BR112019012949A2 - isomerases de xilose que conferem capacidade de fermentação eficiente de xilose em levedura - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere a novas sequências de ácidos nucleicos que codificam isomerases bacterianas de xilose que, quando da transformação de uma célula hospedeira microbiana eucariótica, tal como levedura, para conferir à célula hospedeira a capacidade de isomerizar xilose em xilulose. as sequências de ácidos nucleicos codificam isomerases de xilose que originam de bactérias tais como eubacterium sp., clostridium cellulosi e outras. a invenção se refere ainda a processos de fermentação nos quais as células hospedeiras transformadas fermentam um meio contendo xilose para produzir etanol ou outros produtos de fermentação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ISOMERASES DE XILOSE QUE CONFEREM CAPACIDADE DE FERMENTAÇÃO EFICIENTE DE XILOSE EM LEVEDURA
Campo da invenção [001] A presente invenção se refere aos campos da microbiologia e tecnologia de fermentação. Em particular, a invenção se refere a sequências de ácidos nucleicos que codificam xilose isomerases que quando da transformação de uma célula hospedeira microbiana eucariótica, tal como uma levedura, para conferir à célula hospedeira a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose. A invenção se refere ainda a processos de fermentação em que as células hospedeiras transformadas fermentam um meio contendo pentose para produzir etanol ou outros produtos de fermentação.
Técnica Antecedente [002] A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido o principal organismo de escolha em processos de fermentação industrial, incluindo bebidas alcoólicas e produção de bioetanol. A dominância deste organismo nessas indústrias se deve às suas propriedades superiores, tais como alta produtividade e rendimento do etanol, alta tolerância ao etanol e outros inibidores, e sua excelente manutenção da viabilidade durante a produção, armazenamento e transporte. Além disso, por ser um dos microorganismos mais intensamente estudados, inúmeras ferramentas moleculares estão
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2/86 disponíveis para sua manipulação genética e fisiológica (1).
[003] Por outro lado, cepas naturais de S. cerevisiae não são úteis em indústrias de etanol à base de lignocelulose. Isto é principalmente devido à sua incapacidade de metabolizar açúcares de pentose, particularmente xilose. A xilose é o segundo açúcar mais abundante na natureza. Ele é responsável por um terço do total de açúcar presente na biomassa lignocelulósica, tais como os resíduos agrícolas e florestais, e resíduos sólidos urbanos. Assim, a utilização eficiente da xilose é crucial para a produção de bioetanol à base de lignocelulose (segunda geração) (2 ) .
[004] Existem vários microrganismos capazes de fermentar naturalmente a xilose. No entanto, ao contrário de S. cerevisiae, esses organismos não possuem robustez inerente suficiente para lidar com os ambientes adversos que existentem nas fermentações industriais. Em comparação com S. cerevisiae, eles são menos tolerantes ao etanol e a vários inibidores de crescimento e fermentação, tais como ácidos orgânicos, derivados de furano e compostos fenólicos que estão presentes nos hidrolisados lignocelulósicos (3). Por essa razão, muito esforço está sendo empreendido para projetar S. cerevisiae para a fermentação eficiente da xilose, ao invés de conferir robustez industrial à xilose natural, utilizando microrganismos.
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3/86 [005] Duas vias diferentes de utilização de xilose foram projetadas em levedura. A primeira via, chamada de via fúngica ou a via redox, funciona por uma conversão enzimática de duas etapas de xilose em xilulose. Na primeira etapa, a enzima Xilose Redutase (XR) dependente de NADPH reduz a xilose para o xilitol. O xilitol é subsequentemente oxidado para xilulose pela Xilitol Desidrogenase (XDH) dependente de NAD. A xilulose pode então ser fosforilada em Xilulose-5Fosfato pela Xiluloquinase nativa. Embora as linhagens de levedura que expressam a via redox fúngica possam fermentar eficientemente a xilose, elas geralmente produzem menos etanol por grama de biomassa, devido ao acúmulo de xilitol como subproduto (4) . A baixa produção de etanol e a alta acumulação de xilitol são devidas ao desequilíbrio do cofator gerado pelas enzimas heterólogas XR/XDH. Várias estratégias foram aplicadas para resolver o problema do desequilíbrio do cofator. Isso inclui a modificação da especificidade do cofator de XR e XDH, e a expressão de transidrogenases heterólogas que catalisam a transferência de H+ entre NADPH e NAD+ (5-7). O balanceamento do uso do cofator em levedura que expressa XR/XDH mostrou bom potencial, mas até agora não conseguiu eliminar a produção de xilitol como subproduto. O rendimento de etanol por quantidade de açúcar consumido por essas cepas permanece muito baixo.
[006] A segunda via funciona com uma conversão em uma
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4/86 etapa de xilose para xilulose usando Xilose Isomerase (XI). Esta via alivia o desequilíbrio do cofator associado com a via redox fúngica. A via XI é predominantemente encontrada em bactérias, mas também em alguns fungos. Muitas tentativas anteriores para expressar XI bacteriana em levedura falharam ou resultaram em expressão muito baixa. 0 primeiro XI bacteriano funcionalmente ativo expresso em levedura foi codificado pelo gene XylA a partir da bactéria termofílica Thermus thermophiles (8) . No entanto, a atividade enzimática ótima foi observada a 85 °C, muito acima da temperatura ideal na qual as leveduras podem crescer. No entanto, a cepa recombinante foi capaz de crescer muito lentamente com xilose como única fonte de carbono. Posteriormente, a expressão de um XI fúngico enzimaticamente ativo a partir de Píromyces sp. tornou-se uma grande história de sucesso (9) . Posteriormente, outros Xis de várias espécies de bactérias ou fungos foram ativamente expressos em S. cerevisiae (10). No entanto, a atividade dessas enzimas na levedura permanece menor em comparação com ο XI de Píromyces sp. O primeiro XI bacteriano que apresentou atividade enzimática muito boa quando expresso em levedura foi ο XI da espécie bacteriana Clostridium phytofermentans. Esta enzima foi menos inibida pelo xilitol do que pelas xilose isomerases de outras espécies bacterianas (11) . No entanto, apesar das elevadas atividades enzimáticas in vitro destes Xis reportados até
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5/86 agora, as cepas recombinantes que expressam estas enzimas exibiram apenas crescimento lento e capacidade de fermentação com xilose. Melhoria adicional por mutagênese ou evolução adaptativa da levedura recombinante é necessária para se obter uma capacidade de fermentação de xilose aceitável (12).
[007] Até o momento, existem centenas de sequências XylA disponíveis nos bancos de dados de sequências do NCBI. Essas sequências são uma ótima ferramenta para procurar por Xis funcionalmente ativas originárias de várias espécies. Apesar da vasta informação de sequência, apenas algumas Xis originárias de várias espécies de bactérias foram funcionalmente expressas em leveduras. Recentemente foi relatado que a maioria das Xis ativamente expressas em leveduras se originam do grupo de Bacteroidetes que vive no intestino dos mamíferos (10). Uma desvantagem das Xis provenientes do grupo Bacteroidetes é sua forte inibição pelo xilitol (11). No entanto, muitas Xis bacterianas diferentes das que originam do grupo Bacteroidetes não podem ser funcionalmente expressas em leveduras e ainda não podemos prever antecipadamente se uma XI específica será funcionalmente expressa em levedura ou não.
[008] Existe, portanto, ainda uma necessidade na técnica de sequências nucleotídicas codificando outras xilose isomerases que podem ser utilizadas para transformar células
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6/86 hospedeiras como S. cerevisiae para lhes conferir a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose, de modo a permitir a utilização da célula hospedeira transformada em processos para a produção de etanol ou outros produtos de fermentação por fermentação de matéria-prima contendo pentose.
Sumario da invenção [009] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma célula microbiana eucariótica compreendendo uma sequência nucleotidica, cuja expressão confere ou aumenta na célula a capacidade de isomerizar diretamente a xilose em xilulose, em que a sequência nucleotidica codifica um polipeptideo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 68% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 7. De preferência, a sequência nucleotidica codifica uma sequência de aminoácidos que é obtida a partir de uma bactéria do gênero Eubacteríum, mais preferencialmente uma bactéria da espécie Eubacteríum sp. CAG_180. Uma célula preferida de acordo com a invenção compreende ainda uma segunda sequência nucleotidica, cuja expressão confere ou aumenta na célula a capacidade de isomerizar diretamente a xilose em xilulose, em que a sequência nucleotidica codifica um polipeptideo com atividade de xilose isomerase, polipeptideo esse que
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7/86 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 71% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 10. De preferência, a segunda sequência nucleotidica codifica uma sequência de aminoácidos que é obtida a partir de uma bactéria do gênero Clostridium, mais preferencialmente uma bactéria da espécie Clostridium cellulosi.
[0010] A célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção é preferencialmente uma levedura ou um fungo filamentoso de um gênero selecionado do grupo que consiste em Saccharomyces, Kluyveromycesr Candidar Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Yarrowia, Kazachstania Naumovia, Aspergillusr Trichodermar Humicola, Acremonium, Fusarium e Penicillium.
[0011] Em uma modalidade, a célula microbiana eucariótica é preferivelmente uma levedura que é capaz de fermentação alcoólica anaeróbica. De um modo preferido, a levedura pertence a uma espécie Saccharomyces selecionada do grupo consistindo de S. cerevisiae, S. bayanus, S. bulderi, S. cervazzii, S. cariocanus, S. castellii, S. dairenensis, S. exiguus, S. kluyveri r S. kudriazevii, S. mikatae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. turicensis e S. unisporus.
[0012] Em uma célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptideo com atividade de xilose isomerase é
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8/86 preferivelmente operativamente ligada a um promotor que é insensível à repressão catabólica e/ou que não requer xilose para indução.
[0013] A célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção compreende, de preferência, pelo menos uma modificação genética selecionada de: a) uma modificação genética que aumenta a atividade específica da xilulose quinase; b) uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de fosfato das pentoses; e, c) uma modificação genética que reduz a atividade inespecífica da aldose redutase na célula. A célula compreende ainda de um modo preferido, pelo menos, uma modificação genética que resulta em uma característica selecionada a partir do grupo consistindo de: a) aumento da tolerância ao etanol; b) aumento da tolerância ao ácido acético; c) produção reduzida de glicerol; d) aumento da taxa de fermentação de xilose para etanol; e, e) aumento da tolerância ao calor. Mais preferencialmente na célula: a) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo de um ou mais dos genes ADE1, KIN3, MKT1, VPS70, SWS2 e APJ1 que confere tolerância aumentada ao etanol como descrito em WO 2012/175552 e WO 2014/170330; b) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo de um ou mais dos genes GLO1, DOT5, CUP2 e HAA1 que confere maior tolerância ao ácido acético, como descrito nos documentos WO 2015/181169 e WO 2016/083397; c) a modificação
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9/86 genética é uma modificação que introduz um gene SSK1 mutante que codifica uma proteína sskl truncada como descrito em WO 2014/048863; d) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo do gene NNK1 que confere um aumento da taxa de fermentação de xilose para etanol, como descrito no documento WO 2015/086805; e, e) a modificação genética é a superexpressão de pelo menos um de um gene que codifica a proteína Prp42 e um gene que codifica a proteína Smd2.
[0014] Em uma célula microbiana eucariótica preferida de acordo com a invenção, a sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo com atividade de xilose isomerase é integrada no genoma da célula.
[0015] Uma célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção é de preferência uma célula de uma cepa de levedura industrial ou derivada de uma cepa de levedura industrial. A célula pode ser uma célula diploide, aneuploide ou poliploide.
[0016] Em uma modalidade, uma célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção é uma célula que é melhorada em pelo menos um fenótipo industrialmente relevante por engenharia evolutiva, em que, de um modo preferido, o fenótipo industrialmente relevante é a taxa de utilização de xilose.
[0017] Uma célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção tem ainda mais de preferência, a capacidade de
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10/86 produzir pelo menos um produto de fermentação selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, ácido lático, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas.
[0018] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, ácido lático, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas. O
processo compreende preferencialmente as etapas de: (a)
fermentar um meio contendo uma fonte de xilose e,
opcionalmente, uma fonte de glicose, com uma célula
microbiana eucariótica de acordo com a invenção, pelo que a célula fermenta a xilose e, opcionalmente, a glicose, para o produto de fermentação e, opcionalmente, (b) a recuperação do produto de fermentação.
[0019] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere à utilização de uma célula microbiana eucariótica de acordo com o primeiro aspecto em um processo de acordo com o segundo
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11/86 aspecto .
Descrição da invenção
Definições [0020] A enzima xilose isomerase (EC 5.3.1.5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta da D-xilose em D-xilulose e vice-versa. A enzima também é conhecida como D-xilose cetoisomerase. Algumas xilose isomerases também são capazes de catalisar a conversão entre D-glicose e D-frutose e são, portanto, algumas vezes referidas como glicose isomerase. Xilose isomerases requerem magnésio como cofator. As xilose isomerases da invenção podem ser ainda definidas pela sua sequência de aminoácidos como aqui descrito abaixo. Do mesmo modo, as xilose isomerases podem ser definidas pelas sequências de nucleotídeos que codificam a enzima, bem como pelas sequências de nucleotídeos que hibridizam com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma xilose isomerase, como aqui se descreve a seguir. Uma unidade (U) de atividade de xilose isomerase é aqui definida como a quantidade de enzima produzindo 1 nmol de xilulose por minuto, em uma mistura reacional contendo tampão fosfato 50 mM (pH 7,0), xilose 10 mM e MgClz 10 mM, a 37 °C. A xilulose formada foi determinada pelo método de Dische e Borenfreund (1951, J. Biol. Chem. 192: 583-587) ou por HPLC como é conhecido na técnica.
