt cggatccgcc gcataaccag tgaaacagca ttgctgtcac ttggtcgtgg 720 cagcccggac cgacgatgaa gcatgtttag ctggcccaaa tgttgctgga tagtttttac 780 tgccagaccg cgcgcctgaa gatatagaag ataatcgcga acatcttcag gttctgcggg 840 aaaccatttc cggttattca acttgcacca tgccgcccac gaccggcaaa cggacagaag 900 cattttccag gtatgctcag aaaacgcctg gcgatccctg aacatgtcca tcaggttctt 960 gcgaacctca tcactcgttg catcgaccgg taatgcaggc aaattttggt gtacggtcag 1020 taaattggac at 1032 <210> 16

<21 1 > 327

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> LTR do retrotransposon Ty1 <400> 16

ctgagagatt ggtgaatttt gagatgattg taggcattcc attgttgatc aaggctacaa 60 tattatgtat acagaatata ctaaaagttc tcctcgaggg tagaggaatc ctcaaagggg 120 aagcgatatt tctacataat attattacga ttattcctca ttccgtttta tatgtttcat 180 tatcctatta cattatcaat ccttgcactt cagcttcctc taacttcgat gacagtttct 240 cataccttat gtcatcgtct aacaccgtat atgataatat actggtagtg tgactactag 300 tttatagacg atagttgatt tttattc 327

<210> 17

<21 1 > 2216

<212> DNA

<213> Sequência Nucleotídica <220>

<223> LEU2 (ORF + promotor e terminador)

<400> 17

tcgaggagaa cttctagtat atccacatac ctaatattat tgccttatta aaaatggaat 60 cccaacaatt acatcaaaat ccacattctc ttcaaaatca attgtcctgt acttccttgt 120 tcatgtgtgt tcaaaaacgt tatatttata ggataattat actctatttc tcaacaagta 180 attggttgtt tggccgagcg gtctaaggcg cctgattcaa gaaatatctt gaccgcagtt 240 aactgtggga atactcaggt atcgtaagat gcaagagttc gaatctctta gcaaccatta 300 tttttttcct caacataacg agaacacaca ggggcgctat cgcacagaat caaattcgat 360 gactggaaat tttttgttaa tttcagaggt cgcctgacgc atataccttt ttcaactgaa 420 aaattgggag aaaaaggaaa ggtgagaggc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa 480 gcgttcatga ctaaatgctt gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc 540 tattgttttt tccaataggt ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt 600 acatttcagc aatatatata tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctaag 660 aagatcgtcg ttttgccagg tgaccacgtt ggtcaagaaa tcacagccga agccattaag 720 gttcttaaag ctatttctga tgttcgttcc aatgtcaagt tcgatttcga aaatcattta 780 attggtggtg ctgctatcga tgctacaggt gtcccacttc cagatgaggc gctggaagcc 840 tccaagaagg ttgatgccgt tttgttaggt gctgtgggtg gtcctaaatg gggtaccggt 900 agtgttagac ctgaacaagg tttactaaaa atccgtaaag aacttcaatt gtacgccaac 960 ttaagaccat gtaactttgc atccgactct cttttagact tatctccaat caagccacaa 1020 tttgctaaag gtactgactt cgttgttgtc agagaattag tgggaggtat ttactttggt 1080 aagagaaagg aagacgatgg tgatggtgtc gcttgggata gtgaacaata caccgttcca 1140 gaagtgcaaa gaatcacaag aatggccgct ttcatggccc tacaacatga gccaccattg 1200 cctatttggt ccttggataa agctaatgtt ttggcctctt caagattatg gagaaaaact 1260 gtggaggaaa ccatcaagaa cgaattccct acattgaagg ttcaacatca attgattgat 1320 tctgccgcca tgatcctagt taagaaccca acccacctaa atggtattat aatcaccagc 1380 aacatgtttg gtgatatcat ctccgatgaa gcctccgtta tcccaggttc cttgggtttg 1440 ttgccatctg cgtccttggc ctctttgcca gacaagaaca ccgcatttgg tttgtacgaa 1500 ccatgccacg gttctgctcc agatttgcca aagaataagg ttgaccctat cgccactatc 1560 ttgtctgctg caatgatgtt gaaattgtca ttgaacttgc ctgaagaagg taaggccatt 1620 gaagatgcag ttaaaaaggt tttggatgca ggtatcagaa ctggtgattt aggtggttcc 1680 aacagtacca ccgaagtcgg tgatgctgtc gccgaagaag ttaagaaaat ccttgcttaa 1740 aaagattctc tttttttatg atatttgtac ataaacttta taaatgaaat tcataataga 1800 aacgacacga aattacaaaa tggaatatgt tcatagggta gacgaaacta tatacgcaat 1860 ctacatacat ttatcaagaa ggagaaaaag gaggatagta aaggaataca ggtaagcaaa 1920 ttgatactaa tggctcaacg tgataaggaa aaagaattgc actttaacat taatattgac 1980 aaggaggagg gcaccacaca aaaagttagg tgtaacagaa aatcatgaaa ctacgattcc 2040 taatttgata ttggaggatt ttctctaaaa aaaaaaaaat acaacaaata aaaaacactc 2100 aatgacctga ccatttgatg gagtttaagt caataccttc ttgaaccatt tcccataatg 2160 gtgaaagttc cctcaagaat tttactctgt cagaaacggc cttacgacgt agtcga 2216

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 . Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica caracterizado por compreender:

2. Cassete, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo de:

b) cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado pela sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:10; c) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de sequência SEQ ID NO:6, de gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de sequência nucleotídica SEQ ID NO:13;

combinações de pelo menos dois cassetes de expressão conforme descritos acima.

3. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que o(s) referido(s) promotor(es) é(são) constitutivo(s) ou naturalmente induzível(is).

4. Processo para a transformação de célula eucariótica caracterizado por compreender a introdução, na célula a ser transformada, de pelo menos um cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por adicionalmente compreender a inativação ou deleção do gene GRE3 (SEQ ID NO:14) no genoma da referida célula eucariótica.

6. Micro-organismo geneticamente modificado caracterizado por compreender pelo menos um cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos referidos cassetes de expressão é(são) presente(s) na região dos 5 mil primeiro pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

8. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo e/ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo.

9. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) é inativado ou deletado em/de seu genoma.

10. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que é uma levedura do género selecionado do grupo consistindo de: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.

1 1 . Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

12. Micro-organismo geneticamente modificado caracterizado por ser Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

13. Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos caracterizado por compreender uma etapa de cultivo do micro-organismo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 1 1 .

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1 3, caracterizado pelo rendimento do processo ser de pelo menos 0,45 gramas de etanol produzido por grama de xilose consumida pelo micro-organismo em meio sintético que compreende xilose como fonte de carbono.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1 3 ou 14, caracterizado pela produtividade volumétrica ser de pelo menos 0,67 gramas de etanol produzido por litro a cada hora, quando em meio sintético que compreende xilose como fonte de carbono.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 3 a 15, caracterizado pelo micro-organismo ser o micro-organismo Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

17. Biocombustível caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 3 a 16.

18. Bioquímico caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 3 a 16.