BR102015001420A2 - cassete de expressão, micro-organismo geneticamente modificado, processo para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustíveis e/ou bioquímicos - Google Patents

Abstract

resumo cassete de expressão, micro-organismo geneticamente modificado, processo para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustíveis e/ou bioquímicos a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. dentre outros objetos, a presente invenção descreve novos cassetes de expressão, bem como novos micro-organismos geneticamente modificados, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis com eficiente desempenho em escala industrial. o processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos utilizando-se o micro-organismo descrito no presente documento, também é objeto da presente invenção, bem como os biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.

Description

CASSETE DE EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se relaciona a biocombustíveis, bioquímicos e a processos para sua obtenção. Mais especificamente, a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo, a partir de polímeros da parede celular vegetal. Dentre outros objetos, a presente tecnologia descreve cassetes de expressão para transformação de células eucarióticas e pelo menos um micro-organismo geneticamente modificado, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis. O(s) microorganismo^) geneticamente modificado(s) pela inserção de cassete(s) descrito(s) no presente documento apresenta ampliado consumo de xilose em relação a micro-organismos não modificados com o descrito na invenção, favorecendo assim seu desempenho em escala industrial. São também descritos um processo para a obtenção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos. A presente invenção situa-se nos campos da da Biotecnologia e da Engenharia Química.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A necessidade da substituição da matriz mundial de combustíveis baseada em fontes fósseis por alternativas renováveis tornou a produção de combustíveis de segunda geração, por exemplo, etanol, uma das mais promissoras tecnologias em fase de desenvolvimento. Este processo consiste na conversão de polímeros que formam a biomassa vegetal, principalmente aqueles presentes na parede celular como celulose, hemicelulose e lignina, em biocombustíveis e/ou bioquímicos.

[0003] A biomassa vegetal é uma mistura complexa de compostos quimicamente distintos que podem ser fracionados gerando componentes com aplicações específicas. Assim, do mesmo modo que uma refinaria petroquímica produz uma grande variedade de produtos derivados do petróleo bruto, os mesmos princípios podem ser aplicados a bíorrefinarias, ou seja, refinarias baseadas em biomassa (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquímica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).

[0004] A utilização da biomassa vegetal como fonte de açúcares fermentescíveis é uma alternativa promissora e sustentável, entretanto, alguns desafios ainda precisam ser superados, como a disponibilização dos açúcares da parede celular vegetal. Esse procedimento pode ser feito através da ação de enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases), as quais disponibilizam os monômeros de açúcares (hexoses e pentoses) que, por sua vez, são posteriormente metabolizados por micro-organismos para geração de bioquímicos e biocombustíveis.

[0005] Entretanto, micro-organismos naturalmente capazes de consumir açúcares presentes nas cadeias de celulose e hemi-celulose, não são geralmente passíveis de utilização em escala industrial de forma eficiente. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento de micro-organismos com capacidade de utilizar esses açúcares da parede celular vegetal de forma eficiente em escala industrial, como o(s) descrito(s) na presente invenção.

[0006] A utilização de micro-organismos como plataformas eficientes na conversão de açúcares da biomassa em produtos de alto valor agregado é amplamente descrita. Nesse contexto, a levedura Saccharomyces cerevisiae tem recebido papel de destaque devido à sua robustez e tolerância em condições de fermentação industriais. A facilidade de manipulação genética desse organismo e o uso de ferramentas de engenharia metabólica, em sinergia com biologia de sistemas e biologia sintética tem possibilitado a inclusão de novas rotas metabólicas para a produção de combustíveis e de químicos como etanol, biobutanol, biodiesel, 1,2-propanediol, ácido succínico, ácido pirúvico, dentre outros [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671-90, 2012], [0007] Linhagens selvagens de S. cerevisae não são naturalmente capazes de fermentar pentoses, como, por exemplo, a xilose, presente na biomassa. Entretanto, diversos trabalhos já realizaram procedimentos de engenharia metabólica em S. cerevisiae através da introdução nesses organismos de vias metabólicas para consumo de xilose, tendo como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI).