[0021] Os termos homologia, identidade de sequência
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12/86 e similares são usados aqui de maneira intercambiável. A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptideo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo), conforme determinado por comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, consoante o caso, determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências. A similaridade entre duas sequências de aminoácidos é determinada comparando a sequência de aminoácidos e os seus substitutos de aminoácidos conservados de um polipeptideo com a sequência de um segundo polipeptideo. Identidade e similaridade podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos.
[0022] A identidade de sequência e a similaridade de sequência podem ser determinadas pelo alinhamento de dois peptídeos ou de duas sequências de nucleotídeos usando algoritmos de alinhamento global ou local, dependendo do comprimento das duas sequências. Sequências de comprimentos semelhantes são preferencialmente alinhadas usando um algoritmo de alinhamento global (por exemplo, Needleman Wunsch) que alinha as sequências de forma ótima ao longo de todo o comprimento, enquanto sequências de comprimentos substancialmente diferentes são preferencialmente alinhadas
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13/86 utilizando um algoritmo de alinhamento local (por exemplo, Smith Waterman). As sequências podem então ser referidas como substancialmente idênticas ou essencialmente similares quando elas (quando otimamente alinhadas por, por exemplo, os programas GAP ou BESTFIT usando parâmetros padrão) compartilham pelo menos uma certa porcentagem minima de identidade de sequência (conforme definido abaixo). 0 GAP usa o algoritmo de alinhamento global Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências ao longo de todo o comprimento (comprimento total), maximizando o número de correspondências e minimizando o número de intervalos. Um alinhamento global é adequadamente utilizado para determinar a identidade da sequência quando as duas sequências têm comprimentos semelhantes. Geralmente, os parâmetros padrão do GAP são usados, com uma penalidade de criação de intervalo = 50 (nucleotídeos)/ 8 (proteínas) e penalidade de extensão de intervalo = 3 (nucleotídeos)/ 2 (proteínas). Para nucleotídeos, a matriz de pontuação padrão usada é nwsgapdna e, para proteínas, a matriz de pontuação padrão é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Alinhamentos de sequências e pontuações para identidade de sequência percentual podem ser determinados usando programas de computador, tais como o Pacote GCG Wisconsin, Versão 10.3, disponível da Accelrys Inc., Scranton Road 9685, San Diego, CA 92121-3752 EUA, ou usando software de código aberto, tal
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14/86 como o programa needle (usando o algoritmo global Needleman Wunsch) ou water (usando o algoritmo local Smith Waterman) em EmbossWIN versão 2.10.0, usando os mesmos parâmetros como para o GAP acima, ou usando as configurações padrão (ambos para 'needle' e para 'water' e ambos para proteína e para alinhamentos de DNA, a penalidade de abertura de Gap padrão é 10.0 e a penalidade de extensão de intervalo padrão é 0.5; matrizes de pontuação padrão são Blossum62 para proteínas e DNAFull para DNA) . Quando as sequências têm comprimentos globais substancialmente diferentes, são preferidos alinhamentos locais, tais como aqueles que usam o algoritmo de Smith Waterman.
[0023] Alternativamente, a similaridade ou identidade percentual pode ser determinada por pesquisa em bancos de dados públicos, usando algoritmos como FASTA, BLAST, etc. Assim, as sequências de ácido nucléico e proteína da presente invenção podem ser usadas como uma sequência de consulta para realizar uma busca contra bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas BLASTn e BLASTx (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403—10. Pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de
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15/86 ácido nucléico de oxidoredutase da invenção. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTx, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com intervalos para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. , (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTx e BLASTn) podem ser usados. Veja a página inicial do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0024] Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácidos, o especialista pode também ter em conta as substituições de aminoácidos conservativas, como ficará claro para o especialista. As substituições conservativas de aminoácidos se referem à permutabilidade de resíduos tendo cadeias laterais similares. Exemplos de classes de resíduos de aminoácidos para substituições conservativas são dados nas Tabelas abaixo.
Resíduos Ácidos Asp (D) e Glu (E)
Resíduos Básicos Lys (K) , Arg (R), e His (H)
Resíduos não carregados Ser (S) , Thr (T), Asn (N), e
Hidrofílicos Gin (Q)
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16/86
Resíduos não carregados Gly (G) , Ala (A), Vai (V),
Alifáticos Leu (L),
e He (I)
Resíduos não polares não Cys (C), Met (M), e Pro (P)
carregados
Resíduos Aromáticos Phe (F), Tyr (Y), e Trp (W)
[0025] Classes alternativas de substituição de resíduos de aminoácidos conservativas.
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
[0026] Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduos de Aminoácidos.
Resíduos contendo grupos de álcool S e T
Resíduos alifáticos I, L, V, e M
Resíduos associados a cicloalquenil F, H, W, e Y
Resíduos Hidrofóbicos A, C, F, G, Η, I, L, M, R, T, V, W, e Y
Resíduos com carga negativa D e E
Resíduos polares C, D, E, Η, K, N, Q, R, S, e T
Resíduos positivamente carregados Η, K, e R
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17/86
Resíduos Pequenos A, C, D, G, N, P, S, T, e V
Resíduos muito pequenos A, G, e S
Resíduos envolvidos na formação de A, C, D, E, G, Η, K, N, Q, R, S,
turnos P e T
Resíduos flexíveis Q, T, K, S, G, P, D, E, e R
[0027] As sequências de nucleotídeos que codificam as xilose isomerases da invenção podem também ser definidas pela sua capacidade de hibridizar com as sequências nucleotídicas de codificação de xilose isomerases como aqui exemplificado, sob condições de hibridização moderadas ou preferencialmente rigorosas. Condições de hibridização rigorosas são aqui definidas como condições que permitem uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, de preferência cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferencialmente cerca de 200 ou mais nucleotídeos, para hibridizar a uma temperatura de cerca de 65 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma força iônica comparável, e lavando a 65 °C em uma solução compreendendo cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferencialmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. De preferência, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos durante 10 horas e de preferência a lavagem é realizada durante pelo menos uma hora com pelo menos duas alterações da solução de lavagem. Estas condições
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18/86 normalmente permitem a hibridização especifica de sequências com cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.
[0028] Condições moderadas são aqui definidas como condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize a uma temperatura de cerca de 45 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferencialmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma força iônica comparável, e lavando à temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma força iônica comparável. De preferência, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos durante 10 horas, e de preferência a lavagem é realizada durante pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições permitem habitualmente a hibridização específica de sequências com até 50% de identidade de sequência. O perito na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização de modo a identificar especificamente sequências que variam em identidade entre 50% e 90%.
[0029] Um construto de ácido nucleico ou vetor de ácido nucleico é aqui entendido como ácido nucleico produzida pelo tecnologia de DNA recombinante.
significando uma molécula de homem resultante do uso de O termo construto de ácido
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19/86 nucleico não inclui, portanto, moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural, embora um construto de ácido nucleico possa compreender (partes de) moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural. Os termos vetor de expressão ou construto de expressão se referem a sequências de nucleotídeos que são capazes de afetar a expressão de um gene em células hospedeiras ou organismos hospedeiros compatíveis com tais sequências. Esses vetores de expressão tipicamente incluem pelo menos sequências regulatórias de transcrição adequadas e, opcionalmente, sinais de terminação de transcrição 3'. Os fatores adicionais necessários ou úteis para efetuar a expressão podem também estar presentes, tais como elementos estimuladores da expressão. 0 vetor de expressão será introduzido em uma célula hospedeira adequada e será capaz de efetuar a expressão da sequência de codificação em uma cultura de células in vitro da célula hospedeira. 0 vetor de expressão será adequado para replicação na célula hospedeira ou organismo da invenção.
[0030] Como aqui utilizado, o termo promotor ou sequência reguladora da transcrição se refere a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de uma ou mais sequências de codificação e está localizado a montante em relação à direção da transcrição do local de iniciação da transcrição da sequência codificante, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio
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20/86 de ligação para a polimerase de RNA dependente de DNA, sitios de iniciação da transcrição e outras sequências de DNA, incluindo, mas não se limitando a locais de ligação de fator de transcrição, locais de ligação de proteína repressores e ativadores, e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas para um perito na técnica para atuar diretamente ou indiretamente ao regular a quantidade de transcrição a partir do promotor. Um promotor constitutivo é um promotor ativo na maioria dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor induzível é um promotor que é regulado fisiologicamente ou de desenvolvimento, por exemplo, pela aplicação de um indutor químico.
[0031] O termo marcador selecionável é um termo familiar para um especialista na técnica e é aqui utilizado para descrever qualquer entidade genética que, quando expressa, pode ser utilizada para selecionar uma célula ou células contendo o marcador selecionável. O termo repórter pode ser usado de forma intercambiável com o marcador, embora seja usado principalmente para se referir a marcadores visíveis, tais como a proteína verde fluorescente (GFP). Marcadores selecionáveis podem ser dominantes ou recessivos ou bidirecionais.
[0032] Como aqui utilizado, o termo operacionalmente ligado se refere a uma ligação de elementos de
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21/86 polinucleotídeos em uma relação funcional. Um ácido nucleico é operativamente ligado quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma sequência reguladora da transcrição está operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se ela afetar a transcrição da sequência de codificação. Operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA ligadas são tipicamente contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no frame de leitura.
[0033] Os termos proteína ou polipeptídeo são usados de forma intercambiável e se referem a moléculas consistindo em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a um modo específico de ação, tamanho, estrutura tridimensional ou origem.
[0034] Os fungos (singular fungo) são aqui entendidos como microrganismos eucarióticos heterotróficos que digerem os seus alimentos externamente, absorvendo moléculas nutrientes dentro das suas células. Fungos são um reino separado de organismos eucarióticos e incluem leveduras, mofos e cogumelos. Os termos fungos, fungos e fungos, tal como aqui utilizados, incluem expressamente leveduras bem como fungos filamentosos.
[0035] O termo gene significa um fragmento de DNA compreendendo uma região (região transcrita), que é
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22/86 transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula, operativamente ligada a regiões reguladoras adequadas (por exemplo, um promotor) . Um gene irá normalmente compreender diversos fragmentos, operativamente ligados tais como um promotor, uma sequência de comando 5' , uma região codificadora e uma sequência 3' não traduzida (extremidade 3 ') compreendem um sitio de poliadenilação. Expressão de um gene se refere ao processo em que uma região de DNA que está operativamente ligada a regiões reguladoras apropriadas, particularmente um promotor, é transcrita em um RNA, que é biologicamente ativo, isto é, que é capaz de ser traduzido em uma proteína biologicamente ativa ou peptídeo.
[0036] O termo homólogo, quando utilizado para indicar a relação entre uma dada molécula de ácido nucleico ou polipeptideo recombinante e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, significa que na natureza a molécula de ácido nucleico ou polipeptideo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, de preferência da mesma variedade ou cepa. Se homólogas a uma célula hospedeira, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo irá tipicamente (mas não necessariamente) ser operacionalmente ligada a uma outra sequência do promotor (heteróloga) e, se for o caso, uma outra sequência de sinal de secreção (heteróloga) e/ou sequência de terminação do que em seu ambiente natural. É entendido que as sequências
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23/86 reguladoras, sequências sinalizadoras, sequências de terminação, etc. podem também ser homólogas à célula hospedeira. Neste contexto, a utilização de apenas elementos de sequências homólogos permite a construção de organismos geneticamente modificados (OGMs) autoclonados (a autoclonação é aqui definida como na Diretiva Européia 98/81/CE, Anexo II). Quando utilizado para indicar a relação de duas sequências de ácido nucleico, o termo homólogo significa que uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples pode hibridizar com uma sequência complementar de ácido nucleico de cadeia simples. 0 grau de hibridização pode depender de diversos fatores incluindo a quantidade de identidade entre as sequências e as condições de hibridização, tais como a temperatura e a concentração de sal, como discutido mais tarde.
[0037] O termo heterólogo quando usado com relação a um ácido nucleico (DNA ou RNA) ou proteína se refere a um ácido nucleico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou RNA em que é presente, ou que é encontrado em uma célula ou localização ou locais no genoma ou sequência de DNA ou RNA que diferem daquela em que é encontrado na natureza. Os ácidos nucleicos ou proteínas heterólogas são não endógenos à célula na qual são introduzidos, mas foi obtido a partir de outra célula produzida de forma recombinante ou
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24/86 sinteticamente. Geralmente, embora não necessariamente, esses ácidos nucleicos codificam proteínas que não são normalmente produzidas pela célula na qual o DNA é transcrito ou expresso. Do mesmo modo, o RNA exógeno codifica para proteínas normalmente não expressas na célula em que o RNA exógeno está presente. Os ácidos nucleicos heterólogos e proteínas também podem ser referidos como os ácidos nucleicos ou proteínas como estrangeiros. Qualquer ácido nucleico ou proteína que um especialista na técnica reconhecería como heterólogo ou estrangeiro à célula em que é expresso é aqui abrangido pelo termo ácido nucleico ou proteína heteróloga. 0 termo heterólogo também se aplica a combinações não naturais de sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos, isto é, combinações em que pelo menos duas das sequências combinadas são estrangeiras em relação uma à outra.
