ES2532508T3 - Cepas de levaduras manipuladas para producir etanol a partir de glicerol - Google Patents

Abstract

Una célula de levadura, que comprende: a) un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil- CoA; b) una modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula; c) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de reducir acetil-CoA en acetaldehído; y d) una modificación genética que aumenta la actividad específica de glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+.

Description

Cepas de levaduras manipuladas para producir etanol a partir de glicerol

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la manipulación metabólica en microorganismos tales como levaduras. En particular, la invención se refiere a cepas de levadura que han sido manipuladas para producir etanol a partir de glicerol. Estas cepas han conservado su capacidad natural de producir etanol a partir de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.) y comprenden una capacidad de manipulación para producir etanol a partir de pentosas tales como xilosa. La invención se refiere, además, a los procesos en los que las cepas manipuladas de la invención producen etanol a partir de glicerol, ya sea como material de alimentación principal de la fermentación, o junto con una o más hexosas y pentosas.

Antecedentes de la invención

Tanto la formación como la degradación de glicerol en la levadura Saccharomyces cerevisiae son procesos importantes que han sido estudiados durante más de un siglo. Durante las últimas décadas, se ha hecho hincapié en

(1)

la supresión de la formación de glicerol durante la producción de etanol. A comienzos del siglo pasado (2) se ha estudiado la optimización de la producción de glicerol a partir de azúcares. Ambos aspectos tienen profundas repercusiones económicas. Más recientemente, se ha introducido un aspecto totalmente nuevo en este campo del glicerol. Se trata de (3) la fermentación anaerobia de glicerol en etanol.

(1)

Supresión de la formación de glicerol durante la producción de etanol

El bioetanol es producido por Saccharomyces cerevisiae a partir de una variedad de sustratos, incluidos hidrolizados lignocelulósicos de materiales de alimentación no alimentarios (p. ej., cultivos energéticos y residuos agrícolas). Uno de los problemas de la producción de etanol basada en levaduras es que durante la fermentación etanólica anaerobia de materiales de alimentación de azúcar, se forman invariablemente cantidades sustanciales de glicerol como un subproducto. La disimilación de azúcar durante el crecimiento anaerobio de S. cerevisiae se produce a través de la fermentación alcohólica. En este proceso, el NADH formado en la glucólisis se re-oxida a través de una alcohol deshidrogenasa NAD+-dependiente que convierte acetaldehído (formado por descarboxilación de piruvato) en etanol. Esta vía disimilatoria es redox neutra y, por lo tanto, no puede compensar una reducción neta de NAD+ en NADH que se produce en otros lugares en el metabolismo. Una reducción neta de este tipo de NAD+ en NADH se produce en asimilación cuando la biomasa de levadura se sintetiza en condiciones anaerobias a partir de azúcares y, p. ej., amoníaco. Bajo condiciones anaerobias, la re-oxidación de NADH en S. cerevisiae para compensar la formación de NADH asimilatoria-asociada depende principalmente de la reducción de al menos parte de la fuente de carbono de azúcar en glicerol, resultando un rendimiento menor de etanol. Para abordar este problema, se han explorado varias estrategias de manipulación metabólica para reducir o eliminar la producción de glicerol en S. cerevisiae desarrollada en condiciones anaerobias. Dos ejemplos son:

Nissen et al. (2000) describen una estrategia en la que se eliminó la enzima glutamato deshidrogenasa NADPHdependiente. Glutamina sintetasa y glutamato sintasa se sobre-expresaron. La cepa resultante ya no sintetizaba glutamato a partir de amonio y 2-oxoglutarato a través de una vía que requiere NADPH, sino más bien a través de una vía que requiere NADH y ATP. La cepa resultante tenía un rendimiento un 10% superior en etanol y un rendimiento un 38% inferior en glicerol que la cepa de tipo salvaje.

Guadalupe Medina et al. (2009, Appl. Environ. Microbiol, 76: 190-195) describen una cepa de S. cerevisiae en la que la producción del sub-producto glicerol se elimina por la interrupción de los genes glicerol 3-fosfato deshidrogenasa NAD-dependiente endógenos (GPD1 y GPD2). La expresión del gen mhpF de E. coli que codifica la acetaldehído deshidrogenasa NAD-dependiente acetilante restauró la capacidad de la cepa disgregada con GPD de desarrollarse en condiciones anaerobias. Sin embargo, la cepa disgregada con GPD sólo podría desarrollarse en condiciones anaerobias si el medio se suplementa con ácido acético.

(2)

Optimización de la producción de glicerol a partir de azúcares

Producción de glicerol a partir de azúcares, en contraposición a minimizar su producción durante la formación de etanol, ha sido un proceso económicamente importante durante la 1ª Guerra Mundial en Alemania. En los últimos años se observa un renovado interés en este proceso como lo demuestra, por ejemplo, el trabajo de Overkamp et al (2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 2814-21).

(3)

Fermentación de glicerol en etanol

La fermentación de glicerol en etanol no es factible en condiciones normales de S. cerevisiae y bajo condiciones de cultivo completamente anóxicas debido a un equilibrio desequilibrado de NADH. El glicerol se reduce más que el etanol y, por tanto, el organismo no puede deshacerse de su exceso de NADH por re-oxidación en condiciones anóxicas normales. Algún trabajo inicial se ha hecho en el campo de la fermentación de glicerol en etanol: Yu et al. (2010, Bioresour.Technol. 101(11): 4157-61. Epub 9 de febrero de 2010) describen cepas de S. cerevisiae metabólicamente manipuladas para mejorar la producción de etanol a partir de glicerol mediante la sobre-expresión simultánea de glicerol deshidrogenasa (GCY), dihidroxiacetona quinasa (DAK) y la proteína de absorción de glicerol (GUP1). En una comunicación posterior, Yu et al (2010, J. Biotechnol doi: 10.1016 / j.jbiotec.2010.09.932) describen una optimización de su cepa para la producción de etanol a partir de glicerol mediante la supresión de dos genes de producción de glicerol, FPS1 y GPD2. Se demostró que en sus cepas es posible la producción de etanol a partir de glicerol. Sin embargo, el aumento en el rendimiento dependía de las condiciones microaerobias, que puede explicarse por el requisito para la oxidación de NADH. El exceso de NADH producido en la vía a partir de glicerol a etanol al parecer sólo podría reoxidarse a través de una reacción dependiente de oxígeno.

Waks y Silver (2009, Appl. Environ. Microbiol, 75:1867-1875) describen un sistema de organismo dual sintético para la producción de biohidrógeno. En una primera etapa formiato es producido por una cepa manipulada de S. cerevisiae, en la que se ha implementado una vía super-productora de formiato. En una segunda etapa, el formiato producido por la levadura manipulada es procesado para formar hidrógeno por Escherichia coli. La cepa de S. cerevisiae se manipuló para producir formiato expresando la enzima piruvato formiato liasa (PFL) anaerobia de E. coli. La producción de formiato se incrementó aún más introduciendo también la expresión de una enzima de aguas abajo, la AdhE de E. coli, la enzima bifuncional que reduce acetil-CoA generada por PFL en etanol.

El documento WO 2010/019882 describe levaduras manipuladas genéticamente que son capaces de absorber glicerol y de convertir el glicerol en etanol.

Won-Kyung HONG et al., biotechnology letters vol. 32, nº 8, 2010, páginas 1077-1082 describen la producción mejorada de etanol a partir de glicerol por parte de Hansenula polymorpha manipulada que expresa genes piruvato descarboxilasa y aldehído deshidrogenasa de Zymomonas mobilis.

Es un objeto de la presente invención proporcionar para levaduras que sean capaces de producir etanol a partir de glicerol al tiempo que conserven sus capacidades de fermentación de hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.), así como pentosas tales como xilosa, así como procesos en los que estas cepas se utilizan para la producción de etanol y/u otros productos de la fermentación.

Descripción de la invención

Definiciones

La identidad de secuencia se define en esta memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, tal como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos. Las expresiones "identidad de secuencia" o "similitud de secuencia" significan que dos secuencias de (poli)péptidos o dos secuencias de nucleótidos, cuando se alinean óptimamente, de preferencia en toda su longitud (de al menos la secuencia más corta en la comparación) y maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos tal como mediante los programas ClustalW (1.83), GAP o BESTFIT utilizando parámetros por defecto, comparten al menos un determinado porcentaje de identidad de secuencia según se define en otra parte en esta memoria. GAP utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. Generalmente, se utilizan los parámetros por defecto de GAP, con una penalización por creación de hueco = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) y con una penalización por extensión de hueco = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas). Para nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto utilizada es nwsgapdna y para proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Un programa de alineamiento múltiple preferido para la alineación de secuencias de proteínas de la invención es ClustalW (1.83) utilizando una matriz blosum y configuraciones por defecto (penalización por apertura de hueco: 10; penalización por extensión de hueco: 0,05). Está claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o que tienen un determinado grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Alineamientos de secuencias y puntuaciones de identidad de secuencia porcentual se pueden determinar utilizando programas de ordenador, como el Paquete GCG Wisconsin, versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE.UU. o el software de código abierto Emboss para Windows (versión actual 2.10.0-0.8). Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad se puede determinar mediante la búsqueda en bases de datos tales como FASTA, BLAST, etc.

Una variante de una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos descrita en esta memoria también se puede definir como una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos específicamente descrita en este memoria (p. ej., en el listado de secuencias).

Opcionalmente, en la determinación del grado de similitud de aminoácidos, la persona experta puede tener en cuenta también las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservativas", como resultará evidente para la persona experta. Sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticashidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de carácter básico es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria son aquellas en las que al menos un residuo en las secuencias descritas ha sido eliminado y en su lugar se ha insertado un residuo diferente. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservativo. Sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos que se producen de forma natural son como sigue: Ala a ser; Arg a lys; Asn a gln o his; Asp a glu; Cys a ser o ala; Gin a asn; Glu a asp; Gly a pro; His a asn o gln; Ile a leu o val; Leu a ile o val; Lys a arg; gln o glu; Met a leu o ile; Phe a met, leu o tyr; Ser a thr; Thr a ser; Trp a tyr; Tyr a trp o phe; y Val a ile o leu.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también pueden definirse por su capacidad para hibridarse con partes de secuencias de nucleótidos específicas descritas en esta memoria, respectivamente, bajo condiciones de hibridación moderadas o, preferiblemente, rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 25, de preferencia aproximadamente 50 nucleótidos, 75 ó 100 y lo más preferiblemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos se hibride a una temperatura de aproximadamente 65°C en una disolución que comprende aproximadamente sal 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica equiparable, y lavado a 65°C en una disolución que comprende sal aproximadamente 0,1 M, o menos, preferiblemente 0,2 x SSC o cualquier otra disolución con una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se lleva a cabo durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tienen aproximadamente el 90% o más de identidad de secuencia.

Condiciones moderadas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45°C en una disolución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución con una fuerza iónica equiparable, y el lavado a temperatura ambiente en una disolución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución con una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante una noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tienen hasta el 50% de identidad de secuencia. La persona experta en la técnica será capaz de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente las secuencias que varían en identidad entre 50% y 90%.

Una "construcción de ácido nucleico" o "vector de ácido nucleico" se entiende en esta memoria que significa una molécula de ácido nucleico hecha por el hombre que resulta del uso de la tecnología de ADN recombinante. La expresión "construcción de ácido nucleico", por lo tanto, no incluye moléculas de ácido nucleico que se producen de forma natural, aunque una construcción de ácido nucleico puede comprender (partes de) moléculas de ácido nucleico que se producen de forma natural. Las expresiones "vector de expresión" o “construcción de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos que son capaces de afectar la expresión de un gen en células huéspedes o en organismos huéspedes compatibles con estas secuencias. Estos vectores de expresión incluyen típicamente al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3’. También pueden estar presentes factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión tales como elementos potenciadores de la expresión. El vector de expresión se introducirá en una célula huésped adecuada y será capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora en un cultivo celular in vitro de la célula huésped. El vector de expresión será adecuado para la replicación en la célula u organismo huésped de la invención.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "promotor" o la expresión "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificadoras, y está situado aguas arriba con respecto a la dirección de la transcripción del sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia codificadora, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa ADN-dependiente, sitios de iniciación de la transcripción y cualesquiera otras secuencias de ADN, que incluyen, pero no se limitan a sitios de unión del factor de transcripción, sitios de unión del represor y activador de la proteína, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas para un experto en la técnica que actúan directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de los tejidos bajo la mayoría de condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o por el desarrollo, p. ej., por la aplicación de un inductor químico.

La expresión "marcador seleccionable" es un término familiar para un experto ordinario en la técnica y se utiliza en esta memoria para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, se puede utilizar para seleccionar una célula o células que contienen el marcador seleccionable. El término "informador" se puede utilizar de manera indistinta con marcador, a pesar de que se utiliza principalmente para hacer referencia a marcadores visibles tales como la proteína verde fluorescente (GFP). Marcadores seleccionables pueden ser dominantes o recesivos o bidireccionales.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "enlazado operativamente" se refiere a una unión de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está enlazada operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia codificadora. Enlazada operativamente significa que las secuencias de ADN que se enlazan son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, son contiguas y están en marco de lectura.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen específico.

"Hongos" (singular hongo) se entienden en esta memoria como microorganismos eucariotas heterótrofos que digieren su comida externamente, absorbiendo moléculas de nutrientes en sus células. Los hongos son un reino independiente de organismos eucariotas e incluyen levaduras, mohos y setas. Los términos hongos, hongo y fúngico, tal como se utilizan en esta memoria, incluyen, por lo tanto, expresamente levaduras, así como hongos filamentosos.

El término "gen" significa un fragmento de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (p. ej. un ARNm) en una célula, enlazado operativamente a regiones reguladoras adecuadas

(p. ej., un promotor). Un gen comprenderá habitualmente varios fragmentos enlazados operativamente tales como un promotor, una secuencia conductora 5’, una región codificadora y una secuencia de no traducida 3' (extremo 3’) que comprende un sitio de poliadenilación. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN que está enlazada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de ser traducido a una proteína o péptido biológicamente activo.

El término "homólogo", cuando se utiliza para indicar la relación entre una molécula (recombinante) de ácido nucleico o molécula de polipéptido dada y un organismo huésped o célula huésped dado, se entiende que significa en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido es producida por una célula u organismos huéspedes de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa. Si es homóloga a una célula huésped, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido estará típicamente (pero no necesariamente) enlazada operativamente a otra secuencia promotora (heteróloga) y, en su caso, otra secuencia señal secretora (heteróloga) y/o secuencia de terminador que en su entorno natural. Se entiende que las secuencias reguladoras, secuencias señal, secuencias de terminador, etc. también pueden ser homólogas a la célula huésped. En este contexto, el uso de sólo elementos de secuencia "homólogos" permite la construcción de organismos manipulados genéticamente (GMOs -siglas en inglés) "auto-clonados" (la auto-clonación se define aquí como en la Directiva Europea 98/81/EC Anexo II). Cuando se utiliza para indicar la relación de dos secuencias de ácidos nucleicos, el término "homólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico monocatenario puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra complementaria. El grado de hibridación puede depender de un cierto número de factores, que incluyen la magnitud de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación tales como temperatura y concentración de sal como se discute más adelante.