[0008] Dentre os trabalhos realizados, a introdução de gene que codifica a enzima xilose isomerase (XI) permite que a cepa apresente maior rendimento na produção de álcool e/ou ácidos do que quando ela é modificada com outros genes, como por exemplo, gene que codifica xilose redutase ou xilitol desidrogenase, visto que ocorre um menor acúmulo de subprodutos não desejáveis, como xilitol e glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664], [0009] A via XR-XDH, presente em micro-organismos eucariotos, consiste em duas reações de oxi-redução, onde a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em uma reação mediada por NADPH/NADH e em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD+. O cofator NADPH é principalmente regenerado na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, com produção de C02. Porém, NAD+ é regenerado principalmente na cadeia respiratória, com o 02 como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigênio, não ocorre a completa reoxidação de NAD+, resultando em um desbalanço redox e no acúmulo de xilitol, o que impacta diretamente no rendimento final de etanol [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p,49-59, 2002], Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol, devido à reoxidação do excesso de NADH via XDH [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004], [0010] A via XR-XDH tem maior produtividade inicial por produzir etanol mais rapidamente, apenas com a inserção dos genes responsáveis pela conversão da xilose, porém a via XI tem um maior rendimento por não acumular subprodutos [Microbial Cell Factories, Londres, v.6, n.5, p.1-10, 2007].

[0011] A via xilose isomerase (XI), mais comum em procariotos, ocorre em um único passo, evitando o desbalanço redox e a formação de subprodutos que diminuem o rendimento de etanol. Por várias décadas, tentativas de expressão heteróloga de XI bacterianas em S. cerevisiae não foram bem sucedidas [Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v.32, n.2, p.252-259, 2003]. Em 2003, a expressão funcional em S. cerevisiae de uma xilose isomerase do fungo anaeróbio Piromyces sp. [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.1, p.69-78, 2003] e em 2009 do fungo Orpiromyces sp. [Applied Microbiology and Biotechnology, Heideiberg, v.82, n„6, p. 1067-1078, 2009], resultou em mutantes capazes de crescer em xilose como única fonte de carbono, com altas atividades dessas enzimas, maior rendimento na produção de etanol, menor produção e acúmulo de metabólitos intermediários e com menor repressão catabólica em meio contendo glicose e xilose [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.4, p.399-409, 2005a; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.10, p.925-934, 2005b], [0012] Para que seja capaz de consumir xilose, é necessário que o micro-organismo seja geneticamente modificado, no mínimo, com a adição do gene que codifica a xilose isomerase. Dessa forma, é descrito na literatura que o aumento da expressão dos genes da via das pentoses fosfato favorece a conversão de xilose a etanol é necessário para que o consumo desse açúcar seja eficiente. Assim, os micro-organismos descritos no estado da técnica, que foram geneticamente modificados para consumo de xilose, invariavelmente possuem as modificações genéticas descritas acima. Basicamente, o diferencial de cada um desses micro-organismos é a combinação desses genes e dos promotores pelos quais estão regulados, com o gene que codifica a xilose isomerase, pois é esse o principal gene que possibilita o consumo de xilose por cada micro-organismo modificado.

[0013] A busca por outros micro-organismos que contenham em seu genoma genes que codifiquem proteínas com função xilose isomerase tem crescido nos últimos anos devido à relevância que o tema adquiriu atualmente. Bibliotecas de metagenômica que permitem a busca de xiloses isomerases nos mais diferentes ambientes tornam-se cada vez mais comuns, como por exemplo, a biblioteca de metagenômica do fluido de rumen bovino, que permitiu a obtenção da xilose isomerase descrita no documento US 2012/0225452 A1.

