WO2016070258A1 - Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica, micro-organismo geneticamente modificado com eficiente consumo de xilose, processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímico e/ou etanol assim produzido - Google Patents

Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica, micro-organismo geneticamente modificado com eficiente consumo de xilose, processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímico e/ou etanol assim produzido Download PDF

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WO2016070258A1
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seq
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microorganism
gene
terminator
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PCT/BR2015/050207
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Gleidson Silva TEIXEIRA
Gonçalo Amarante Guimarães PEREIRA
Leandro Vieira DOS SANTOS
Lucas Salera PARREIRAS
Luige Armando Llerena CALDERÓN
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Biocelere Agroindustrial Ltda.
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Definitions

  • Said invention is in the fields of biofuels, biochemicals and processes for obtaining them. More specifically, the present invention provides technical solutions for the production of second generation fuels based on the conversion of plant biomass, for example from cell wall polymers.
  • the present invention describes a genetically modified microorganism submitted to evolutionary engineering process with efficient fermentative performance in the conversion of sugars present in plant biomass to biochemicals and / or biofuels in the presence of high concentration of inhibitors generated by biomass processing to make sugars available.
  • the evolutionary engineering improvement process allows the microorganism to increase its xylose consumption and its resistance to inhibitors, especially acids, among which is acetic acid.
  • the modifications described in this report favor the performance of said microorganism when on an industrial scale. Additionally, a process for obtaining biofuels and / or biochemicals and the products thus obtained are also described.
  • Plant biomass is a complex mixture of chemically distinct compounds that can be fractionated into components with specific applications.
  • biorefineries ie biomass-based refineries
  • LV Pereira, GAG Green Petrochemicals - Anais do Symposium Microorganisms in Agroenergy: From Prospecting to Bioprocesses (Embrapa Publishing House ISSN 2177-4439, 2013).
  • plant biomass as a source of fermentable sugars is a promising and sustainable alternative, however, some challenges still need to be overcome, such as the availability of plant cell wall sugars.
  • This procedure can be done, for example, through the action of hydrolytic enzymes (cellulases and hemicellulases), which make available the sugar monomers (hexoses and pentoses) which, in turn, are later metabolized by microorganisms during the fermentation process. for biochemical and biofuel generation.
  • the first step is the pretreatment of plant biomass, which consists of a thermal process under pressure to disrupt the ligno-cellulosic matrix and solubilization of hemicellulose and solid cellulose.
  • plant biomass which consists of a thermal process under pressure to disrupt the ligno-cellulosic matrix and solubilization of hemicellulose and solid cellulose.
  • the second step is hydrolysis, in which hydrolytic enzymes (or an acid treatment) added to the process will act directly on polymers that form the cell wall, reducing these polymers to sugar monomers, which will then be converted to ethanol by yeast. specialized during the fermentation.
  • hydrolyzate contains high levels of monomeric sugars provided by hydrolysis (acid or enzymatic).
  • Such inhibitors which are present in lignocellulosic hydrolyzate and which negatively interfere with the performance of microorganisms include weak organic acids, sugar-derived compounds such as furfural and hydroxymethyl furfural, and lignin degradation products.
  • Acetic acid deserves prominence in this process as it is one of the major inhibitors released during the solubilization and hydrolysis of hemicellulose.
  • the rate of acetic acid in hydrolyzate may generally range from 0 to about 17 g / l depending on the material used for hydrolysis and its toxicity is highly elevated at low pH (Palmqvist & Hahn-Hagerdal 2000b; Zaldivar et al. 2001; Lima et al., 2004). It is also important to point out, in relation to compounds that inhibit the metabolism of fermenting microorganisms in the biofuel and biochemical production process, that even the first generation process subjects yeasts to these inhibitors mainly acids.
  • inhibitors may also come from molasses or metabolites produced by bacteria such as lactic acid, acetic acid, among others (Basso, L. C, Amorim HV, AJ de Oliveira and ML Lopes. production in Brazil. "Fems Yeast Research 8 (7): 1155-1163, 2008).
  • xylose isomerase xylose isomerase
  • the XR-XDH pathway common in eukaryotic microorganisms, has higher initial productivity by allowing ethanol to be produced more quickly, only by inserting the genes responsible for xylose conversion.
  • This pathway consists of two oxy-reduction reactions. In the first, xylose is reduced to xylitol by the action of the enzyme xylose reductase (XR), in a NADPH / NADH-mediated reaction, and then xylitol is oxidized to xylulose. by the enzyme xylitol dehydrogenase (XDH), mediated exclusively by NAD +.
  • XR xylose reductase
  • XDH xylitol dehydrogenase
  • the NADPH cofactor is mainly regenerated in the oxidative phase of the pentose phosphate pathway with CO2 production.
  • NAD + is mainly regenerated in the respiratory chain, with O2 as the final electron acceptor.
  • O2 the final electron acceptor.
  • complete NAD + reoxidation does not occur, resulting in redox imbalance and xylitol accumulation, which directly impacts the final ethanol yield [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p .49-59, 2002].
  • another formed byproduct is glycerol [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004].
  • xylose metabolism performed via the xylose isomerase (XI) pathway is more common in prokaryotes and occurs in a single step, thus avoiding redox imbalance and allowing less formation of byproducts that decrease ethanol yield. Additionally, the XI pathway may result in higher ethanol yield by accumulating fewer fermentation by-products [Microbial Celi Factories, London, v.6, n.5, p.1-10, 2007].
  • microorganisms described in the prior art which have been genetically engineered for xylose consumption invariably possess the genetic modifications described above.
  • the differential of each of these microorganisms is the combination between the genes of the pentose phosphate pathway and the promoters by which they are regulated, besides, mainly, the gene that encodes xylose isomerase, since this is the fundamental gene that enables xylose consumption by each modified microorganism.
  • microorganisms capable of converting xylose to biochemicals and / or biofuels it is found that obtaining microorganisms which, in addition to being capable of The fact that converting sugars present in lignocellulosic biomass into biofuels and / or biochemicals is also sufficiently resistant to inhibitors derived from the pretreatment process is not trivial.
  • the microorganism described in the present invention is efficient in the conversion of sugars present in lignocellulosic plant biomass, mainly in high concentrations of inhibitors of cellular metabolism, being the main inhibitor acetic acid, in biofuels and / or among them, mainly ethanol.
  • the present invention describes, among other objects, a genetically modified microorganism with efficient fermentative performance in converting sugars contained in plant biomass such as lignocellulosic materials into biofuels and / or biochemicals when compared to their version without them. genetic modifications described herein.
  • Said microorganism additionally subjected to process of evolutionary engineering, presents additional genetic modifications that are due to the evolutionary process and that allow it not only to be efficient in the conversion of pentoses into fuels and / or biochemicals, but also to be advantageously effective in performing this conversion in the presence of high concentration.
  • substances that inhibit its metabolism and are normally present in lignocellulosic hydrolyzate we can mention mainly acetic acid.
  • the genetically modified microorganism described in the present invention refers to a genetically transformed eukaryotic cell, for example a yeast or filamentous fungus, preferably a yeast of the genus Saccharomyces.
  • the pentose preferably used by the microorganism for conversion to alcohols and / or biochemicals indicated above is xylose, but is not restricted to it.
  • the microorganism described in the present invention is genetically modified by the introduction of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 encoding a peptide with xylose isomerase function, providing expression of an enzyme that favors xylose isomerization into xylulose.
  • the present invention also describes an expression cassette comprising a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, which encodes the xylose isomerase-like peptide and which is optionally inserted into a eukaryotic cell for expression of said isomerase in its active form.
  • the expression cassette of the invention is characterized in that it comprises: a nucleotide sequence encoding a peptide with xylose isomerase function SEQ ID NO: 1; at least one promoter for said coding nucleotide sequence; and - one or more nucleotide sequences selected from: a transcription terminator nucleotide sequence; a selection marker; one or more nucleotide sequence (s) coding (s) of other enzymes; combinations thereof or a plasmid comprising such sequences, with at least one of the nucleotide sequences defined above being heterologous.
  • One or more expression cassettes are used in the transformation of eukaryotic cells according to the invention.
  • the expression cassette of the invention also comprises sequences selected from the group comprising the coding sequences for the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 9), Transaldolase (SEQ NO ID: 5), Transcetolase (SEQ ID NO: 11) , Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 7) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 12) and / or combinations thereof.
  • the present invention provides a eukaryotic cell, yeast or filamentous fungi, for example a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, transformed with a nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1, which may be single copy or, for example, multiple copies (at least five to twenty copies or more than twenty copies) of this nucleotide sequence may be inserted into the genome.
  • the enzymes presented which constitute the pentose phosphate pathway, as well as the xylose isomerase represented by SEQ ID NO: 1, at least one of the genes encoding them must be overexpressed and, for example, linked. to constitutive or naturally inducible promoters.
  • the present invention describes a host cell comprising an expression cassette containing endogenous non-oxidative phase enzyme genes of the pentose phosphate pathway, which are, for example, constructed using strong and constitutive cell promoters. in which they will be inserted.
  • the present invention also describes deletion or inactivation of the GRE3 gene, which encodes an aldose reductase and is represented in SEQ ID NO: 14.
  • Xylitol production decreases the total ethanol yield that can be obtained.
  • xylitol is an inhibitor of the action of the enzyme xylose isomerase.
  • the aforementioned genetic modifications favor the flow of the non-oxidative part of the pentose phosphate pathway.
  • the favoring of this pathway can be directly correlated to the host cell's consumption of xylose.
  • the more xylose consumed the more active the flow would be.
  • the present invention describes the stable and high copy number integration (at least between five and twenty copies or more than twenty copies) of the XI-expressing cassette (SEQ ID N: 1) into the genome. of the host cell.
  • This document therefore describes a eukaryotic cell, for example, a genetically modified Saccharomyces cerevisiae microorganism containing in its genome at least one of the enzyme genes required to favor the non-oxidative portion of the pentose phosphate pathway. , inserted, for example, in high copy numbers (at least between five and twenty copies or more than twenty copies) and in the region between the centromere and its first adjacent gene. Having all the metabolic pathway required for xylose conversion under aerobic conditions, the strain is able to consume the xylose present in the culture medium, but under anaerobic conditions consumption is very slow.
  • the microorganism After undergoing the genetic modifications described herein, the microorganism is then subjected to an evolutionary engineering process comprising successive subcultures of the microorganism of interest in a culture medium containing a carbon source usable by the microorganism.
  • a carbon source usable by the microorganism mainly xylose, and increasing and varying concentrations of at least one microorganism metabolism inhibiting substance, preferably increased acetic acid, as noted in Example 4.
  • the process of obtaining microorganisms of the invention allows to obtain a microorganism with substantial and improved pentose conversion, mainly xylose in fuels and / or biochemicals and concomitant resistance to present inhibitors. in lignocellulosic hydrolyzate, mainly to acetic acid.
  • the process sought to select microorganisms that produce or are capable of producing biochemicals and / or biofuels of interest in a shorter time and / or greater amount, in the presence of the sugar source of interest and with a high concentration of inhibitors in relation to the amount of sugars in the culture medium, when compared with microorganisms not evolved for resistance to inhibitors present in lignocellulosic hydrolyzate.
  • the microorganism is cultured in a culture medium containing a lignocellulosic hydrolyzate comprising one or more inhibitors such as acetic acid and / or formic acid, as may be seen in Example 5.
  • the medium is supplemented with nitrogen.
  • the microorganisms with the best growth rate in said medium (s) are selected and isolated for subsequent use.
  • This selected microorganism has random genetic mutations arising from the evolution process and is deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Culture - Leibniz-lnstitut Deutsch Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen under number 28788 (DSM28788).