Los términos "heterólogos" y "exógenos", cuando se utilizan con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína, se refieren a un ácido nucleico o proteína que no se produce naturalmente como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en el que está presente, o que se encuentra en una célula o lugar o lugares en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difieren de aquel en el que se encuentra en la naturaleza. Ácidos nucleicos o proteínas heterólogos y exógenos no son endógenos a la célula en la que se introducen, pero se han obtenido de otra célula o se han producido de forma sintética o recombinante. Generalmente, aunque no necesariamente, tales ácidos nucleicos codifican proteínas, es decir, proteínas exógenas, que no se producen normalmente por la célula en la que se transcribe o se expresa el ADN. De manera similar, ARN exógeno codifica proteínas que no se expresan normalmente en la célula en la que está presente el ARN exógeno. A ácidos nucleicos y proteínas exógenos/heterólogos también se les puede aludir como ácidos nucleicos o proteínas extraños. Cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la técnica reconocería como extraño a la célula en la que se expresa queda abarcado en esta memoria por la expresión ácido nucleico o proteína heterólogo o exógeno. Los términos heterólogo y exógeno también se aplican a combinaciones no naturales de secuencias de ácidos nucleicos

o aminoácidos, es decir, combinaciones en donde al menos dos de las secuencias combinadas son extrañas una con respecto a la otra.

La "actividad específica" de una enzima se entiende en esta memoria que significa la cantidad de actividad de una enzima particular por cantidad de proteína total de la célula huésped, habitualmente expresada en unidades de actividad de la enzima por mg de proteína total de la célula huésped. En el contexto de la presente invención, la actividad específica de una enzima particular puede ser aumentada o disminuida en comparación con la actividad específica de esa enzima en una célula huésped (por lo demás idéntica) de tipo salvaje.

"Condiciones anaerobias" o un proceso de fermentación anaerobia se define en esta memoria como condiciones o una operación de proceso de fermentación en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente se consume menos de 5, 2,5 ó 1 mmol/L/h, más preferiblemente 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones.

Descripción detallada de la invención

El biodiesel está teniendo y continuará teniendo un impacto sustancial en el sector de los biocombustibles. Se puede producir a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo algas, colza y palma. Una amplia lista de fuentes de materiales de alimentación potenciales está disponible de "Feedstock and Biodiesel Characteristics Report," Renewable Energy Group, Inc., www.regfuel.com (2009)". Los aceites vegetales a partir de los cuales se produce el biodiesel mediante interesterificación resultan inevitablemente en grandes corrientes de subproductos de glicerol. Además, el material vegetal del que se extrae el aceite dará lugar a un subproducto lignocelulósico. Este último subproducto contendrá celulosa y hemicelulosas en diferentes concentraciones relativas. Estos azúcares poliméricos se pueden hidrolizar en glucosa y pentosas tales como xilosa, respectivamente, por procedimientos conocidos que todavía están optimizados. Por lo tanto, pueden resultar dos corrientes de subproductos de la producción de biodiesel. La presente invención describe un método para la fermentación concomitante tanto de glicerol como de los azúcares en etanol. Este proceso se puede aplicar para diversos materiales de alimentación. Como un ejemplo, a continuación se presenta con cierto detalle la situación en la industria del aceite de palma.

La industria del aceite de palma produce grandes cantidades de subproductos. El aceite consiste en sólo el 10% de la biomasa total producida en la plantación. El resto se compone de materiales lignocelulósicos tales como hojas de la palma de aceite, troncos y racimos vacíos (EFB -siglas en inglés) (véase, p. ej., http://umpir.ump Edu.my/697/l/Kamarul_Azlan_Abd_Hamid.pdf). Estos materiales lignocelulósicos se pueden utilizar para la producción de productos de valor añadido tal como etanol que se puede utilizar como biocombustible. Los materiales lignocelulósicos se pueden hidrolizar por métodos conocidos en corrientes que contienen hexosas y pentosas tales como glucosa y xilosa, que luego pueden ser fermentados a etanol por las cepas de levadura manipuladas tal como se describe, p. ej., por Kuypers et al (2005, FEMS Yeast Res. 5:399-409). Sin embargo, las corrientes que contienen hexosa y pentosa a partir de la hidrólisis de este tipo de materiales lignocelulósicos son relativamente diluidas y, por lo tanto, producirán concentraciones relativamente bajas de etanol de no más de aproximadamente 5% (v/v).

Al mismo tiempo, se generan grandes cantidades de glicerol concentrado como un subproducto en la producción de biodiesel a partir de reacciones de transesterificación utilizando aceites vegetales tales como aceite de palma y alcoholes. Se prevé que la disponibilidad de glicerol bruto aumente en los próximos años como consecuencia del crecimiento de la producción de biodiesel en todo el mundo. Por consiguiente, estarán disponibles grandes cantidades de glicerol concentrado a bajo costo cerca de las plantaciones de aceite de palma. Esto ofrece la posibilidad de aumentar la concentración de carbono de corrientes diluidas obtenidas en la hidrólisis de materiales lignocelulósicos anteriormente descrita, al mezclar en el glicerol altamente concentrado disponible. La utilización de tales corrientes mixtas requeriría cepas de levaduras manipuladas que pueden fermentar no sólo hexosas y pentosa, sino también glicerol para dar etanol. Sin embargo, el consumo anaerobio de gran cantidad de glicerol produciría un desequilibrio redox en la levadura. La presente invención aborda este problema mediante la manipulación de la levadura para producir ácido fórmico, además de etanol. Por lo tanto, la presente invención proporciona cepas de levadura manipuladas para producir etanol y ácido fórmico a partir de fuentes de carbono que contiene uno o más de glicerol, hexosa y pentosa, así como procesos en los que estas cepas se utilizan para producir etanol y ácido fórmico a partir de estas fuentes de carbono.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una célula huésped fúngica que comprende un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil-CoA. Una enzima con la capacidad de convertir el piruvato y la coenzima-A en formiato y acetil-CoA cataliza la reacción (CE 2.3.1.54):

piruvato + coenzima A (CoA) ↔ acetil-CoA + formiato.

Una enzima de este tipo se entiende en esta memoria como una enzima con actividad de piruvato formiato liasa y se la alude como una piruvato formiato liasa (PFL) o formiato C-acetiltransferasa.

5 Un gen exógeno adecuado que codifica una enzima que tiene actividad de piruvato formiato liasa es, p. ej., una piruvato formiato liasa procariota tal como la piruvato formiato liasa de E. coli. La piruvato formiato liasa de E. coli. es un dímero de PflB (codificado por pflB), cuya maduración requiere la activación de la enzima PflAE (codificada por pflA), S-adenosilmetionina radical, y un único donante de electrones, que en el caso de E. coli es flavodoxina (Buis y Broderick, 2005, Arch. Biochem. Biophys. 433:288-296; Sawers y Watson, 1998, Mol. Microbiol. 29: 945-954). Sin

10 embargo, Waks y Silver (supra) han demostrado que para la activación de la piruvato formiato liasa en levaduras sólo se requiere la coexpresión de una enzima activante, pero la expresión de flavodoxina no es necesaria.

El gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1. Ejemplos adecuados de 15 organismos que comprenden una enzima con actividad de piruvato formiato liasa se proporcionan en la Tabla 1. Ejemplos adicionales de organismos de este tipo se enumeran por Lehtiö y Goldman (2004, Prot. Engin. Design & Selection 17:545-552). Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas están disponibles en bases de datos públicas y pueden ser utilizadas por la persona experta para diseñar secuencias de nucleótidos optimizadas en los codones que codifican la enzima correspondiente con actividad de piruvato formiato liasa (véase, p. ej., SEQ ID NO:

20 2). El gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos tiene no más de 420, 380, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10 ó 5 sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 1.

25 Tabla 1: Enzimas con actividad de piruvato formiato liasa relacionada con pflB de E. coli

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Escherichia coli cepa K12 subcepa MG1655

100%

Shigella boydii

100%

Escherichi alberti TW07627

99%

Salmonella enteric

97%

Citrobacter rodentium ICC168

97%

Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044

96%

Yersinia aldovae ATCC 35236

91%

Proteus mirabilis HI4320

87%

Haemophilus influenza Rd KW20

86%

Actinobacillus succiongenes 130Z

83%

Piromyces sp. E2

57%

La célula huésped de la invención comprende además, preferiblemente, un gen exógeno que codifica la enzima activante PflAE para la activación de la piruvato formiato liasa. La enzima activante piruvato formiato liasa se entiende en esta memoria como una enzima que cataliza la reacción:

30 S-adenosil-L-metionina + dihidroflavodoxina + [piruvato formiato liasa]-glicina ↨ 5'-desoxiadenosina + L-metionina + flavodoxina semiquinona +

radical [formiato C-acetiltransferasa]-glicin-2-ilo El gen exógeno que codifica la enzima activante piruvato formiato liasa comprende preferiblemente una secuencia 35 de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 3. Ejemplos adecuados de organismos que

comprenden una enzima con actividad de piruvato formiato liasa se proporcionan en la Tabla 2. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas están disponibles en bases de datos públicas y pueden ser utilizadas por la persona experta para diseñar secuencias de nucleótidos optimizadas en los codones que codifican la enzima correspondiente con actividad de piruvato formiato liasa (véase, p. ej., SEQ ID NO: 4). El gen exógeno que codifica

5 la enzima con actividad de piruvato formiato liasa también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos tiene no más de 135, 125, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 8, 5 ó 2 sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 3.

10 Tabla 2: Enzimas con actividad de piruvato formiato liasa relacionada con pflA de E. coli

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Escherichia coli cepa K12 subcepa MG1655

100%

Shigella boydii

100%

Escherichi alberti TW07627

99%

Salmonella enteric

98%

Citrobacter rodentium ICC168

98%

Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044

97%

Yersinia rhodei ATCC 43380

89%

Proteus penneri ATCC 35198

85%

Haemophilus parasuis 29755

70%

En una célula huésped preferida de la invención, los genes exógenos que codifican la enzima con actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante piruvato formiato liasa son del mismo organismo donante, es decir,

15 pueden ser homólogos entre sí. Sin embargo, los genes exógenos que codifican la enzima con actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante piruvato formiato liasa también pueden ser de diferentes organismos donantes, es decir, pueden ser heterólogos entre sí.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para la preparación o construcción de las células de levadura de la invención. Para este propósito se utilizan técnicas de biología genética y molecular estándares que son 20 generalmente conocidas en la técnica y que se han descrito, p. ej., por Sambrook y Russell (2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al. (1987, comps., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing y Wiley Interscience, Nueva York). Además, la construcción de cepas de levaduras huéspedes mutadas se lleva a cabo por cruces genéticos, esporulación de los diploides resultantes, disección tétrada de las esporas haploides que contienen los marcadores

25 auxotróficos deseados y purificación de colonias de tales levaduras huéspedes haploides en el medio de selección apropiado. Todos estos métodos son métodos genéticos estándares de levaduras conocidos por las personas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sherman et al, Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1978) y Guthrie et al. (comps.) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991).

Los genes exógenos que codifican la enzima con actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante piruvato

30 formiato liasa son, preferiblemente, construcciones de expresión que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica las enzimas enlazadas operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la expresión de las enzimas tras la transformación de las construcciones de expresión en la célula huésped de la invención. Por lo tanto, el gen o la construcción de expresión comprenderá al menos un promotor que es funcional en la célula huésped enlazada operativamente a la secuencia codificadora. El gen o la construcción puede

35 comprender, además, una secuencia conductora 5’ aguas arriba de la región codificadora y una secuencia 3'-no traducida (extremo 3') que comprende un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción aguas abajo de la secuencia codificadora. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima con actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante piruvato formiato liasa pueden estar presentes juntas en una sola construcción de expresión, o cada una de las enzimas puede estar presente en una construcción de

40 expresión separada.

Promotores adecuados para la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima con actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante piruvato formiato liasa (así como otras enzimas de la invención, véase más adelante) incluyen promotores que son preferiblemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos bajo condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. 45 Promotores que tienen estas características están ampliamente disponibles y son conocidos por la persona experta. Ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, p. ej., promotores de genes glicolíticos tales como los promotores fosfofructoquinasa (PPK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato quinasa (PYK), fosfoglicerato quinasa (PGK), promotor de glucosa-6-fosfato isomerasa (PGI1) de levaduras. Más detalles acerca de tales promotores de levaduras se pueden encontrar en (documento WO

93/03159). Otros promotores útiles son promotores de genes que codifican proteínas ribosomales (TEF1), el promotor del gen lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4 y similares), el promotor de enolasa (ENO) y el promotor transportador de hexosa (glucosa) (HXT7). Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima que tiene actividad de piruvato formiato liasa y la enzima activante PflAE se expresan en condiciones anaerobias utilizando un promotor anóxico tal como, p. ej., el promotor ANB1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación aguas arriba serán conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el promotor que está enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos según se define arriba es homólogo a la célula huésped. Secuencias de terminación adecuadas se pueden obtener, p. ej., a partir del gen citocromo c1 (CYC1) o un gen alcohol deshidrogenasa (p. ej., ADH1).

Para aumentar la probabilidad de que la enzima con actividad de piruvato formiato liasa se expresa a niveles suficientes y en forma activa en las células huésped transformadas de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica estas enzimas, así como la enzima activante piruvato formiato liasa y otras enzimas de la invención (véase más adelante), se adaptan preferiblemente para optimizar su uso de codones al de la célula huésped en cuestión. La capacidad de adaptación de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima al uso de codones de una célula huésped se puede expresar como índice de adaptación de codones (CAI). El índice de adaptación de codones se define en esta memoria como una medida de la capacidad de adaptación relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes altamente expresados en una célula huésped u organismo particular. La capacidad de adaptación relativa (w) de cada uno de los codones es la relación del uso de cada uno de los codones al del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice CAI se define como la media geométrica de estos valores de capacidad de adaptación relativa. Se excluyen codones no sinónimos y codones de terminación (que dependen del código genético). Los valores del CAI oscilan entre 0 y 1, indicando los valores más altos una mayor proporción de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15:1281-1295; véase también: Jansen et al, 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada tiene preferiblemente un CAI de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ó 0,9. Las más preferidas son las secuencias que han sido optimizadas en codones para la expresión en la célula huésped fúngica en cuestión tal como, p. ej., células de S. cerevisiae.