[0014] Essa busca por xiloses isomerases em diferentes organismos não garante, entretanto, que elas sejam funcionalmente expressas quando inseridas em Saccharomyces. O documento WO 2010074577, por exemplo, descreve a existência de alguns domínios que seriam conservados na proteína xilose isomerase e que a presença desses domínios no peptídeo garantiría que a proteína fosse expressa de maneira funcional em Saccharomyces. Essas análises basearam-se sequências de aminoácidos de xiloses isomerases de Piromyces sp E2, previamente descrita em WO 03062430, Cyllamyces aberensi e Bacteroides thetaitaomicron, descritas em US 7943366 e Clostridium phylofermentans, descrita por Brat, D e colaboradores [Applied and Environmental Microbiology, vol. 75, No. 8, pp. 2304-2311, Apr. 2009], [0015] Entretanto, genes de xiloses isomerases de vários outros organismos que possuem os domínios indicados no documento WO 2010074577 também foram inseridas em leveduras, mas não apresentaram atividade funcional [Appl Eviron Microbiol. 2009; 75(8): 2304-11; Enzyme and Microbial Technology, vol. 32, pp. 252-259, 2003.; Applied and Environmental Microbiology, vol. 62, No. 12, pp. 4648-4651, Dec. 1996; Biotechnology and Bioengineering Symposium, No. 13, pp. 245-250, 1983]. Este fato nos mostra que atualmente ainda não existe qualquer padrão em proteínas com atividade xilose isomerase que garanta que a inserção de seu gene codificante em Saccharomyces irá gerar proteína com atividade xilose isomerase funcional.

[0016] De fato, a grande maioria das xiloses isomerases identificadas em bactérias quando expressas em S. cerevisiae não conferem a habilidade na levedura de crescer em xilose. Pelo menos um trabalho tem estudado esse tema [Enzyme and Microbial Technology 32 (2003) 252-259] sugerindo que a não formação do tetrâmero (xilose isomerase é uma proteína tetramérica) seja a principal causa da não funcionalidade em S. cerevisiae. A presença da combinação correta de aminoácidos na interface do tetrâmero gerando pontes de sulfeto e alto número de ligações iônicas, além de condições fisiológicas como pH interno da célula diferente do hospedeiro original, poderíam ser os principais motivos da não funcionalidade das xiloses isomerases quando expressas em S. cerevisiae, mas atualmente essa informação não pode ser afirmada com certeza.

[0017] Portanto, a obtenção de micro-organismos, preferencialmente leveduras, que produzam proteínas com atividade de xilose isomerase a partir da inserção em seu genoma de gene de outro micro-organismo, não é um processo trivial.

[0018] Adicionalmente, é importante salientar que, no processo fermentativo brasileiro para produção de etanol, é usual que as usinas façam a reutilização intensiva de células de levedura utilizadas na fermentação, processo esse conhecido como reciclagem. Nesse processo até 90% das leveduras podem ser reutilizadas de uma fermentação para outra, resultando em densidades celulares muito elevadas no interior do fermentador e fazendo com que o tempo de fermentação seja muito curto [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008], [0019] Em algumas plantas industriais, a reciclagem pode ocorrer durante todo o período da safra, durando até nove meses. Assim, o período prolongado de reciclagem somado à contínua entrada de contaminantes microbianos no sistema, torna o ambiente da fermentação altamente competitivo, impondo severas tensões bióticas e abióticas sobre as cepas de leveduras utilizadas no processo [International Sugar Journal, Londres, v.112, p,86-89, 2010], Este ambiente competitivo resulta na substituição das leveduras que iniciaram o processo de fermentação por leveduras selvagens. Esse fato acontece, pois as leveduras selvagens ocorrem naturalmente na cana-de-açúcar e, portanto, são inseridas juntamente com ela no processo de fermentação, acabando, assim, por contaminar todo o processo industrial [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008], [0020] Adicionalmente, alguns trabalhos já demonstraram que aquelas leveduras que iniciam o processo de fermentação, e acabam sendo substituídas pelas selvagens, também não são capazes de sobreviver às situações estressantes do processo industrial de fermentação, como alta concentração de etanol, alta temperatura, estresse osmótico em decorrência de sais e açúcares, acidez, sulfitos e contaminação bacteriana [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008]. Assim, a obtenção de linhagem com eficiente capacidade de resistência ao agressivo processo de fermentação industrial, bem como passível de modificações genéticas para aquisição de características de interesse, como consumo de pentoses, mais especificamente xilose, não é um processo trivial.