Descrição das modalidades [0038] Até à data, uma vasta quantidade de sequências de aminoácidos da xilose isomerase está disponível publicamente no Genbank e em outras bases de dados de sequências. Entre elas estão algumas sequências de aminoácidos de xilose isomerases que são conhecidas pela capacidade de expressão funcional em leveduras, incluindo, por exemplo, xilose isomerases de fungos anaeróbios como Piromyces, do grupo Bacteroidetes que vive no intestino de mamíferos, bem como xilose isomerases bacteriana da espécie Clostridium
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25/86 phytofermentans. Os presentes inventores descobriram surpreendentemente sequências de aminoácidos de xilose isomerases que não estão relacionadas com as enzimas Píromyces, Bacteroidetes e C. phytofermentans - no sentido de que a maioria delas compartilha menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos das enzimas de Píromyces (PiXI; SEQ ID NO: 18) e C. phytofermentans (CpXI; SEQ ID NO: 17) (ver Tabela 1) e que, no entanto, possuem a capacidade de expressão funcional (isto é, ativa) em leveduras.
[0039] A expressão funcional de uma xilose isomerase em uma levedura é aqui entendida como a expressão de uma sequência codificadora otimizada de códon para a xilose isomerase a partir de um promotor glicolitico em um plasmideo baseado em 2μ em uma cepa hospedeira de S. cerevisiae, cuja expressão permite o crescimento detectável da levedura em xilose como única fonte de carbono, de preferência sob condições anaeróbicas com a produção de etanol à custa de xilose, mais preferencialmente com pelo menos um de uma taxa de crescimento, biomassa e rendimento de etanol que é pelo menos 10, 20, 50 ou 80% do conseguido com uma sequência otimizada por códon que codifica para a xilose isomerase de Píromyces (com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18) sob condições idênticas. A cepa hospedeira de S. cerevisiae preferencialmente é uma cepa hospedeira modificada para
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26/86 crescimento em xilose por superexpressão de xilulose quinase (XKS1) e todos os genes da via de fosfato de pentoses (PPP), tais como, por exemplo, a cepa M315CpXIA/CpXIA (ver Exemplos). De preferência, a expressão funcional é a expressão que permite o crescimento detectável da cepa hospedeira na xilose como única fonte de carbono a uma temperatura inferior a 35, 33, 30 ou 28°C e a uma temperatura superior a 20, 22 ou 25°C.
[0040] Tabela 1. Identidade de sequência das sequências de aminoácidos de xilose isomerases em comparação com a sequência de aminoácidos de Píromyces sp. XI (PiXI) e C.
phytofermentans XI (CpXI).
Fonte de xilose isomerase % identidade para PiXI % identidade para CpXI Expressão funcional em levedura SEQ ID NO. Código
Lachnoclostridi
um 54,99 96, 12 + 1 LplXI
phytofermentans
Clostridium algidicarnis 53,83 72,60 + 2 Ca2XI
Mageeibacillus indolicus 53,02 69,35 + 3 MÍ3XI
Ruminococcus sp, NK3A76 52,19 68,64 - 4 Rs4XI
Epulopiscium sp,
'N,t, morphotype 52,94 67,28 + 5 Es5XI
B
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27/86
Alkaliphilus metalliredigens 52,76 65,53 + 6 Am6XI
Eubacterium sp, CAG_180 54,38 65,44 + 7 Es7XI
Clostridium
saccharoperbuty 53,23 64,61 + 8 Cs8XI
lacetonicum
Fusobacterium mortiferum 51,96 65,67 + 9 Fm9XI
[Clostridium] cellulosi 50,69 64,84 + 10 CclOXI
Cellulosilyticu m lentocellum 53,35 64,53 + 11 C111XI
Peptoclostridiu m difficile 54,04 62,93 + 12 Pcdl2X I
(Pepto)clostrid
ium difficile 54,50 62,70 - 13 Cdl3XI
NAP 0 8
Caldicellulosir uptor acetigenus 50,35 61,75 - 14 Cal4XI
Agrobacterium tumefaciens 49,89 52,50 - 15 Atl5XI
Burkholderia cenocepacia 49,32 51,70 - 16 Bcl6XI
[0041] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira transformada isomerizar a xilose em xilulose que tem a capacidade de
A capacidade de isomerizar a xilose para xilulose é conferida à célula hospedeira por
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28/86 transformação da célula hospedeira com um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica uma xilose isomerase. A capacidade da célula hospedeira transformada de isomerizar xilose em xilulose é entendida como significando a isomerização direta de xilose, em uma única reação catalisada por xilose isomerase, para xilulose, em oposição à conversão em duas etapas de xilose em xilulose via um intermediário xilitol como catalisado pela xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente.
[0042] Em uma modalidade, a sequência nucleotidica que
codifica a xilose isomerase é selecionada do grupo que
consiste em:
[0043] (a ) uma sequência nucleotidica que codifica um
polipeptideo com atividade de xilose isomerase, cujo
polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que tem
pelo menos 65,5, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 7 (Eubacteríum sp. CAG_180);
[0044] (b) uma sequência nucleotidica que codifica um polipeptideo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 64,9, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,
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29/86
76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 10 ([Clostridium] cellulosic ;
[0045] (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 64,7, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99 % identidade
de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 8 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum);
[0046] (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 64,6, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99 % identidade
de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 11 (Cellulosilyticum lentocellum);
[0047] (e) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo
polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 67,3, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
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92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de
sequência com o aminoácido sequência de SEQ ID NO. 5
(Ep ul opí s ci um sp. 'N.t. morfotipo B);
[0048] (f) uma sequência de nucleotídeos que codifica um
polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 96,2, 96,5, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1 (Lachnoclostrídíum phytofermentans);
[0049] (g) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 65,6, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade
de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 6 (Alkalíphílus metallíredígens);
[0050] (h) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 69,4, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 3 (Mageeíbacíllus índolícus) ;
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31/86 [0051] (1) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 72,7, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,
82, 83, 84 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,
96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com a sequência
de aminoácidos da SEQ ID NO. 2 (Clostridium algidicarnis) ;
[0052] (j) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que
tem, pelo menos, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 95, 96, 97, 98 ou 99% de
identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 12 (Peptocl os tridi um difficile') ;
[0053] (k) uma sequência de nucleotídeos da cadeia complementar de que hibridiza com uma sequência de nucleotídeos de um de (a) - (j); e, [0054] (1) uma sequência nucleotídica cuja sequência difere da sequência de uma sequência nucleotídica de (k) devido à degenerescência do código genético.
[0055] As sequências de nucleotídeos da invenção codificam uma nova classe de xilose isomerases que podem ser funcionalmente expressas em células hospedeiras microbianas eucarióticas da invenção, tal como definido abaixo. As
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32/86 sequências de nucleotídeos da invenção codificam preferencialmente xilose isomerases que ocorrem naturalmente no organismo de origem, por exemplo, a bactéria de origem.
[0056] Uma sequência de nucleotídeo preferida da invenção codifica assim uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à de uma xilose isomerase que é obtenível a partir de (ou ocorre naturalmente em) uma bactéria da família Clostridiaceae, mais preferivelmente uma bactéria do gênero Clostridium, por exemplo, Clostridium algidicarnis, mas mais preferido é o Clostridium saccharoperbutylacetonicum e o mais preferido é o [Clostridium] cellulosi.
[0057] Outra sequência nucleotídica preferida da invenção codifica uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à de uma xilose isomerase que se pode obter a partir de (ou ocorre naturalmente em) uma bactéria da família Eubacteriaceae, mais preferencialmente uma bactéria do gênero Eubacterium, dos quais a espécie Eubacterium sp. CAG_180 é a mais preferida.
[0058] Alternativamente, a sequência de nucleotídeos da invenção codifica uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à de uma xilose isomerase que é obtenível a partir de (ou ocorre naturalmente em) uma bactéria de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Cellulosilyticum, Epulopiscium,
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Lachnoclostridium, Alkalíphílus, Mageeíbacíllus e
Peptoclostridium, mais preferivelmente uma bactéria de uma
espécie selecionada do grupo que consiste em
Cellulosilyticum lentocellum, Epulopiscium sp. 'N.t. morfotipo B, Lachnoclostridium phytofermentans, Metaloídígens Alkalíphílus, Mageeíbacíllus indolicus e Peptoclostridium difficile.
[0059] É entendido, no entanto, que as sequências nucleotidicas que codificam as formas manipuladas de qualquer uma das xilose isomerases definidas acima e que compreendem uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos em comparação com as correspondentes xilose isomerases de ocorrência natural, mas que estão dentro das faixas de identidade ou similaridade como aqui definido estão expressamente incluídos na invenção. Por conseguinte, em uma modalidade, a sequência nucleotídica da invenção codifica uma sequência de aminoácidos de xilose isomerase compreendendo uma sequência de assinatura de xilose isomerase conforme definido por Meaden et al. (1994, Gene, 141: 97-101) : VXW [GP] GREG [YSTA] (presente nas posições 187-195) e [LIVM] EPKPX [EQ] P (presente nas posições 232239) , em que X pode ser qualquer aminoácido e em que os aminoácidos entre parênteses indicam que um dos aminoácidos entre parêntesis pode estar presente nessa posição na sequência de assinatura. A sequência de aminoácidos da xilose
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34/86 isomerase da invenção compreende ainda de preferência os resíduos de aminoácido conservados His-102, Asp-105 e Asp340, que constituem uma tríade diretamente envolvido na catálise, Lys-235 desempenha um estrutural, bem como um funcional papel de catalisador, e Glu-233, que está envolvida na ligação do magnésio (Vangrysperre et al, 1990, Biochem J. 265:.. 699-705; Henrick et al., J. Mol Biol 208: 129-157... Bhosale et al. , 1996 Microbiol. Rev. 60: 280-300) . As posições dos aminoácidos das sequências de assinatura acima e resíduos conservados se referem às posições na sequência de aminoácidos de referência da xilose isomerase de Píromyces de SEQ ID NO: 18. Em sequências de aminoácidos da presente invenção que não seja a SEQ ID NO: 18, de um modo preferido, o as posições de aminoácidos das sequências de assinatura acima e resíduos conservados estão presentes nas posições de aminoácidos correspondentes às posições das sequências de assinatura e resíduos conservados na SEQ ID NO: 18, de preferência em um alinhamento de sequência ClustalW (1,83 ou 1,81) utilizando configurações padrão. O especialista saberá como identificar posições de aminoácidos correspondentes em sequências de aminoácidos de xilose isomerase que não SEQ ID NO: 18, utilizando algoritmos de alinhamento de sequências de aminoácidos como definido acima. Um exemplo de tal alinhamento é mostrado na Tabela 2.
[0060] Em algumas modalidades, portanto, a sequência
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35/86 nucleotidica pode codificar formas manipuladas de qualquer uma das xilose isomerases definidas acima e que compreendem uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos em comparação com a xilose isomerase de ocorrência natural correspondente, mas que estão dentro dos limites de identidade ou similaridade como definido aqui. A sequência de nucleotídeos da invenção codifica uma xilose isomerase, a sequência de aminoácidos dos quais, pelo menos, compreende em cada uma das posições invariáveis (que são indicadas na Tabela 2 com um *) , o aminoácido presente na posição invariável. De preferência, a sequência de aminoácidos também compreende nas posições fortemente conservadas (que estão indicadas na Tabela 2 com um um dos aminoácidos presentes em uma posição fortemente conservada. Mais preferivelmente, a sequência de aminoácidos também compreende também nas posições menos fortemente conservadas (que estão indicadas na Tabela 2 com um .) um dos aminoácidos presentes em uma posição menos conservada. É improvável que as substituições de aminoácidos foram dessas posições invariáveis e conservadas afetem a atividade da xilose isomerase. Além disso, até à data, uma vasta quantidade de sequências de aminoácidos de xilose isomerases são conhecidas na técnica e adicionam-se continuamente novas. Os alinhamentos de sequências da SEQ ID NO: 18 e as sequências de xilose isomerase da invenção com estas
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36/86 sequências de aminoácidos de xilose e isomerase indicarão mais regiões conservadas e posições de aminoácidos, cuja conservação é importante para a estrutura e atividade enzimática.
[0061] A sequência nucleotidica codifica uma xilose isomerase que é preferencialmente expressa na forma ativa na célula hospedeira. Assim, a expressão da sequência nucleotidica na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com uma atividade especifica de pelo menos 10 de atividade de xilose isomerase por mg de proteína a 25°C, de preferência pelo menos 20, 25, 30, 50, 100, 200 ou 300 U por mg a 25°C. A atividade específica da xilose isomerase expressa na célula hospedeira aqui definida como a quantidade de unidades de atividade de xilose isomerase por mg de proteína do lisado sem células da célula hospedeira, por exemplo, um lisado livre de células de levedura. A determinação da atividade de xilose isomerase, quantidade de proteína e preparação do ligado livre de células é como descrito nos Exemplos. De preferência, a expressão da sequência nucleotidica na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com um Km para a xilose que é inferior a 50, 40, 30 ou 25 mM, mais preferencialmente, o Km para a xilose é de cerca de 20 mM ou menos.
[0062] A sequência de nucleotídeos codifica uma xilose isomerase que preferivelmente tem sensibilidade reduzida à
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37/86 inibição pelo xilitol. Preferivelmente, a xilose isomerase apresenta menos inibição por xilitol do que a isomerase de Piromyces (SEQ ID NO: 18), mais preferencialmente a xilose isomerase mostra menos inibição por xilitol do que a isomerase de C. phytofermentans (SEQ ID NO: 17). A sequência de nucleotídeos assim codifica uma xilose isomerase de um modo preferido que tem uma constante aparente de inibição Ki que é superior a 4,6, xilitol 5, 10, 14,51, 15 mM. A sensibilidade à inibição pelo xilitol e a constante de inibição aparente Ki para o xilitol pode ser determinada como descrito em (11).