  • microorganism DSM28788 described in the present invention is, for example, of industrial lineage and differentially exhibits the characteristics of being non-flocculant, allowing low glycerol and xylitol formation, having high viability, high growth rate, not producing foam. , among others.
  • the present invention also discloses and comprises a process of producing biofuels and biochemicals from plant biomass, preferably the lignocellulosic portion of the plant biomass.
  • the biofuel and / or biochemical production process described in the present invention utilizes the microorganism of the invention (DSM 28788) for biofuel and / or biochemical production.
  • said process comprises the following steps:
  • the process of the invention provides for the production of biofuels comprising predominantly alcohols, especially ethanol.
  • the process of the invention provides for the production of biochemicals selected from the group comprising, but not limited to: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol 2,3-butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).
  • the present invention describes biofuels, for example ethanol, and / or biochemicals produced by the process using the microorganism of the invention, such as the microorganism deposited with the Leibniz Institute - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen under number 28788 (DSM28788).
  • inventive concept claimed herein is not limited to the embodiments exemplified above, which are to be construed as: evidence of the material existence of the invention; and as an information medium that readily enables a person skilled in the art to reproduce it - both in the specific forms here exemplified and in others legally within the full scope of the revealed inventive concept and the claimed objects.
  • the microorganism which is one of the objects of the invention is particularly efficient in converting pentoses constituting lignocellulosic material into alcohols and / or acids.
  • Said microorganism is efficient in converting pentoses, including xylose, present in lignocellulosic material, such as that previously subjected to hydrolysis process.
  • the microorganism described herein in addition to its efficient ability to convert, for example, xylose to ethanol, also exhibits effective resistance to inhibitors present in the lignocellulosic hydrolyzate during the fermentation process.
  • the main inhibitor being comprised in this hydrolyzate is acetic acid.
  • acids, including acetic acid in the first generation process for the production of biochemicals and / or biofuels, allowing efficient yield of the present microorganism also in this process.
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 17, indicating the region coding for LEU2 (underlined), along with its promoter and terminator (not underlined).
  • Figure 2 shows xylose consumption and ethanol production under anaerobic conditions by the microorganism described in the present invention following the genetic manipulation process for insertion of pentose phosphate pathway genes and genetically modified xylose isomerase gene, SEQ ID NO: 1, and before the evolution process.
  • the vertical axis describes the concentration in grams per liter and the horizontal axis the time in hours.
  • the xylose concentration is indicated by ( ⁇ ), while the ethanol concentration by time is represented by ( ⁇ ).
  • Figure 3 shows the consumption of xylose and ethanol production under anaerobic conditions by the microorganism described herein.
  • invention after the process of genetic manipulation for insertion of pentose phosphate pathway genes and genetically modified xylose isomerase gene, SEQ ID NO: 1, and after evolution process.
  • the vertical axis describes the concentration in g / L and the horizontal axis the time in hours.
  • the xylose concentration is indicated by ( ⁇ ), while the ethanol concentration by time is represented by ( ⁇ ).
  • Figure 4 shows the comparison in xylose consumption between the control microorganism (modified for xylose consumption only, no selection for inhibitor resistance), represented by (A) and the DSM28788 microorganism, represented by ( ⁇ ) .
  • the vertical axis shows the xylose concentration in grams per liter, while the horizontal axis shows the time in hours.
  • Figure 5 shows the comparison in ethanol production between the control microorganism (modified for xylose consumption only, no selection for inhibitor resistance), represented by ( ⁇ ) and the microorganism DSM28788, represented by (A) .
  • the vertical axis shows the concentration of ethanol in grams per liter, while the horizontal axis shows the time in hours.
  • Figure 6 shows us in line (1) the performance of the control microorganism, ie efficiently evolved to xylose consumption and, in line (2), the performance of the microorganism DSM28788, when subjected to different acid concentrations. acetic acid in the culture medium at different times.
  • Each of the acetic acid concentrations and time to which the strains were subjected were: (A) 5 grams of acetic acid per liter of YEPD medium for 24hs; (B) 11 grams of acetic acid per liter of YEPD medium for 24 hours; (C) 12 grams of acetic acid per liter of YEPD medium for 30 hours; (D) 12 grams of acetic acid per liter of YEPD medium for 48 hours; (E) 14 grams of acetic acid per liter of YEPD medium for 48 hours.
  • Figure 8 shows the comparison of xylose consumption kinetics between the DSM28788 microorganism ( ⁇ ) and the control microorganism ( ⁇ ), evolved only for xylose consumption.
  • the left vertical axis shows the Xylose scale in g / L, while the horizontal axis shows the time in hours.
  • the scale of formic acid (dashed line) and acetic acid (dotted line) are observed, both in g / L.
  • Figure 10 shows the compilation of values for glucose consumption, xylose and ethanol production by the microorganism DSM28788 when in lignocellulosic hydrolyzate.
  • concentrations of glucose ( ⁇ ), xylose ( ⁇ ) and ethanol (A) are shown on the vertical axis in grams per liter, while on the horizontal axis the time in hours is displayed.
  • the present invention describes, among other objects, a genetically modified microorganism with efficient fermentative performance in the conversion of sugars contained in plant biomass such as lignocellulosic materials into biofuels and / or biochemicals when compared to their version without them. genetic modifications described herein.
  • the present invention presents a expression cassette for eukaryotic cell transformation comprising:
  • xylose isomerase SEQ ID NO: 1
  • transaldolase SEQ ID NO: 5
  • ribose 5-phosphate isomerase SEQ ID NO: 7
  • xylulokinase SEQ ID NO: 9
  • transcetolase SEQ ID NO: 11
  • ribose 5-phosphate epimerase SEQ ID NO: 12
  • nucleotide sequence defined in a) is operably linked to the promoter nucleotide sequence defined in b) and the terminator nucleotide sequence defined in c), any of said sequences being heterologous.
  • the expression cassette is selected from the group consisting of:
  • (a) expression cassette comprising gene encoding xylose isomerase of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 1, TDH1 promoter of at least 95% identity of at least nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, and TDH1 terminator of at least 95% identity of at least nucleotide sequence SEQ ID NO: 3; b) expression cassette comprising ADH1 promoter represented by at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 8, XKS1 gene represented by at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 9 and ADH1 terminator represented for at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 10;
  • c) expression cassette comprising TDH1 sequence promoter of at least 95% identity of at least nucleotide SEQ ID NO: 2, TAL1 gene of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 5, TDH1 terminator gene of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 3, followed by PGK1 promoter of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 6, of at least 95% identity of at least RKI1 gene ( SEQ ID NO: 7) and at least 95% identity terminator of at least 5 nucleotide sequence SEQ ID NO: 13;
  • d) expression cassette comprising TDH1 promoter of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 02, TKL1 gene of at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 11, Ribose 5 encoding gene Phosphate Epimerase at least 95% identity of (SEQ ID NO: 7), TDH1 terminator at least 95% identity of at least sequence SEQ ID NO: 3, followed by PGK1 promoter of at least 95% sequence identity SEQ ID NO: 6, RPE1 gene of at least 95% sequence identity SEQ ID NO: 12 and PGK1 terminator of at least 95% sequence identity SEQ ID NO: 13; and combinations of at least two expression cassettes as described above.
  • At least one of said promoters is constitutive or naturally inducible.
  • the present invention provides a genetically modified microorganism comprising at least one expression cassette as defined above.
  • one or more of said expression cassettes are present in the region between the centromere and its first adjacent gene.
  • the promoter sequences, coding sequences, and terminator sequences of the expression cassettes are stable in the microorganism genome or are present in at least 5 copies in the microorganism genome or both.
  • the GRE3 gene (SEQ ID NO: 14) is inactivated or deleted in its genome.
  • the microorganism is a yeast of the genus selected from the group consisting of: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula and Yarrowia.
  • the microorganism is Saccharomyces cerevisiae yeast DSM28788.
  • the present invention provides a genetically modified microorganism for expression peptide with xylose isomerase function which is Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
  • the present invention provides a biofuel and / or biochemical production process comprising a. place lignocellulosic plant biomass, optionally previously subjected to pretreatment and hydrolysis, in contact with the microorganism as defined above, preferably under anaerobic conditions, but this is not a restrictive condition for the process; and b. optionally make further collection of the generated compound.
  • the biofuel and / or biochemical production process comprises
  • the process produces at least 0.70 grams of ethanol per liter of lignocellulosic hydrolyzate per hour under anaerobic conditions in medium comprising at least 12 grams of acetic acid per liter of lignocellulosic hydrolyzate.
  • the process produces at least 0.74 grams of ethanol per liter of lignocellulosic hydrolyzate per hour under anaerobic conditions in medium comprising at least 15 grams of acetic acid per liter of lignocellulosic hydrolyzate.
  • the present invention provides a biofuel obtained by the process as defined above.
  • the present invention provides a biochemist obtained by the process as defined above.
  • the present invention provides ethanol obtained by the process as defined above.
  • the said microorganism additionally subjected to evolutionary engineering process, presents additional genetic modifications that are due to the evolutionary process and that allow it not only to be efficient in converting pentoses into fuels and / or biochemicals, as well as being advantageously effective in performing such conversion in the presence of high concentration of metabolism inhibiting substances normally present in the lignocellulosic hydrolyzate.
  • these inhibitors we can mention mainly acetic acid and formic acid. It may produce at least 0.70 grams of ethanol per liter of lignocellulosic hydrolyzate per hour under anaerobic conditions in medium comprising at least 12 grams of acetic acid per liter of lignocellulosic hydrolyzate.
  • the process produces at least 0.74 grams of ethanol per liter of lignocellulosic hydrolyzate per hour under anaerobic conditions in medium comprising at least 15 grams of acetic acid per liter of lignocellulosic hydrolyzate.
  • the genetically modified microorganism described in the present invention refers to a genetically transformed eukaryotic cell, for example a yeast or filamentous fungus.
  • yeast are considered to be any individual of the Eumycotina group, i.e. unicellularly growing true fungi which preferentially perform anaerobic fermentation such as Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces. , Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula and Yarrowia.
  • Filamentous fungi are those characterized by presenting vegetative mycelium and growing from the elongation of the hyphae, as well as performing aerobic respiration, such as Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora and Acremonium.
  • the present invention describes a genetically modified microorganism, for example a yeast of the genus Saccharomyces.
  • One embodiment of the invention describes a microorganism of the Saccharomyces cerevisiae species more efficient in converting pentoses present in the lignocellulosic material into alcohols and / or biochemicals such as, for example, succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poly (butyrate hydroxide) without, however, being restricted to them as compared to their version without the genetic modifications described herein.
  • biochemicals such as, for example, succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poly (butyrate
  • the pentose preferably used by the microorganism for conversion to alcohols and / or biochemicals above is xylose, but is not restricted to it.
  • the microorganism described in the present invention is genetically modified by introducing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 encoding a peptide with xylose isomerase function, providing expression of an enzyme that favors xylose isomerization into xylulose.
  • a nucleotide sequence encoding a peptide with xylose isomerase function has been described in Orpinomyces sp. (XI, EC 5.3.1 .5). Such a sequence was manually optimized by the inventors for the codons preferably used by Saccharomyces cerevisiae.
  • the optimized xylose isomerase sequence SEQ ID NO: 1 used in the present invention is therefore unnatural and different from natural xylose isomerase sequences already described in banks.
  • CAI Codon Adaptation Index
  • the CAI index is the geometric mean of the relative adaptation values and non-synonymous codons and, in some cases, the termination codons are excluded. Values range from 0 to 1, with larger values indicating a higher proportion of the most abundant codons [Nucleic Acids Research 15: 1281-1295].
  • the present invention also describes an expression cassette comprising a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, encoding the xylose isomerase-like peptide and which is optionally inserted into a eukaryotic cell for expression of said isomerase in its active form.