[0021] O(s) micro-organismo(s) descrito(s) na presente invenção é(são), portanto, vantajosamente adaptado(s) ao processo brasileiro de fermentação industrial e mostra(m)-se diferencialmente eficiente(s) na conversão de açúcares da biomassa vegetal, principalmente material lignocelulósico, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, ou seja, com rendimento suficiente para ser aplicado em escala industrial, mesmo sob as condições estressantes do processo de fermentação brasileiro. Adicionalmente, o micro-organismo descrito na presente invenção apresenta características de interesse industrial como: ser uma cepa não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, entre outros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0022] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão que compreende: a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com pelo uma das sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17; e b) ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante.

[0023] Opcionalmente, um dos cassetes de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22).

[0024] É um outro objeto da presente invenção um micro-organismo geneticamente modificado para a expressão de xilose isomerase e que expressa pelo menos um peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0025] O micro-organismo geneticamente modificado apresenta eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado a versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas descritas no presente documento.

[0026] O micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a célula eucariótica transformada geneticamente, como, por exemplo, levedura ou fungo filamentoso.

[0027] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegeta! caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo conforme definido e revelado no presente pedido de patente; e b) recolher o biocombustível e/ou bioquímico produzido após a etapa a).

[0028] Em uma concretização, a presente invenção descreve um microorganismo geneticamente modificado, como, por exemplo, levedura do gênero Saccharomyces mais eficiente, quando comparado com à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas contidas no presente documento, na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - polihidróxido butirato, sem entretanto restringir-se a eles.

[0029] Em uma concretização, a pentose utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é a xilose sem, entretanto, restringir-se a ela.

[0030] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO;4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que cada um desses peptídeos podem ser expressos nessa célula eucariótica, por exemplo, em sua forma ativa e funcional de xilose isomerase. Salienta-se que qualquer uma das sequências de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, podem apresentar-se em cópia única ou, em uma outra concretização, em múltiplas cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos inseridas no genoma.

[0031] A célula hospedeira geneticamente modificada descrita na presente invenção adicionalmente compreende modificações genéticas que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, de forma que a inserção de qualquer sequência de nucleotídeos que codifique peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com as sequências descritas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, possa favorecer a isomerização de xilose em xilulose.

[0032] Assim, para o aumento de fluxo da via das pentoses fosfato na célula hospedeira, são inseridos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase (XKS1, EC 2.7.1.17), cuja sequência de nucleotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:18, a Transaldolase (TAL1, EC 2.2.1.2), representada pela sequência SEQ ID NO:19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:20, Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1, EC 5.3.1.6), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:21; e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:22. A inserção dos genes da via das pentoses-fosfato não é obrigatória ou restritiva para transformação da célula hospedeira com qualquer das ditas sequências de nucleotídeos capazes de codificar peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com aqueles descritos pelas sequências de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO;6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0033] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um ou mais cassetes de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, em uma das concretizações, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.

[0034] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:23. Aldose redutase favorece o acúmulo de xilitol cujo acúmulo na célula, por sua vez, diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.

[0035] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, como por exemplo, o micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, em uma das concretizações, em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.

[0036] Assim, após ser submetido às modificações genéticas descritas anteriormente, o micro-organismo é então submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do micro-organismo de interesse em um meio de cultura contendo concentrações variáveis e crescentes de fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo para seleção daquele com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis ou bioquímicos.

[0037] O micro-organismo descrito na presente invenção é, em uma de suas concretizações, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir de espuma, entre outros.

[0038] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal.

[0039] Em uma das concretizações, a presente invenção revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal, utilizando o microorganismo descrito pela presente invenção.

[0040] O referido processo compreende as seguintes etapas: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o microorganismo descrito na presente invenção; e b) opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.