[0063] As sequências nucleotídicas da invenção, que codificam polipeptídeos com atividade de xilose isomerase, podem ser obtidas a partir de genômico e/ou DNAc de uma bactéria que pertence a um filo, classe, ordem, família ou gero como descrito acima, utilizando o modo para isolamento de sequências nucleotídicas que são bem conhecidos na técnica per se (ver por exemplo Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). As sequências nucleotídicas da invenção são, por exemplo, obtidos em um processo em que a) primers de PCR degenerados (tais como os nas SEQ ID NOs 19 e 20) são utilizados em genômico e/ou cDNA de um organismo adequado (por exemplo, uma bactéria como indicado acima) para gerar
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38/86 um Fragmento de PCR compreendendo parte das sequências nucleotidicas que codificam os polipeptideos com atividade de xilose isomerase, b) o fragmento de PCR obtido em a) é utilizado como sonda para pesquisar um DNAc e/ou biblioteca genômica do organismo e c) produção de um DNAc ou ge DNA normal que compreende a sequência nucleotidica que codifica um polipeptideo com atividade de xilose isomerase.
[0064] Para aumentar a probabilidade de a xilose isomerase ser expressa em níveis suficientes e na forma ativa nas células hospedeiras da invenção, a sequência nucleotidica que codifica estas enzimas, bem como outras enzimas da invenção (ver abaixo), são preferencialmente adaptadas para otimizar seu uso de códon ao da célula hospedeira em questão. A adaptabilidade de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima para a utilização de códons de uma célula hospedeira pode ser expressa como o índice de adaptação códon (CAI). O índice de adaptação de códons é aqui definido como uma medida da adaptabilidade relativa da utilização de códons de um gene para a utilização de códons de genes altamente expressos em uma célula ou organismo hospedeiro particular. A adaptabilidade relativa (w) de cada códon é a razão entre o uso de cada códon e o códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como a média geométrica desses valores relativos de adaptabilidade. Códons não sinônimos e códons de
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39/86 terminação (dependentes do código genético) são excluídos. Os valores de CAI variam de 0 a 1, com valores mais altos indicando uma proporção maior dos códons mais abundantes (ver Sharp e Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; ver também: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res 31 (8) : 2242-51). Uma sequência de nucleotídeos adaptada tem de preferência um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9. As mais preferidas são as sequências que foram codificadas para expressão em células de S. cerevisiae,
conforme listado nas SEQ ID NOs: 21- -34, das quais SEQ ID
NOs: 27, 28 e 30 são preferidas, e SEQ ID NO: 28 é mais
preferido •
[0065] A célula hospedeira a ser transformada com um
construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase da invenção é de preferência um hospedeiro microbiano eucariota, mais preferencialmente uma célula hospedeira fúngica, tal como uma levedura ou uma célula hospedeira de fungo filamentoso. De preferência, a célula hospedeira é uma célula cultivada. A célula hospedeira da invenção, de preferência, é um hospedeiro capaz de transporte de pentose (xilose e de preferência também arabinose), ativo ou passivo, para dentro da célula. A célula hospedeira contém preferivelmente glicólise ativa. A célula hospedeira pode conter ainda de preferência uma via das pentoses fosfato endógena e pode
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40/86 conter atividade de xilulose quinase endógeno de modo que xilulose isomerizado a partir de xilose podem ser metabolizados em piruvato. O hospedeiro contém ainda preferencialmente enzimas para conversão de uma pentose (preferivelmente através de piruvato) em um produto de fermentação desejado tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas. Uma célula hospedeira particularmente preferida é uma célula hospedeira que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, de preferência, fermentação alcoólica anaeróbica. A célula hospedeira preferencialmente tem ainda uma alta tolerância ao etanol, uma alta tolerância ao pH baixo (isto é, capaz de crescer em pH menor que 5, 4 ou 3) e para ácidos orgânicos como ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico e açúcar produtos de degradação, tais como furfural e hidroxi-metilfurfural, e uma alta tolerância a temperaturas elevadas. Qualquer uma destas características ou atividades da célula hospedeira pode estar naturalmente presente na célula hospedeira ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética, preferencialmente por auto-clonagem ou pelos modos da invenção descritos abaixo. Uma célula adequada é uma célula cultivada, uma célula que pode ser cultivada no processo de
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41/86 fermentação, por exemplo, em fermentação submersa ou em estado sólido. Células particularmente adequadas são microrganismos eucarióticos como, por exemplo, os fungos, no entanto, mais adequados para utilização na presente invenção são leveduras ou fungos filamentosos.
[0066] As leveduras são aqui definidas como microrganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Leveduras: características e identificação, JA Barnett, RW Payne, D. Yarrow, 2000, 3a ed., Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido; e, As leveduras, um estudo taxonômico, CP Kurtzman e JW Fell (eds) 1998, 4a ed., Elsevier Science Publ. BV, Amsterdã, Holanda) que crescem predominantemente em forma unicelular. As leveduras podem crescer por brotamento de um talo unicelular ou podem crescer por fissão do organismo. As leveduras preferidas como células hospedeiras pertencem aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromycesr Cândida , Pichia, Schízosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanníomyces, Yarrowía, Kazachstanía e Naumovía. As espécies de leveduras preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. exigus, S. bayanus, K. lactis, K. marxíanus e Schízosaccharomyces pombe.
[0067] De preferência, a célula de levedura da invenção é uma célula de levedura que é naturalmente capaz de fermentação anóxica, mais preferencialmente fermentação
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42/86 alcoólica e mais preferencialmente fermentação alcoólica anóxica. Ao longo dos anos, sugestões foram feitas para a introdução de vários organismos para a produção de bioetanol a partir de açúcares de colheita. Na prática, no entanto, todos os principais processos de produção de bioetanol continuaram a utilizar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtor de etanol. Isto é devido às muitas características atrativas das espécies de Saccharomyces para processos industriais, isto é, uma elevada capacidade de crescimento anaeróbico, tolerante a ácidos, etanol e osmotolerância e, claro, a sua elevada capacidade fermentativa alcoólica. Mais preferivelmente, portanto, uma célula hospedeira de levedura da invenção pertence a uma espécie selecionada do grupo consistindo de Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus, S. bulderi, S. cervazzii, S. caríocanus, S. castellíí, S. daírenensís, S. exíguus. , S. kluyverí , S. kudríazevíí, S. míkatae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. turícensís e S. unísporus (Kurtzman, 2003, supra; e JA Barnett, RW Payne, D. Yarrow, 2000, supra) . De preferência, a célula de levedura da presente invenção é uma cepa de levedura industrial ou uma cepa de levedura derivado da cepa de levedura industrial. As linhagens de leveduras industriais são geralmente diploides, poliploides ou aneuplóides e possuem capacidade comprovada para aplicação em fermentação industrial em larga escala. As cepas de
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43/86 levedura industrial adequadas incluem, por exemplo, as linhagens comerciais leveduras Gert Strand Turbo, Alltech SuperStart™, Fermiol Super HA™, Thermosacc™ e Ethanol Red™. São também adequadas células de levedura derivadas de qualquer uma destas cepas por modificações como aqui descritas.
[0068] Os fungos filamentosos são aqui definidos como microrganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumicotina. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetative composto por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetative por fungos filamentosos é por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono da maioria dos fungos filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Fungos filamentosos preferidos como células hospedeiras pertencem aos gêneros Aspergillusr Trichodermar Humicola, Acremonium, Fusarium e Penicillium.
[0069] Em uma célula hospedeira da invenção, a sequência nucleotidica que codifica a xilose-isomerase como definida acima está, de preferência, operacionalmente ligada a um promotor que causa expressão suficiente das sequências nucleotidicas na célula para conferir à célula a capacidade de converter xilose em xilulose. Mais preferivelmente, o
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44/86 promotor provoca expressão suficiente das sequências nucleotidicas para conferir à célula a capacidade de crescer em xilose como única fonte de carbono e/ou energia, mais preferencialmente sob condições anaeróbicas. Os promotores adequados para expressão da sequência nucleotidica, como definida acima, incluem promotores que são insensíveis repressão de catabolite (glicose) e/ou que não requerem xilose para indução. Promotores com estas características estão amplamente disponíveis e são conhecidos do especialista. Exemplos adequados de tais promotores incluem por exemplo, promotores de genes glicólicos tais como a fosfofrucoquinase (PPK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeo-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK), glicose-6-fosfato promotores do promotor de isomerase (PGI1) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes sobre tais promotores de levedura podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são os promotores de genes que codificam a proteína ribossômica, o promotor do gene da lactase (LAC4), promotores da álcool desidrogenase (ADH1, ADH4 e semelhantes), o promotor da enolase (ENO), o promotor transportador da hexose (glicose) (HXT7) e o promotor do citocromo cl (CYC1). Outros promotores, tanto constitutivos e induzíveis, potenciadores e ou sequências ativadoras a montante serão conhecidos dos peritos na técnica. De um modo
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45/86 preferido, o promotor que está operacionalmente ligado à sequência nucleotidica como definida acima é homólogo à célula hospedeira.
[0070] Em uma célula hospedeira da invenção, a sequência nucleotidica que codifica a xilose-isomerase como definida acima é preferivelmente expressa a partir de um construto de expressão em que a sequência de codificação está operativamente ligada a um promotor como definido acima. Um construto de expressão em uma célula hospedeira da invenção pode estar presente em um plasmideo, de preferência um plasmideo multicópia. No entanto, mais preferencialmente o construto de expressão é integrada no genoma da célula hospedeira. De preferência, a célula hospedeira compreende múltiplas cópias do construto de expressão integrada no seu genoma. Mais preferencialmente, as múltiplas cópias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ou mais cópias) do construto de expressão estão integradas em mais do que uma, por exemplo, pelo menos dois locais genômicos ou cromossômicos diferentes no genoma da célula hospedeira. Uma localização cromossômica preferida para a integração de um construto de expressão no genoma de uma célula hospedeira da invenção é uma região intergênica, v.g. a região intergênica a jusante de TYE7 e a montante do gene de tRNA tP (UGG) 03 no cromossomo XV. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um diploide, célula hospedeira poliploide ou aneuploidia. De preferência,
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46/86 na célula hospedeira diploide, poliploide ou aneuplóide, o construto de expressão está presente em uma localização cromossômica que está presente em pelo menos duas cópias no genoma da célula. Opcionalmente, mais de uma cópia em tandem, por exemplo, duas cópias, do construto de expressão é integrada em uma localização genômica ou cromossômica.
[0071] Em uma modalidade, uma célula hospedeira da invenção compreende mais de um tipo diferente de sequência nucleotidica que codifica, por exemplo, pelo menos duas xilose isomerases diferentes como definido acima, ou por exemplo, codificando xilose isomerases como definido acima em combinação com qualquer outra xilose isomerase, por exemplo, uma xilose isomerase já conhecida na técnica.
[0072] A célula hospedeira da invenção compreende ainda, de um modo preferido, atividade de xilulose quinase, de modo a que a xilulose isomerizada da xilose possa ser metabolizada em piruvato. De preferência, a célula contém atividade de xilulose quinase endógena. Mais preferivelmente, uma célula da invenção compreende uma modificação genética que aumenta a atividade especifica da xilulose quinase. De preferência, a modificação genética faz com que a superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo por superexpressão de uma sequência nucleotidica que codifica uma xilulose quinase. O gene que codifica a xilulose quinase pode ser endógeno à célula ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à
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47/86 célula. Uma sequência de nucleotídeos que pode ser utilizado para a superexpressão de xilulose quinase nas células da invenção é, por exemplo, o gene da xilulose quinase de S. cerevisiae (XKS1) como descrito por Deng e Ho (1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199). Outra xilulose quinase preferida é uma xilose quinase que está relacionada com a xilulose quinase de Piromyces (xylB; ver documento WO 03/0624430). Esta xilulose quinase de Piromyces está, na verdade, mais relacionada com a quinase procariótica do que com todas as quinases eucarióticas conhecidas, tais como a quinase de levedura. As xilulose quinases eucarióticas têm sido indicadas como quinases de açúcar não-específicos, que têm uma ampla gama de substratos que inclui xilulose. Em contraste, as xilulose quinases procarióticas, às quais a Piromyces quinase está mais intimamente relacionada, têm sido indicadas como quinases mais específicas para a xilulose, isto é, possuindo um intervalo de substrato mais estreito. Nas células da invenção, uma xilulose quinase a ser superexpressada é a superexpressão por pelo menos um fator 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética que causa a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar-se ao nível estacionário da atividade da enzima, ao nível estacionário da proteína da enzima bem como ao nível estacionário do
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48/86 transcrito que codifica para a enzima.
[0073] Uma célula da invenção compreende adicionalmente de preferência uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose fosfato tal como descrito no documento WO 06/009434. Em particular, a modificação genética provoca um aumento no fluxo da via não-oxidativa das pentoses fosfatas. Uma modificação genética que provoca um fluxo aumentado da parte não oxidativa da via das pentoses fosfato é aqui entendida como significando uma modificação que aumenta o fluxo em pelo menos um fator 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 quando comparado ao fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética que causa o aumento do fluxo. O fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses fosfato pode ser medido como descrito em WO 06/009434 .
[0074] Modificações genéticas que aumentam o fluxo da via das pentoses fosfato pode ser introduzidas nas células da invenção de várias maneiras. Estes incluindo, por exemplo, atingir níveis de atividade de estado estacionário mais elevados de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da via não-oxidativa das pentoses fosfato e/ou um nível de estado estacionário reduzido de atividade inespecífica da redutase da aldose. Estas alterações nos níveis de atividade de estado estacionário podem ser efetuadas por seleção de mutantes espontâneos (ou induzida por produtos químicos ou
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49/86 radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente, de genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam esses genes.