  • the expression cassette of the invention is characterized in that it comprises: a nucleotide sequence encoding a peptide with xylose isomerase function SEQ ID NO: 1; at least one promoter for said coding nucleotide sequence; and - one or more nucleotide sequences selected from: a transcription terminator nucleotide sequence; a selection marker; one or more nucleotide sequence (s) coding for another enzyme; combinations thereof or a plasmid comprising such sequences, with at least one of the nucleotide sequences defined above being heterologous.
  • One or more expression cassettes are used in the transformation of eukaryotic cells according to the invention.
  • the expression cassette of the invention also comprises sequences selected from the group comprising the coding sequences of the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 9), Transaldolase (SEQ NO ID: 5), Transcetolase (SEQ ID NO: 11) , Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 7) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 12) and / or combinations thereof.
  • the eukaryotic host cell / microorganism is a yeast of the Saccharomyces cerevisiae species, but it is noted that any eukaryotic cell can be transformed with one or more expression cassettes of the invention comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a eukaryotic cell, yeast or filamentous fungi, for example a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, transformed with a nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1, which may be single copy or, for example, multiple copies (at least five to twenty copies or more than twenty copies) of this nucleotide sequence may be inserted into the genome.
  • the genetically modified host cell further comprises pentose phosphate pathway genes, so that the insertion of SEQ ID NO: 1 encoding xylose isomerase favors the xylose isomerization into xylulose. Therefore, in addition to the insertion of SEQ ID NO: 1 into the host cell, the present invention describes genetic modifications in that host cell aimed at favoring the metabolic flow through the pentose phosphate pathway, but these modifications are not, however, a restrictive factor for host cell transformation with the nucleotide sequence represented in SEQ ID NO: 1.
  • the enzymes presented which constitute the pentose phosphate pathway, as well as the xylose isomerase represented by SEQ ID NO: 1, at least one of the genes encoding them must be overexpressed and, for example, linked. to constitutive or naturally inducible promoters. Overexpression of the genes encoding these enzymes may be due to increased copy number of the nucleotide sequence encoding them, expression of episomal genes present in vectors that may be inserted into the host eukaryotic cell through the use of heterologous promoters to that sequence.
  • promoters may be constitutive or naturally inducible.
  • the present invention describes host cell comprising an expression cassette containing endogenous non-oxidative phase enzyme genes of the pentose phosphate pathway, which are, for example, constructed using strong and constitutive cell promoters. in which they will be inserted.
  • the present invention describes four embodiments of integrative expression cassettes, which were constructed using Saccharomyces cerevisiae constitutive, high expression promoters, and stably integrated into the host cell genome.
  • One of the described cassettes comprises the gene encoding xylose isomerase, SEQ ID NO: 1.
  • copy of SEQ ID NO: 1 is inserted into the flanked host cell, for example, by the promoter and terminator region of the Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase gene, isoenzyme 1 (TDH1).
  • TDH1 Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase gene
  • the cassette containing the gene encoding xylose isomerase that has been inserted into the host cell genome is formed by the TDH1 promoter, whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 2 gene XI (SEQ ID NO : 1 and TDH1 terminator, whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 3).
  • a second cassette described in the present invention contains gene encoding the enzyme Xylulokinase (SEQ ID NO: 9).
  • the present disclosure indicates that the cassette is, for example, constructed using promoter and terminator of the alcohol dehydrogenase (ADH1) enzyme encoding gene.
  • ADH1 alcohol dehydrogenase
  • the cassette containing the Xylulokinase coding gene is described as constituted by the ADH1 promoter represented by SEQ ID NO: 8, XKS1 gene (SEQ ID NO: 9) and ADH1 terminator represented by SEQ ID NO: 10.
  • Another cassette described in the present invention contains genes encoding Transaldolase (SEQ NO ID: 5) and Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 7).
  • This cassette is constructed, for example, using promoters and terminators of the gene encoding the enzyme Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase, isoenzyme 1 (TDH1) to flank the Transaldolase gene and promoters and terminators of the 3-phosphoglycerate kinase (PGK1) enzyme. to flank the Ribose 5-Phosphate Isomerase gene.
  • the expression cassette consists of, for example, TDH1 promoter (SEQ ID NO: 2), TAL1 gene (SEQ ID NO: 5), and TDH1 terminator (SEQ ID NO: 3), followed by promoter PGK1, whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 6, RKI1 gene (SEQ ID NO: 7 and terminator, whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 13.
  • a last cassette described in the present invention contains genes encoding Transcetolase (SEQ ID NO: 11) and Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 7), for example, with function associated with Glyceraldehyde 3 gene promoters and terminators.
  • the expression cassette that has been inserted into the host cell genome and contains the Transcetolase and Ribose 5-Phosphate Epimerase genes is comprised, for example, of the TDH1 promoter (SEQ ID NO: 2), TKL1 gene (SEQ ID NO: 11) and TDH1 terminator (SEQ ID NO: 3), followed by PGK1 promoter (SEQ ID NO: 6), RPE1 gene (SEQ ID NO: 12) and PGK1 terminator (SEQ ID NO: 13).
  • All expression cassettes with the pentose phosphate metabolic pathway genes that favor xylose consumption are inserted into the target chromosome region located between the centromere and the first gene adjacent to it, for example in the first 5,000 region base pairs counted from the centromere in either upstream or downstream direction, and may even be upstream only, downstream only, or both simultaneously.
  • Upstream direction is considered to be that located prior to the start point of the transcription unit of a DNA sequence, which starts at the promoter and ends at the terminator.
  • downstream is considered the region located after the starting point of the transcription unit of a DNA sequence.
  • the present invention also describes the deletion or inactivation of the GRE3 gene, which encodes an aldose reductase and is represented in SEQ ID NO: 14.
  • Xylitol production decreases the total ethanol yield that can be obtained.
  • xylitol is an inhibitor of the action of the enzyme xylose isomerase.
  • the aforementioned genetic modifications favor the flow of the non-oxidative part of the pentose phosphate pathway.
  • the favoring of this pathway can be directly correlated to the host cell's consumption of xylose.
  • the present invention describes the stable and high copy number integration (at least between five and twenty copies or more than twenty copies) of the XI-expressing cassette (SEQ ID N: 1) into the genome. of the host cell.
  • This document therefore describes a eukaryotic cell, for example, a genetically modified Saccharomyces cerevisiae microorganism containing in its genome at least one of the enzyme genes required to favor the non-oxidative part of the pentose phosphate pathway. , inserted, for example, in high copy numbers (at least between five and twenty copies or more than twenty copies) and in the region between the centromere and its first adjacent gene. Having all the metabolic pathway required for xylose conversion under aerobic conditions, the strain is able to consume the xylose present in the culture medium, but under anaerobic conditions consumption is very slow.
  • the microorganism After undergoing the genetic modifications described herein, the microorganism is then subjected to an evolutionary engineering process comprising successive subcultures of the microorganism of interest in a culture medium containing a carbon source usable by the microorganism. mainly xylose, and varying and increasing concentrations of at least one microorganism metabolism inhibiting substance, preferably increased acetic acid, as noted in Example 4. Repeating this operation allows selection of microorganisms that have random genetic modifications derived from the process of evolution, such microorganisms being resistant to said inhibitor of interest, as shown in Example 4.
  • an evolutionary engineering process comprising successive subcultures of the microorganism of interest in a culture medium containing a carbon source usable by the microorganism. mainly xylose, and varying and increasing concentrations of at least one microorganism metabolism inhibiting substance, preferably increased acetic acid, as noted in Example 4. Repeating this operation allows selection of microorganisms that have random genetic modifications derived from the process of evolution, such
  • the process of obtaining microorganisms of the invention allows to obtain a microorganism with substantial and improved pentose conversion, mainly xylose in fuels and / or biochemicals and concomitant resistance to present inhibitors.
  • a microorganism with substantial and improved pentose conversion mainly xylose in fuels and / or biochemicals and concomitant resistance to present inhibitors.
  • lignocellulosic hydrolyzate mainly to acetic acid.
  • the process sought to select microorganisms that produce or are capable of producing biochemicals and / or biofuels of interest in a shorter time and / or greater amount, in the presence of the sugar source of interest and with a high concentration of inhibitors in relation to the amount of sugars in the culture medium, when compared with microorganisms not evolved for resistance to inhibitors present in lignocellulosic hydrolyzate.
  • the microorganism is cultured in a culture medium containing a lignocellulosic hydrolyzate comprising one or more inhibitors such as acetic acid and / or formic acid, as may be seen in Example 5.
  • the medium is supplemented with nitrogen.
  • the microorganisms with the best growth rate in said medium (s) are selected and isolated for subsequent use.
  • This selected microorganism has random genetic mutations arising from the evolution process and is deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Culture - Leibniz-lnstitut Deutsch Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen under number 28788 (DSM28788).
  • microorganism DSM28788 described in the present invention is, for example, of industrial lineage and differentially exhibits the characteristics of being non-flocculant, allowing low glycerol and xylitol formation, having high viability, high growth rate, not producing foam. , among others.
  • the present invention also discloses and comprises a process for producing biofuels and biochemicals from plant biomass, preferably the lignocellulosic portion of plant biomass.
  • the biofuel and / or biochemical production process described in the present invention utilizes the microorganism of the invention (DSM 28788) for biofuel and / or biochemical production.
  • said process comprises the following following steps:
  • the process of the invention provides for the production of biofuels comprising predominantly alcohols, especially ethanol.
  • the process of the invention provides for the production of biochemicals selected from the group comprising, but not limited to: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol 2,3-butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).
  • the present invention describes biofuels, for example ethanol, and / or biochemicals produced by the process using the microorganism of the invention, such as the microorganism deposited with the Leibniz Institute - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen under number 28788 (DSM28788).
  • inventive concept claimed herein is not limited to the embodiments exemplified above, which are to be interpreted: as evidence of the material existence of the invention; and as an informational medium that readily enables a person skilled in the art to reproduce it - both in the specific forms here exemplified and in others legally within the full scope of the disclosed inventive concept and claimed objects.
  • the microorganism which is one of the objects of the invention is particularly efficient in converting pentoses constituting lignocellulosic material into alcohols and / or acids.
  • Said microorganism is efficient in converting pentoses, including xylose, present in lignocellulosic material, such as that previously subjected to hydrolysis process.
  • the microorganism described herein in addition to its efficient ability to convert, for example, xylose to ethanol, also exhibits effective resistance to inhibitors present in the lignocellulosic hydrolyzate during the fermentation process.
  • the main inhibitor being comprised in this hydrolyzate is acetic acid.
  • acids, including acetic acid in the first generation process for the production of biochemicals and / or biofuels, allowing efficient yield of the present microorganism also in this process.
  • each gene was amplified by PCR of the S. cerevisiae genome and cloned into integrative expression cassettes. .
  • the URA3 gene flanked by two loxP regions in the same orientation was cloned, allowing that region to be removed by expression of Cre recombinase and the URA3 auxotrophic marker could be used in all expression cassettes. with the described genes.
  • the xylulokinase gene-encoding gene expression cassette for example, that gene was amplified by PCR of the S. cerevisiae genome and cloned adjacent to the promoter and terminator of the Alcohol dehydrogenase (ADH1) -coding gene. . After the terminator, it was inserted the URA3 gene flanked by two loxP regions in the same orientation. At the end of the cassette, homology regions were cloned near S. cerevisiae centromere two and eight. Two transformations were performed to insert the cassettes expressing the XKS1 gene at 288 bp from centromere two and 228 bp from centromere eight. Thus, in addition to the endogenous copy, the transformant has two more copies of the XKS1 gene under the action of a high-expressive constitutive promoter.