[0041] O processo revelado pela presente invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).

[0042] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, preferencialmente etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0043] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão que compreende: a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com pelo uma das sequências descritas em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO;11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17; e b) ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante.

[0044] Em uma concretização, o referido promotor para a referida sequência nucleotídica codificante é um promotor forte e/ou constitutivo do micro-organismo no qual o cassete será inserido.

[0045] Em uma concretização, o cassete de expressão compreende uma sequência nucleotídica adicional selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outras enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas.

[0046] Em uma concretização, o cassete de expressão compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste de sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO;21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22) e/ou combinações destas.

[0047] É um outro objeto da presente invenção um micro-organismo geneticamente modificado para a expressão de xilose isomerase e que expressa pelo menos um peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0048] Em uma concretização, o micro-organismo expressa o peptídeo conforme definido pela sequência descrita em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0049] Em uma concretização, os peptídeos conforme definidos em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17podem ser expressos de forma isolada ou simultaneamente.

[0050] Em uma concretização, a sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 apresenta-se em alto número de cópias em seu genoma.

[0051] Em uma concretização, são inseridas na célula hospedeira no mínimo de cinco cópias a vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO;3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0052] Em uma concretização, são inseridas na célula hospedeira pelo menos vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO;17.

[0053] Em uma concretização, um ou mais dos referidos cassetes de expressão pode(m) ser inserido(s) na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, tanto na direção upstream quanto downstream, podendo ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

[0054] Em uma concretização, um ou mais dos referidos cassetes de expressão pode(m) estar presente(s) na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

[0055] Em uma concretização, o micro-organismo é eucarionte.

[0056] Em uma concretização, o micro-organismo eucarionte é fungo ou levedura.

[0057] Em uma concretização, o micro-organismo eucarionte é um fungo filamentoso.

[0058] Em uma concretização, a levedura é do gênero Saccharomyces.

[0059] Em uma concretização, o microrganismo que recebe o(s) referido(s) cassete(s) de expressão é de uma linhagem industrial.

[0060] Em uma concretização, o gene GRE3 (SEQ ID NO:23) do microorganismo é inativado ou deletado em/de seu genoma.

[0061] Em uma concretização, o micro-organismo consome material lignocelulósico da biomassa vegetal.

[0062] Em uma concretização, o micro-organismo consome pentoses presentes em material lignocelulósico, preferencialmente a xilose.

[0063] Em uma concretização, o micro-organismo consome xilose em condições anaeróbias.

[0064] Em uma concretização, o micro-organismo produz como biocombustível o etanol.

[0065] Em uma concretização, o micro-organismo geneticamente modificado produz como bioquímico: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).

[0066] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetai caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo conforme definido e revelado no presente pedido de patente; e b) recolher o biocombustível e/ou bioquímico produzido após a etapa a).

[0067] Em uma concretização, a biomassa vegetal lignocelulósica da etapa a) do referido processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal é, em uma das concretizações, submetida previamente a pré-tratamento e/ou à hidrólise.

[0068] Em uma concretização, o contato entre a biomassa vegetal lignocelulósica e o micro-organismo descrito pela presente invenção ocorre em condições anaeróbias. Tais condições anaeróbias não são, entretanto, uma condição restritiva para o processo que é revelado pela presente invenção.

[0069] É um outro objeto da presente invenção um biocombustível e/ou bioquímico obtido com o micro-organismo conforme revelado na presente invenção.

[0070] Em uma concretização, o biocombustível e/ou bioquímico é o etanol.

[0071] É um outro objeto da presente invenção o biocombustível e/ou bioquímico que é obtido pelo processo revelado na presente invenção.

[0072] Em uma concretização, o biocombustível e/ou bioquímico é o etanol.

[0073] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas descritas no presente pedido de patente.

[0074] De forma mais específica, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a célula eucariótica transformada geneticamente [0075] Em uma concretização, o micro-organismo é uma levedura ou fungo filamentoso.