[0075] Em uma célula preferida da invenção, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo menos uma enzima da via (não oxidativa) das pentoses fosfato. De um modo preferido, a enzima é selecionada do grupo consistindo das enzimas que codificam para a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase. Várias combinações de enzimas da via (não oxidativa) das pentoses fosfato podem ser superexpressas. Em uma modalidade da invenção, cada uma das enzimas ribulose5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase é superexpressa na célula da invenção.
[0076] Existem vários meios disponíveis na técnica para a superexpressão de enzimas nas células da invenção. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa pelo aumento do número de cópias do gene que codifica para a enzima na célula, através da integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula, através da expressão do gene a partir de um vetor de expressão de múltiplas cópias epissomais ou através da introdução de um vetor de expressão epissômico que compreende múltiplas cópias do gene. A sequência de
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50/86 codificação utilizada para a superexpressão das enzimas é preferencialmente homóloga à célula hospedeira da invenção. No entanto, as sequências codificadoras que são heterólogas à célula hospedeira da invenção pode ser igualmente aplicadas.
[0077] Alternativamente, a superexpressão de enzimas nas células da invenção pode ser conseguida utilizando um promotor que não é nativo da sequência codificadora da enzima a ser expressa em excesso, isto é, um promotor que é heterólogo à sequência codificadora à qual está operativamente ligado. Embora o promotor seja preferencialmente heterólogo à sequência de codificação à qual está operativamente ligado, também é preferido que o promotor seja homólogo, isto é, endógeno à célula da invenção. De preferência, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível estacionário mais elevado do transcrito compreendendo a sequência de codificação (ou é capaz de produzir mais moléculas transcritas, isto é, moléculas de RNAm, por unidade de tempo) do que o promotor que é nativo da sequência de codificação preferencialmente sob condições em que xilose ou xilose e glicose estão disponíveis como fontes de carbono, mais preferencialmente como fontes principais de carbono (isto é, mais de 50% da fonte de carbono disponível consiste em xilose ou xilose e glicose), mais preferencialmente como únicas fontes de carbono.
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Promotores adequados neste contexto incluem promotores como descrito acima para expressão das sequências nucleotidicas que codificam as xilose isomerases como definidas acima.
[0078] Uma outra célula preferida da invenção compreende uma modificação genética que reduz a atividade da aldoseredutase inespecifica na célula. De um modo preferido, a atividade da aldose-redutase não especifica é reduzida na célula hospedeira através de uma ou mais modificaes genicas que reduzem a expressão de ou inativa um gene que codifica uma aldose redutase inespecifica. De preferência, as modificações genéticas reduzir ou inativar a expressão de cada cópia endógena de um gene que codifica uma aldose redutase inespecifica que é capaz de reduzir uma aldopentose, incluindo, xilose, xilulose e arabinose, no genoma da célula. Uma determinada célula pode compreender múltiplas cópias dos genes que codificam a aldose redutase inespecifica como um resultado de di-, poli- ou aneuploidia, e/ou uma célula pode conter vários diferente (iso) enzimas com atividade de redutase de aldose que diferem na sequência de aminoácidos e que são cada um codificado por um gene diferente. Também em tais casos preferencialmente a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase inespecifica é reduzida ou inativada. De um modo preferido, o gene é inativado por deleção de pelo menos uma parte do gene ou por disrupção do gene, de modo que, neste contexto, o termo gene inclui também
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52/86 qualquer sequência não codificante a montante ou a jusante da sequência de codificação, a (parcial) deleção ou inativação dos quais resulta em uma redução da expressão de atividade inespecifica da redutase da aldose na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma redutase da aldose, cuja atividade é para ser reduzido na célula das sequências de invenção e de aminoácidos de tais redutases de aldose são descritos em WO 06/009434 e incluem, por exemplo, os genes (inespecíficos) redutase de aldose do gene GRE3 de S. cerevisiae (Trãff et al. , 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67: 5668-5674) e seus ortólogos noutras espécies.
[0079] Uma célula hospedeira da invenção compreende ainda, de preferência, pelo menos uma modificação genética que resulta em uma característica selecionada do grupo que consiste em: a) tolerância aumentada ao etanol; b) aumento da tolerância ao ácido acético; c) produção reduzida de glicerol; d) aumento da xilose para a taxa de fermentação alcoólica; e e) aumento da tolerância ao calor.
[0080] A modificação genética que resulta no aumento da tolerância ao etanol é preferivelmente uma modificação como por exemplo descritos nos documentos WO 2012/175552 e WO 2014/170330, tais como, por exemplo, uma modificação que introduz alelos de um ou mais ADE1, KIN3, MKT1 e VPS70 que conferem maior tolerância ao etanol, e/ou uma modificação
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53/86 que superexpressa um gene SWS2 do tipo selvagem e/ou que inativa o gene APJ1, que também confere aumento tolerância ao etanol.
[0081] A modificação genética que resulta no aumento da tolerância de ácido acético é de preferência uma modificação como por exemplo descrito em WO 2015/181169 e WO 2016/083397, tal como, por exemplo, uma modificação que introduz um alelo de um ou mais dos genes GLO1, DOT5, CUP2 e HAA1 que confere maior tolerância ao ácido acético.
[0082] A modificação genética que resulta na redução da produção de glicerol, de preferência, é uma modificação como por exemplo descrito em WO 2014/048863, tal como, por exemplo, uma modificação que introduz um gene SSK1 mutante que codifica uma proteína truncada sskl.
[0083] A modificação genética que resulta em um aumento da taxa de fermentação de xilose para etanol é preferivelmente uma modificação como por exemplo descrito no documento WO 2015/086805, tal como, por exemplo, uma modificação que introduz um alelo do gene NNK1 que confere uma xilose aumentada à taxa de fermentação do etanol.
[0084] A modificação genética que resulta no aumento da tolerância ao calor é preferencialmente uma modificação como, por exemplo, descrito no documento WO 2014/090930, tal como, por exemplo, uma modificação que introduz a superexpressão de pelo menos um de um gene que codifica a
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54/86 proteína Prp42 e um gene que codifica a proteína Smd2.
[0085] Uma célula hospedeira preferida da invenção é uma célula hospedeira que é melhorada em pelo menos um fenótipo industrialmente relevante por engenharia evolucionária. A engenharia evolutiva é um processo em que os fenótipos industrialmente relevantes de um microrganismo, aqui a levedura, podem ser acoplados à taxa de crescimento específica e/ou à afinidade por um nutriente, por um processo de seleção natural de configuração racional. Engenharia Evolutiva é, por exemplo, descrito em detalhe em Çakar et al. (2011, FEMS Yeast Research 12: 171-182) . De preferência, a taxa de utilização da D-xilose da célula hospedeira é melhorada pela engenharia evolutiva. A melhoria da taxa de utilização de D-xilose de células hospedeiras de levedura por engenharia evolutiva é descrita em detalhe por Demeke et al. (12, 15 e 16) .
[0086] Em uma célula hospedeira preferida de acordo com a invenção, o construto de ácido nucleico confere à célula hospedeira a capacidade de crescer em xilose como fonte de
carbono/energia, de preferência como única fonte de
carbono/energia e preferencialmente sob condições
anaeróbicas, isto é, condições como aqui defini das abaixo
para o processo de fermentação anaeróbica. De preferência, quando crescido em xilose como fonte de carbono/energia, o hospedeiro transformado essencialmente n produz xilitol, por
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55/86 exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou, por exemplo, menos de 5, 2, 1, 0,5 ou 0,3% do carbono consumido em uma base molar.
[0087] Uma célula hospedeira da invenção preferivelmente tem a capacidade de crescer em xilose como única fonte de carbono/energia a uma taxa de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 tu1 sob condições aeróbicas, ou, mais preferencialmente, a uma taxa de pelo menos 0, 005, 0, 01, 0, 02, 0, 05, 0, 08, 0, 1, 0, 12, 0, 15 ou 0,2 tu1 sob condições anaeróbicas. Uma célula da invenção preferencialmente tem a capacidade de crescer em uma mistura de glicose e xilose (em uma proporção em peso de 1: 1) como única fonte de carbono/energia a uma taxa de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0 , 25 ou 0,3 tu1 sob condições aeróbicas, ou, mais preferencialmente, a uma taxa de pelo menos 0, 005, 0, 01, 0, 02, 0, 05, 0, 08, 0, 1, 0, 12, 0, 15 ou 0,2 tu1 sob condições anaeróbicas. Assim, em uma célula hospedeira preferida de acordo com a invenção, o construto de ácido nucleico confere à célula hospedeira a capacidade de fermentar anaerobicamente a xilose como única fonte de carbono em um processo em que, em última análise, o piruvato é utilizado como elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação como etanol, ácido lático, ácido 3hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol,
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56/86 etileno, glicerol, ácido butirico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas.
[0088] De um modo preferido, uma célula da invenção tem uma taxa de consumo de xilose específica de pelo menos 200, 300, 400, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg h-1 (g de peso seco) -1. De um modo preferido, uma célula da invenção tem um rendimento de produto de fermentação (tal como etanol) em xilose que pelo menos 20, 40, 50, 60, 80, 90, 95 ou 98% do rendimento da célula de produto de fermentação (tal como etanol) em glicose. Mais preferencialmente, o rendimento da célula hospedeira modificada do produto de fermentação (tal como etanol) na xilose é igual ao rendimento da célula hospedeira do produto de fermentação (tal como etanol) na glicose. Do mesmo modo, o rendimento de biomassa da célula hospedeira modificada em xilose é de preferência pelo menos 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 ou 98% do rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. Mais preferencialmente, o rendimento de biomassa da célula hospedeira modificada em xilose é igual ao rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. É entendido que, na comparação dos rendimentos em glicose e xilose, ambos os rendimentos são comparados em condições aeróbicas ou ambas em condições anaeróbicas.
[0089] Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação
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57/86 selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3 propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas. 0 processo compreende preferencialmente as etapas de: a) fermentar um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula como aqui definido acima, em que a célula fermenta xilose no produto de fermentação e, opcionalmente, b) recuperação do produto de fermentação.
[0090] Além de uma fonte de xilose, a fonte de carbono no meio de fermentação pode também compreender uma fonte de glicose. O especialista apreciará ainda que o meio de fermentação pode ainda compreender também outros tipos de hidratos de carbono, tais como, por exemplo, em particular uma fonte de arabinose. As fontes de xilose e glicose podem ser xilose e glicose como tal (isto é, como açúcares monoméricos) ou podem estar na forma de qualquer oligo- ou polímero de hidrato de carbono compreendendo unidades de xilose e/ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanas, celulose, amido e semelhantes. Para libertação de unidades de xilose e/ou glicose a partir desses hidratos de carbono, podem ser adicionadas carboidrases apropriadas (tais como xilanases, glucanases, amilases, celulases,
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58/86 glucanases e semelhantes) ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excretar essas carboidrases. Uma vantagem adicional da utilização de fontes de glicose oligo ou poliméricas é que permite manter uma concentração baixa de glicose livre durante a fermentação, e utilizando quantidades limitantes de taxa das carboidrases preferivelmente durante a fermentação. Isso, por sua vez, impedirá a repressão dos sistemas necessários para o metabolismo e o transporte de açúcares não-glicidicos, como a xilose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta a xilose e a glicose, de preferência simultaneamente, caso em que preferencialmente utilizada uma célula hospedeira modificada que insensível repressão da glicose para impedir o crescimento diauxico. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá ainda o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. Composições de meios de fermentação para o crescimento de microrganismos eucarióticos tais como
leveduras e fungos filamentosos são bem conhecidos na
técnica.
[0091] 0 processo de fermentação pode ser um processo de
fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de
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59/86 fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente não é consumido oxigênio, preferencialmente menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, mais preferencialmente 0 mmol/l/h (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável) e em que as moléculas orgânicas servem como aceitadores de elétrons e doadores de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e na formação de biomassa, não pode ser oxidado pela fosforilação oxidativa. Para resolver este problema, muitos microrganismos utilizam piruvato ou um dos seus derivados como um aceitador de elétrons e hidrogênio, regenerando assim o NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbico preferido, o piruvato é utilizado como elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação como o etanol, bem como produtos de fermentação não-etanol como ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, acrílico ácido, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas. Os processos anaeróbicos da invenção são preferidos aos processos aeróbicos, porque os processos anaeróbicos não requerem investimentos e energia para a aeração e, além disso, os processos anaeróbicos produzem rendimentos mais altos do produto do que os
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60/86 processos aeróbicos. Alternativamente, o processo de fermentação da invenção pode ser executado sob condições limitadas de oxigênio aeróbico. De preferência, em um processo aeróbico em condições limitadas pelo oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferivelmente de pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente de pelo menos 7 mmol/L/h.
[0092] O processo de fermentação é de preferência executado a uma temperatura que é ótima para as células modificadas da invenção. Assim, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura inferior a 42 °C, de preferência inferior a 38 °C. Para leveduras ou células fúngicas filamentosas, o processo de fermentação é preferencialmente realizado a uma temperatura inferior a 35, 33, 30 ou 28 °C e a uma temperatura superior a 20, 22 ou 25°C. Para algumas espécies, como Kluyveromyces marxianus, e cepas de Saccharomyces cerevisiae manipuladas, o processo de fermentação pode ser executado a
temperaturas consideravelmente mais elevadas, isto é, a 42
°C, 43 °C, ou preferencialmente entre 45 e 50 °C, ou em casos
raros entre 50 e 55 °C.