  • ADH1 Alcohol dehydrogenase
  • Transaldolase TAL 1
  • Ribose 5-Phosphate Isomerase RKI1
  • TDH1 isoenzyme 1
  • PGK1 3-phosphoglycerate kinase
  • TTL1 Transcetolase
  • RPE1 Ribose 5-Phosphate Epimerase
  • 126 bp were cloned from each side with homology to a region close to Saccharomyces cerevisiae chromosome five, allowing integration via homologous recombination into that region.
  • the Xylose Isomerase expressing cassette represented by SEQ ID NO: 1 has been modified by including at the ends of the cassette delta elements of the retrotransposon Ty1 ( element present in high copy number in the genome of S. cerevisiae).
  • the URA3 marker flanked by the loxP regions is replaced in this plasmid by the LEU2 marker.
  • the LEU2 gene is deleted in a step of genetic manipulation. In this step, the URA3 gene is integrated, flanked by loxP regions adjacent to LEU2 promoter and terminator homology regions, resulting in deletion of this gene. Then, the XI cassette flanked by the Ty1 elements is inserted and using the auxotrophic marker LEU2 to select the transformants.
  • the deletion of the GRE3 gene which encodes an aldose reductase and is represented in SEQ ID NO: 14, was performed in two steps by genetic manipulation, aimed at decreasing xylitol production from xylose.
  • the URA3 gene was integrated, flanked by loxP regions adjacent to GRE3 gene promoter and terminator homology regions, resulting in deletion of this region.
  • the URA3 marker was removed by transient expression of Cre recombinase.
  • the micro- genetically modified organism described in the present invention when under anaerobic conditions, consumes xylose present in the culture medium slowly and with low biofuel generation, in the case of ethanol, as can be seen in Figure 2.
  • Said microorganism was subjected to an evolutionary engineering process which consisted of successive subcultures in medium containing 50 g / l xylose under semi-anaerobic conditions.
  • the inoculum was started with optical density (OD) of -1.0. Due to low initial growth, in the first two experiments a low amount of glucose (0.5%) was added to the medium for faster culture growth. After 48 hours of cultivation, an aliquot was transferred to a new culture medium flask and the experiment was repeated. In the third transfer, the addition of glucose to the culture medium was not necessary because there was an increase in the growth rate of the xylose microorganism as the sole carbon source. Twenty colonies of the evolved cell mixture were isolated and analyzed.
  • microorganisms that showed efficient growth using xylose as sole carbon source were inoculated in medium containing 50 g / L xylose, 6 g / L yeast, 1 g / l Ammonium chloride, 5 g / l Monobasic potassium phosphate, 1.5 g / l Magnesium chloride and starting with 5 g / l acetic acid, at pH4.5 and temperature of 30 ° C.
  • the initial inoculum had Optical Density (OD) equal to 0.2 and successive subcultures were performed every 48 hours, selecting for each subculture those strains with the highest growth potential in medium containing acetic acid.
  • OD Optical Density
  • the strain with the best resistance potential in acetic acid-containing medium containing random genetic mutations resulting from the evolution process was deposited at the Leibniz Institute - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen under 28788 (DSM28788). This strain was also selected due to its superior performance in the xylose to ethanol conversion capacity, as can be seen in Figure 3.
  • the culture medium was prepared using sugarcane straw hydrolyzate which comprised between 1 g / l and 50 g / l xylose, for example 42 g / l and between 1 and 60 g / l glucose, being for example 55 g / L, in addition to 0-1% acetic acid, 0-0.5% HMF and 0-0.5% furfural, the main inhibitors that occur in the fermentation process.
  • the hydrolyzate was supplemented with adequate nutrients to support yeast growth.
  • Each of the cultures was started with an Optical Density (OD) of 0.1 when measured at 600 nm wavelength and incubated at 200 rpm at 30 ° C for 16 hours.
  • OD Optical Density
  • One volume of each culture was centrifuged at 4000 rpm for 10 min. The pellet cells were washed in distilled water and resuspended in the culture medium suitable for bioreactor transfer.
  • Xylose and ethanol quantifications were performed by HPLC high performance liquid chromatography and using the Alliance HT (Waters) refractive index detector chromatograph (Waters 2414). The runs were performed using an HPX-87H (BioRad) column maintained at 35 ° C with 4 mM sulfuric acid as the mobile phase and a flow rate of 0.6 mL / min.
  • Figure 7 shows the increased ethanol production capacity by the DSM28788 microorganism compared to a microorganism control that was modified only for xylose consumption, without selection for inhibitor resistance, thus proving to be the most suitable for biofuel and / or biochemical production, for example ethanol.
  • the pre-inoculum of the strains was done in YEPD medium (20 g / l glucose, 20 g / l peptone and 10 g / l yeast extract) and grown in shaker for approximately 16 hours at 30 ° C. by 200 rpm. After this period, the cells were centrifuged, washed and resuspended in sterile distilled water with final OD 1.0.
  • microorganism DSM28788 that was evolved to resist inhibitors comprised in lignocellulosic hydrolyzate, for example acetic acid, also showed higher growth in medium supplemented with 11 g / l acetic acid relative to the control microorganism ( Figure 6, column B).
  • Example 7 COMPARATIVE FERMENTATION BETWEEN DSM 28788 LINE AND NON-RESISTANT LINE (CONTROL) USING LAB MEDIA UNDERSTANDING THE HIGH CONCENTRATION OF ORGANIC ACID (ACETIC ACID AND FORMIC ACID).
  • microorganisms Two microorganisms, one of them being control, ie modified and evolved only for efficient xylose consumption, and the microorganism deposited at the Leibniz Institute - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen under number 28788 (DSM28788) were tested halfway. A combination of high concentrations of acetic acid and formic acid, aiming to evaluate the performance of both microorganisms when subjected to high concentrations of inhibitors.
  • the laboratory medium used was YEP (10 g / L yeast extract and 20 g / L bacteriological peptone) containing a mixture of sugars (50 g / L glucose and 40 g / L xylose) and two normally found inhibitors. in lignocellulosic hydrolysates (8 g / l acetic acid and 4 g / l formic acid). Cultures were started with approximately 0.4 g / l of cells on a dry basis. In addition, the cultures were maintained in anaerobic condition to induce fermentation, each culture was incubated in a bioreactor where the pH was adjusted and controlled at 5 ° C and where the temperature was maintained at 32 ° C. Samples were taken at appropriate intervals and xylose, glucose and ethanol were quantified.
  • Table X shows us the comparison of volumetric productivity and sugar intake index between the DSM28788 microorganism and the control microorganism that was evolved only for xylose consumption.
  • Table 2 Comparison of volumetric productivity and sugar consumption index.
  • the present invention also discloses and comprises a process for producing biofuels and biochemicals from plant biomass, for example the lignocellulosic portion of plant biomass.
  • the biofuel and / or biochemical production process described in the present invention utilizes the microorganism of the invention for biofuel and / or biochemical production.
  • said process consists of the following steps:
  • the present process is capable of yielding at least 0.46 grams of ethanol produced per gram of sugar consumed when performed in lignocellulosic hydrolyzate. Additionally, the present process yields at least 0.74 grams of ethanol produced per liter of hydrolyzate every hour.
  • the process of the invention provides for the production of biofuels comprising predominantly alcohols, especially ethanol.
  • the process of the invention provides for the production of biochemicals selected from the group comprising, but not limited to: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol 2,3-butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).
  • the present invention describes biofuels, for example ethanol, and biochemicals produced by the process using the microorganism of the invention, such as the microorganism deposited with the Leibniz Institute - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen under 28788 (DSM28788).
  • inventive concept claimed herein is not limited to the embodiments exemplified above, which are to be interpreted: as evidence of the material existence of the invention; and as an informational medium that readily enables a person skilled in the art to reproduce it - both in the specific forms here exemplified and in others legally within the full scope of the disclosed inventive concept and claimed objects.

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Abstract

A presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. Dentre outros objetos, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis e eficiente resistência aos inibidores gerados pelas etapas de processamento da biomassa para disponibilização dos açúcares, principalmente ao ácido acético, favorecendo assim seu desempenho em escala industrial. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos utilizando-se o micro-organismo descrito no presente documento, também é objeto da presente invenção, bem como os biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.

Description

CASSETE DE EXPRESSÃO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA EUCARIÓTICA, MLCRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO COM EFICIENTE CONSUMO DE XILOSE, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BLOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS E BLOCOMBUSTÍVEL E/OU
BIOQUÍMICO E/OU ETANOL ASSIM PRODUZIDO
CRIAÇÃO E CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A referida invenção situa-se nos campos dos biocombustíveis, bioquímicos e processos para sua obtenção. Mais especificamente, a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. Dentre outros objetos, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado e submetido a processo de engenharia evolutiva com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis em presença de alta concentração de inibidores gerados pelas etapas de processamento da biomassa para disponibilização dos açúcares. O processo de melhoramento por engenharia evolutiva permite que o microorganismo amplie seu consumo de xilose e sua resistência aos inibidores, principalmente ácidos, entre os quais se destaca o ácido acético. As modificações descritas no presente relatório favorecem o desempenho do dito micro-organismo quando em escala industrial. Adicionalmente, são também descritos um processo para a obtenção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] A necessidade da substituição da matriz mundial de combustíveis baseada em fontes fósseis por alternativas renováveis tornou a produção de combustíveis de segunda geração, por exemplo, etanol, uma das mais promissoras tecnologias em fase de desenvolvimento. Este processo consiste na conversão de polímeros que formam a biomassa vegetal, principalmente aqueles presentes na parede celular como celulose, hemicelulose e lignina, em biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0003] A biomassa vegetal é uma mistura complexa de compostos quimicamente distintos que podem ser fracionados gerando componentes com aplicações específicas. Assim, do mesmo modo que uma refinaria petroquímica produz uma grande variedade de produtos derivados do petróleo bruto, os mesmos princípios podem ser aplicados a biorrefinarias, ou seja, refinarias baseadas em biomassa (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquímica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).
[0004] A utilização da biomassa vegetal como fonte de açúcares fermentescíveis é uma alternativa promissora e sustentável, entretanto, alguns desafios ainda precisam ser superados, como a disponibilização dos açúcares da parede celular vegetal. Esse procedimento pode ser feito, por exemplo, através da ação de enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases), as quais disponibilizam os monômeros de açúcares (hexoses e pentoses) que, por sua vez, são posteriormente metabolizados por micro-organismos durante processo de fermentação para geração de bioquímicos e biocombustíveis.
[0005] Nesse contexto, é relevante considerarmos que o processo para liberação desses monômeros de açúcares envolve principalmente duas etapas:
a) A primeira etapa é o pré-tratamento da biomassa vegetal, que consiste de processo térmico sob pressão para disruptura da matriz ligno-celulósica e solubilização da hemicelulose e celulose sólida. Assim, há um aumento da acessibilidade dos polímeros que constituem a parede celular vegetal às enzimas que realizarão o posterior processo de hidrólise.
b) A segunda etapa é a hidrólise, na qual enzimas hidrolíticas (ou um tratamento ácido) adicionadas ao processo irão agir diretamente sobre polímeros que formam a parede celular, reduzindo esses polímeros a monômeros de açúcares, os quais serão posteriormente convertidos a etanol por leveduras especializadas durante a fermentação.
[0006] A solução resultante destes dois tratamentos é genericamente referida como hidrolisado, por conter altos teores de açúcares monoméricos disponibilizados pela hidrólise (ácida ou enzimática).
[0007] Nessas etapas, entretanto, é liberada alta concentração de substâncias que afetam negativamente os micro-organismos fermentadores, genericamente conhecidas como inibidores, os quais prejudicam significativamente o metabolismo desses micro-organismos e, consequentemente, seu crescimento e o rendimento na conversão de açúcares em combustíveis e/ou bioquímicos (Palmqvist et al., 1998, 1999; Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000a, b; Larsson et al., 2001 ; Zaldivar et al., 2001 ; Klinke et al., 2004; Lima et al., 2004).