[0076] Na presente invenção, leveduras são consideradas como qualquer indivíduo do grupo Eumycotina, ou seja, fungos verdadeiros, que crescem de modo unicelular e que façam, por exemplo, fermentação anaeróbia. Exemplos não limitantes de tais fungos são: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.

[0077] Fungos filamentosos, por sua vez, são aqueles caracterizados por apresentarem micélio vegetativo e crescerem a partir da elongação das hifas, além de realizarem respiração aeróbia como, por exemplo, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora e Acremonium.

[0078] A presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, por exemplo, levedura do gênero Saccharomyces.

[0079] Em uma concretização, é descrito na presente invenção um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto restringir-se a eles, quando comparado com à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas contidas no presente documento.

[0080] Em uma concretização, a pentose utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose sem, entretanto, restringir-se a ela.

[0081] Na presente invenção são feitas referências a diversas sequências gênicas, todas listadas na seção Listagem de Sequências. Para breve referência e facilidade de compreensão, suas funções ou genes respectivos são indicados na tabela 1 a seguir.

Tabela 1 - Sequências gênicas ou de aminoácidos referidas na presente invenção e respectivos genes/funções.

[0082] As sequências de aminoácidos apresentadas nas sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ !D NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16 e/ou SEQ ID NO: 17 representam peptídeos com característica de xilose isomerase que, quando expressos de forma isolada ou simultaneamente em célula eucariótica, favorecem a isomerização de xilose em xilulose.

[0083] Salienta-se ainda que a expressão simultânea desses peptídeos na célula não caracteriza, de nenhuma forma, qualquer dependência entre eles para sua expressão. Portanto, define-se que a expressão simultânea desses peptídeos refere-se apenas à expressão dos peptídeos ao mesmo tempo, na mesma célula, sendo que a expressão de cada um dos referidos peptídeos independe da expressão do outro. Por exemplo, se ocorre a expressão simultânea dos peptídeos representados pelas sequências SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 na célula, entende-se que a expressão do peptídeo representado pela SEQ ID NO:1 independe da expressão do peptídeo representado pela SEQ ID NO:2 e vice-versa.

[0084] Assim, o micro-organismo descrito pela presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO;4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que cada um desses peptídeos podem ser expressos nessa célula eucariótica, por exemplo, em sua forma ativa e funcional de xilose isomerase.

[0085] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira eucariótica/micro-organismo sendo, por exemplo, levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, porém salienta-se que qualquer célula eucariótica pode ser transformada com um ou mais cassetes de expressão da presente invenção, que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e o qual possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17. Salienta-se também que as sequências de nucleotídeos que codificam os ditos peptídeos podem ser inseridas na célula eucariótica, e podem ser incorporadas no mesmo cassete ou em cassetes diferentes.

[0086] Portanto, a presente invenção descreve uma célula hospedeira eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, como por exemplo levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com um ou mais cassetes de expressão da invenção, sendo que ao menos um cassete compreenda sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0087] Adicionalmente, salienta-se que qualquer uma das sequências de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, podem apresentar-se em cópia única ou em múltiplas cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos inseridas no genoma.

[0088] A célula hospedeira geneticamente modificada descrita na presente invenção adicionalmente compreende modificações genéticas que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, de forma que a inserção de qualquer sequência de nucieotídeos que codifique peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16 e/ou SEQ ID NO: 17 possa favorecer a isomerização de xilose em xilulose.

[0089] Assim, para aumento de fluxo da via das pentoses fosfato na célula hospedeira, são inseridos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase (.XKS1, EC 2.7.1.17), cuja sequência de nucieotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:18, a Transaidolase (TAL1, EC 2.2.1.2), representada pela sequência SEQ ID NO: 19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), cuja sequência de nucieotídeos é representada por SEQ ID NO:20, Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1, EC 5.3.1.6), cuja sequência de nucieotídeos é representada por SEQ ID NO:21; e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), cuja sequência de nucieotídeos é representada por SEQ ID NO:22.