[0093] De preferência, nos processos de fermentação da
invenção, as células mantêm estavelmente as construções de
ácido nuclei co que conferem à célula a capacidade de
isomerizar a xilose em xilulose e, opcionalmente, converter
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61/86 a arabinose em 5-fosfato de D-xilulose. De preferência, no processo, pelo menos 10, 20, 50 ou 75% das células retêm as capacidades de isomerização de xilose em xilulose e, opcionalmente, conversão de arabinose em 5-fosfato de Dxilolose após 50 gerações de crescimento, de preferência sob condições de fermentação industrial.
[0094] Um processo de fermentação preferido de acordo com a invenção é um processo para a produção de etanol, em que o processo compreende as etapas de: a) fermentar um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula como definido acima, pelo que a célula fermenta xilose e opcionalmente b) recuperação do etanol. O meio de fermentação pode ainda ser realizado como descrito acima. No processo, a produtividade volumétrica de etanol é de preferência pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose no processo é preferivelmente de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98%. O rendimento em etanol é aqui definido como uma percentagem do rendimento máximo teórico, que para xilose e glicose é de 0,51 g etanol por g xilose ou glicose.
[0095] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo compreender e suas conjugações é usado em seu sentido não limitativo para significar que itens seguindo a palavra estão incluídos, mas itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo
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62/86 indefinido a ou an não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um e apenas um dos elementos. 0 artigo indefinido a ou an normalmente significa pelo menos um.
[0096] Todas as referências de patente e literatura citadas na presente especificação são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[0097] Os exemplos seguintes são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção de qualquer forma.
Breve descrição dos desenhos [0098] Figura 1. Desempenho de fermentação de xilose da cepa Μ315ΟρΧΙΔ/ΟρΧΙΔ expressando um plasmídeo contendo um dos primeiros 7 genes XylA. O código indicando a origem bacteriana dos genes XylA é explicado na Tabela 1. A fermentação foi realizada em duplicado usando dois transformantes independentes a uma densidade celular inicial de Ig DW/L em 50mL de meio YP contendo 4% de xilose a 35 °C. O valor médio é mostrado no gráfico. A produção de CO2 foi estimada medindo a perda de peso durante a fermentação.
[0099] Figura 2. Desempenho da fermentação de xilose da cepa Μ315ΟρΧΙΔ/ΟρΧΙΔ Expressando um plasmídeo com um dos 11 genes XylA. O código indicando a origem bacteriana dos genes XylA é explicado na Tabela 1. A fermentação foi realizada
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63/86 utilizando densidade celular inicial de Ig DW/L em 45 mL de meio YP contendo 4% de xilose a 35 °C. A produção de CO2 foi estimada medindo a perda de peso durante a fermentação.
[00100] Figura 3. Integração dos genes XylA no genoma.
[00101] A) Método de integração usando a metodologia CRISPR/Cas9 no cromossomo XV entre TYE7 e tp (UGG) 03. As setas indicadas por gl e g2 são locais de gRNA onde Cas9 faz uma quebra de fita dupla nos cromossomos, guiada por dois locais de corte de gRNA em um único plasmideo de RNA guia. Um DNA de doador baseado em plasmideo (pDonor) continha duas sequências Xyl e XII e XI2 flanqueadas pelas sequências H1 e H2 que são homólogas ao local de integração para suportar a recombinação homólogo.
[00102] B) Imagem de eletroforese em gel de PCR realizada para verificar a inserção adequada dos genes XylA no genoma usando dois primers que flanqueiam as sequências homólogas Hl e H2 [mostradas como prFw (GY94) e prRv (GY95)] na parte inferior do painel A. A inserção de uma única cópia de XylA em ambos os alelos do cromossomo produziu um produto de PCR de cerca de 3kb (por exemplo, Lane CpXI 1, 2 e 5), enquanto a inserção de duas cópias em ambos os alelos resultou em um produto de PCR de 5kb (por exemplo, Lane CpXI 3 e 6) . Esperase que a ausência de uma inserção de XylA produza uma banda de PCR de cerca de 1,6 Kb de banda, que é o tamanho da banda de PCR obtida para a cepa de controle T18.
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64/86 [00103] Figura 4. Desempenho de fermentação de xilose das cepas baseadas em GSE16-T18CpXIA/CpXIA Após a integração genética de diferentes genes XylA. O código que indica a origem bacteriana dos genes XylA é explicado na Tabela 1. Para cada gene XylA, foram selecionadas duas cepas contendo 2 ou 4 cópias. A fermentação foi realizada utilizando densidade celular inicial de Ig DW/L em 50 mL de meio YP contendo 4% de xilose a 35 °C. A produção de CO2 foi estimada medindo a perda de peso durante a fermentação.
[00104] Figura 5. A) Desempenho de fermentação de xilose das cepas baseadas em MDS130 com integração genômica de diferentes genes XylA como indicado. O código que indica a origem bacteriana dos genes XylA é explicado na Tabela 1. B) Comparação direta do desempenho da fermentação da xilose da cepa MDS130 com a cepa MDC5.
Exemplos
Exemplo 1
Introdução [00105] Apesar da vasta informação sobre sequências de xilose isomerases em bancos de dados de sequências públicas, apenas alguns foram funcionalmente expressos em leveduras. Um gargalo pode ser devido a diferenças nos mecanismos de regulação da síntese de proteínas entre procariotas e eucariotos. A síntese de proteínas bacterianas em leveduras pode não ser adequadamente regulada, o que podería ser a
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65/86 razão para a ocorrência frequente de proteínas inativas ou insolúveis. Estudos mostraram que a expressão adequada de um gene não se correlaciona necessariamente com a atividade enzimática adequada (13). Na maioria das cepas que expressam XylA, alta atividade enzimática de XI e capacidade de fermentação de xilose adequada foi observada somente após a adaptação evolutiva da cepa hospedeira, indicando que existem outros mecanismos regulatórios necessários para o bom funcionamento das enzimas XI e para sua conexão adequada com as outras enzimas da via de fermentação da levedura (11,12). Embora os mecanismos regulatórios não sejam bem compreendidos, certas alterações genéticas são requeridas pelo hospedeiro recombinante para a atividade XI adequada. Esta falta de uma cepa de levedura adequada como hospedeira da expressão funcional, por sua vez, dificulta o rastreio de potenciais Xis que podem estar ativos em um hospedeiro apropriado, mas não em uma cepa de levedura regular.
[00106] Para superar o gargalo da ausência de uma cepa hospedeira adequada para a triagem de genes XI bacterianos ativos, desenvolvemos duas cepas de levedura que são capazes de crescer diretamente e fermentar eficientemente xilose após a expressão de um XI bacteriano. Estas cepas possuem a mesma linhagem de levedura industrial da cepa que expressou com sucesso o gene Clostridium phytofermentans XylA (CpXI) (12,15,16) . A primeira cepa M315_CpXIA/CpXIA Foi
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66/86 desenvolvida por deleção das duas cópias de CpXI do genoma da cepa M315. Esta cepa progenitora M315 foi desenvolvida por mutagênese aleatória de uma cepa industrial recombinante Ethanol Red, que continha duas cópias de CpXI e xiluloquinase (XKS1) e todos os genes da via das pentoses fosfato (PPP) foram superexpressos no cromossoma. A segunda cepa de plataforma GSE16-T18CpXI Δ/CpXIÚ Foi desenvolvida por deleção de todas as cópias do gene CpXI do cromossoma da cepa industrial de fermentação de xilose GSE16-T18, que continha 16 a 18 cias de CpXI. 0 GSE16-T18 foi desenvolvido a partir da linhagem M315 através de uma série de rodadas adaptativas evolutivas em meio sintético e em hidrolisado de lignocelulose. A eliminação de todas as cópias CpXI da cepa aboliu completamente o desempenho da fermentação da xilose. A reintrodução de xilose isomerase nestas cepas de plataforma restaurou a eficiência da capacidade de fermentação da xilose. Portanto, essas duas linhagens nos forneceram uma ferramenta útil para o rastreamento de potenciais genes XylA de diferentes fontes para expressão funcional em leveduras. Usando estas cepas de plataforma, nós pudemos selecionar vários genes XylA bacterianos para uma rápida capacidade de fermentação de xilose, o que resultou na identificação de vários genes que expressam xilose isomerase com desempenho superior.
Materiais e métodos
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Construção de plasmideos multi-cópias portadores de genes XylA [00107] Cada um dos 14 genes XylA bacterianos foi sintetizado em dois blocos de cerca de 700 pb com 30 pb de sobreposição entre si. Os dois fragmentos do gene gblock foram ligados por PCR utilizando um par de iniciadores, cada um com uma sequência de cauda de 30 pb para criar sobreposição à extremidade 5 'e 3' de um vetor linearizado p426tefl. O vetor p426tefl (Mumberg et al. , 1995, vetores de levedura para expressão controlada de proteína heteróloga em diferentes fundos genéticos. Gene, 156; 119-122) foi linearizado utilizando enzimas de restrição PstI e HindIII entre o promotor tefl e o terminador cycl. O fragmento de PCR e o vetor linearizado foram montados utilizando o kit de clonagem de conjuntos Gibson (New England BioLabs, EUA), e transformados em E. coli cepa ToplO quimicamente competente (Invitrogen). Os plasmideos foram subsequentemente isolados a partir da E. coli utilizando o kit NucleoSpin® Plasmid EasyPure (MACHEREY-NEGEL GMBH & CO. KG, Alemanha) . Os plasmideos isolados foram transformados na cepa hospedeira de levedura utilizando o método padrão LiAc/PEG (18).
Supressão de CpXI de GSE16-T18 [00108] A cepa GSE16-T18 transportou entre 16 e 18 cópias do gene CpXI que foi originalmente inserido em duas cópias, substituindo parte do gene PYK2 no cromossoma XV. O gene
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CpXI foi amplificado no locus cromossômico em múltiplas repetições em tandem durante uma etapa de engenharia evolutiva (15).
[00109] As múltiplas cópias dos genes XylA foram eliminadas usando uma metodologia baseada em CRISPR/Cas9. Primeiro, um plasmideo único transportando gRNA duas sequências alvo gRNA de ambos as extremidades dos genes xylA amplificados e um gene de resistência à higromicina hph foi construído. A seguir, dois fragmentos de DNA doador foram produzidos por amplificação por PCR de dois genes marcadores de seleção, o gene kan de resistência à canamicina e o marcador de resistência nourseotricina nat. Cada gene marcador foi flanqueado por sequências homólogas às sequências alvo de gRNA a montante e a jusante no genoma. Depois disso, a cepa GSE16-T18 foi transformada com um plasmideo Cas9 tendo um marcador de seleção de ble. A cepa GSE16-T18-Cas9 expressando Cas9 foi subsequentemente transformada com o plasmideo gRNA e os dois fragmentos de DNA-doador. Os transformantes foram selecionados apenas para o marcador hph no gRNA. Os transformantes positivos que expressam o marcador de resistência hph foram avaliados para a substituição efetiva das múltiplas cópias do gene XylA com os dois marcadores kan e NAT, tanto fenotipicamente e por PCR. Uma cepa que substituiu todos os Xyla cópias por um kan e um marcador nat foi selecionado, e os marcadores foram
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69/86 removidos subsequentemente por um outro CRISPR/passo cas9 usando um plasmideo gRNA que tem como alvo cada um dos marcadores e kan nat. Uma sequência de PYK2 completa flanqueada por sequências a montante e a jusante dos marcadores inseridos no genoma foi utilizada como um DNA doador para curar o gene PYK2 parcialmente deletado. A cepa final desprovida de qualquer gene CpXI e transportando o PYK2 inteiro foi referida como GSE16-T18CpXIA/CpXIA.
Otimização do método CRISPR/Cas9 para integração genômica dos genes XyiA [00110] A integração genômica de 2 a 4 cópias de cada um dos genes XylA foi realizada usando um sistema CRISPR/Cas9 otimizado. Primeiro, um DNA doador foi construído em um plasmideo multicópia contendo duas sequências XylA flanqueadas por sequências homólogas a sequências a montante e a jusante do sítio de integração para desencadear a recombinação homóloga. O DNA plasmídico doador (pDonor) foi transformado na cepa de levedura GSE16-T18CpXIA/CpXIA e selecionado diretamente em placas contendo xilose como uma fonte de carbono. As cepas transportadoras do plasmideo pDonor foram então transformadas com um plasmideo gRNA com o marcador hph e um plasmideo Cas9 com o marcador kan e selecionadas em geneticina e higromicina YPD +. Os transformantes que crescem na presença de ambos os marcadores de resistência a antibióticos foram transferidos para uma
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70/86 nova placa YPD para serem avaliados quanto integração correta do DNA doador no genoma. Isto foi realizado por PCR usando um par de iniciadores de tratamento a montante e a jusante do local de inserção. Uma vez que a inserção foi confirmada, as cepas perderam os plasmideos cultivando-as em meio YPD por 5 dias e então transferindo serialmente as cepas para uma nova placa YPD a cada 24h. Após 5 dias, espalhou-se uma amostra para colônias únicas e várias colônias foram avaliadas quanto à perda dos plasmideos gRNA e Cas9 contendo os marcadores hph e kan, respectivamente. As colônias que perderam ambos os plasmideos foram verificados por PCR para avaliar a perda do plasmideo doador uma vez que o plasmideo doador estava desprovido de marcador de seleção.
Fermentações de pequena escala [00111] Fermentações em pequena escala foram realizadas essencialmente de acordo com o protocolo descrito anteriormente (12) . Resumidamente, as células foram précultivadas em 5 ml de YPD durante 24 h. Posteriormente, Iml de cultura foi transferido para 50mL de YPD em um frasco Erlenmeyer de 300mL. Após 24h de crescimento, as células foram colhidas e uma quantidade de Ig DW/L de células foi inoculada em 50mL de meio YP contendo 4% p/v xilose como fonte de carbono, em tubos cilíndricos com rolha de borracha e tubos de vidro. As culturas foram continuamente agitadas com uma vareta magnética a 120 rpm e incubadas a 35 °C. O
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71/86 progresso das fermentações foi seguido pela medição do peso devido à perda de CO2 durante a fermentação.