La célula huésped fúngica a transformar con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa es preferiblemente una célula huésped de levadura. Preferiblemente, la célula huésped es una célula cultivada. La célula huésped de la invención, preferiblemente, es un huésped capaz transportar, de forma activa o pasiva, pentosa (xilosa y preferiblemente también arabinosa) a la célula. La célula huésped contiene preferiblemente glicólisis activa. La célula huésped puede contener además, preferiblemente, una ruta de pentosa fosfato endógena y puede contener actividad de xilulosa quinasa endógena, de manera que xilulosa isomerizada a partir de xilosa puede ser metabolizada en piruvato. El huésped contiene además, preferiblemente, enzimas para la conversión de una pentosa (preferiblemente a través de piruvato) a un producto de fermentación deseado tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propano-diol, butanoles (1-butanol, 2-butanol, isobutanol) y productos derivados de isopreno. Una célula huésped particularmente preferida es una célula de levadura que de forma natural es capaz de fermentación alcohólica, preferiblemente, fermentación alcohólica anaerobia. La célula huésped de levadura tiene además, preferiblemente, una alta tolerancia a etanol, una alta tolerancia a pH bajo (es decir, capaz de crecer a un pH menor que 5, 4 ó 3) y a ácidos orgánicos tal como ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico y productos de degradación de azúcares tales como furfural e hidroxi-metilfurfural, y una alta tolerancia a las temperaturas elevadas. Cualquiera de estas características o actividades de la célula huésped puede estar presente de forma natural en la célula huésped o puede ser introducida o modificada por modificación genética, preferiblemente mediante auto-clonación o por los métodos de la invención que se describen más adelante. Una célula adecuada es una célula cultivada, una célula que se pueden cultivar en proceso de fermentación, p. ej., en fermentación sumergida o en estado sólido. Células huésped particularmente adecuadas son microorganismo eucariotas tales como, p. ej., hongos, sin embargo, las más adecuadas para uso en la presente invención son las levaduras.

Levaduras se definen en esta memoria como microorganismos eucarióticos e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Yeasts: characterístics and identification, J.A. Barnett, R.W. Payne, D. Yarrow, 2000, 3ª ed, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido, y, The yeasts, a taxonomic study, C.P. Kurtzman y J.W. Fell (comps.) 1998, 4ª ed., Elsevier Science Publ. BV, Amsterdam, Países Bajos), que crecen predominantemente en forma unicelular. Las levaduras pueden crecer, ya sea por injerto de un tallo unicelular o pueden crecer por la fisión del organismo. Células de levaduras preferidas para uso en la presente invención pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia. Preferiblemente, la levadura es capaz de fermentación anaerobia, más preferiblemente fermentación alcohólica anaerobia. A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bio-etanol a partir de azúcares de los cultivos. En la práctica, sin embargo, todos los principales procesos de producción de bioetanol han continuado utilizando las levaduras del género Saccharomyces como productoras de etanol. Esto se debe a las muchas características atractivas de especies de Saccharomyces para procesos industriales, es decir, una alta tolerancia a los ácidos, etanol y osmo-tolerancia, a la capacidad de crecimiento anaerobio y naturalmente a su gran capacidad fermentativa alcohólica. Especies de levaduras como células huéspedes preferidas incluyen S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombe.

En una realización adicional, la célula huésped de la invención comprende, además, una modificación genética que reduce la actividad específica de formiato deshidrogenasa NAD+-dependiente en la célula. Formiato deshidrogenasas NAD+-dependientes (FDH; EC 1.2.1.2) catalizan la oxidación de formiato en bicarbonato donando los electrones a NAD+. En las células de la invención, la actividad específica de formiato deshidrogenasa se reduce preferiblemente en al menos un factor de 0,8, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 ó 0,01 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que provoca la reducción en la actividad específica, preferiblemente en condiciones anaerobias. La actividad de formiato deshidrogenasa se puede determinar según se describe por Overkamp et al. (2002, Yeast 19:509-520).

Preferiblemente, la actividad de formiato deshidrogenasa se reduce en la célula huésped mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión de o inactivan un gen que codifica una formiato deshidrogenasa. Preferiblemente, las modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada una de las copias endógenas del gen que codifica una formiato deshidrogenasa específica en el genoma de la célula. Una célula dada puede comprender múltiples copias del gen que codifica una formiato deshidrogenasa específica con una y la misma secuencia de aminoácidos como resultado de diploidía, poliploidía o aneuploidía. En tales casos, preferiblemente se reduce o inactiva la expresión de cada una de las copias del gen específico que codifica la formiato deshidrogenasa. Alternativamente, una célula puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad formiato deshidrogenasa que difieren en la secuencia de aminoácidos y que son cada una codificada por un gen diferente. En tales casos, en algunas realizaciones de la invención puede preferirse que sólo se reduzcan o inactiven determinados tipos de las isoenzimas, mientras que otros tipos no se ven afectados. Preferiblemente, sin embargo, se reduce o inactiva la expresión de todas las copias de genes que codifican (iso)enzimas con actividad de formiato deshidrogenasa.

Preferiblemente, una actividad de formiato deshidrogenasa que codifica un gen es inactivada por la deleción de al menos una parte del gen o por la interrupción del gen, con lo que en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificadora aguas arriba o aguas abajo de la secuencia codificadora, cuya deleción o inactivación (parcial) resulta en una reducción de la expresión de la actividad de formiato deshidrogenasa en la célula huésped.

Un gen preferido que codifica una formato deshidrogenasa cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es la S. cerevisiae FDH1 según se describe por van den Berg y Steensma (1997, Yeast 13:551-559), que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y ortólogos de la misma en otras especies. Por lo tanto, un gen que codifica una formiato deshidrogenasa cuya actividad ha de ser reducida o inactivada en la célula de la invención es preferiblemente un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5, o un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

Sin embargo, en algunas cepas de S. cerevisiae un segundo gen que codifica una formiato deshidrogenasa es activo, es decir, el FDH2, véase, p. ej., Overkamp et al. (2002, supra). Otro gen preferido que codifica una formiato deshidrogenasa cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es, por lo tanto, un FDH2 de

S. cerevisiae según se describe por Overkamp et al. (2002, supra), que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y ortólogos de la misma en otras especies. Por lo tanto, un gen que codifica una formiato deshidrogenasa cuya actividad ha de ser reducida o inactivada en la célula de la invención es preferiblemente un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 o un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En una realización adicional, se reduce o inactiva la actividad de todos los genes en la célula huésped que codifica una formiato deshidrogenasa. En este tipo de células preferiblemente todas las copias de genes endógenos que codifican una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5 o 6 (o que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 6) son inactivadas o al menos reducidas en la expresión.

En una realización preferida, la célula huésped de la invención comprende, además, un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de reducir acetilCoA en acetaldehído, gen que confiere a la célula la capacidad de convertir acetilCoA (y/o ácido acético) en etanol. Una enzima con la capacidad de reducir acetilCoA en acetaldehído se entiende en esta memoria como una enzima que cataliza la reacción (ACDH; EC 1.2.1.10):

acetaldehído + NAD+ + Coenzima A ↔ acetil-Coenzima A + NADH + H+.

Por lo tanto, la enzima cataliza la conversión de acetilCoA en acetaldehído (y viceversa) y también se la alude como una acetaldehído deshidrogenasa (acetilante NAD-dependiente) o una acetil-CoA reductasa. La enzima puede ser una enzima bifuncional que cataliza, además, la conversión de acetaldehído en etanol (y viceversa; véase más adelante). Por conveniencia, se aludirá en esta memoria a una enzima que tiene al menos la capacidad de reducir 5 acetilCoA en cualquiera de acetaldehído o etanol como una "acetaldehído deshidrogenasa". Además, se entiende en esta memoria que la célula huésped tiene actividades de alcohol deshidrogenasa endógenas que permiten a la célula, estando provista de actividad de acetaldehído deshidrogenasa, completar la conversión de acetil-CoA en etanol. Además, también se prefiere que la célula huésped tenga una acetil-CoA sintetasa endógena que permita a la célula, estando provista de actividad de acetaldehído deshidrogenasa, completar la conversión de ácido acético (a

10 través de acetil-CoA) en etanol.

El gen exógeno puede codificar una enzima monofuncional que tiene solamente actividad acetaldehído deshidrogenasa (es decir, una enzima que sólo tiene la capacidad de reducir acetilCoA en acetaldehído) tal como, p. ej., la acetaldehído deshidrogenasa codificada por el gen mhpF de E. coli. Un gen exógeno adecuado que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica 15 una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 7. Ejemplos adecuados de procariotas que comprenden enzimas monofuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa se proporcionan en la Tabla 3. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas monofuncionales están disponibles en bases de datos públicas y pueden utilizarse por la persona experta para diseñar secuencias de nucleótidos optimizadas en codones que codifiquen la enzima monofuncional

20 correspondiente (véase, p. ej. SEQ ID NO: 8). El gen exógeno que codifica la enzima monofuncional que tiene sólo actividad de acetaldehído deshidrogenasa también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 7.

Tabla 3: Enzimas con actividad de acetaldehído deshidrogenasa relacionada con mhpF de E. coli

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Escherichia coli cepa K12 subcepa MG1655

100%

Shigella sonnei

100%

Escherichi coli IAI39

99%

Citrobacter youngae ATCC 29220

93%

Citrobacter sp. 30_2

92%

Klebsiella pneumoniae 342)

87%

Klebsiella variicola

87%

Pseudomonas putida

81%

Ralstonia eutropha JMP134

82%

Burkolderia sp. H160

81%

Azotobacter.vinelandii DJ

79%

Ralstonia metallidurans CH34

70%

Xanthobacter autotrophicus Py2

67%

Burkolderia cenocepacia J2315

68%

Frankia sp. EAN1pec

67%

Polaromonas sp. JS666

68%

Burkholderia phytofirmans PsJN

70%

Rhodococcus opacus B4

64%

Preferiblemente, la célula huésped comprende un gen exógeno que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de convertir acetilCoA en etanol. La ventaja de utilizar una enzima bifuncional con actividades de acetaldehído deshidrogenasa y 30 alcohol deshidrogenasa en lugar de separar enzimas para cada una de las actividades de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, es que permite la canalización directa del producto intermedio entre las enzimas que catalizan reacciones consecutivas en una ruta y ofrece la posibilidad de medios eficientes, exclusivos y protegidas de suministro de metabolitos. La canalización del sustrato, por lo tanto, disminuye el tiempo de tránsito de los productos intermedios, evita la pérdida de los productos intermedios por difusión, protege productos intermedios 35 lábiles de disolvente y previene la entrada de productos intermedios que compitan en las vías metabólicas. Por consiguiente, la enzima bifuncional permite una conversión más eficiente de acetilCoA en etanol, en comparación con las enzimas acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa por separado. Una ventaja adicional de utilizar la enzima bifuncional es que también se puede utilizar en células huésped que tienen poca o ninguna actividad de alcohol deshidrogenasa bajo la condición utilizada tal como, p. ej., condiciones anaerobias y/o

40 condiciones de represión catabólica.

Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son conocidas en la técnica de procariotas y protozoos, incluyendo, p. ej., las enzimas bifuncionales codificadas por los genes adhE de Escherichia coli y ADH2 de Entamoeba histolytica (véase, p. ej., Bruchaus y Tannich, 1994, J. Biochem. 303: 743748; Burdette y Zeikus, 1994, J. Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett. 27: 505-510; Yong et al, 5 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6464-6469). Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y actividad de alcohol deshidrogenasa son proteínas más grandes que consisten en alrededor de 900 aminoácidos y son bifuncionales, debido a que exhiben actividad tanto de acetaldehído deshidrogenasa (ACDH; EC 1.2.1.10) como de alcohol deshidrogenasa (ADH; EC 1.1.1.1). El adhE de E. coli y ADH2 de Entamoeba histolytica muestran una identidad de aminoácidos del 45%. Por lo tanto, en una realización de la invención, un gen 10 exógeno adecuado que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 9 y 11. Ejemplos adecuados de procariotas comprenden enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y actividad de alcohol deshidrogenasa se proporcionan en las Tablas 4 y 5. Las secuencias de 15 aminoácidos de estas enzimas bifuncionales están disponibles en bases de datos públicas y pueden ser utilizadas por la persona experta para diseñar secuencias de nucleótidos optimizadas en codones que codifican la correspondiente enzima bifuncional (véase, p. ej., SEQ ID NO: 10 ó 12). El gen exógeno que codifica una enzima bifuncional con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones,

20 inserciones y/o deleciones en comparación con al menos una de SEQ ID NO: 9 y 11.

Tabla 4: Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa relacionadas con adhE de E. coli

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Escherichia coli O157:H7 cepa Sakai

100%

Shigella sonnei

100%

Shigella dysenteriae 1012

99%

Klebsiella pneumonia 342

97%

Enterobacter sp. 638

94%

Yersinia pestis biovar Microtus cepa 91001

90%

Serratia proteamaculans 568

90%

Pectobacterium carotovorum WPP14

90%

Sodalis glossinidius cepa ‘morsitans’

87%

Erwinia tasmaniensis Et1/99

86%

Aeromonas hydrophila ATCC 7966

81%

Vibria vulnificus YJ016]

76%

25 Tabla 5: Enzimas bifuncionales con actividad de acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa relacionadas conADH2 de Entamoeba histolytica

Organismo

Identidad de aminoácidos (%)

Entamoeba histolytica HM-1:IMSS

99%

Entamoeba dispar SAW760

98%

Mollicutes bacterium D7

65%

Fusobacterium mortiferum ATCC 9817

64%

Actinobacillus succinogenes 130Z

63%

Pasteurella multocida Pm70

62%

Mannheimia succiniciproducens MBEL55E

61%

Streptococcus sp. 2_1_36FAA]

61%

Para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades de

30 acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa, la secuencia de nucleótidos (a expresar) se coloca en una construcción de expresión en la que está operativamente enlazada a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la expresión de la enzima después de la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase arriba). Promotores adecuados para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima

35 bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa incluyen promotores que son preferiblemente insensible a la represión de catabolitos (glucosa), que son activas en condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de promotores de este tipo se han dado arriba.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y de alcohol deshidrogenasa, o la enzima que tiene actividad de acetaldehído deshidrogenasa está adaptada para optimizar su uso de codones al de la célula huésped en cuestión (según se describe arriba).

La enzima que tiene actividades de acetaldehído deshidrogenasa y, opcionalmente, de alcohol deshidrogenasa se expresa preferiblemente en forma activa en la célula huésped transformada. Por lo tanto, la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una acetaldehído deshidrogenasa con una actividad específica de al menos 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 ó 0,10 μmol min-1 (mg de proteína)-1, determinada como la tasa de reducción de NADH, dependiente de acetil-CoA, en los extractos celulares de la célula huésped transformada a 30°C según se describe en los Ejemplos en esta memoria.

En una realización adicional, la célula huésped de la invención comprende, además, una modificación genética que aumenta al menos uno de: i) la actividad específica de glicerol deshidrogenasa; ii) la actividad específica de dihidroxiacetona quinasa; y iii) el transporte de glicerol a la célula.