[0090] Salienta-se que, apesar da inserção dos genes da via das pentoses-fosfato ser relevante para favorecer a isomerização de xilose pela célula hospedeira, essas modificações genéticas não são, de nenhuma forma, obrigatórias ou restritivas para transformação da célula hospedeira com qualquer sequência de nucieotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

[0091] Na célula hospedeira descrita na presente invenção, ao menos um dos genes que codificam as enzimas apresentadas, compreendidas na via das pentose-fosfato e/ou pelo menos uma sequência de nucieotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase que possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, deve apresentar-se superexpresso e, em uma concretização, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis.

[0092] A superexpressão dos genes que codificam essas enzimas pode ser em decorrência do aumento do número de cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos que as codifica, expressão de genes epissomais presentes em vetores que podem ser inseridos na célula eucariótica hospedeira, através do uso de promotores heterólogos àquela sequência na qual ele encontra-se operativamente ligado, ou mesmo homólogos da célula onde foram inseridos, ou como endógenos na célula hospedeira, desde que eles sejam capazes de produzir um estado estável de transcrição mais elevado do que seria realizado pela célula em sua versão sem as presentes modificações genéticas, nas situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio. Esses promotores podem ser constitutivos ou naturalmente induzíveis.

[0093] É também objeto da presente invenção um cassete de expressão caracterizado por compreender: - pelo menos uma sequência de nucleotídeos capazes de codificar peptídeos com função xilose isomerase e que possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que esses peptídeos podem ser expressos na célula eucariótica de forma isolada ou simultaneamente; - ao menos um promotor para quaisquer das diferentes sequências nucleotídicas codificantes; e - uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas.

[0094] Um ou mais cassetes de expressão podem ser usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.

[0095] Em uma concretização, um dos cassetes de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO;22).

[0096] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um ou mais cassetes de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.

[0097] Todos os cassetes de expressão com os genes da via metabóiica das pentoses fosfato que favorecem o consumo de xilose e/ou sequências de nucleotídeos capazes de codificar peptídeos com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele. Por exemplo, na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, ser apenas downstream ou ser ambos simultaneamente.

[0098] Direção upstream é considerada aquela localizada anteriormente ao ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA, a qual se inicia no promotor e encerra no terminador. Por sua vez, downstream é considerada a região localizada após o ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA.

[0099] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:23. Aldose redutase favorece o acúmulo de xilitol cujo acúmulo na célula, por sua vez, diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.

[0100] Dessa maneira, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias de pelo menos um cassete contendo sequência de nucleotídeos que codifica peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO;15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que esses peptídeos podem ser expressos na célula hospedeira de forma isolada ou simultaneamente.

[0101] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, preferencialmente micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos preferencialmente em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de metabolizar a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.

[0102] Assim, após ser submetido às modificações genéticas descritas anteriormente, o micro-organismo é então submetido ao processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do microorganismo de interesse em um meio de cultura contendo concentrações variáveis e crescentes de fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo. A repetição desta operação proporciona selecionar micro-organismos com capacidade de metabolizar de forma mais eficiente e com maior produtividade a fonte de carbono de interesse. Assim, o processo de obtenção de microorganismos da invenção foi ajustado para a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis ou bioquímicos.

[0103] O micro-organismo descrito na presente invenção é, em uma de suas concretizações, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir de espuma, entre outros.

[0104] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal, por exemplo, a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo revelado pela presente invenção para a produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.

[0105] O referido processo compreende as seguintes etapas: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo descrito na presente invenção; e b) opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.

[0106] A biomassa vegetal lignocelulósica da etapa a) do referido processo pode ser, em uma das concretizações, submetida previamente a pré-tratamento e/ou hidrólise.

[0107] O contato entre a biomassa vegetal lignocelulósica e o microorganismo descrito da etapa a. do referido processo ocorre, em uma das concretizações, em condições anaeróbias. No entanto, é importante ressaltar que as condições anaeróbias não são obrigatórias para o contato entre biomassa e micro-organismo revelado na presente invenção.