[0008] Esses inibidores que estão presentes no hidrolisado lignocelulósico e que interferem negativamente na performance dos microorganismos incluem ácidos orgânicos fracos, compostos derivados do açúcar como furfural e hidroximetil furfural, e produtos provenientes da degradação da lignina.
[0009] O ácido acético merece destaque nesse processo, pois é um dos principais inibidores liberado durante a solubilização e hidrólise de hemicelulose. A taxa de ácido acético em hidrolisado pode variar geralmente entre 0 e aproximadamente 17 g/L dependendo do material utilizado para hidrólise e sua toxicidade é altamente elevada em pH baixo (Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000b; Zaldivar et al., 2001 ; Lima et al., 2004). É relevante salientar também, em relação a compostos inibidores do metabolismo de micro-organismos fermentadores no processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos, que mesmo o processo de primeira geração submete as leveduras a esses inibidores principalmente os ácidos. Esses inibidores podem ser também provenientes do melaço ou metabolitos produzidos por bactérias, como ácido lático, ácido acético, entre outros (Basso, L. C, H. V. de Amorim, A. J. de Oliveira and M. L. Lopes. "Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil." Fems Yeast Research 8(7): 1155-1163, 2008).
[0010] É relevante salientar que a maior parte dos micro-organismos fermentadores como, por exemplo, a levedura Saccharomyces cerevisiae não são naturalmente capazes de fermentar pentoses, como, por exemplo, a xilose, presente na biomassa. Entretanto, diversos trabalhos já realizaram procedimentos de engenharia metabólica em S. cerevisiae introduzindo nesses organismos as vias metabólicas para consumo de xilose, tendo como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI).
[0011] É descrito no estado da técnica que a introdução de gene que codifica a enzima xilose isomerase (XI) permite que a cepa apresente maior rendimento na produção de álcool e/ou ácidos do que quando ela é modificada com outros genes, como por exemplo, gene que codifica a enzima xilose redutase ou xilitol desidrogenase, visto que o metabolismo utilizando xilose isomerase permite menor acúmulo de subprodutos não desejáveis, como xilitol e glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664].
[0012] A via XR-XDH, comum em micro-organismos eucariotos, tem maior produtividade inicial por permitir que o etanol seja produzido mais rapidamente, apenas com a inserção dos genes responsáveis pela conversão da xilose. Essa via consiste em duas reações de oxi-redução, sendo que na primeira, a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em reação mediada por NADPH/NADH e, em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD+. O cofator NADPH é principalmente regenerado na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, com produção de CO2. Porém, NAD+ é regenerado principalmente na cadeia respiratória, com o O2 como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigénio, não ocorre a completa reoxidação de NAD+, resultando em um desbalanço redox e no acúmulo de xilitol, o que impacta diretamente no rendimento final de etanol [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1 , p.49-59, 2002]. Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004].
[0013] Por sua vez, o metabolismo de xilose realizado através da via xilose isomerase (XI) é mais comum em procariotos e ocorre em um único passo, evitando assim o desbalanço redox e permitindo menor formação de subprodutos que diminuem o rendimento de etanol. Adicionalmente, a via da XI pode resultar em um maior rendimento de etanol por acumular menor quantidade de subprodutos da fermentação [Microbial Celi Factories, Londres, v.6, n.5, p.1-10, 2007].
[0014] Assim, micro-organismos descritos no estado da técnica, que foram geneticamente modificados para consumo de xilose, invariavelmente possuem as modificações genéticas descritas acima. Basicamente, o diferencial de cada um desses micro-organismos é a combinação entre os genes da via das pentoses fosfato e dos promotores pelos quais estão regulados, além, principalmente, do gene que codifica a xilose isomerase, pois é esse o gene fundamental que possibilita o consumo de xilose por cada microorganismo modificado.
[0015] Entretanto, esses micro-organismos que se tornam capazes de consumir açúcares presentes nas cadeias de celulose e hemi-celulose, não são geralmente passíveis de utilização em escala industrial de forma eficiente. Isso acontece pois tais cepas modificadas acabam sendo susceptíveis a ter seu desempenho fermentativo comprometido quando submetidas a condições muito desfavoráveis para fermentação como, por exemplo, meio com alta concentração de inibidores, fato que, como observado, ocorre regularmente nos processos de segunda geração.
[0016] Grande parte dessa ineficiência ocorre principalmente graças ao ácido acético, um dos principais inibidores gerados no processamento de biomassa lignocelulósica, e que afeta negativamente a cinética de fermentação de açúcares realizada, por exemplo, por Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas para realizarem consumo de xilose. [0017] Ressalta-se ainda que, no que se refere especificamente à produção de etanol de segunda geração, a levedura Saccharomyces cerevisiae recebe papel de destaque devido à sua robustez e tolerância em condições industriais de fermentação. Adicionalmente, trata-se de um micro-organismo cuja manipulação genética é facilitada, e o uso de ferramentas de engenharia metabólica, em sinergia com biologia de sistemas e biologia sintética, tem possibilitado a inclusão de novas rotas metabólicas para a produção de combustíveis e químicos como etanol, biobutanol, biodiesel, 1 ,2-propanediol, ácido succínico, ácido pirúvico, entre outros [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671-90, 2012].
[0018] Apesar dos documentos WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 e WO2014018552 descreverem micro-organismos capazes de converter xilose à bioquímicos e/ou biocombustíveis, verifica-se que a obtenção de micro-organismos que, além de serem capazes de converter açúcares presentes na biomassa lignocelulósica em biocombustíveis e/ou bioquímicos, sejam também suficientemente resistentes aos inibidores derivados do processo de pré-tratamento, não é trivial.
[0019] Assim, o micro-organismo descrito na presente invenção mostra- se eficiente na conversão de açúcares presentes na biomassa vegetal lignocelulósica, principalmente em altas concentrações de inibidores do metabolismo celular, sendo o principal inibidor o ácido acético, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, dentre eles, principalmente etanol.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0020] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0021] O dito micro-organismo, adicionalmente submetido a processo de engenharia evolutiva, apresenta modificações genéticas suplementares que são decorrentes do processo de evolução e que o permitem não somente mostrar-se eficiente na conversão de pentoses em combustíveis e/ou bioquímicos, como também ser vantajosamente eficaz em realizar essa dita conversão na presença de elevada concentração de substâncias inibidoras de seu metabolismo e que normalmente estão presentes no hidrolisado lignocelulósico. Entre esses inibidores podemos citar, principalmente, ácido acético.
[0022] De modo mais específico, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a uma célula eucariotica transformada geneticamente, por exemplo uma levedura ou fungo filamentoso, preferencialmente uma levedura do género Saccharomyces.
[0023] A pentose preferencialmente utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose, sem, entretanto, restringir-se a ela.
[0024] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 que codifica um peptídeo com função xilose isomerase, proporcionando a expressão de uma enzima que favorece a isomerização de xilose em xilulose.
[0025]Assim, a presente invenção descreve também um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 , que codifica o peptídeo do tipo xilose isomerase e que, opcionalmente, é inserido em uma célula eucariotica para a expressão da referida isomerase em sua forma ativa.
[0026]O cassete de expressão da invenção é caracterizado por compreender: - uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase SEQ ID NO:1 ; - ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante; e - uma ou mais sequências nucleotídicas selecionadas dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas. Um ou mais cassetes de expressão são usados na transformação de células eucarioticas de acordo com a invenção.
[0027]Opcionalmente, o cassete de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:9), Transaldolase (SEQ NO ID:5), Transcetolase (SEQ ID NO:11 ), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:12) e/ou combinações destas.
[0028] Portanto, a presente invenção proporciona uma célula eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, sendo, por exemplo, uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 1 , a qual pode apresentar-se em cópia única ou, por exemplo, múltiplas cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) dessa sequência de nucleotídeos podem ser inseridas no genoma.
[0029] Dentre as enzimas apresentadas, e que constituem a via das pentose-fosfato, assim como a xilose isomerase representada por SEQ ID NO:1 , ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, por exemplo, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0030] Em uma concretização, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos.
[0031] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14. A produção de xilitol diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.
[0032] Quando realizadas em Saccharomyces cerevisiae, as modificações genéticas acima citadas favorecem o fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses-fosfato. O favorecimento dessa via pode ser diretamente correlacionado ao consumo de xilose pela célula hospedeira. Assim, quanto mais xilose fosse consumida, mais ativo estaria o fluxo por essa via.
[0033] Adicionalmente, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1 ) no genoma da célula hospedeira.
[0034] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, por exemplo, micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, por exemplo, em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de consumir a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.
[0035] O micro-organismo após ser submetido às modificações genéticas descritas no presente documento, é, então, submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do microorganismo de interesse em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo, principalmente xilose, e concentrações variáveis e crescentes de pelo menos uma substância inibidora do metabolismo do micro-organismo, preferencialmente ácido acético acrescido, como observado no Exemplo 4. [0036] Assim, em uma concretização, o processo de obtenção de microorganismos da invenção, permite a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis e/ou bioquímicos e concomitante resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, principalmente ao ácido acético. Ou seja, o processo buscou selecionar microorganismos que produzam ou sejam capazes de produzir bioquímicos e/ou biocombustíveis de interesse em menor tempo e/ou maior quantidade, na presença da fonte de açúcar de interesse e com alta concentração de inibidores em relação à quantidade de açúcares no meio de cultura, quando comparados com micro-organismos não evoluídos para resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.
[0037] Em uma concretização, o micro-organismo é cultivado em um meio de cultura contendo um hidrolisado lignocelulósico que compreende um ou mais inibidores como, por exemplo, ácido acético e/ou ácido fórmico, como pode ser observado no Exemplo 5. Opcionalmente, o meio é suplementado com nitrogénio. Os micro-organismos com melhor velocidade de crescimento no referido meio (são) selecionado(s) e isolado(s), para subsequente uso. Esse micro-organismo selecionado possui mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução e encontra-se depositado na Coleção Alemã de Micro-organismos e Cultura de Células - Leibniz-lnstitut Deutsch Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0038] O micro-organismo DSM28788 descrito na presente invenção é, por exemplo, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir espuma, entre outros.
[0039] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção (DSM 28788) para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0040] Em uma concretização, o referido processo compreende as seguintes etapas:
a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e
b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0041] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0042] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e/ou bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0043] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.
[0044] Salienta-se, então, que o micro-organismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulosico em álcoois e/ou ácidos. Referido micro-organismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulosico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise.
[0045] Adicionalmente, salienta-se também que o micro-organismo descrito no presente documento, além de eficiente capacidade na conversão, por exemplo, de xilose em etanol, apresenta também eficaz resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulosico durante o processo de fermentação, sendo o principal inibidor compreendido nesse hidrolisado o ácido acético. Destaca-se também a presença de ácidos, incluindo o ácido acético, no processo de primeira geração para produção de bioquímicos e ou biocombustíveis, permitindo eficiente rendimento do presente micro-organismo também nesse processo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0046] Na Figura 1 é apresentada a sequência de nucleotídeos representada como SEQ ID NO:17, sendo indicada a região que codifica LEU2 (sublinhada), juntamente com seu promotor e terminador (não sublinhado).
[0047] A Figura 2 mostra o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentoses fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1 , e antes do processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em gramas por Litro e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■).
[0048] Na Figura 3 observa-se o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentoses fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1 , e após processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em g/L e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■).
[0049] A Figura 4 mostra a comparação no consumo de xilose entre o micro-organismo controle (modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores), representado por ( A) e o microorganismo DSM28788, representado por (·). No eixo vertical mostra-se a concentração de xilose em gramas por Litro, enquanto o eixo horizontal apresenta o tempo em horas.