Preferiblemente, la modificación genética que aumenta la actividad específica de al menos una de glicerol deshidrogenasa y de dihidroxiacetona quinasa es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de una glicerol deshidrogenasa y una dihidroxiacetona quinasa. Sin embargo, alternativamente, la actividad específica de la glicerol deshidrogenasa y/o dihidroxiacetona quinasa se puede aumentar mediante la expresión de una enzima que tiene actividad incrementada en comparación con la enzima de tipo salvaje endógena de la célula huésped, además de, o como un reemplazo de la enzima de tipo salvaje.

Una glicerol deshidrogenasa se entiende en esta memoria como una enzima que cataliza la reacción química (EC 1.1.1.6):

glicerol + NAD+ ↔ glicerona + NADH + H+

Otros nombres en uso común incluyen glicerina deshidrogenasa, glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+ y glicerol:NAD+ 2-oxidorreductasa. Preferiblemente, la modificación genética determina la sobre-expresión de una glicerol deshidrogenasa, p. ej., mediante la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una glicerol deshidrogenasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa pueden ser endógena a la célula o puede ser una glicerol deshidrogenasa que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobre-expresión de glicerol deshidrogenasa en las células de la invención son, p. ej., el gen glicerol deshidrogenasa de S. cerevisiae (GCY1) tal como, p. ej., se describe por Oechsner et al. (1988, FEBS Lett.

238: 123-128) o Voss et al. (1997, Yeast 13: 655-672). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 13, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 13. En una realización preferida, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la glicerol deshidrogenasa tal como, p. ej., una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la glicerol deshidrogenasa de SEQ ID NO: 13.

Sin embargo, la glicerol deshidrogenasa codificada por el gen GCY1 de levadura parece ser específica para el cofactor NADP+ (EC 1.1.1.72) en oposición a NAD+ (EC 1.1.1.6). Las levaduras tales como S. cerevisiae parecen carecer de actividad de glicerol deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.1.1.6) (véase, p. ej., la ruta KEGG 00561). Secuencias de nucleótidos preferida para la sobreexpresión de una deshidrogenasa de glicerol heteróloga en las células de la invención son, por tanto, por ejemplo, secuencias que codifican deshidrogenasas glicerol bacterianas que utilizan NAD+ como factor de Co (EC 1.1.1.6), tales como por ejemplo, el gen gldA de E. coli descrito por Truniger y Boos (1994, J Bacteriol 176 (6):. 1796-1800)., la expresión de que en la levadura ya ha sido reportado (Lee y Dasilva, 2006, Metab Ing 8 ( l): 58-65). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una deshidrogenasa de glicerol heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de 176(6):1796-1800), cuya expresión en levaduras ya ha sido reseñada (Lee y Dasilva, 2006, Metab Eng. 8(1):58-65). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una glicerol deshidrogenasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 49 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 49. En una realización preferida, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la glicerol deshidrogenasa heteróloga tal como, p. ej., una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicerol deshidrogenasa de SEQ ID NO: 49. Una de estas secuencias de nucleótidos optimizadas en codones se proporciona, p. ej., en SEQ ID NO: 50 (posiciones 10-1113; CAI = 0,976).

Para la sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa, la secuencia de nucleótidos (a ser sobre-expresada) se puede colocar en una construcción de expresión en la que está enlazada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobre-expresión de la enzima glicerol deshidrogenasa después de la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase arriba). Promotores adecuados para la (sobre)expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de glicerol deshidrogenasa incluyen promotores que son preferiblemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa),que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan arriba. En las células de la invención, una glicerol deshidrogenasa a ser sobre-expresada se sobre-expresa preferiblemente en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión. Preferiblemente, la glicerol deshidrogenasa se sobre-expresa en condiciones anaerobias en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobreexpresión. Ha de entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica en la célula), al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario de la codificación del transcrito para la enzima en la célula. La sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una actividad de glicerol deshidrogenasa específica de al menos 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 ó 5,0 U min-1 (mg de proteína)-1, determinado en extractos celulares de las células huésped la transformadas a 30°C según se describe en los Ejemplos de esta memoria.

Una dihidroxiacetona quinasa se entiende en esta memoria como una enzima que cataliza la reacción química ((EC 2.7.1.29):

ATP + glicerona ↔ ADP + fosfato de glicerona

Otros nombres en uso común incluyen glicerona quinasa, ATP:glicerona fosfotransferasa y acetol quinasa (fosforilante). Se entiende que glicerona y dihidroxiacetona son la misma molécula. Preferiblemente, la modificación genética determina la sobre-expresión de una dihidroxiacetona quinasa, p. ej., mediante la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa puede ser endógena a la célula o puede ser una dihidroxiacetona quinasa que es heteróloga a la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobre-expresión de dihidroxiacetona quinasa en las células de la invención son, p. ej. los genes dihidroxiacetona quinasa de S. cerevisiae (DAK1) y (DAK2) tal como, p. ej., se describe por Molin et al. (2003, J. Biol. Chem. 278:1415-1423). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NOs: 14 y 15, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con al menos una de SEQ ID NOs: 14 y 15. En una realización preferida, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la dihidroxiacetona quinasa tal como, p, ej,, una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la dihidroxiacetona quinasa de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la dihidroxiacetona quinasa de SEQ ID NO: 15. Una secuencia de nucleótidos preferida para la sobre-expresión de un dihidroxiacetona quinasa es una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 14 (S. cerevisiae (DAK1), que tiene una

o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 14.

Secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobre-expresión de una dihidroxiacetona quinasa heterólogo en las células de la invención son, p. ej., secuencias que codifican dihidroxiacetona quinasas bacterianas tales como el gen dhaK de Citrobacter freundii, p. ej., descrito por Daniel et al. (1995, J. Bacteriol. 177:4392-4401). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 52 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 52. En una realización preferida se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la dihidroxiacetona quinasa heteróloga tal como, p. ej., una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la secuencia de aminoácidos de la dihidroxiacetona quinasa de SEQ ID NO: 52. Una secuencia de nucleótidos optimizada en codones de este tipo se proporciona, p. ej., en SEQ ID NO: 53 (posiciones 10 -1668).

Para la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa, la secuencia de nucleótidos (a ser sobre-expresada) se puede colocar en una construcción de expresión en la que está operativamente enlazada a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobreexpresión de la enzima dihidroxiacetona quinasa después de la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase arriba). Promotores adecuados para la (sobre)expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de dihidroxiacetona quinasa incluyen promotores que son preferiblemente insensibles a la represión del catabolito (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan arriba. En las células de la invención, un dihidroxiacetona quinasa a ser sobre-expresada se sobre-expresa preferiblemente en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobreexpresión. Preferiblemente, la dihidroxiacetona quinasa se sobre-expresa en condiciones anaerobias por al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobreexpresión. Ha de entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica en la célula), al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario de la codificación del transcrito que codifica la enzima en la célula. La sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una actividad de dihidroxiacetona quinasa específica de al menos 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ó 0,05 U min-1 (mg de proteína)-1, determinado en extractos celulares de las células huéspedes transformadas a 30°C según se describe en los Ejemplos en esta memoria.

Preferiblemente, la modificación genética que aumenta el transporte de glicerol a la célula es preferiblemente una modificación genética que determina la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de una proteína de absorción de glicerol y un canal de glicerol.

Una proteína de absorción de glicerol se entiende en esta memoria como una proteína con múltiples segmentos transmembranales que pertenece a la incluida en la superfamilia de las O-aciltransferasas ligadas a la membrana (MBOAT) que incluyen, p. ej., las proteínas de absorción de glicerol de S. cerevisiae codificadas por los genes GUP1 y GUP2. Preferiblemente, la modificación genética determina la sobre-expresión de una proteína de absorción de glicerol, p. ej., mediante la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de absorción de glicerol. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol puede ser endógena a la célula o puede ser una proteína de absorción de glicerol que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobre-expresión de la proteína de absorción de glicerol en las células de la invención son, p. ej., los genes de proteínas de absorción de glicerol de S. cerevisiae (GUP1) y (GUP2) y ortólogos de los mismos según se describe, p. ej., por Neves et al. (2004, FEMS Yeast Res. 5:51-62). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NOs: 16 (Gup1p) y 17 (Gup2p) o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con al menos una de SEQ ID NOs : 16 y 17. En una realización preferida, se sobreexpresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la proteína de absorción de glicerol tal como, p. ej., una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de absorción de glicerol de SEQ ID NO: 16 o una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de absorción de glicerol de SEQ ID NO: 17. Aunque la naturaleza exacta de la influencia de GUP1 sobre el transporte de glicerol aún no está clara, Yu et al. (2010, supra) han demostrado que la sobre-expresión de GUP1 en

S. cerevisiae mejora la producción de etanol en células de crecimiento en glicerol. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos preferida para la sobre-expresión de una proteína de absorción de glicerol es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de absorción de glicerol que es capaz de rescatar el fenotipo, asociado al estrés de una sal, de un mutante gup1Δ de S. cerevisiae mediante complementación según se describe por Neves et al. (2004, supra). Tales ortólogos de complementación de GUP1 de S. cerevisiae incluyen secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 60, 68, 72, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y pueden obtenerse a partir de especies de levaduras que pertenecen a los géneros de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia.

Un canal de glicerol en esta memoria se entiende como un miembro de la familia MIP de proteínas de los canales revisado por Reizer et al. (1993, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28: 235-257), proteínas de los canales que comprender un dominio transmembrana de 250 -280 aminoácidos que consiste en seis dominios con segmentos membranales y que tienen al menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de identidad de aminoácidos, o al menos 55, 60, 65, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de similitud de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de SEQ ID NO: 18, el FPS1 de acuagliceroporina de S. cerevisiae. Alternativamente, la proteína de los canales comprende un dominio transmembranal de 250 -280 aminoácidos que consiste en seis dominios que abarcan la membrana, y que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de SEQ ID NO: 18.

Las secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobreexpresión de un canal de glicerol en las células de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que codifican el gen FPS1 de acuagliceroporina de levadura, p. ej. S. cerevisiae (Van Aelst et al, 1991, EMBO J. 10: 2095-2104) y ortólogos del mismo de otras levaduras, incluyendo Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus y Zygosaccharomyces rouxii tal como se describe, p. ej., por Neves et al. (2004, supra). Sin embargo, no se excluye el uso de canales de glicerol bacterianos o vegetales, ya que, p. ej., Luyten et al. (1995, EMBO J. 14: 1360-1371) han demostrado que el facilitador de glicerol de E. coli, que tiene solamente un 30% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de la FPS1 de acuagliceroporina de S. cerevisiae, puede complementar la absorción de glicerol en un mutante fps1Δ de S. cerevisiae. La secuencia de nucleótidos que codifica el canal de glicerol puede ser endógena a la célula

o puede ser un canal de glicerol que es heterólogo a la célula. En una realización preferida, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica el canal de glicerol tal como, p. ej., una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la acuagliceroporina de SEQ ID NO: 18.

Para la sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol y/o la proteína del canal de glicerol, la secuencia de nucleótidos (a ser sobre-expresada) se puede colocar en una construcción de expresión en la que está enlazada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobre-expresión de la proteína de absorción de glicerol y/o la proteína del canal de glicerol después de la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase arriba). Promotores adecuados para la (sobre)expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol y/o la proteína del canal de glicerol incluyen promotores que son preferiblemente insensible a la represión de catabolitos (glucosa), que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de promotores de este tipo se dan arriba. En las células de la invención, una proteína de absorción de glicerol y/o una proteína del canal de glicerol a ser sobre-expresada se sobre-expresa preferiblemente en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión. Preferiblemente, la proteína de absorción de glicerol y/o la proteína del canal de glicerol se sobreexpresa en condiciones anaerobias en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión. Ha de entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica en la célula), al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario de la codificación del transcrito para la enzima en la célula.

En una realización adicional, la célula huésped de la invención comprende, además, una modificación genética que aumenta la actividad específica de acetil-CoA sintetasa en la célula, preferiblemente bajo condiciones anaerobias, ya que esta actividad es limitante de la velocidad en estas condiciones. Acetil-CoA sintetasa o acetato-CoA ligasa (EC 6.2.1.1) se entiende en esta memoria como una enzima que cataliza la formación de un nuevo enlace químico entre acetato y coenzima A (CoA). Preferiblemente, la modificación genética determina la sobre-expresión de una acetil-CoA sintetasa, p. ej., mediante la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa puede ser endógena a la célula o puede ser una acetil CoA sintetasa que es heteróloga a la célula. Secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para la sobre-expresión de acetil-CoA sintetasa en las células de la invención son, p. ej., los genes de acetil CoA sintetasa de S. cerevisiae (ACS1 y ACS2) tal como se describe, p. ej., por de Jong-Gubbels et al. (1998, FEMS Microbiol Lett.

165: 15-20). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID NOs: 19 y 20, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con al menos una de SEQ ID NOs: 19 y 20.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que se sobre-expresa codifica una acetil CoA sintetasa con una alta afinidad para acetato. Se prefiere el uso de una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad para acetato de condiciones en las que hay una concentración relativamente baja de ácido acético en el medio de cultivo, p. ej., no más de 2 g de ácido acético/L de medio de cultivo. Una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad para acetato se define en esta memoria como un acetil-CoA sintetasa con una afinidad más alta para acetato que la acetil-CoA sintetasa codificada por S. cerevisiae ACS2 (SEQ ID NO: 20). Preferiblemente, una acetil-CoA sintetasa con una alta afinidad para acetato tiene una Km para acetato de no más de 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 ó 0,1 mM tal como, p. ej., la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS1 de S. cerevisiae. Más preferiblemente, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

En otra realización, la secuencia de nucleótidos que es sobre-expresada codifica una acetil-CoA sintetasa con una tasa máxima (Vmáx). Se prefiere el uso de una acetil-CoA sintetasa con una alta tasa máxima para la condición bajo la cual hay una concentración relativamente alta de ácido acético en el medio de cultivo, p. ej., al menos 2, 3, 4 ó 5 g de ácido acético/L de medio de cultivo. Una acetil-CoA sintetasa con una alta tasa máxima se define en esta memoria como una acetil-CoA sintetasa con una tasa máxima más alta que la acetil-CoA sintetasa codificada por ACS1 de S. cerevisiae. Preferiblemente, la acetil-CoA sintetasa con una alta tasa máxima es la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS2 de S. cerevisiae. Más preferiblemente, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos optimizada en codones (véase arriba) que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

Para la sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa (a ser sobre-expresada) se puede colocar en una construcción de expresión en la que está enlazada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobre-expresión de la enzima acetil-CoA sintetasa después de la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase arriba).