Resultos
Triagem para sequências XI que suportam o crescimento de S. cerevisiae na xilose como única fonte de carbono [00112] Expressão em leveduras de Xis oriundas de várias espécies de bactérias tem sido relatada na última década. A maioria das enzimas não mostrou atividade enzimática razoável em S. cerevisiae. Apenas um número limitado de Xis com boa atividade enzimática está disponível até o momento. Como existe um grande número de sequências em bancos de dados públicos, como o NCBI, exploramos bancos de dados de sequências para pesquisar genes XylA originados em diversos ambientes. Selecionamos 16 sequências codificando para XI de 16 espécies bacterianas. As sequências variaram de 62% a 96% de identidade com a sequência de C. phytofermentans XylA (Tabela 1) e entre 50 e 55% da sequência de Piromyces sp E2 XylA ao nível dos aminoácidos.
[00113] Cada sequência foi codificada e sintetizada pelo IDT (Integrated DNA Technologies, Heverlee, Bélgica). Os genes com códons otimizados foram, subsequentemente, clonados em um vetor de levedura de expressão p426-TEFl, sob o controle do promotor TEF1 e Cycl terminador. Para comparação, também construímos um plasmídeo com o gene CpXI sob controle do mesmo promotor e terminador. Os plasmídeos
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72/86 construídos foram subsequentemente transformados na cepa de plataforma M315CpXIA/CpXIA.
[00114] Os transformantes foram selecionados em meio sintético contendo xilose como fonte de carbono (placa SCX). Após 5 dias a 30 °C, 7 dos 14 transformantes foram capazes de crescer na placa SCX. Mais tarde, 4 transformantes adicionais cresceram em colônias menores, após 7 dias, indicando que os genes desses 4 transformantes adicionais suportavam apenas o crescimento lento da xilose. No entanto, um total de 11 dos 16 genes testados foram capazes de suportar o crescimento em meio com xilose como única fonte de carbono.
Confirmação da expressão correta dos genes [00115] A fim de confirmar a presença do gene expresso na cepa hospedeira, a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando primers que amplificam especificamente cada gene. Como esperado, obteve-se um resultado de PCR positivo com o peso molecular esperado de 1,2 kb para todas as cepas testadas (dados não mostrados). As cepas de controle negativo M315CpXIA/CpXIA E M315CpXI falharam em mostrar uma banda de PCR, confirmando a especificidade do produto de PCR.
Fermentação em meio com xilose [00116] Uma vez que o crescimento e a fermentação são características diferentes e frequentemente não se
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73/86 correlacionam bem entre si, avaliamos todos os 11 transformantes XylA quanto ao desempenho da fermentação em meio YP contendo xilose como única fonte de carbono. Os primeiros 7 transformantes XylA foram testados em um primeiro lote de ensaios de fermentação. Curiosamente, todos os 7 transformantes XylA mostraram capacidade de fermentação rápida da xilose em meio YP contendo 4% de xilose (Figura 1) . Uma cepa controle com o gene CpXI também foi avaliada para comparação. Dois dos genes recém-isolados (Es7XI e CclOXI) mantiveram desempenho de fermentação de xilose semelhante ao da CpXI.
[00117] Subsequentemente, repetimos o teste de fermentação e incluímos os quatro transformantes XylA de crescimento lento. Como mostrado na Figura 2, todos os 11 transformantes foram capazes de fermentar muito bem a xilose. As 7 cepas mostrando fermentação rápida no primeiro teste de fermentação também mostraram o mesmo perfil de fermentação rápida. Além disso, duas cepas do segundo lote de crescimento lento (Es5XI e C111XI) mostraram um perfil de fermentação semelhante às primeiras 7 cepas de fermentação rápida. Portanto, 9 dos 11 transformantes foram capazes de suportar a capacidade de fermentação rápida da xilose em um fundo industrial de levedura.
[00118] Para confirmar que os transformantes XylA realmente não carregavam mais CpXI, que é capaz de suportar
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74/86 por si só alta capacidade de fermentação de xilose, nós testamos todas as culturas no final da fermentação por PCR usando primers específicos exclusivos para a sequência CpXI. Como esperado, nenhuma das culturas foi positiva para o gene CpXI, enquanto a cepa de controle que transporta o plasmideo CpXI foi positiva para a banda de peso molecular esperada (dados não mostrados).
Integração de genes XylA no genoma [00119] Uma vez que o número de cópias do plasmideo varia grandemente in vivo durante o crescimento ou fermentação, a seleção do gene mais ativo com base no desempenho da fermentação de cepas transportadoras de plasmídeos pode criar uma forte tendência. Além disso, os plasmídeos são instáveis e não são um sistema de expressão gênica ideal para aplicação industrial. Assim, realizamos a integração genômica de 3 dos 8 genes que suportam a melhor capacidade de fermentação da xilose e também o gene CpXI para comparação. A integração foi realizada no genoma de uma linhagem robusta de levedura de plataforma industrial GSE16T18CpXIA/CpXIA, utilizando um sistema CRISPR/Cas9 modificado que otimizamos para uma única etapa de transformação e para integração eficiente de genes estranhos em 2 a 4 cópias, como descrito na seção de métodos. Utilizando esta metodologia, conseguimos integrar de forma estável 2 a 4 cópias de cada um dos genes em uma região intergênica a
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75/86 jusante de TYE7 e a montante do gene tRNA tP (UGG) 03 no cromossoma XV. A integração adequada dos genes no genoma foi confirmada por PCR (Figura 3).
Desempenho de fermentação após a integração genômíca do XylA [00120] O desempenho de fermentação das cepas transportando 2 a 4 cópias de cada gene XylA foi avaliado em meio YP com xilose como única fonte de carbono. Como mostrado na Figura 4, as cepas que transportam o gene Es7XI, Cs8XI ou Fm9XI no genoma mostraram elevada capacidade de fermentação de xilose. As cepas transportando Cs8XI e Fm9XI mostraram desde o início uma taxa de fermentação de xilose comparável à da cepa transportando CpXI, enquanto a cepa portadora de Es7XI mostrou um atraso no início da fermentação, mas recuperou depois uma elevada taxa de fermentação de xilose. Embora a cepa com duas cópias de Cs8XI mostrasse uma taxa de fermentação de xilose um pouco mais lenta do que a cepa com duas cópias de CpXI, ela mostrou a maior taxa de fermentação durante a fase exponencial da fermentação (Figura 4). Além disso, as cepas com 4 cópias de Cs8XI fermentaram em uma taxa maior que a cepa com o mesmo número de cópias de CpXI.
Conclusão [00121] Onze dos 16 genes xylA recentemente identificados conferem um desempenho muito bom em xilose de fermentação de uma cepa de levedura industrial, quando expresso a partir de
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76/86 um plasmídeo de cópias múltiplas, sob o controle do promotor TEF1 e Cycl terminador. Exceto para o gene XylA obtido a partir de L. phytofermentans, que tem 96% de identidade de sequência com a de CpXI, todos os genes XylA expressos funcionalmente carecem de identidade de sequência significativa com qualquer das xilose isomerases que foram ativamente expressas a data. As espécies bacterianas das quais estes genes XylA foram obtidos são isolados de diversos ambientes. Embora a maioria das espécies habite ambientes ricos em matéria vegetal, o que explica sua capacidade celulolítica, a bactéria M. índolícus é um organismo não celulolítico que foi isolado do trato genital feminino (17). Do ponto de vista evolutivo, isso indicaria que não há correlação com a funcionalidade da Xilose Isomerase, uma vez que não há necessidade da XI permanecer ativa em ambiente sem hemicelulose. Por outro lado, não se pode excluir que a bactéria M. índolícus também viva em ambientes onde a utilização de xilose é importante para sua sobrevivência, mas não para a capacidade lignocelulolítica.
[00122] Três dos 11 genes XylA foram estudados após a sua integração no genoma. O gene Cs8XI estava entre os melhores para conferir capacidade de fermentação de xilose à cepa industrial da plataforma quando integrada em 2 ou 4 cópias. Este gene é derivado de uma espécie bacteriana produtora de acetona-butanol, C. saccharoperbutylacetonícum. Embora se
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77/86 saiba que a bactéria utiliza xilose, o gene XI deste organismo nunca foi expresso na levedura S. cerevisiae. Por outro lado, o gene Fm9XI foi previamente expresso em levedura (WO 2010/074577). Curiosamente, os genes Cs8XI e Fm9XI XylA têm apenas 68% de identidade de sequência ao nivel dos aminoácidos. A baixa identidade de sequência dos dois genes XylA não é surpreendente, uma vez que os dois organismos de origem não estão relacionados. Cs8XI é, portanto, um novo gene que confere excelente capacidade de fermentação de xilose em levedura com integração cromossômica de apenas 2 a 4 cópias. A integração de cópias adicionais do gene pode melhorar ainda mais a capacidade de fermentação da xilose. Além disso, a integração dos outros genes identificados neste trabalho no genoma da cepa plataforma é importante para a expressão estável dos genes e também pode resultar em alta capacidade de fermentação da xilose.
Exemplo 2
Desempenho de Es7XI e CclOXI na linhagem MDS130 [00123] Melhoramos ainda a cepa GSE16-T18 para uma fermentação melhorada da xilose e tolerância ao inibidor por rearranjo genômico e adaptação evolutiva. A cepa MDS130 foi assim selecionada mostrando capacidade de fermentação de xilose altamente melhorada em hidrolisados ricos em inibidor. Posteriormente, nós eliminamos completamente os genes CpXI do genoma da MDS130 usando a técnica CRISPR/Cas9
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78/86 como descrito acima na seção deleção da CpXI da GSE16-T18. Como esperado, a cepa knockout MDS130CpXIA/CpXIA não foi capaz de utilizar xilose (Figura 5A).
[00124] Em seguida, introduzimos os dois novos genes XI de melhor desempenho, Es7XI e CclOXI, no genoma de MDS130CpXIA/CpXIA a jusante do gene TYE7 no cromossomo XV. Com apenas duas cópias de cada gene introduzido, a cepa de deleção foi capaz de utilizar xilose, mas a uma taxa mais lenta em comparação com a cepa MDS130 original que transportou cerca de 18 cópias de CpXI. A fim de avaliar se a combinação dos dois genes melhorou o desempenho da fermentação de xilose, introduzimos 4 cópias adicionais de CclOXI em linhagens contendo duas cópias de Es7X. Isto resultou em uma melhoria significativa da taxa de fermentação, próximo do desempenho da cepa MDS130 (Figura 5A) .
[00125] Foi mostrado anteriormente que um gene de interesse adjacente a uma sequência de ARS é frequentemente amplificado quando as células crescem sob uma pressão seletiva, requerendo uma expressão elevada do gene de interesse (WO2016026954). Por essa razão, introduzimos o Ex7XI cerca de 2000 nucleotídeos a montante do ARS1529 em duas cópias e evoluímos em YP + 4% xilose para induzir a amplificação cromossômica. Após 3 semanas, os isolados de células individuais foram avaliados e a cepa MDC5 que melhor
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79/86 se desenvolveu a partir dos isolados de célula única testados foi selecionada. A análise do número de cópias de genes por análise de qPCR mostrou que está linhagem continha cerca de 12 cópias de Es7XI. 0 desempenho da cepa MDC5 com 12 cópias de Es7XI foi semelhante ao da MDS130 que transportou cerca de 18 cópias de CpXI (Figura 5B). Isso mostra o desempenho superior do Es7XI sobre o CpXI, pelo menos no plano de fundo da tensão testado.