[0050] A Figura 5 mostra a comparação na produção de etanol entre o micro-organismo controle (modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores), representado por (·) e o microorganismo DSM28788, representado por (A). No eixo vertical mostra-se a concentração de etanol em gramas por Litro, enquanto o eixo horizontal apresenta o tempo em horas.
[0051] A Figura 6 nos mostra na linha (1) a performance do microorganismo controle, ou seja, eficientemente evoluído para consumo de xilose e, na linha (2), a performance do micro-organismo DSM28788, quando submetidos a diferentes concentrações ácido acético no meio de cultura, em diferentes tempos. Cada uma das concentrações de ácido acético e tempo a que as linhagens foram submetidas foram: (A) 5 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 24hs; (B) 1 1 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 24 horas; (C) 12 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 30 horas; (D) 12 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 48 horas; (E) 14 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 48 horas.
[0052] Na Figura 7 observamos a comparação da cinética de consumo de glicose entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (·), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa-se a escala de Glicose em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0053] A Figura 8 mostra a comparação da cinética de consumo de xilose entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (·), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa- se a escala de Xilose em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0054] Na Figura 9 vemos a comparação da cinética de produção de etanol entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (·), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa- se a escala de Etanol em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0055] A Figura 10 mostra a compilação dos valores relativos ao consumo de glicose, xilose e produção de etanol pelo micro-organismo DSM28788, quando em hidrolisado lignocelulósico. As concentrações de glicose (·), xilose (■) e etanol (A ) são mostradas no eixo vertical em gramas por Litro, enquanto no eixo horizontal é apresentado o tempo em horas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0056] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0057] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica compreendendo:
a) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de: xilose isomerase (SEQ ID NO:1 ), transaldolase (SEQ ID NO:5), ribose 5-fosfato isomerase (SEQ ID NO:7), xiluloquinase (SEQ ID NO:9), transcetolase (SEQ ID NO:11 ) e ribose 5-fosfato epimerase (SEQ ID NO:12);
b) pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica promotora selecionada do grupo consistindo de: promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:2), promotor 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:6), promotor da enzima álcool desidrogenase 1 (SEQ ID NO:8);
c) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica terminadora selecionada do grupo consistindo de: terminador gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:3), terminador de álcool desidrogenase (SEQ ID NO:10), terminador 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:13);
e em que a sequência nucleotídica definida em a) está funcionalmente ligada à sequência nucleotídica promotora definida em b) e à sequência nucleotídica terminadora definida em c), sendo heteróloga qualquer das referidas sequências.
[0058] Em uma concretização da presente invenção, o cassete de expressão é selecionado do grupo consistindo de:
a) cassete de expressão que compreende gene que codifica xilose isomerase de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:1 , promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, e terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:3; b) cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:10;
c) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência pelo menos 95% de identidade de pelo menos nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:6, de pelo menos 95% de identidade de pelo menos gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência 5 nucleotídica SEQ ID NO:13;
d) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:02, gene TKL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:11 , gene codificador de Ribose 5- Fosfato Epimerase pelo menos 95% de identidade da (SEQ ID NO:7), terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:6, gene RPE1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:12 e terminador PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:13; e combinações de pelo menos dois cassetes de expressão conforme descritos acima.
e em que o(s) dito(s) cassete(s) de expressão é(são) funcional(is) na(s) célula(s) eucariótica(s).
[0059] Em uma concretização do cassete de expressão, pelo menos um dos referidos promotores serem constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0060] Em um segundo aspecto, a presente invenção apresenta um micro-organismo geneticamente modificado compreendendo pelo menos um cassete de expressão conforme definido acima.
[0061] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, um ou mais dos referidos cassetes de expressão estão presentes na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.
[0062] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo ou ambos.
[0063] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) é inativado ou deletado em seu genoma.
[0064] Em uma concretização da presente invenção, o micro-organismo é uma levedura do género selecionado do grupo consistindo de: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia. Em uma concretização, o micro-organismo é levedura Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
[0065] Em um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta um micro-organismo geneticamente modificado para expressão peptídeo com função xilose isomerase o qual é Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
[0066] Em um quarto aspecto, a presente invenção apresenta um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreendendo a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo conforme definido acima, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0067] Em uma concretização da presente invenção, o processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreende
a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e
b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0068] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,70 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulosico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 12 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulosico.
[0069] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,74 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulosico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 15 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulosico.
[0070] Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um biocombustível obtido pelo processo conforme definido acima.
[0071] Em um sexto aspecto, a presente invenção apresenta um bioquímico obtido pelo processo conforme definido acima.
[0072] Em um sétimo aspecto, a presente invenção apresenta etanol obtido pelo processo conforme definido acima.
[0073] O dito micro-organismo, adicionalmente submetido a processo de engenharia evolutiva, apresenta modificações genéticas suplementares que são decorrentes do processo de evolução e que o permitem não somente mostrar-se eficiente na conversão de pentoses em combustíveis e/ou bioquímicos, como também ser vantajosamente eficaz em realizar essa dita conversão na presença de elevada concentração de substâncias inibidoras de seu metabolismo e que normalmente estão presentes no hidrolisado lignocelulosico. Entre esses inibidores podemos citar, principalmente, ácido acético e ácido fórmico. Pode produzir pelo menos 0,70 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulosico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 12 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulosico.
[0074] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,74 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulosico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 15 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulosico.
[0075] De modo mais específico, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a uma célula eucariotica transformada geneticamente, por exemplo uma levedura ou fungo filamentoso.
[0076] Na presente invenção, leveduras são consideradas como qualquer indivíduo do grupo Eumycotina, ou seja, fungos verdadeiros, que crescem de modo unicelular e que façam preferencialmente fermentação anaeróbia, como por exemplo, Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.
[0077] Fungos filamentosos, por sua vez, são aqueles caracterizados por apresentarem micélio vegetativo e crescerem a partir da elongação das hifas, além de realizarem respiração aeróbia, como por exemplo, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora e Acremonium.
[0078] De forma ainda mais específica, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, por exemplo uma levedura do género Saccharomyces.
[0079] Uma concretização da invenção descreve um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto restringir-se a eles, quando comparado com sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0080] A pentose preferencialmente utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose, sem, entretanto, restringir-se a ela.
[0081] Na presente invenção são feitas referências a diversas sequências gênicas, todas listadas na seção Listagem de Sequências. Para breve referência e facilidade de compreensão, suas funções ou genes respectivos são indicados na Tabela 1 a seguir.
Tabela 1 - Sequências referidas na presente invenção e respectivos genes/funções.
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[0082] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 que codifica um peptídeo com função xilose isomerase, proporcionando a expressão de uma enzima que favorece a isomerização de xilose em xilulose.
[0083] Uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase foi descrita em Orpinomyces sp. {XI, EC 5.3.1 .5). Tal sequência foi manualmente otimizada pelos inventores para os códons preferencialmente utilizados por Saccharomyces cerevisiae. A sequência otimizada de xilose isomerase SEQ ID NO:1 , utilizada na presente invenção, é, portanto, não natural e diferente de sequências naturais de xilose isomerase já descritas em bancos.
[0084] Após otimização da sequência representada em SEQ ID NO:1 , o CAI {Codon Adaptation Index), índice que determina a possibilidade de altos níveis de expressão de proteína, foi de 0,79 para 0,91 , indicando a obtenção de uma eficiente expressão dessa proteína em S. cerevisiae. O índice CAI é a média geométrica dos valores relativos de adaptação e para seu cálculo são excluídos códons não sinónimos e, em alguns casos, também os de terminação. Os valores variam entre 0 e 1 , sendo que os maiores indicam maior proporção dos códons mais abundantes [Nucleic Acids Research 15: 1281-1295].
[0085]Assim, a presente invenção descreve também um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 , que codifica o peptídeo do tipo xilose isomerase e que, opcionalmente, é inserido em uma célula eucariótica para a expressão da referida isomerase em sua forma ativa.
[0086]O cassete de expressão da invenção é caracterizado por compreender: - uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase SEQ ID NO:1 ; - ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante; e - uma ou mais sequências nucleotídicas selecionadas dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas. Um ou mais cassetes de expressão são usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.
[0087]Opcionalmente, o cassete de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:9), Transaldolase (SEQ NO ID:5), Transcetolase (SEQ ID NO:11 ), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:12) e/ou combinações destas.
[0088] Em uma concretização, a célula hospedeira eucariótica/micro- organismo é uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, porém salienta-se que qualquer célula eucariótica pode ser transformada com um ou mais cassetes de expressão da invenção, que compreende a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO:1.
[0089] Portanto, a presente invenção proporciona uma célula eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, sendo, por exemplo, uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 1 , a qual pode apresentar-se em cópia única ou, por exemplo, múltiplas cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) dessa sequência de nucleotídeos podem ser inseridas no genoma.
[0090] Em uma concretização, a célula hospedeira geneticamente modificada adicionalmente compreende genes da via das pentoses fosfato, para que a inserção de SEQ ID NO:1 , que codifica xilose isomerase, favoreça a isomerização de xilose em xilulose. Portanto, adicionalmente à inserção de SEQ ID NO:1 na célula hospedeira, a presente invenção descreve modificações genéticas nessa mesma célula que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, não sendo essas modificações, entretanto, um fator restritivo para transformação da célula hospedeira com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO:1.
[0091] Dentre as enzimas apresentadas, e que constituem a via das pentose-fosfato, assim como a xilose isomerase representada por SEQ ID NO:1 , ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, por exemplo, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis. A superexpressão dos genes que codificam essas enzimas pode ser em decorrência do aumento do número de cópias da sequência de nucleotídeos que as codifica, expressão de genes epissomais presentes em vetores que podem ser inseridos na célula eucariótica hospedeira, através do uso de promotores heterólogos àquela sequência na qual ele encontra-se operativamente ligado, ou mesmo homólogos da célula onde foram inseridos, ou como endógenos na célula hospedeira, desde que eles sejam capazes de produzir um estado estável de transcrição mais elevado do que seria realizado pela célula em sua versão sem as presentes modificações genéticas, nas situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio. Esses promotores podem ser constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0092] Em uma concretização, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos. Especificamente, a presente invenção descreve quatro concretizações de cassetes de expressão integrativos, que foram construídos utilizando-se promotores de alta expressão e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.
[0093] Um dos cassetes descritos compreende o gene que codifica xilose isomerase, SEQ ID NO:1 . Em uma concretização, cópia de SEQ ID NO:1 é inserida na célula hospedeira flanqueado, por exemplo, pela região promotora e terminadora do gene Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1). Assim, de forma resumida, o cassete que contém o gene que codifica xilose isomerase e que foi inserido no genoma da célula hospedeira é formado pelo promotor TDH1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:2, gene XI (SEQ ID NO:1 e terminador TDH1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:3).
[0094] Um segundo cassete descrito na presente invenção, contém gene que codifica a enzima Xiluloquinase (SEQ ID NO:9). A presente descrição indica que o cassete é, por exemplo, construído utilizando-se promotor e terminador do gene que codifica enzima álcool desidrogenase (ADH1 ). Assim, descreve-se que o cassete que contém o gene codificador de Xiluloquinase é constituído pelo promotor ADH1 , representado por SEQ ID NO:8, gene XKS1 (SEQ ID NO:9) e terminador ADH1 , representado por SEQ ID NO:10.
[0095] Mais um cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transaldolase (SEQ NO ID:5) e Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7). Este cassete é construído, por exemplo, utilizando-se promotores e terminadores do gene que codifica a enzima Gliceraldeído 3- Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1) para flanquear o gene da Transaldolase e promotores e terminadores da enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1) para flanquear o gene de Ribose 5-Fosfato Isomerase. Assim, de forma resumida, o cassete de expressão é constituído, por exemplo, de promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TAL1 (SEQ ID NO:5,) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1 , cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:6, gene RKI1 (SEQ ID NO:7 e terminador, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:13.