Promotores adecuados para la (sobre)expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad de acetil CoA sintetasa incluyen promotores que son preferiblemente insensibles a la represión de catabolitos (glucosa),que son activos en condiciones anaerobias y/o que preferiblemente no requieren xilosa o arabinosa para la inducción. Ejemplos de tales promotores se dan arriba. En las células de la invención, una acetil CoA sintetasa a ser sobre-expresada se sobre-expresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión. Preferiblemente, la acetil CoA sintetasa se sobre-expresa en condiciones anaerobias en al menos un factor de 2, 5, 10, 20, 50 ó 100, en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión. Ha de entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad específica), al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario de la codificación del transcrito para la enzima.

En una realización adicional, la célula huésped de la invención comprende, además, una modificación genética que reduce la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula. La glicerol 3fosfato deshidrogenasa o glicerolfosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8) cataliza la reducción de la dihidroxiacetona fosfato en sn-glicerol 3-fosfato, mientras que NADH se oxida en NAD+. En las células de la invención, la actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa específica se reduce preferiblemente en al menos un factor de 0,8, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 ó 0,01 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobre-expresión, preferiblemente en condiciones anaerobias.

Preferiblemente, la actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa se reduce en la célula huésped en una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión de o inactivan un gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa. Preferiblemente, las modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada una de las copias endógenas del gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa específica en el genoma de la célula. Una célula dada puede comprender múltiples copias del gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa específica con una y la misma secuencia de aminoácidos como resultado de diploidía, poliploidía o aneuploidía. En tales casos, preferiblemente la expresión de cada una de las copias del gen específico que codifica la glicerolfosfato deshidrogenasa se reduce o inactiva. Alternativamente, una célula puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad de glicerolfosfato deshidrogenasa que difieren en la secuencia de aminoácidos y que son cada una codificada por un gen diferente. En tales casos, en algunas realizaciones de la invención, se prefiere que sólo determinados tipos de las isoenzimas se reduzcan o inactiven mientras que otros tipos no se ven afectados (véase más adelante). Preferiblemente, el gen es inactivado por deleción de al menos una parte del gen o por la interrupción del gen, con lo que en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificante aguas arriba o aguas abajo de la secuencia codificadora, cuya deleción o inactivación (parcial) resulta en una reducción de la expresión de la actividad glicerolfosfato deshidrogenasa en la célula huésped.

Un gen preferido que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa, cuya actividad ha de ser reducida o inactivada en la célula de la invención es el gen GPD2 de S. cerevisiae según se describe por Eriksson et al. (1995, Mol. Microbiol.

17: 95-107), que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y ortólogos de la misma en otras especies. Por lo tanto, un gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa, cuya actividad ha de ser reducida o inactivada en la célula de la invención es preferiblemente un gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21, o una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 21.

En una realización preferida de la invención, la célula huésped de la invención comprende una ruta de respuesta de glicerol de alta osmolaridad funcional. Preferiblemente, por lo tanto, sólo se reduce o inactiva la actividad del o de los genes que codifican una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21, mientras que al menos es funcional un gen endógeno que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con la secuencia de al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad con SEQ ID NO: 22. SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de aminoácidos codificada por el gen GPD1 de S. cerevisiae según se describe por Albertyn et al. (1994, Mol. Cell. Biol. 14: 41354144), que tiene un 69% de identidad de aminoácidos con la glicerolfosfato deshidrogenasa S. cerevisiae GPD2. El gen GPD1 de S. cerevisiae es la glicerolfosfato deshidrogenasa inducida por estrés de S. cerevisiae, que es importante para el crecimiento bajo estrés osmótico como puede ocurrir bajo condiciones de fermentaciones industriales. Su expresión es regulada, entre otros, por la ruta de respuesta de glicerol de alta osmolaridad. Por lo tanto, es ventajoso que una célula huésped de la invención tenga al menos una copia funcional de un gen endógeno que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácidos que tiene una

o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con SEQ ID NO: 22.

En una realización adicional, se reduce o inactiva la actividad de todos los genes en la célula huésped que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa. En tales células, preferiblemente se inactivan o al menos se reducen en la expresión todas las copias de genes endógenos que codifican una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21 ó 22 (o que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con al menos una de SEQ ID NO de: 21 y 22).

En una realización preferida adicional, la célula huésped de la invención tiene al menos uno de: a) la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa; y, b) la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato. Para a) la célula tiene preferiblemente un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional, gen que confiere a la célula la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa. Para b) la célula tiene preferiblemente genes exógenos funcionales que codifican una L-arabinosa isomerasa, una L-ribuloquinasa y una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa, genes que juntos confieren a la célula la capacidad de convertir por isomerización L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato.

Células huésped fúngicas que tienen la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa tal como se describe, p. ej., en el documento WO 03/0624430 y en el documento WO 06/009434. La capacidad de isomerizar xilosa a xilulosa es conferida preferiblemente a la célula mediante transformación con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa. Por lo tanto, preferiblemente la célula adquiere la capacidad de isomerizar directamente xilosa en xilulosa. Por lo tanto, más preferiblemente, la célula adquiere la capacidad de crecer en condiciones aerobias y/o anaerobias en xilosa como única fuente de energía y/o carbono, aunque la isomerización directa de xilosa en xilulosa (y el posterior metabolismo de xilulosa). Es en esta memoria se entiende que la isomerización directa de xilosa en xilulosa se produce en una única reacción catalizada por una xilosa isomerasa, en oposición a la conversión en dos etapas de xilosa en xilulosa a través de un compuesto intermedio de xilitol catalizada por la xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente.

Varias xilosas isomerasas (y sus secuencias de aminoácidos y codificadoras de nucleótidos) que se pueden utilizar con éxito para conferir a la célula de la invención la capacidad de isomerizar directamente xilosa en xilulosa se han descrito en la técnica. Éstas incluyen las xilosa isomerasas de Piromyces sp. y de otros hongos anaerobios que pertenecen a las familias Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces o Ruminomyces (documento WO 03/0624430), Cyllamyces aberensis (documento US 20060234364), Orpinomyces (Madhavan et al, 2008, DOI 10.1007/s00253008-1794-6), la xilosa isomerasa del género Bacteroides bacteriano, incluyendo, p. ej., B. thetaiotaomicron (documento WO 06/009434), B. fragilis y B. uniformis (documento WO 09/109633), la xilosa isomerasa del Clostridium phytofermentans de bacteria anaerobia (Brat et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2304-2311), y las xilosa isomerasas de Clostridium difficile, Ciona intestinales y Fusobacterium mortiferum (documento WO 10/074577).

Células huéspedes fúngicas que tienen la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato tal como se describe, p. ej., en Wisselink et al. (2007, AEM Acepts, publicado en línea previo a la impresión el 1 de junio de 2007; Appl. Environ. Microbiol. doi: 10.1128/AEM.00177-07) y en el documento EP 1 499 708. La capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato se confiere preferiblemente a la célula mediante transformación con uno o más constructos de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican a) una arabinosa isomerasa; b) una ribuloquinasa, preferiblemente una L-ribuloquinasa una xilosa isomerasa; y c) una ribulosa-5-P-4 epimerasa, preferiblemente una L-ribulosa-5-P-4-epimerasa. Preferiblemente, en las células de la invención, la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato es la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5fosfato a través de las reacciones subsiguientes de 1) isomerización de arabinosa en ribulosa ; 2) fosforilación de ribulosa a ribulosa 5-fosfato; y, 3) epimerización de ribulosa 5-fosfato en D-xilulosa 5-fosfato. Secuencias de nucleótidos adecuadas que codifican arabinosa isomerasas, un ribuloquinasa y ribulosa-5-P-4-epimerasas pueden obtenerse de Bacillus subtilis, Escherichia coli (véase, p. ej. el documento EP 1 499 708), Lactobacilli, p. ej., Lactobacillus plantarum (véase, p. ej. Wisselink et al. supra), o especies de Clavibacter, Arthrobacter y Gramella, de los cuales preferiblemente Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y Gramella forsetii (véase el documento WO2009/011591).

La célula huésped transformada de la invención comprende, además, preferiblemente la actividad de xilulosa quinasa, de modo que xilulosa isomerizada a partir de xilosa puede ser metabolizada a piruvato. Preferiblemente, la célula contiene actividad de xilulosa quinasa endógena. Más preferiblemente, una célula de la invención comprende una modificación genética que aumenta la actividad específica xilulosa quinasa. Preferiblemente, la modificación genética determina la sobre-expresión de una xilulosa quinasa, p. ej., mediante la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una xilulosa quinasa. El gen que codifica la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula o puede ser una xilulosa quinasa que es heteróloga a la célula. Una secuencia de nucleótidos que se puede utilizar para la sobre-expresión de xilulosa quinasa en las células de la invención es, p. ej., el gen de la xilulosa quinasa de S. cerevisiae (XKS1) según se describe por Deng y Ho (1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193199). Otra xilulosa quinasa preferida es una xilulosa quinasa que se relaciona con la xilulosa quinasa de Piromyces (xylB; véase el documento WO 03/0624430). Este xilulosa quinasa de Piromyces está en realidad más relacionada con quinasa procariota que con todas las quinasas eucarióticas conocidas tales como la levadura quinasa. Las xilulosa quinasas eucarióticas se han indicado como azúcar quinasas no específicas, que tienen una gama de sustratos amplia que incluye xilulosa. En contraposición, se ha indicado que las xilulosa quinasas procarióticas, con las que la quinasa de Piromyces está más estrechamente relacionada, son quinasas más específicas para xilulosa, es decir, que tienen un intervalo de sustrato más estrecho. En las células de la invención, una xilulosa quinasa a ser sobre-expresada se sobre-expresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina la sobreexpresión. Ha de entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estacionario de la codificación del transcrito que codifica la enzima.

Una célula de la invención comprende, además, preferiblemente una modificación genética que aumenta el flujo de la vía de la pentosa fosfato según se describe en el documento WO 06/009434. En particular, la modificación genética determina un aumento del flujo de la parte no oxidativa de la pentosa fosfato. Una modificación genética que determina un flujo incrementado de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato se entiende en esta memoria que significa una modificación que aumenta el flujo en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que determina el flujo incrementado. El flujo de la parte no oxidativa de la vía de las pentosa fosfato se puede medir como se describe en el documento WO 06/009434.

Modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato se pueden introducir en las células de la invención de diversas maneras. Éstas incluyen, p. ej., conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa quinasa y/o una o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la vía de pentosa fosfato y/o un nivel de estado estacionario reducido de actividad inespecífica de la aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario se puede efectuar mediante la selección de mutantes (espontáneos o inducidos por sustancias químicas o radiación) y/o por tecnología de ADN recombinante, p. ej., mediante la sobreexpresión o la inactivación, respectivamente, de genes que codifican las enzimas o factores que regulan estos genes.

En una célula preferida de la invención, la modificación genética comprende la sobre-expresión de al menos una enzima de la (parte no oxidativa) de la vía de pentosa fosfato. Preferiblemente, la enzima se selecciona del grupo que consiste en las enzimas que codifican ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Se pueden sobre-expresar diversas combinaciones de enzimas de la (parte no oxidativa) de la vía de pentosa fosfato. P. ej., las enzimas que se sobre-expresan pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, y transaldolasa;

o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, y transcetolasa. En una realización de la invención cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa se sobre-expresa en la célula de la invención. Se prefiere una célula en la que la modificación genética comprende al menos la sobre-expresión de la enzima transaldolasa. Más preferida es una célula en la que la modificación genética comprende al menos la sobre-expresión tanto de las enzimas transcetolasa como transaldolasa, ya que una célula huésped de este tipo ya es capaz de crecimiento anaerobio en xilosa. De hecho, bajo algunas condiciones, los autores de la invención han encontrado que las células que sobre-expresan únicamente la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaerobio en xilosa que las células que sobre-expresan las cuatro de las enzimas, es decir, la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5 fosfato 3epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Además, se prefieren células de la invención que sobre-expresan tanto las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa como ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa frente a células que sobre-expresan únicamente la isomerasa o sólo la 3-epimerasa, dado que la sobre-expresión de sólo una de estas enzimas puede producir desequilibrios metabólicos.

Existen diversos medios disponibles en la técnica para la sobre-expresión de enzimas en las células huéspedes de la invención. En particular, una enzima puede ser sobre-expresada aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula, p. ej., mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula, mediante la expresión del gen a partir de un vector de expresión multicopia episomal o mediante la introducción de un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen. La secuencia codificadora utilizada para la sobre-expresión de las enzimas es preferiblemente homóloga a la célula huésped de la invención. Sin embargo, igualmente se pueden emplear secuencias codificadoras que son heterólogas a la célula huésped de la invención. Alternativamente, la sobre-expresión de enzimas en las células de la invención se puede lograr mediante el uso de un promotor que no es nativo a la secuencia codificadora para la enzima a ser sobre-expresada, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia codificadora a la que está enlazado operativamente. Aunque el promotor es preferiblemente heterólogo a la secuencia codificadora a la que está enlazado operativamente, también se prefiere que el promotor sea homólogo, es decir, endógeno a la célula de la invención. Preferiblemente, el promotor heterólogo es capaz de producir un nivel de estado estacionario más alto del transcrito que comprende la secuencia codificadora (o es capaz de producir más moléculas de transcrito, es decir, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo de la secuencia codificadora, preferiblemente bajo condiciones en las que una o más de xilosa, arabinosa y glucosa están disponibles como fuentes de carbono, más preferiblemente como fuentes de carbono principales (es decir, más de 50% de la fuente de carbono disponible consiste en una o más de xilosa, arabinosa y glucosa), lo más preferiblemente como únicas fuentes de carbono.

Una célula preferida adicional de la invención comprende una modificación genética que reduce la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula. Preferiblemente, la actividad inespecífica de la aldosa reductasa se reduce en la célula huésped mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión de o neutralizan un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferiblemente, las modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada una de las copias endógenas de un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica que es capaz de reducir una aldopentosa, incluyendo xilosa, xilulosa y arabinosa, en el genoma de la célula. Una célula dada puede comprender múltiples copias de genes que codifican aldosa reductasas inespecíficas como resultado de diploidía, poliploidía o aneuploidía, y/o una célula puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad de aldosa reductasa que difieren en la secuencia de aminoácidos y que son cada una codificada por un gen diferente. También en tales casos, preferiblemente se reduce o inactiva la expresión de cada uno de los genes que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferiblemente, el gen se inactiva por deleción de al menos una parte del gen o por la interrupción del gen, con lo que en este contexto, el término gen también incluye cualquier secuencia no codificadora aguas arriba o aguas abajo de la secuencia codificadora, cuya deleción o inactivación (parcial) resulta en una reducción de la expresión de la actividad inespecífica de la aldosa reductasa en la célula huésped. Una secuencia de nucleótidos que codifica una aldosa reductasa cuya actividad se ha de reducir en la célula de la invención y secuencias de aminoácidos de dichas aldosa reductasas se describen en el documento WO 06/009434 e incluyen, p. ej., los genes (inespecíficos) de la aldosa reductasa del gen GRE3 de S. cerevisiae (Traff et al, 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67: 5668-5674) y ortólogos de los mismos en otras especies.