[0108] O processo revelado pela presente invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).

[0109] A presente invenção também se refere aos biocombustíveis, como, por exemplo, o etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção.

[0110] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir do presente pedido de patente, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.

[0111] Salienta-se, então, que o microrganismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulósico em álcoois e/ou ácidos. Referido microrganismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulósico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise.

EXEMPLOS

Exemplol - Prospecção de Xiloses Isomerases [0112] A prospecção de todas as sequências que na presente invenção são descritas como xiloses isomerases foram obtidas com a utilização do software XIMMER. Esse software permite a identificação in-silico de enzimas que catalisam a reação química de conversão da xilose para a xilulose.

[0113] Apesar dessas enzimas poderem ser naturalmente encontradas em bactéria e plantas, quando inseridas dentro do genoma de fungos ou leveduras, entre elas a Saccharomyces cerevisiae, apenas algumas são capazes de funcionar corretamente, conforme já descrito em patentes e artigos da literatura.

[0114] Assim, a presente invenção descreve sequências funcionais de Xilose Isomerase em micro-organismos, bem como os micro-organismos geneticamente modificados e evoluídos para conversão de xilose em bioquímicos e/ou biocombustíveis.

REIVINDICAÇÕES

CASSETE DE EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS

E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS

Claims (27)

1. Cassete de expressão caracterizado por compreender: a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar para peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com pelo uma das sequências descritas em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17; e b) ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante.

2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido promotor ser um promotor forte e/ou constitutivo do micro-organismo no qual o cassete será inserido.

3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma sequência nucleotídica adicional selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outras enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas.

4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste de sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaidolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22) e/ou combinações destas.

5. Micro-organismo geneticamente modificado para expressão de xilose isomerase caracterizado por expressar peio menos um peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por expressar o peptídeo conforme definido peía sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

7. Micro-organismo, de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelos peptídeos conforme definidos pela sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 poderem ser expressos de forma isolada ou simultaneamente.

8. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 apresentar-se em alto número de cópias em seu genoma.

9. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, caracterizado por serem inseridas na célula hospedeira no mínimo de cinco cópias a vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO;7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

10. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 9, caracterizado por serem inseridas na célula hospedeira pelo menos vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.

11. Micro-organismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos referidos cassetes de expressão poder(em) ser inserido(s) na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, tanto na direção upstream quanto downstream, podendo ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

12. Micro-organismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de um ou mais dos referidos cassetes de expressão poder(em) estar presente(s) na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.

13. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado por ser micro-organismo eucarionte.

14. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo micro-organismo eucarionte ser fungo ou levedura.

15. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela levedura ser do gênero Saccharomyces.

16. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15 caracterizado pelo fato da linhagem que recebe o(s) referido(s) cassete(s) de expressão ser uma linhagem industrial.

17. Micro-organismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, caracterizado pelo fato de que o gene GRE3 (SEQ ID NO:23) é inativado ou deletado em/de seu genoma.

18. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 17 caracterizado pelo fato de consumir material lignocelulósico da biomassa vegetal.

19. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 18 caracterizado pelo fato de consumir pentoses presentes em material lignocelulósico, preferencialmente a xilose.

20. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 19 caracterizado por consumir xilose em condições anaeróbias.

21. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 20 caracterizado por produzir como biocombustível o etanol.

22. Micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 20 caracterizado por produzir como bioquímico: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB -poli(hidróxido butirato).

23. Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar a biomassa vegetal lignocelulósica, em contato com o micro-organismo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 22; e b) coletar o biocombustível e/ou bioquímico gerado após a etapa a).

24. Biocombustível e/ou bioquímico caracterizado por ser obtido com o micro-organismo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 22.

25. Biocombustível e/ou bioquímico caracterizado por ser etanol.

26. Biocombustível e/ou bioquímico caracterizado por ser obtido pelo processo conforme definido pela reivindicação 23.

27. Biocombustível e/ou bioquímico caracterizado por ser etanol.