[0096] Um último cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transcetolase (SEQ ID NO:11 ) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7), por exemplo, com função associada aos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1), flanqueando o gene de Transcetolase e promotor e terminador do gene que codifica a enzima 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1). Assim, de forma resumida, o cassete de expressão que foi inserido no genoma da célula hospedeira e contém os genes de Transcetolase e Ribose 5-Fosfato Epimerase, é constituído por exemplo por promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TKL1 (SEQ ID NO:11 ) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1 (SEQ ID NO:6), gene RPE1 (SEQ ID NO:12) e terminador PGK1 (SEQ ID NO:13).
[0097] Todos os cassetes de expressão com os genes da via metabólica das pentoses fosfato que favorecem o consumo de xilose são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, por exemplo na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.
[0098] Direção upstream é considerada aquela localizada anteriormente ao ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA, a qual se inicia no promotor e encerra no terminador. Por sua vez, downstream é considerada a região localizada após o ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA.
[0099] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14. A produção de xilitol diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.
[0100] Quando realizadas em Saccharomyces cerevisiae, as modificações genéticas acima citadas favorecem o fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses-fosfato. O favorecimento dessa via pode ser diretamente correlacionado ao consumo de xilose pela célula hospedeira. Assim, quanto mais xilose fosse consumida, mais ativo estaria o fluxo por essa via. [0101] Adicionalmente, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1 ) no genoma da célula hospedeira.
[0102] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, por exemplo, micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, por exemplo, em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de consumir a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.
[0103] O micro-organismo após ser submetido às modificações genéticas descritas no presente documento, é, então, submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do microorganismo de interesse em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo, principalmente xilose, e concentrações variáveis e crescentes de pelo menos uma substância inibidora do metabolismo do micro-organismo, preferencialmente ácido acético acrescido, como observado no Exemplo 4. A repetição desta operação permite a seleção de micro-organismos que possuem modificações genéticas aleatórias derivadas do processo de evolução, sendo esses micro-organismos resistentes ao referido inibidor de interesse, como mostrado no Exemplo 4.
[0104] Assim, em uma concretização, o processo de obtenção de microorganismos da invenção, permite a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis e/ou bioquímicos e concomitante resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, principalmente ao ácido acético. Ou seja, o processo buscou selecionar microorganismos que produzam ou sejam capazes de produzir bioquímicos e/ou biocombustíveis de interesse em menor tempo e/ou maior quantidade, na presença da fonte de açúcar de interesse e com alta concentração de inibidores em relação à quantidade de açúcares no meio de cultura, quando comparados com micro-organismos não evoluídos para resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.
[0105] Em uma concretização, o micro-organismo é cultivado em um meio de cultura contendo um hidrolisado lignocelulósico que compreende um ou mais inibidores como, por exemplo, ácido acético e/ou ácido fórmico, como pode ser observado no Exemplo 5. Opcionalmente, o meio é suplementado com nitrogénio. Os micro-organismos com melhor velocidade de crescimento no referido meio (são) selecionado(s) e isolado(s), para subsequente uso. Esse micro-organismo selecionado possui mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução e encontra-se depositado na Coleção Alemã de Micro-organismos e Cultura de Células - Leibniz-lnstitut Deutsch Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0106] O micro-organismo DSM28788 descrito na presente invenção é, por exemplo, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir espuma, entre outros.
[0107] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção (DSM 28788) para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0108] Em uma concretização, o referido processo compreende as seguintes etapas:
a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e
b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0109] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0110] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e/ou bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0111] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.
[0112] Salienta-se, então, que o micro-organismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulosico em álcoois e/ou ácidos. Referido micro-organismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulosico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise. [0113] Adicionalmente, salienta-se também que o micro-organismo descrito no presente documento, além de eficiente capacidade na conversão, por exemplo, de xilose em etanol, apresenta também eficaz resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico durante o processo de fermentação, sendo o principal inibidor compreendido nesse hidrolisado o ácido acético. Destaca-se também a presença de ácidos, incluindo o ácido acético, no processo de primeira geração para produção de bioquímicos e ou biocombustíveis, permitindo eficiente rendimento do presente micro-organismo também nesse processo.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - CONSTRUÇÃO DOS CASSETES PARA DE EXPRESSÃO E INSERÇÃO DOS MESMOS NO GENOMA
[0114] Para construção de cada um dos cassetes que continham genes da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, incluindo gene da Xilose Isomerase, cada um dos genes foi amplificado por PCR do genoma de S. cerevisiae e clonado em cassetes de expressão integrativos.
[0115] Adjacente ao terminador de cada cassete, foi clonado o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação, permitindo que essa região pudesse ser retirada pela expressão da recombinase Cre e o marcador auxotrófico URA3 pudesse ser utilizado em todos os cassetes de expressão com os genes descritos.
[0116] Em relação à construção do cassete de expressão contendo gene que codifica xilose isomerase, adicionalmente à construção acima descrita, nas extremidades do cassete foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região.
[0117] Para a construção do cassete de expressão com gene que codifica xiluloquinase, por exemplo, amplificou-se esse gene por PCR do genoma de S. cerevisiae e ele foi clonado adjacente ao promotor e terminador do gene que codifica Álcool desidrogenase {ADH1). Após o terminador, foi inserido o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação. Na extremidade do cassete foi clonado regiões de homologia próximas ao centromero dois e oito de S. cerevisiae. Foram realizadas duas transformações para inserir os cassetes expressando o gene XKS1 a 288 pb do centromero dois e a 228 pb do centromero oito. Dessa maneira, além da cópia endógena, o transformante tem mais duas cópias do gene XKS1 sob a ação de um promotor constitutivo de alta expressão.
[0118] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transaldolase { TAL 1) e Ribose 5-Fosfato Isomerase {RKI1), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1) e 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.
[0119] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transcetolase (TKL1 ) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1 ), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 { TDH1) e 3-fosfoglicerato Quinase {PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.
[0120] A transformação da célula hospedeira com cada um dos cassetes contendo genes da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato seguiu o protocolo de Gietz e Schiestl [Nature Protocols 2, 31 - 34; 2007], via acetato de lítio, e cada um dos genes, flanqueados por promotores e terminadores forte e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, foi estavelmente integrado ao cromossomo da célula hospedeira. A correta integração foi confirmada por PCR. Após a confirmação, a região URA3 foi excisada do genoma pela expressão transiente da recombinase Cre, deixando apenas um sítio loxP no local, após o terminador do gene inserido. [0121] Nas extremidades do cassete da Xilose Isomerase, foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região.
Exemplo 2 - INSERÇÃO DO CASSETE DE XILOSE ISOMERASE NO GENOMA EM ALTO NÚMERO DE CÓPIAS
[0122] Para garantir a integração estável e em alto número de cópias na célula hospedeira, o cassete que expressa a Xilose Isomerase representada por SEQ ID NO:1 foi modificado com a inclusão, nas extremidades do cassete, de elementos delta do retrotransposon Ty1 (elemento presente em alto número de cópias no genoma de S. cerevisiae).
[0123] O marcador URA3 flanqueado pelas regiões loxP é substituído nesse plasmídeo pelo marcador LEU2. Previamente, o gene LEU2 é deletado em uma etapa de manipulação genética. Nessa etapa, integra-se o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador de LEU2, resultando na deleção desse gene. Em seguida, é inserido o cassete da XI, flanqueado pelos elementos Ty1 e usando o marcador auxotrófico LEU2 para seleção dos transformantes.
ExempHo 3— DELEÇÃO DO GENE GRE3
[0124] A deleção do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14, foi realizado em duas etapas através de manipulação genética, visando a diminuição da produção de xilitol a partir de xilose. Na primeira etapa, foi integrado o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador do gene GRE3, resultando na deleção dessa região. Na segunda etapa, após confirmada a deleção, o marcador URA3 foi retirado pela expressão transiente da recombinase Cre.
Exemplo 4 - EVOLUÇÃO ADAPTATIVA E CONSUMO DE XILOSE
[0125] Além de ser manipulado geneticamente com a inserção de todos os genes da via metabólica necessária para conversão de xilose, o micro- organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção, quando em condições anaeróbias, consome xilose presente no meio de cultivo de forma lenta e com baixa geração de biocombustível, no caso etanol, como pode ser observado na Figura 2.
[0126] O referido micro-organismo foi submetido a um processo de engenharia evolutiva que consistiu de repicagens sucessivas em meio contendo 50 g/L de xilose em condições semi-anaeróbicas. O inoculo era iniciado com densidade óptica (OD) de -1 ,0. Devido a um baixo crescimento inicial, nos dois primeiros experimentos foi adicionado uma baixa quantidade de glicose (0,5%) ao meio visando um crescimento mais rápido da cultura. Após 48 horas de cultivo, uma alíquota era transferida para um novo frasco com meio de cultura e o experimento era repetido. Na terceira transferência, não foi necessária a adição de glicose ao meio de cultivo por notar-se um aumento na velocidade de crescimento do micro-organismo em xilose como única fonte de carbono. Foram isoladas e analisadas 20 colónias da mistura de células evoluídas.
[0127] Para seleção de micro-organismo com eficiente resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, micro-organismos que apresentavam eficiente crescimento utilizando xilose como única fonte de carbono foram inoculados em meio contendo 50 g/L xilose, 6 g/L extrato de levedura, 1 g/L Cloreto de amónio, 5 g/L Fosfato de potássio monobásico, 1 ,5 g/L Cloreto de magnésio e iniciando com 5 g/L ácido acético, em pH4,5 e temperatura de 30°C.
[0128] O inoculo inicial apresentava Densidade Óptica (OD) igual a 0,2 e repicagens sucessivas eram realizadas a cada 48 horas, selecionando-se a cada repicagem aquelas linhagens com maior potencial de crescimento em meio contendo ácido acético. Ao final, a linhagem com melhor potencial de resistência em meio contendo ácido acético, contendo mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução foi depositada no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788). Essa linhagem foi selecionada também devido ao seu desempenho superior quanto à capacidade de conversão de xilose a etanol, como pode ser observado na Figura 3.
Exemplo 5 - COMPARAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO DEPOSITADO NO INSTITUTO LEIBNIZ - DEUTSCH SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN SOB O NÚMERO 28788 (DSM28788), COM EFICIENTE CRESCIMENTO EM HIDROLISADO E CONSUMO DE XILOSE, COM MICRO-ORGANISMO CONTROLE.
[0129] Dois micro-organismos, sendo um deles controle, ou seja, modificado e evoluído apenas para consumo eficiente de xilose, e o microorganismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788) foram testados em hidrolisado lignocelulósico de palha de cana, cujo conteúdo foi anteriormente descrito por compreender xilose, glicose, ácido acético, HMF, furfural, os principais inibidores que ocorrem no processo de fermentação. Além disso, o meio utilizado para esses testes foi suplementado com nutrientes adequados para suportar o crescimento da levedura, as amostras foram mantidas em condição semi-anaeróbica de modo a induzir fermentação, e cada uma das amostras foi acondicionada em shaker a 30°C, sob agitação de 200rpm. As Densidades Ópticas (DO) foram medidas em alguns pontos, nos quais foram quantificados xilose e etanol.
[0130] A comparação das performances do micro-organismo controle e do micro-organismo DSM28788 em relação ao consumo de xilose e produção de etanol, nas condições indicadas no parágrafo anterior, pode ser observada nas Figuras 4 e 5 respectivamente.