Una célula huésped transformada aún más preferida de acuerdo con la invención puede comprender modificaciones genéticas adicionales que resultan en una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en (a) el transporte incrementado de xilosa y/o arabinosa en la célula; (b) una sensibilidad disminuida a la represión catabólica; (c) una tolerancia incrementada al etanol, osmolaridad o ácidos orgánicos; y (d) una producción reducida de sub-productos. Sub-productos se entienden que significan moléculas con contenido en carbono que no sean el producto de fermentación deseado, e incluyen, p. ej., xilitol, arabinitol, glicerol y/o ácido acético. Cualquier modificación genética descrita en esta memoria puede introducirse mediante mutagénesis clásica y rastreo y/o selección para el mutante deseado, o simplemente por rastreo y/o selección de los mutantes espontáneos con las características deseadas. Alternativamente, las modificaciones genéticas pueden consistir en la sobre-expresión de genes endógenos y/o la inactivación de genes endógenos. Genes cuya sobre-expresión se desea para el transporte incrementado de arabinosa y/o xilosa en la célula se eligen preferiblemente de genes que codifican un transportador de hexosa o pentosa. En S. cerevisiae y otras levaduras estos genes incluyen HXT1, HXT2, HXT3, HXT4, HXT5, HXT7 y GAL2, de los cuales los más preferidos son HXT7, HXT5 y GAL2 (véase Sedlack y Ho, Yeast 2004; 21: 671684). Otro transportador preferido para la expresión en levaduras es el transportador de glucosa codificado por el gen SUT1 de P. stipitis (Katahira et al, 2008, Enzyme Microb. Technol. 43: 115-119). De manera similar, se pueden sobre-expresar ortólogos de estos genes transportadores en otras especies. Otros genes que pueden ser sobreexpresados en las células de la invención incluyen genes que codifican enzimas glucolíticas y/o enzimas etanologénicas tales como alcohol deshidrogenasas. Genes endógenos preferidos para la inactivación incluyen genes de hexosa quinasa, p. ej., el gen HXK2 de S. cerevisiae (véase Diderich et al, 2001, Appl. Environ. Microbiol.

67: 1587-93); los genes MIG1 o MIG2 de S. cerevisiae; genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de glicerol tales como los genes de S. cerevisiae glicerol fosfato deshidrogenasa 1 y/o 2, u ortólogos (hibridantes) de estos genes en otras especies. Otras modificaciones adicionales preferidos de células huéspedes para la fermentación de xilosa se describen en van Maris et al. (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418), documentos WO2006/009434, WO2005/023998, WO2005/111214 y WO2005/091733. Cualquiera de las modificaciones genéticas de las células de la invención según se describe en esta memoria, en la medida de lo posible, son introducidas o modificadas preferiblemente por modificación genética de auto-clonación.

Una célula huésped preferida de acuerdo con la invención tiene la capacidad de crecer en al menos una de xilosa y arabinosa como fuente de carbono/energía, preferiblemente como única fuente de carbono/energía, y preferiblemente bajo condiciones anaerobias, es decir, condiciones según se definen en esta memoria más adelante para el proceso de fermentación anaerobia. Preferiblemente, cuando se cultivan en xilosa como fuente de carbono/energía, la célula huésped no produce esencialmente xilitol, p. ej., el xilitol producido está por debajo del límite de detección o, p. ej., menos de 5, 2, 1, 0,5 ó 0,3% del carbono consumido sobre una base molar. Preferiblemente, cuando se cultivan en arabinosa como fuente de carbono/energía, la célula no produce esencialmente arabinitol, p. ej., el arabinitol producido está por debajo del límite de detección o, p. ej., menos de 5, 2, 1, 0,5 ó 0,3% del carbono consumido sobre una base molar.

Una célula huésped preferida de la invención tiene la capacidad de crecer en al menos una de una hexosa, una pentosa, glicerol, ácido acético y combinaciones de los mismos a una tasa de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 en condiciones aerobias o, más preferiblemente, a una tasa de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 en condiciones anaerobias. Por lo tanto, preferiblemente la célula huésped tiene la capacidad de crecer en al menos una de xilosa y arabinosa como única fuente de carbono/energía a una tasa de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 en condiciones aerobias o, más preferiblemente, a una tasa de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 bajo condiciones anaerobias. Más preferiblemente, la célula huésped tiene la capacidad de crecer en una mezcla de una hexosa (p. ej., glucosa) y al menos una de xilosa y arabinosa (en una relación ponderal de 1: 1) como única fuente de carbono/energía a una tasa de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 en condiciones aerobias o, más preferiblemente, a una tasa de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12 , 0.15 ó 0.2 h-1 bajo condiciones anaerobias. Más preferiblemente, la célula huésped tiene la capacidad de crecer en una mezcla de una hexosa (p. ej., glucosa), al menos una de xilosa y arabinosa y glicerol (en una relación ponderal de 1: 1: 1) como única fuente de carbono/energía a una tasa de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 en condiciones aerobias o, más preferiblemente, a una tasa de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08 , 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 bajo condiciones anaerobias.

En un aspecto, la invención se refiere al uso de una célula de levadura de acuerdo con la invención para la preparación de un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, ácido láctico, ácido 3hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propano-diol, butanoles y productos derivados de isoprenoides.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propano-diol, butanoles (1-butanol, 2 butanol, isobutanol) y productos derivados de isoprenoides. El procedimiento puede ser un procedimiento en el que se produce formiato además del producto de fermentación. El procedimiento comprende preferiblemente la etapa de: a) fermentar un medio con una célula de levadura, con lo que el medio contiene o es alimentado con: a) una fuente de al menos una de una hexosa, una pentosa y glicerol y en donde la célula de levadura fermenta la al menos una de una hexosa, pentosa y glicerol al producto de fermentación y, opcionalmente, a formiato. Preferiblemente, la célula de levadura es una célula (huésped) según se define arriba en esta memoria. El procedimiento comprende preferiblemente, además, una o más etapas adicionales en las que se recuperan el producto de fermentación y/o el formiato. El procedimiento puede ser un procedimiento discontinuo, un procedimiento de alimentación por lotes o un procedimiento continuo como son bien conocidos en la técnica.

En un procedimiento preferido, la fuente de al menos una de una hexosa, una pentosa y glicerol comprende o consiste en: hexosa y pentosa; hexosa y glicerol; pentosa y glicerol; hexosa, pentosa y glicerol. En un procedimiento preferido adicional, la fuente de al menos una de una hexosa, una pentosa y glicerol comprende, además, ácido acético.

En un procedimiento preferido la fuente de hexosa comprende o consiste en glucosa. Preferiblemente, la fuente de pentosa comprende o consiste en al menos una de xilosa y arabinosa, de las cuales se prefiere xilosa. Preferiblemente, el medio fermentado por las células de la invención comprende o es alimentado con (fracciones de) biomasa hidrolizada que comprende al menos una de al menos una hexosa y una pentosa tal como glucosa, xilosa y/o arabinosa. La (fracciones de) biomasa hidrolizada que comprenden las hexosas y las pentosas comprenderán habitualmente también ácido acético (o una sal del mismo). Un ejemplo de biomasa hidrolizada a fermentar en los procedimientos de la invención es, p. ej., biomasa lignocelulósica hidrolizada. Biomasa lignocelulósica se entiende aquí como biomasa vegetal que se compone de celulosa, hemicelulosa y lignina. Los polímeros de hidratos de carbono (celulosa y hemicelulosa) están estrechamente vinculados a la lignina. Ejemplos de biomasa lignocelulósica a ser hidrolizada para uso en la presente invención incluyen los residuos agrícolas (incluyendo, p. ej., racimos vacíos (EFB) de la palma de aceite, rastrojo de maíz y bagazo de caña de azúcar), residuos de madera (incluyendo desechos de aserraderos y fábricas de celulosa) y residuos de papel (municipales). Métodos para la hidrólisis de biomasa tal como lignocelulosa son conocidos en la técnica per se, e incluyen, p. ej., ácidos tal como ácido sulfúrico y enzimas tales como celulasas y hemicelulasas.

En el procedimiento de la invención, las fuentes de xilosa, glucosa y arabinosa pueden ser xilosa, glucosa y arabinosa como tales (es decir, como azúcares monoméricos) o pueden estar en forma de cualquier oligómero o polímero de hidratos de carbono que comprende unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa tales como, p. ej., lignocelulosa, arabinanos, xilanos, celulosa, almidón y similares. Para la liberación de unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa a partir de este tipo de hidratos de carbono, carbohidrasas apropiadas (tales como arabinasas, xilanasas, glucanasas, amilasas, celulasas, glucanasas y similares) pueden añadirse al medio de fermentación o pueden ser producidas por la célula huésped modificada. En este último caso, la célula huésped puede ser modificada por ingeniería genética para producir y excretar estas carbohidrasas. Una ventaja adicional del uso de fuentes oligoméricas o poliméricas de glucosa es que permite mantener una concentración baja (más baja) de glucosa libre durante la fermentación, p. ej., mediante el uso de cantidades limitantes de la tasa de las carbohidrasas preferiblemente durante la fermentación. Esto, a su vez, evitará la represión de los sistemas necesarios para el metabolismo y transporte de azúcares no glucosa tales como xilosa y arabinosa. En un procedimiento preferido, la célula huésped modificada fermenta tanto la glucosa y al menos una de xilosa y arabinosa, preferiblemente de forma simultánea, en cuyo caso preferiblemente se utiliza una célula huésped modificada que es insensible a la represión de glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de al menos una de una hexosa, una pentosa y glicerol como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá, además, los ingredientes apropiados requeridos para el crecimiento de la célula huésped modificada. Composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos eucariotas tales como levaduras son bien conocidas en la técnica.

En el procedimiento de la invención, el medio comprende además preferiblemente y/o es alimentado con una fuente de glicerol. El glicerol para su uso en el procedimiento de la presente invención puede ser ventajosamente glicerol que se genera como un subproducto en la producción de biodiesel a partir de reacciones de transesterificación utilizando aceites vegetales tales como aceite de palma, o grasas animales y un alcohol.

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio. Un proceso de fermentación anaerobio se define aquí como una operación de proceso de fermentación en ausencia de oxígeno o en la que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente se consume menos de 5, 2,5 ó 1 mmol/L/h, más preferiblemente 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en la que las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones y aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, NADH producido en la glucólisis y la formación de biomasa no puede ser oxidado mediante fosforilación oxidativa. Para resolver este problema muchos microorganismos utilizan piruvato o uno de sus derivados como un aceptor de electrones y de hidrógeno, regenerando con ello NAD+. Así, en un proceso de fermentación anaerobia preferido se utiliza piruvato como un electrón (y aceptor de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, así como productos de fermentación no etanol tales como ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propanodiol, butanoles (1-butanol, 2-butanol, isobutanol) y productos derivados de isoprenoides, preferiblemente bajo la producción concomitante de formiato. Se prefieren los procesos anaerobios de la invención frente a los procesos aerobios, ya que los procesos anaerobios no requieren inversiones ni energía para la aireación y, además, los procesos anaerobios producen mayores rendimientos de producto que los procesos aerobios. Alternativamente, el proceso de fermentación de la invención puede ser ejecutado bajo condiciones limitadas de oxígeno aerobias. Preferiblemente, en un proceso aerobio bajo condiciones limitadas de oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos 5,5, más preferiblemente al menos 6 e incluso más preferiblemente al menos 7 mmol/L/h.

El proceso de fermentación se ejecuta preferiblemente a una temperatura que es óptima para las células modificadas de la invención. Por lo tanto, para la mayoría de las células de levadura, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es inferior a 42°C, preferiblemente inferior a 38°C. Para las células de levadura, el proceso de fermentación se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura que es inferior a 35, 33, 30 ó 28°C y a una temperatura que es superior a 20, 22 ó 25°C.

Debido a que el ácido fórmico no disociado es más tóxico para las células huésped de la invención en comparación con el ion ácido disociado, el proceso de fermentación se ejecuta preferiblemente a un pH que es mayor que el pKa del ácido fórmico, que es 3,75. Por consiguiente, el proceso de fermentación se ejecuta preferiblemente a un pH de al menos 3,8, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 u 8,0. Preferiblemente, el proceso de fermentación se lleva a cabo a al menos los pHs antes mencionados durante toda la duración del proceso. Alternativamente, el pH puede ser regulado a fin de mantener la concentración de ácido fórmico no disociado por debajo de una concentración dada. Preferiblemente, el pH del medio se regula durante el proceso de fermentación para mantener una concentración de ácido fórmico no disociado que no es mayor que 50,0, 30,0, 20,0, 18,1, 15,0, 10,0, 5,0, 2,0 ó 1,0 mM.

Un proceso de fermentación preferido de acuerdo con la invención es un procedimiento para la producción de etanol y, opcionalmente, formiato, en donde el proceso comprende la etapa de fermentar un medio con una célula de levadura, con lo que el medio contiene o es alimentado con una fuente de al menos una de una hexosa, una pentosa y glicerol y en el que la célula de levadura fermenta la al menos una de una hexosa, pentosa y glicerol a etanol y, opcionalmente, formiato. Opcionalmente, el proceso comprende la etapa de recuperación de al menos uno de etanol y, opcionalmente, formiato. La fermentación puede además realizarse según se describe arriba. En el proceso la productividad volumétrica de etanol es preferiblemente al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ó 10,0 g de etanol por litro por hora. El rendimiento de etanol en hexosa y/o pentosa y/o glicerol (y/o acetato) en el proceso es preferiblemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%. El rendimiento de etanol se define aquí como un porcentaje del rendimiento máximo teórico que, para xilosa, glucosa y arabinosa, es 0,51 g de etanol por g de hexosa o pentosa. Para glicerol el rendimiento máximo teórico es 0,50 g de etanol por g de glicerol, y para ácido acético el rendimiento máximo teórico es de 0,77 g de etanol por g de ácido acético.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitativo en el sentido de que están incluidos los artículos siguientes de la palabra, pero no se excluyen los artículos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una", por lo tanto, significa habitualmente "al menos uno".

Todas las referencias a patentes y bibliografía citadas en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

1. Ensayos de actividad enzimática

Extractos celulares para ensayos de actividad se prepararon a partir de cultivos por lotes aerobios o anaerobios en crecimiento exponencial y se analizaron en cuanto al contenido de proteína según se describe por Abbot et al, (2009, Appl. Environ. Microbiol. 75:2320-2325).

La actividad de acetaldehído deshidrogenasa NAD+-dependiente (EC 1.2.1.10) se midió a 30°C monitorizando la oxidación de NADH a 340 nm. La mezcla de reacción (volumen total 1 ml) contenía tampón fosfato potásico 50 mM (pH 7,5), NADH 0,15 mM y extracto celular. La reacción se inició mediante la adición de acetil-coenzima A 0,5 mM.