Tabela 2 Alinhamento CLUSTAL das sequências de aminoácidos da xilose isomerase por MUSCLE (3.8)
PiXI MAKEYFPQIQKIKFEGKDSKNPLAFHYYDAEKEVMGKKMKDWLRFAMAWWHTLCAEGADQ
CclOXI -MKEYFSNIPKVRYEGPDSKNPFAFKFYNPEEKIAGKTMREQLKFSLAYWHTLDAEGTDM
Am6XI -MREHFLEINKIKFEGGDSTNPLAFKYYDANRIVAGKKMKDHLRFALSYWHTLTGNGTDP
Fm9XI —MEFFKGIDKVKYEGVKTNNLLAFAHYNPEEVILGKKMKDHLKFAMSYWHTLTGEGTDP
Cs 8X1 -MKEYFGNVSKINYEGPGSKNPYSFKYYNPDEVIGGKTMKEHLRFSLSYWHTLTANGADP
Cl11X1 -MAEFFKGIGVIPFEGADSVNPLAFKHYNKDEKVGDKTMAEHLRFAMSYWHTLCAEGGDP
Pcdl2XI -MSEIFKGIGQIKFEGVKSDNELAFRYYNPEQWGNKTMKEHLRFAMSYWHTLCGEGNDP
Es7X1 ---MYFNNIEKIKFEGVNSKNPLAFKYYDADRIIAGKKMSEHLKFAMSYWHTMCADGTDM
Es5X1 -MVNGLTNIPPVKFEGRDSKKALSFKYYNPDEMIQGKKMKDYLKFAMSYWHTLCGDGTDP
MÍ3XI —MKFFENVPKVKYEGSKSTNPFAFKYYNPEAVIAGKKMKDHLKFAMSWWHTMTATGQDQ
Ca2XI -MKEYFKGIPEVKYEGKDSINPFAFKFYDAKRVIDGKSMEEHLKFAMSWWHTMTATGTDP
LplXI -MKNYFPNVPEVKYEGPNSTNPFAFKYYDAERIVAGKTMKEHCRFALSWWHTLCAGGADP
CpXI -MKNYFPNVPEVKYEGPNSTNPFAFKYYDANKWAGKTMKEHCRFALSWWHTLCAGGADP
PiXI FGGGTKSFPWNEGTDAIEIAKQKVDAGFEIMQKLGIPYYCFHDVDLVSEGNSIEEYESNL
CclOXI FGRATMDKSFGETD-PMAIYKNKAYAAFELMDKLDIDYFCFHDRDIAPEGPTLSETNKNL
Am6XI FGQPTMERDYNSLD-GIELSKARVDAAFELMTKLGIEFFCFHDLDIAPEGNSLQEKLDNL
Fm9XI FGNATMDREWNEYT-PMEKAKARVKAGFEFMEKLGLEYFCFHDKDIAPEAETLEEYHRNL
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Cs8XI FGAGTMLRPWDDITNEMDLAKARMEAAFELMDKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLQETNENL
C111XI FGSTTAARPWNQIANPIEMAKAKVDAGFEFMQKLGIEYFCFHDRDIAPEGKDLAETNQIL
Pcdl2XI FGVGTVERPWNNITDPIEIAKIKVDAGFEFMSKMGIEYFCFHDRDIAPEGRDLEETNKIL
Es7XI FGRGTINKSFGGKT-AIEIYEHKVYAAFELMEKLGMQYFCFHDRDIAPEGATLKETNENL
Es5XI FGSSTIDRDYSGQT-PMEKAKTKADVAFALMQILGIEYFCFHDLDIAPTGNSLKELKNNL
MÍ3XI FGSGTMSRIYDGQTEPLALAKARVDAAFDFMEKLNIEYFCFHDADLAPEGNSLQERNENL
Ca2XI FGAGTIDRNYGQTE-SMEIARAKVDAAFELMKKLGIKYFCFHDVDIVPEGKDLKETKENL
LplXI FGVTTMDRSYGNITDPMEFAKAKVDAGFELMTKLGIEYFCFHDADIAPEGENFEESKKNL
CpXI FGVTTMDRTYGNITDPMELAKAKVDAGFELMTKLGIEFFCFHDADIAPEGDTFEESKKNL
PiXI KAWAYLKEKQKETGIKLLWSTANVFGHKRYMNGASTNPDFDWARAIVQIKNAIDAGIE
CclOXI DEIVSLLKKLMAEHNKKLLWGTANTFSHPRYVHGAGTSCNASVFAFAAAQIKKAIEITKE
Am6XI DTILERIEDKMKETGIKCLWGTTNAFSHPRFMHGAATSPNADVFAFAAAQVKKALEITHR
Fm9XI DEIVDLIEEEMKRTGIKLLWGTSNMFSHPRFMHGAATSCNADVFAYAAAQTKKALEITKR
Cs8XI DEIVAYCKELMKKYNKKLLWGTANCFTNPRYVHGAGTSCNADVFAYAAAQIKKALEVTKE
C111XI DEWAYIKVKMQETGIKLLWGTANCFNNKRFMHGAGTTCNAEVFAYAAAQIKKAIEVTKE
Pcdl2XI DEIVEYIKVNMEKTGIKLLWGTANMFGNPRFVHGASTTCNADVYAYAAAQVKKAMEITKY
Es7XI ERIVPIIKSEMKRTGIKLLWGTANCFNHPRYMCGAGTAPSADVFAYAAAQIKKAIEITVE
Es5XI IEITDYIKGLMDKTGIKLLWGTANCFSHPRYMNGAGTSPQADIFACAAAQIKNAIDATIK
MÍ3XI QEMVSYLKQKMAGTSIKLLWGTSNCFSNPRFMHGAATSCEADVFAWTATQLKNAIDATIA
Ca2XI SVIVDYIEEKMKGTDIKLLWGTANCFSSPRYMHGAGTSCNADSFSYAASQIKNAIDATIQ
LplXI FVIVDYIKEKMDQTGIKLLWGTANNFGHPRFMHGASTSCNADVFAYAAAKIKNALDATIK
CpXI FEIVDYIKEKMDQTGIKLLWGTANNFSHPRFMHGASTSCNADVFAYAAAKIKNALDATIK
PiXI LGAENYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHMATMLTMARDYARSKGFKGTFLIEPKPMEPT
CclOXI LDGCGYVFWGGREGYETLLNTDMELELDNMARLLKMAVDYARSIGFKGEFFIEPKPKEPT
Am6XI LRGENYVFWGGREGYETLLNTDIALENDNLAKFLKMAKDYARNIGFEGQFLIEPKPKEPT
Fm9XI LNGTGYVFWGGREGYETLLNTDIGLELDNLARFLQMAVDYAKKIGFEGQFFIEPKPKEPT
Cs8XI LGGENYVFWGGREGYETLLNTDMGLELDNFARLLQMAVDYAKEIGFTGQFLIEPKPKEPT
C111XI LGGENYVFWGGREGYETLLNTDTGLELDNFARLLQMAVDYAKEIGFTGQFLIEPKPKEPT
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Pcdl2XI LGGENFVFWGGREGYETLLNTNTELEMDNFARFLQMAVDYAKEIGFTGQFLIEPKPKEPT
Es7XI LGGQGYVFWGGREGYDTILNTDMAKEQDNMAYLMRMAVDYGRSIGFTGDFYIEPKPKEPT
Es5XI LGGTGYVFWGGREGYETLLNTNMEIELDNMAKLMHMAVDYARSKGFTGDFYIEPKPKEPT
MÍ3XI LGGKGYVFWGGREGYETLLNTDVGLEMDNYARMLKMAVAYARSKGYTGDFYIEPKPKEPT
Ca2XI LGGSGYVFWGGREGYETLLNTDMGFELDNMARLMKMAVKYARKKGFNGDFYIEPKPKEPT
LplXI LGGKGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELDNMARLMKMAVEYGRANGFDGDFYIEPKPKEPT
CpXI LGGKGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELDNMARLMKMAVEYGRANGFDGDFYIEPKPKEPT
PiXI KHQYDVDTETAIGFLKAHNLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELACAVDAGMLGSIDANR
CclOXI KHQYDYDVSTVLAFLRKYGLDKVFKVNIEANHATLAQHTFQHELRVARINGVLGSVDANQ
Am6XI KHQYDFDTMTVLGFLRKYNLIDDFKLNIEANHATLAGHTFQHELAMARINGVLGSVDANQ
Fm9XI KHQYDFDTTTVLEFLRKYNLDKYFKMNIEANHATLAGHTFQHELCTARINGVFGSIDANQ
Cs8XI KHQYDFDTATVLGFLKKYNLDKYFKVNIEANHATLAQHTFQHELNFARINNFLGSIDANQ
C111XI KHQYDFDTATVLAFLRKYNLDTYFKMNIEANHATLAGHTFQHELNMSRINNVLGSIDANQ
Pcdl2XI KHQYDFDTATVLGFLRKYNLDKYFKMNIEANHATLAGHTFQHELNIARINNVLGSIDANQ
Es7XI KHQYDFDVSTVLAFLRKYDLDKDFKMNIEANHATLAGHTFQHELRVARDNGVFGSIDANQ
Es5XI KHQYDFDVATWGFLRKYGLDKDFKMNIEANHATLAGHTFQHELNVARVNNVFGSIDANQ
MÍ3XI KHQYDFDVATCVAFLEKYDLMRDFKVNIEANHATLAGHTFQHELRMARTFGVFGSVDANQ
Ca2XI KHQYDFDAATVIGFLRKYDLMDDFKLNIEANHATLAGHTFPHELAVARINGVFGSVDANQ
LplXI KHQYDFDTATVLGFLRKYGLEKDFKMNIEANHATLAGHTFEHELALARVNGVFGSVDANQ
CpXI KHQYDFDTATVLAFLRKYGLEKDFKMNIEANHATLAGHTFEHELAMARVNGAFGSVDANQ
PiXI GDYQNGWDTDQFPIDQYELVQAWMEIIRGGGFVTGGTNFDAKTRRNSTDLEDIIIAHVSG
CclOXI GDVMLGWDTDQFPTNVYDTALAMYEILKNGGLPSGGLNFDSKNRRGSFEPEDIFHGFIAG
Am6XI GDLLLGWDTDQFPTNIYDATLSMYEVLKNGGIAPGGLNFDAKVRRGSFKPDDLFIAYIVG
Fm9XI GDMLLGWDTDQFPTNVYDAVLAMYETLLAGGFKEGGLNFDAKVRRGSFEPKDLFYAYISG
Cs8XI GDPMLGWDTDQFPTNIYDATLAMYEILKNGGLAPGGVNFDAKVRRASFEKEDLFLAYIAG
C111XI GDLMLGWDTDQFPTNIYDATMAMYEVLKAGGIAPGGFNFDSKVRRGSFEEADLFIAYIAG
Pcdl2XI GDLLLGWDTDQFPTNIYDATLAMYEVLKQGGIAPGGFNFDSKVRRASFEVEDLFLAYIAG
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Célula microbiana eucariótica caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos, cuja expressão confere, ou aumenta na célula a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose, em que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 68% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 7, e que de preferência a sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos que é obtenível de uma bactéria do gênero Eubacteríum, mais preferencialmente, uma bactéria da espécie Eubacteríum sp. CAG_180.
  2. 2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula compreende ainda uma sequência de nucleotídeos, a expressão da qual confere, ou aumenta, a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose, em que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, cujo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 71% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 10, e que de preferência a sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos que é obtenível de uma bactéria do gênero Clostridium, mais preferencialmente, uma bactéria da espécie Clostridium
    Petição 870190057521, de 21/06/2019, pág. 16/25
    2/6 cellulosi.
  3. 3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula é uma levedura ou um fungo filamentoso de um gênero selecionado do grupo consistindo em Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenuia, Kloeckera, Schwanniomyces, Yarrowia, Kazachstania Naumovia, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium, e Penicillium.
  4. 4. Célula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a célula é uma levedura capaz de fermentação alcoólica anaeróbica.
  5. 5. Célula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a levedura pertence a uma espécie Saccharomyces selecionada a partir do grupo que consiste em
    5. cerevisiae, S. bayanus, S. bulderi, S. cervazzii, S. cariocanus, S. castellii, S. dairenensis, S. exiguus, S. kluyveri, S. kudriazevii, S. mikatae, S. paradoxus, S. pastorianusr S. turicensis e S. unisporus.
  6. 6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo com atividade de xilose isomerase é operavelmente ligada a um promotor que é insensível à repressão catabólica e que não requer xilose para indução.
    Petição 870190057521, de 21/06/2019, pág. 17/25
    3/6
  7. 7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a célula compreende pelo menos uma modificação genética selecionada a partir de:
    a) uma modificação genética que aumenta a atividade especifica da xilulose quinase;
    b) uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose fosfato; e,
    c) modificação genética que reduz a atividade de aldose redutase não específica na célula.
  8. 8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a célula compreende ainda pelo menos uma modificação genética que resulta em uma característica selecionada do grupo que consiste em:
    a) tolerância aumentada a etanol;
    b) tolerância aumentada a ácido acético;
    c) produção reduzida de glicerol;
    d) aumento da taxa de fermentação de xilose em etanol;
    e,
    e) termo-tolerância aumentada.
  9. 9. Célula, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que:
    a) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo de um ou mais dos genes ADE1, KIN3, MKT1, VPS70, SVJ2 e APJ1 que conferem tolerância aumentada a etanol conforme descrito em WO 2012/175552 e WO
    Petição 870190057521, de 21/06/2019, pág. 18/25
    4/6
    2014/170330;
    b) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo de um ou mais dos genes GLO1, DOT5, CUP2 e
    HAA1 que conferem tolerância aumentada a ácido acético como descrito em WO 2015/181169 e WO 2016/083397;
    c) a modificação genética é uma modificação que introduz um gene SSK1 mutante que codifica uma proteína sskl truncada como descrito em WO 2014/048863;
    d) a modificação genética é uma modificação que introduz um alelo do gene NNK1 que confere uma taxa aumentada de fermentação de xilose em etanol conforme descrito em WO 2015/086805; e,
    e) a modificação genética é a superexpressão de pelo menos um de um gene que codifica a proteína Prp42 e um gene que codifica a proteína Smd2.
  10. 10. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo com atividade de xilose isomerase é integrada no genoma da célula.
  11. 11. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de uma cepa industrial de levedura ou derivada de uma cepa industrial de levedura.
  12. 12. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula
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    5/6 diploide, aneuplóide ou poliplóide.
  13. 13. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a célula é melhorada em pelo menos um fenótipo industrialmente relevante por engenharia evolucionária, em que, de preferência, o fenótipo industrialmente relevante é a taxa de utilização de xilose.
  14. 14. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a célula tem a capacidade de produzir pelo menos um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos beta-lactama e cefalosporinas.
  15. 15. Processo para a produção de um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, ácido mucônico, álcoois graxos, ácidos graxos, antibióticos beta-lactama e cefalosporinas, sendo que o processo é caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose, e opcionalmente uma fonte de glicose, com uma célula como
    Petição 870190057521, de 21/06/2019, pág. 20/25
    6/6 definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, por meio do qual a célula fermenta a xilose e, opcionalmente, a glicose, para o produto de fermentação e, opcionalmente, (b) recuperação do produto de fermentação.
BR112019012949A 2016-12-21 2017-12-21 isomerases de xilose que conferem capacidade de fermentação eficiente de xilose em levedura BR112019012949A2 (pt)

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