Meio de cultivo
[0131] O meio de cultivo foi preparado utilizando hidrolisado de palha de cana que compreendia entre 1 g/L e 50 g/L de xilose, sendo por exemplo 42 g/L e entre 1 e 60 g/L de glicose, sendo por exemplo 55 g/L, além de 0-1 % de ácido acético, 0-0,5% de HMF e 0-0,5% de furfural, os principais inibidores que ocorrem no processo de fermentação. O hidrolisado foi suplementado com os nutrientes adequados para suportar o crescimento da levedura.
Preparação do Inoculo
[0132] Uma alíquota de cultura do micro-organismo controle e do microorganismo DSM28788, cada uma previamente criopreservada a -85°C (em solução de glicerol 20%w/v) foi reativada em meio YEPD (20 g/L de glicose, 10 g de extrato de levedura e 20 g/l de peptona), durante 6 horas em 50 mL de meio YEPD 20 g/L de glicose em um agitador orbital a 200 rpm e 30°C. Posteriormente uma alíquota destas culturas foi transferida para dois diferentes recipientes contendo 200 ml de meio YEPD 40 g/l de glicose.
[0133] Cada uma das culturas foi iniciada com uma Densidade Óptica (DO) igual a 0,1 , quando aferida em 600 nm de comprimento de onda e incubada a 200 rpm a 30°C durante 16 horas. Um volume de cada cultura foi centrifugado a 4000 rpm por 10 min. As células do pellet foram lavadas em água destilada e ressuspendidas no meio de cultura adequado para transferência no biorreator.
Quantificação dos produtos da fermentação
[0134] As quantificações de xilose e etanol foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência HPLC e utilizando o cromatógrafo Alliance HT (Waters) com detector de índice de refração (Waters 2414). As corridas foram realizadas utilizando uma coluna HPX-87H (BioRad) mantida a 35°C, com ácido sulfúrico 4 mM como fase móvel e um fluxo de 0,6 mL/min.
[0135] Na Figura 6 vemos que o consumo de xilose pelo microorganismo DSM28788 ocorre de forma mais rápida em relação ao microorganismo controle, que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores. Este resultado é particularmente relevante no que diz respeito à capacidade do micro-organismo em consumir xilose de forma eficiente na presença de inibidores.
[0136] A Figura 7 mostra a ampliada capacidade de produção de etanol pelo micro-organismo DSM28788 em comparação a um micro-organismo controle que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores, mostrando-se assim o mais adequado para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos, por exemplo o etanol.
EXEMPLO 6 - RESISTÊNCIA DO MICRO-ORGANISMO DEPOSITADO NO INSTITUTO LEIBNIZ - DEUTSCH SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN SOB O NÚMERO 28788 (DSM28788) EM MEIO CONTENDO ELEVADAS CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO ACÉTICO
[0137] Duas linhagens, sendo uma delas controle, em que o microorganismo foi evoluído apenas para consumo de xilose e não para resistência a inibidores, e a segunda linhagem formada pelo micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788), foram testadas em meio de cultura YEPD suplementado com concentrações crescentes de ácido acético (concentração variável entre 5 e 15 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD).
[0138] O pré-inóculo das linhagens foi feito em meio YEPD (20 g/L de glicose, 20 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura) e crescido em shaker por aproximadamente 16 horas à 30°C por 200 rpm. Após esse período, as células foram centrifugadas, lavadas e ressuspendidas em água destilada esterilizada com OD final de 1 ,0.
[0139] Uma alíquota de 10 microlitros de cada cultura foi aplicada nas placas contendo meio suplementado com ácido acético. As placas foram incubadas a 30°C e o crescimento foi observado por três dias. Os experimentos foram feitos em duplicata.
[0140] Na menor concentração testada (5 g/L), as duas linhagens apresentaram crescimento. Nessas condições, o micro-organismo DSM28788 apresentou crescimento superior em relação ao micro-organismo controle após 24 horas (Figura 6, coluna A).
[0141] No mesmo período, o micro-organismo DSM28788 que foi evoluído para resistir aos inibidores compreendido no hidrolisado lignocelulósico, por exemplo ácido acético, também apresentou maior crescimento em meio suplementado com 1 1 g/L de ácido acético, em relação ao micro-organismo controle (Figura 6, coluna B).
[0142] Em concentrações superiores (aproximadamente 15g/L), como mostrado na Figura 6, linha 2, coluna E, observa-se que o micro-organismo DSM28788 ainda apresenta crescimento em ácido acético pronunciadamente superior ao micro-organismo controle.
Exemplo 7 - FERMENTAÇÃO COMPARATIVA ENTRE A LINHAGEM DSM 28788 E A LINHAGEM NÃO RESISTENTE (CONTROLE) UTILIZANDO MEIO DE LABORATÓRIO COMPREENDENDO A COMBINAÇÃO DE ALTA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS (ÁCIDO ACÉTICO E ÁCIDO FÓRMICO) COMO INIBIDORES.
[0143] Dois micro-organismos, sendo um deles controle, ou seja, modificado e evoluído apenas para consumo eficiente de xilose, e o microorganismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788) foram testados meio de laboratório compreendendo a combinação de altas concentrações de ácido acético e ácido fórmico, visando avaliar o desempenho de ambos micro-organismos quando submetidos a altas concentrações de inibidores.
[0144] O meio de laboratório utilizado foi YEP (10 g/L extrato de levedura e 20 g/L peptona bacteriológica) contendo uma mistura de açúcares (50 g/L de glicose e 40 g/L xilose) e dois inibidores normalmente encontrados em hidrolisados lignocelulosicos (8 g/L de ácido acético e 4 g/L de ácido fórmico). As culturas foram iniciadas com aproximadamente 0,4 g/L de células em base seca. Além disso, as culturas foram mantidas em condição anaeróbica de modo a induzir fermentação, cada uma das culturas foi incubada em um biorreator onde o pH foi ajustado e controlado em 5 e onde a temperatura foi mantida em 32 °C. Amostras foram retiradas em intervalos adequados e foram quantificados xilose, glicose e etanol.
[0145] A comparação das performances do micro-organismo DSM28788 em relação ao consumo de glicose, consumo de xilose e produção de etanol, nas condições indicadas no parágrafo anterior, pode ser observada nas Figuras 7, 8 e 9, respectivamente.
[0146] Na Figura 7 observamos a comparação em relação ao consumo de glicose pelo micro-organismo DSM28788 e pelo micro-organismo controle. Pode ser notado, que nas condições testadas, o micro-organismo DSM28788 apresenta uma velocidade de consumo de glicose significativamente superior em relação ao micro-organismo controle (modificado geneticamente para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores).
[0147] Este resultado demonstra que o micro-organismo descrito na presente invenção e que foi evoluído para eficiente consumo de xilose e resistência a inibidores, como, por exemplo, ácido acético e ácido fórmico, apresenta também maior taxa de consumo de glicose.
[0148] Por sua vez, na Figura 8 vemos que o consumo de xilose pelo micro-organismo DSM28788 ocorre de forma mais rápida em relação ao microorganismo controle, que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores. Esta comparação mostra claramente a capacidade do micro-organismo em consumir xilose mais rapidamente em relação ao micro-organismo controle mesmo quando submetido à combinação de altas concentrações de inibidores como ácido acético e ácido fórmico.
[0149] Adicionalmente, na Figura 9, observa-se que a produção de etanol condiz com a maior velocidade de consumo dos açúcares. Ou seja, o etanol é produzido mais rapidamente pelo micro-organismo DSM28788, quando comparado ao micro-organismo controle.
[0150] Finalmente na Tabela 2, pode ser observada comparação numérica produtividade volumétrica de etanol (que avalia a velocidade produção de etanol por cada litro e a cada hora, g/Lh) e o índice de consumo de açúcar total (que mensura a quantidade de açúcar consumido em função do açúcar alimentado para cada cultura). Para ambos os parâmetros avaliados, vemos que os números são significativamente superiores para o micro- organismo DSM28788, quando comparado ao micro-organismo controle.
[0151] A tabela X nos mostra a comparação da produtividade volumétrica e o índice de consumo de açúcares entre o micro-organismo DSM28788 e o micro-organismo controle que foi evoluído apenas para consumo de xilose.
Tabela 2: Comparação da produtividade volumétrica e o índice de consumo de açúcares.
Parâmetro DSM28788 Controle
Produtividade volumétrica (g/L h) 0.39 ± 0,008 0.32 ± 0,011
Consumo de açúcar total (%) 75% ± 1 ,3% 61 %± 1 ,1 %
EXEMPLO 8 - PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOQUÍMICOS E/OU BIOCOMBUSTÍVEIS A PARTIR DE BIOMASSA VEGETAL
[0152] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, por exemplo a porção lignocelulosica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0153] Em uma concretização, o referido processo consiste nas seguintes etapas:
a. colocar biomassa vegetal lignocelulosica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788), preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0154] O presente processo é capaz de apresentar rendimento pelo menos de 0,46 gramas de etanol produzido a cada grama de açúcar consumido, quando realizado em hidrolisado lignocelulósico. Adicionalmente, o presente processo apresenta produtividade de, pelo menos, 0,74 gramas de etanol produzido por litro de hidrolisado a cada hora. Esses resultados podem ser observados na Figura 9.
[0155] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1 ,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1 ,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0156] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0157] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 . Cassete de expressão para a transformação de célula eucariotica caracterizado por compreender:
a) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de: xilose isomerase (SEQ ID NO:1 ), transaldolase (SEQ ID NO:5), ribose 5-fosfato isomerase (SEQ ID NO:7), xiluloquinase (SEQ ID NO:9), transcetolase (SEQ ID NO:11 ) e ribose 5-fosfato epimerase (SEQ ID NO:12);
b) pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica promotora selecionada do grupo consistindo de: promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:2), promotor 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:6), promotor da enzima álcool desidrogenase 1 (SEQ ID NO:8);
c) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica terminadora selecionada do grupo consistindo de: terminador gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:3), terminador de álcool desidrogenase (SEQ ID NO:10), terminador 3- fosfato quinase (SEQ ID NO:13);
e em que a sequência nucleotídica definida em a) está funcionalmente ligada à sequência nucleotídica promotora definida em b) e à sequência nucleotídica terminadora definida em c), sendo heteróloga qualquer das referidas sequências.
2. Cassete, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo de:
a) cassete de expressão que compreende gene que codifica xilose isomerase de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:1 , promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, e terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:3; b) cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:10;
c) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência pelo menos 95% de identidade de pelo menos nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:6, de pelo menos 95% de identidade de pelo menos gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência 5 nucleotídica SEQ ID NO:13;
d) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:02, gene TKL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:11 , gene codificador de Ribose 5-Fosfato Epimerase pelo menos 95% de identidade da (SEQ ID NO:7), terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:6, gene RPE1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:12 e terminador PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:13; e combinações de pelo menos dois cassetes de expressão conforme descritos acima.
e em que o(s) dito(s) cassete(s) de expressão é(são) funcional(is) na(s) célula(s) eucariótica(s).
3. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de os pelo menos um dos referidos promotores serem constitutivos ou naturalmente induzíveis.
4. Micro-organismo geneticamente modificado caracterizado por compreender pelo menos um cassete de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos referidos cassetes de expressão serem presentes na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.
6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo ou ambos.
7. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) ser inativado ou deletado em seu genoma.
8. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que é uma levedura do género selecionado do grupo consistindo de: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Cândida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.
9. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é levedura Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
10. Micro-organismo geneticamente modificado para expressão peptídeo com função xilose isomerase caracterizado por ser Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
1 1 . Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos caracterizado por
a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro- organismo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e
b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
12. Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos caracterizado por
a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microorganismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e
b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 ou 12, caracterizado por produzir pelo menos 0,70 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 12 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por produzir pelo menos 0,74 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 15 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
15. Biocombustível caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 1 a 14.
16. Bioquímico caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 1 a 14.
17. Etanol caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 1 a 14.
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