Para determinar la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8), se prepararon extractos celulares según se describe arriba, excepto que el tampón fosfato fue reemplazado por tampón trietanolamina (10 mM, pH 5). Las actividades de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se ensayaron en extractos celulares a 30°C según se describió previamente (Blomberg y Adler, 1989, J. Bacteriol. 171:1087-1092,9). Las velocidades de reacción eran proporcionales a las cantidades de extracto de células añadidas.

La actividad de acetil-CoA sintasa (EC 6.2.1.1) se midió según se describe por Frenkel y Kitchens (1977, J. Biol. Chem. 252: 504-507), que es una modificación del método de Webster (Webster, 1969, Methods Enzymol. 13: 375381). La formación de NADH medida se realiza espectrofotométricamente cuando la acetil-CoA producida se acopla con reacciones de citrato sintasa y malato deshidrogenasa. El sistema de ensayo contenía Tris-Cl 100 mM (pH 7,6), MgCl2 10 mM, ATP 6 mM, malato 5 mM, NAD+ 1 mM, NADH 0,1 mM, ditiotreitol 2,5 mM o 2-mercaptoetanol, coenzima A 0,2 mM, 25 µg de citrato sintasa (80 unidades/mg), 20 µg de malato deshidrogenasa (1000 unidades/mg), y acetato 10 mM y la tasa se midió a 340 nm y se calculó a partir del coeficiente de extinción de NADH (6,22 x 106 cm2/mol).

La actividad de la glicerol deshidrogenasa y de la dihidroxiacetona quinasa se miden a 30°C en extractos celulares, esencialmente como se describe anteriormente (González et al, 2008, Metab. Eng. 10, 234-245). Las actividades enzimáticas de glicerol deshidrogenasa y de dihidroxiacetona quinasa se reseñan como µmoles de sustrato/min/mg de proteína celular.

2. Construcción de la cepa

Todas las modificaciones se inician con la cepa RN1041 fermentadora de xilosa. RN1041 es una cepa basada en CEN.PK con el siguiente genotipo:

Mat a, ura3-52, Ieu2-112, his3::loxP, gre3 ::loxP, loxP-Ptpi::TAL1, loxP-Ptpi::RK11, loxP-Ptpi-TKL1, loxP-Ptpi-RPE1, delta::Padh1XKSlTcyc1-LEU2, delta::URA3-Ptpi-xylA-Tcicl

Mat a = tipo de apareamiento a

Mutaciones ura3-52, leu2-112, his3::loxP en los genes ura3, leu2 y his3, el ura3 se complementa con la construcción de sobre-expresión xylA de Piromyces, leu2 se complementa con la construcción de sobre-expresión XKS1. his3 podría ser utilizado para la selección de plásmidos adicionales, RN1041 necesita histidina en el medio de crecimiento.

gre3::loxP = deleción del gen gre3 que codifica xilosa reductasa, el sitio loxP queda después de la eliminación del marcador.

loxP-Ptpi ….= sobre-expresión de la vía pentosas fosfato het, el sitio loxP aguas arriba del promotor constitutivo se deja después de la eliminación del marcador.

delta:: = integración de la construcción después de la recombinación en las repeticiones terminales largas del retrotransposón Ty1.

Construcciones para la expresión de genes pflA y pflB de E. coli en levadura

Los genes pflA y pflB de E. coli se obtuvieron como genes sintéticos optimizados en codones. La construcción de expresión de pflA ligando un fragmento promotor de TEF1 (cortado con las enzimas de restricción SalI y HindIII, de la colección de plásmidos Royal Nedalco), un ORF (marco de lectura abierto) sintético de pflA (cortado con HindIII y BssHII) y un fragmento terminador de ADH1 (cortado con BssHII y BsiWl; de la colección de plásmidos Royal Nedalco) junto con pCRII romo (Invitrogen) para producir pRN613.

La construcción de expresión de pflB ligando un fragmento de promotor de PGK1 (cortado con las enzimas de restricción Spel y PstI; de la colección de plásmidos Royal Nedalco), un ORF sintético de pflB (cortado con PstI y SalI) y un fragmento terminador de PGl1 (cortado con XhoI y BsiWl; de la colección de plásmidos Royal Nedalco) juntos en pCRII romo (Invitrogen) para producir pRN614.

El marcador LEU2 del plásmido pRS305 (Sikorski y Hieter, 1989, Genetics 122:19-27) se intercambia para el marcador ZeoMX (zeoMX = resistencia a fleomicina debido a la expresión del gen Tn5 ble con una secuencia de promotor de TEF1 y de terminador de Ashbya gossypii). Los transformantes de levadura se seleccionan en medios que contienen zeomicina, pRS305 se corta con BStBl y BsrGl y un fragmento de ZeoMX (de la colección de plásmidos Royal Nedalco) se corta con las mismas enzimas de restricción. El ligamiento proporciona el plásmido pRS30z.

Un ORI de 2μ se introduce cortando pRS30z con Aflll en Mfel y cortando un fragmento de 2μ (de la colección de plásmidos Royal Nedalco) con Aflll y EcoRI. Los fragmentos se ligan para producir pRN615 (6341 pb).

Para la construcción final pRN615 se corta con XhoI y Spel, este vector se combina con los insertos de pRN613 cortados con SalI y BsiWl (1510 pb) y pRN614 cortado con Spel y BsiWl (3381 pb) para producir pRN616 (SEQ ID NO: 31).

Para la expresión de sólo el gen pflA de E. coli, pRN613 se corta con SalI y BsiWl y este fragmento se liga en pRN615 cortado con Acc65I y XhoI para producir pRN619 (SEQ ID NO: 32).

Para la expresión de sólo el gen pflB de E. coli, pRN614 se corta con XhoI y BsiWl y este fragmento se liga en pRN615 cortado con Acc65I y XhoI para producir pRN620 (SEQ ID NO: 33).

Los plásmidos pRN616, pRN619 y pRN620 se utilizan para transformar la cepa de levadura RN1041 junto con los otros plásmidos como se indica en la Tabla 7 para generar las cepas como se indica en la Tabla 7.

Construcciones para la sobre-expresión de GCY1, gldA, DAK1 dhaK y GUP1

GCY1

La PCR se lleva a cabo en ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores introduciendo un sitio PstI 5’ de la ATG y un sitio Aflll 3’ de la TAA para producir el fragmento de SEQ ID NO: 25. Un fragmento de ADN que comprende el promotor Actin1 de S. cerevisiae se liga aguas arriba del ORF de GCY1 y el fragmento de ADN que comprende el fragmento de terminador ADH1 de S. cerevisiae se ligó aguas abajo del ORF de GCY1.

gldA

La construcción para la expresión en la levadura del gldA de E. coli se hizo mediante ligamiento de un fragmento de promotor ACT1 de levadura (cortado con las enzimas de restricción Spel y PstI), un ORF sintético (SEQ ID NO: 50), que codifica el gldA de E. coli (cortado con PstI en BssHll) y un fragmento de terminador de CYC1 de levadura (cortado con BssHII y BsiWl) juntos en pCRII romo (Invitrogen) para producir pRNgldA (SEQ ID NO: 51).

DAK1

La PCR se lleva a cabo en ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores introduciendo un sitio XbaI 5’ de la ATG y un sitio SalI 3’ de la TAA para producir el fragmento que figura en SEQ ID NO: 26. Un fragmento de ADN que comprende el promotor TPI1 de S. cerevisiae se liga aguas arriba del ORF de DAK1 y el fragmento de ADN que comprende el fragmento de terminador PGI1 de S. cerevisiae se ligó aguas abajo del ORF de DAK1 para producir la construcción de expresión de SEQ ID NO: 26.

dhaK

La construcción para la expresión en la levadura de dhaK de Citrobacter freundii se hizo ligando el fragmento de promotor TPI1 de levadura (cortado con las enzimas de restricción XhoI y XbaI), un ORF sintético (SEQ ID NO: 53) que codifica dhaK de C. freundii (cortado con XbaI y SalI) y un fragmento de terminador PGI1 levadura (cortado con XhoI y BsiWl) juntos en pCRII romo (Invitrogen) para producir pRNdhaK (SEQ ID NO: 54).

GUP1

La PCR se lleva a cabo en ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores introduciendo un sitio HindIII 5’ de la ATG y un sitio BamHI 3’ de la TAA para producir el fragmento que figura en SEQ ID NO: 27. Un fragmento de ADN que comprende el promotor TDH3 de S. cerevisiae se liga aguas arriba del ORF de GUP1 y el fragmento de ADN que comprende el fragmento terminador CYC1 de S. cerevisiae se liga aguas abajo del ORF de GUP1 para producir la construcción de expresión de SEQ ID NO: 27.

Cepas que sobre-expresan GCY1, DAK1 y GUP1

Las construcciones de expresión arriba descritas de GCY1, DAK1 y GUP1 se combinan en un plásmido centromérico a base de pRS315 que tiene el gen de resistencia a higromicina como marcador seleccionable para producir pRN605 (SEQ ID NO: 29). El plásmido pRN605 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7.

Las construcciones de expresión arriba descritas de GCY1 y DAK1 se combinan en un plásmido centromérico a base de pRS315 que tiene el gen de resistencia a higromicina como marcador seleccionable para producir pRN608 (SEQ ID NO: 30) se utilizan para transformar la cepa de levadura RN1041 junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar la cepa RN1098, según se indica en la Tabla 7.

Cepas que expresan gldA de E. coli con o sin la expresión de dhaK de C. freundii

La construcción de expresión gldA de E.coli se corta del plásmido pRNgldA con las enzimas de restricción Spel y BsiWl. La construcción de expresión dhaK de C.freundii se corta a partir del plásmido pRNdhaK con las enzimas de restricción XhoI y BsiWl. Estos fragmentos se ligan en el plásmido pRN595 cortado con las enzimas de restricción Spel y SalI para producir pRN957 (SEQ ID NO: 55). El plásmido pRN958 (SEQ ID NO: 56) se hace posteriormente a partir del plásmido pRN957 mediante la supresión de la construcción de expresión dhaK de C.freundii. Para ello, el plásmido pRN957 se corta con las enzimas de restricción PspOMI y AvrII, las partes de cadena sencilla se rellenan con la ADN polimerasa phusion (Finnzymes) y el plásmido se vuelve a ligar.

Las construcciones de expresión de DAK1 y GUP1 se combinan en un plásmido centromérico a base de pRS315 que tiene el gen de resistencia a higromicina como marcador seleccionable para producir pRN607 (SEQ ID NO: 57).

Los plásmidos pRN957, pRN958 y pRN607 utilizados para transformar la levadura junto con los otros plásmidos indicados en la Tabla 7 para producir la cepa RN1194, RN1195 y RN1196.

Construcción para la sobreexpresión de FPS1

La PCR se lleva a cabo en ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores introduciendo un sitio NsiI 5’ de la ATG y un sitio BamHI 3’ de la TAA para producir el fragmento que figura en SEQ ID NO: 28. Un fragmento de ADN que comprende el promotor ADH1 (medio) de S. cerevisiae se liga aguas arriba del ORF de FSP1 y el fragmento de ADN que comprende el fragmento de terminador CYC1 de S. cerevisiae se liga aguas abajo del ORF de FSP1 para producir la construcción de expresión de SEQ ID NO: 28. El ligamiento de estos fragmentos en pCRII romo produce pRN617. El inserto de pRN617 se corta con BsiWl y XhoI y se clona en pRN616 cortado con BsrGI y SalI para producir pRN618 (SEQ ID NO: 34). El plásmido pRN618 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7.

Construcciones para la deleción de FDH1 y FDH2

Los cebadores FDHuf, FDHur, FDHdf y FDHdr se utilizan para la amplificación de fragmentos de secuencias genómicas aguas arriba y aguas abajo de los dos genes FDH1 y FDH2 para su inactivación. Los mismos cebadores se utilizan para los dos alelos FDH1 y FDH2.

Para la inactivación del alelo FDH1, un fragmento de PCR de 423 pb aguas arriba con un sitio BspEI en el extremo 3' para el ligamiento al marcador de MX, y un sitio Bbsl en el extremo 5' para el aislamiento de la construcción de deleción se amplifica utilizando FDHuf y FDHur y se clona en pCRII (romo) utilizando la clonación topo (Invitrogen), que resulta en un sitio BstBl adicional en el extremo 5'.

FDHuf: TCGAAGACTCCGAATGAAAAAGACATGCCAG (SEQ ID NO: 35)

FDHur: TCCGGATACCAAGTTCATTTTCAATACACCCCA (SEQ ID NO: 36)

Un fragmento de PCR de 378 pb aguas abajo con un sitio NsiI y un sitio SphI en el extremo 5’ para el ligamiento al marcador de MX, y un sitio Bbsl en el extremo 3' para el aislamiento de la construcción de deleción se amplifica utilizando FDHdf y FDHdr.

FDHdf: ATGCATGCAGAATGGTTCTTATGCCAC (SEQ ID NO: 37)

FDHdr: GAAGACAGTTCTGTTATTAACGACGAGCCA (SEQ ID NO: 38)

Para la construcción final el fragmento aguas abajo cortado con XhoI y NsiI se liga al marcador patMX (colección Royal Nedalco) cortado con BspEI y NsiI en el plásmido que contiene el fragmento aguas arriba cortado con BspEI y XhoI. El plásmido final, pRN621 (SEQ ID NO: 39), se corta con Bbsl antes de la transformación de la levadura. Se seleccionan transformantes para la resistencia a fosfinotricina. La integración correcta del fragmento de interrupción se verifica mediante PCR con cebadores específicos.

FDH2 se encuentra como un pseudogen en algunas cepas (p. ej. S288C, YPL275W e YPL276W). Dos mutaciones restaurar la homología de ORF con FDH1 (T436C y delA476). El análisis de la secuencia muestra que en el fondo CEN.PK (RN1041) FDH2 es un ORF homólogo a FDH1.

Para la construcción final el fragmento aguas abajo cortado con XhoI y SphI se liga al marcador kanMX (colección Royal Nedalco) cortado con BspEI y SphI en el plásmido que contiene el fragmento aguas arriba cortado con BspEI y XhoI. El plásmido final, pRN622 (SEQ ID NO: 40), se corta con Bbsl antes de la transformación de la levadura. Los transformantes se seleccionan para resistencia a G418. La integración correcta del fragmento de interrupción se verifica mediante PCR con cebadores específicos.

Fragmentos de interrupción de pRN621 y pRN622 se utilizan para transformar la cepa de levadura RN1041 junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7.

Construcciones para la expresión de los genes mhpF, adhE de E. coli o adh2 de Entamoebe histolytica en levaduras

Para la expresión del gen mhpF de E. coli, un fragmento de promotor de PGK1 de levadura (Spel-PstI) y un fragmento de terminador de ADH1 (Aflll-NotI) (ambos de la colección de plásmidos Nedalco) se ligaron en el fragmento sintético optimizado en codones que codifica el mhpF de E. coli (SEQ ID NO: 8).

pRS 303 con 2μ ori (= pRN347, colección de plásmidos Royal Nedalco) se cortó con SpeI y NotI y la construcción de expresión de mhpF se clonó en este vector para producir pRN558 (SEQ ID NO: 41). pRN558 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 (selección en medio que carece de histidina) junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7. La sobre-expresión de mhpF se verifica mediante qPCR.

Para la expresión del gen adhE de E. coli, un fragmento sintético optimizado en codones que codifica el adhE de E. coli (SEQ ID NO: 10) se corta con XbaI y AfllI y se liga en pRN558 cortado con XbaI y AfllI (reemplazando el gen mhpF de E. coli en pRN558) para producir pRN595 (SEQ ID NO: 42). pRN595 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 (selección en medio que carece de histidina), junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7. La sobre-expresión de adhE se verifica mediante qPCR.

Para la expresión del adh2 de Entamoebe histolytica, un fragmento sintético optimizado en codones que codifica el adh2 de E. coli (SEQ ID NO: 12) se corta con XbaI y AfllI y se liga en pRN558 cortado con XbaI y AfllI (reemplazando el gen mhpF de E. coli en pRN558) para producir pRN596 (SEQ ID NO: 43). pRN596 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 (selección en medio que carece de histidina), junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7. La sobre-expresión de adh2 se verifica mediante qPCR.

Construcciones para la deleción de GPD2

Los cebadores GPD2uf, GPD2ur, GPD2df y GPD2dr se utilizan para la amplificación de fragmentos de secuencias genómicas aguas arriba y aguas abajo del gen GPD2 para su inactivación. Un fragmento de PCR de 407bp aguas arriba con un sitio Aflll en el extremo 3' (derivado de la secuencia de GPD2) y un sitio BglII en el extremo 5' (para el aislamiento de la construcción de deleción) se amplifica utilizando GPD2uf, GPD2ur y se clona en pCR2.1 (topo T / A, Invitrogen).

GPD2uf: GGTACCAGATCTTTTGCGGCGAGGTGCCG (SEQ ID NO: 44)

GPD2ur: TCTAGACTTAAGGAATGTGTATCTTGTTAATCTTCTGACAGC (SEQ ID NO: 45)

Un fragmento de PCR de 417 pb aguas abajo con un sitio XhoI en el extremo 5' y un sitio BglII en el extremo 3' se amplifica utilizando GPD2df y GPD2dr.

GPD2df: CTCGAGATAGTCTACAACAACGTCCGCA (SEQ ID NO: 46)

GPD2dr: CCATGGAGATCTGCAGTGAAAAAGCTCGAAGAAACAGCT (SEQ ID NO: 47)

Para la construcción final, el plásmido que contiene el fragmento aguas arriba se corta con Aflll y Kpn, el fragmento aguas abajo se corta con XhoI en Ncol y el marcador natMX (colección de plásmidos Royal Nedalco) se corta con Aflll en XhoI y los fragmentos se ligan para producir el plásmido pRN594 (SEQ ID NO: 48). pRN594 se corta con BglII antes de la transformación de la levadura. pRN594 se utiliza para transformar la cepa de levadura RN1041 (selección para la resistencia a nourseotricina) junto con los otros plásmidos según se indica en la Tabla 7 para generar las cepas según se indica en la Tabla 7. La integración correcta se verifica mediante PCR utilizando cebadores específicos.

3. Fermentaciones con las cepas construidas

3.1 Ajuste experimental

Las cepas RN1041, RN1088, RN1089, RN1090, RN1091, RN1092, RN1093, RN1094, RN1095, RN1096, RN1097, RN1098, RN1099, RN1194, RN1195 y RN1196 se someten todas a ensayo en cuanto a su capacidad para crecer tanto en condiciones anóxicas (sin oxígeno presente) a expensas de glicerol como fuente de carbono. Al mismo tiempo, se monitoriza la formación de ácido fórmico y etanol. En varios casos se confirma mediante experimentos que las cepas consumidoras de glicerol también conservan su capacidad de fermentar glucosa y xilosa. Precultivos de las cepas se preparan mediante la inoculación de un cultivo patrón de glicerol congelado de la levadura en un medio YP (extracto de levadura -peptona) con la adición del azúcar glucosa (2,5% p/v) a 32°C y pH 5,5. Después de 24 h de incubación, este cultivo se utiliza para inocular los cultivos del fermentador. Las células se recogen mediante centrifugación y se lavan con dH2O fría. La inoculación de la levadura utilizada es 2 gramos de levadura en materia seca por litro de medio de fermentación.

Las fermentaciones se llevan a cabo como cultivo en quimiostato a 32°C en fermentadores de 1 litro con un volumen de trabajo de 800 ml. La tasa de dilución se fija en 0,1 h-1. Estas fermentaciones discontinuas anóxicas se realizan en medio YP al que se añade glicerol en combinación con xilosa y/o glucosa. El pH del cultivo se mantiene en pH = 7,0 mediante la adición automática de KOH 2M. Los cultivos se agitan a 300 rpm.

Muestras para análisis de producción de glucosa, xilosa, etanol, glicerol y ácido fórmico se toman en situaciones de estado estacionario que se obtienen después de 5 cambios de volumen del recipiente de fermentación. Las concentraciones de etanol, glicerol y ácido fórmico se controlan mediante análisis por HPLC. La glucosa y la xilosa se determinan mediante análisis de HPAEC (Dionex).

3.2 Resultados

La cepa RN1041 (Tablas 6 y 7) es una cepa que se deriva de la cepa RN1001 (RN1001 his3::loxP). La cepa RN1001 se ha descrito previamente. Si se añade glucosa (25 mM) o xilosa (25 mM) al medio YP, entonces las fermentaciones anóxicas en las condiciones arriba descritas conducen a un consumo total de glucosa o xilosa por parte de esta cepa. Las concentraciones de etanol en los medios de glucosa y xilosa, respectivamente, son 40 mM y 33 mM en estado estable. Se forman pequeñas cantidades de glicerol tanto para glucosa como para xilosa (1,8 y 1,5 mM, respectivamente). No se observa la formación de ácido fórmico. En ausencia de azúcares en el medio YP, no se forma etanol ni glicerol o ácido fórmico. Si se añade glicerol al medio a una concentración de 50 mM, entonces el organismo no produce etanol adicional ni ácido fórmico en comparación con las situaciones con glucosa o xilosa sola.

La cepa RN1088 se derivó de la cepa RN1041 por

1.

supra-regulación de DAK1, GCY1 y GUP1 permitiendo una absorción y consumo incrementados de glicerol en condiciones anóxicas

2.

expresión heteróloga de pflA + pflB, lo que permite la conversión de piruvato en ácido fórmico y acetilCoA

3.

expresión heteróloga de adhE2, lo que permite la conversión de acetil-CoA en etanol

4.

eliminación de FDH1 y FDH2 evitando la oxidación de ácido fórmico por parte de esta cepa.

El organismo se somete a ensayo en cuanto al crecimiento y la formación de producto de la misma manera que RN1041 según se describe arriba. Con cualquiera de glucosa o xilosa se obtienen resultados similares a RN1041 en términos de producción de etanol. Sin embargo, la formación de glicerol fue ligeramente inferior y se observan trazas de ácido fórmico. Si se añade glicerol al medio con contenido en xilosa o glucosa a una concentración de 50 mM, entonces el organismo no consume más glicerol ni produce etanol adicional y, además, no se produce ácido fórmico adicional. Las cepas RN1089 y RN1090 tienen una base genética similar a RN1088. La única diferencia es que adhE no se expresa en estos organismos. En su lugar se expresan adh2 o mhpF. Las características de estas cepas durante las fermentaciones de glicerol son similares a las características de la cepa RN1088. Ambas cepas mostraron características similares a RN1088 para la fermentación tanto de glucosa como de xilosa como cepa RN1088.

Las cepas RN1091, RN1092 y RN1093 tienen el mismo fondo genético que la cepa RN1088 con la excepción de deshidrogenasas de ácido fórmico. Estas cepas tienen 1 ó 2 genes todavía presentes que codifican una formiato deshidrogenasa. Ninguno de los 3 organismos es capaz de realizar buenas fermentaciones en glicerol. Sólo se observaron trazas de cualquiera de etanol y ácido fórmico durante los experimentos de fermentación. Los organismos hacen fermentar tanto glucosa como xilosa a un ritmo equiparable a la cepa RN1088.

Las cepas RN1094, RN1095 y RN1096 tienen el mismo fondo genético que la cepa RN1088, con la excepción de la expresión de cualquiera de pflA o pflB. Estas cepas carecen de cualquiera de estos dos genes o de cualquiera de los genes. Ninguno de los 3 organismos es capaz de realizar buenas fermentaciones en glicerol. No se observa etanol o ácido fórmico adicional basado en la adición de glicerol 50 mM a un medio con contenido en xilosa (25 mM) durante los experimentos de fermentación. Los organismos hacen fermentar tanto la glucosa o xilosa a tasas equiparables a la cepa RN1088.

La cepa RN1097 se deriva de la cepa RN1088 suprimiendo GPD2. Al hacerlo, se podría evitar una operación parcial de un ciclo fútil en el nivel de consumo/producción de glicerol. Con glucosa o xilosa, la concentración de etanol en estados estacionarios son 38 mM y 31 mM, respectivamente. El glicerol se acumula en 0,9 mM y 0,5 mM, respectivamente, y ácido fórmico se había acumulado en 1,0 mM y 0,8 mM, respectivamente. Si se añade glicerol al medio con contenido en xilosa o glucosa a una concentración de 50 mM, entonces el organismo no consume más glicerol ni produce etanol adicional y, además, no se produce ácido fórmico adicional.

Las cepas RN1098 y RN1099 se asemejan a la cepa RN1088, pero difieren genéticamente en el nivel del o de los transportadores de glicerol. La cepa RN1098 tiene FPS1 sobre-expresado en lugar de GUP1, mientras que la cepa RN1099 tiene los dos genes transportadores expresados. Los organismos se someten a ensayo en cuanto al crecimiento y la formación de producto de la misma manera que RN1041 según se describe arriba. Con cualquiera de glucosa o xilosa se obtienen resultados similares a RN1041 en términos de producción de etanol. Sin embargo, la formación de glicerol era ligeramente inferior y se observaron trazas de ácido fórmico. Si se añadió glicerol ya sea al medio con contenido en xilosa o glucosa a una concentración de 50 mM, entonces los organismos RN1098 y RN1099 no consumían más glicerol ni producían etanol adicional y además no se produjo ácido fórmico adicional alguno.

RN1194 se somete a ensayo en cuanto al crecimiento y la formación de producto de la misma manera que RN1041 según se describe arriba. Con cualquiera de glucosa o xilosa, se obtienen resultados similares a RN1041 en términos de producción de etanol. Sin embargo, la formación de glicerol es ligeramente inferior y se observaron trazas de ácido fórmico. Si se añade glicerol ya sea al medio con contenido en xilosa o glucosa a una concentración de 50 mM, entonces el organismo produce etanol adicional y, además, se produce ácido fórmico. La concentración de etanol en estado estacionario en el medio de glicerol/glucosa es 75 mM y la concentración de ácido fórmico es 32 mM. El nivel de glicerol restante es de 7 mM. La concentración de etanol en estado estacionario en el medio de glicerol/xilosa es 66 mM y la concentración de ácido fórmico es 30 mM. El nivel de glicerol restante es de 8 mM. No se hacen intentos para someter a ensayo cualquier otro producto de fermentación que podrían haber sido producidos sobre la base de glicerol. RN1196 produce resultados similares a los de RN1194, aunque el consumo de glicerol y la producción de etanol y ácido fórmico se reducen en cierta medida en comparación con RN1194.

La cepa RN1195 se deriva de la cepa RN1194 suprimiendo GPD2. Al hacerlo, se podría evitar una operación parcial de un ciclo fútil en el nivel de consumo/producción de glicerol. Con glucosa o xilosa, la concentración de etanol en estados estacionarios son 38 mM y 31 mM, respectivamente. El glicerol se acumula en 0,9 mM y 0,5 mM, respectivamente, y ácido fórmico se acumula en 1,0 mM y 0,8 mM, respectivamente. Si se añade glicerol al medio con contenido en xilosa (25 mM) a una concentración de 50 mM, entonces el organismo produce tanto etanol como ácido fórmico. La concentración final de etanol en estado estacionario era de 72 mM, para glicerol 2 mM, y para ácido fórmico 37 mM. No se hicieron intentos para someter a ensayo cualesquiera otros productos de fermentación que podrían haber sido producidos sobre la base de glicerol. Estos resultados indican claramente que la deleción del gen GPD2 tiene un efecto beneficioso sobre la fermentación de glicerol en la cepa RN1195 en comparación con la cepa RN1194.

Tabla 7

plásmidos

selección

His3 hph loxPNatMXloxP nat kan zeo

Cepa

RN1041

pRN347

RN1088

pRN595 pRN605 pRN621 pRN622 pRN616

RN1089

pRN596 pRN605 pRN621 pRN622 pRN616

RN1090

pRN558 pRN605 pRN621 pRN622 pRN616

RN1091

pRN595 pRN605 pRN616

RN1092

pRN595 pRN605 pRN621 pRN616

RN1093

pRN595 pRN605 pRN622 pRN616

RN1094

pRN595 pRN605 pRN621 pRN622

RN1095

pRN595 pRN605 pRN621 pRN622 pRN619

RN1096

pRN595 pRN605 pRN621 pRN622 pRN620

RN1097

pRN595 pRN605 pRN594 pRN621 pRN622 pRN616

RN1098

pRN595 pRN608 pRN621 pRN622 pRN618

RN1099

pRN595 pRN605 pRN621 pRN622 pRN618

RN1194

pRN597 pRN621 pRN622 pRN616

RN1195

pRN957 pRN594 pRN621 pRN622 pRN616

RN1196

pRN958 pRN607 pRN621 pRN622 pRN616

pRN347 = pRS303 + 2µORI

LISTADO DE SECUENCIAS

5

<110> <120> Royal Nedalco s. v. C5 Yeast Company s. v. Cepas de levaduras manipuladas para producer etanol y formiato

<130>

P6031691PCT

10

<150> <151> EP10191736.7 2010-11-18

15

<150> <151> <150> <151> US61/415.054 2010-11-18 US61/471.836 2011-04-05

20

<160> <170> 57 PatentIn version 3.3

25

<210> <211> <212> <213> 1 760 PRT Escherichia coli

<400>

1

5

<210> <211> <212> <213> 2 2283 ADN Artificial

<220> <223>

pflB de E. coli optimizado en codones sintético

10

<400> 2

5

<210> <211> <212> <213> 3 246 PRT Escherichia coli

<400>

3

5

<210> <211> <212> <213> 4 741 ADN Artificial

<220> <223>

pflA de E. coli optimizado en codones sintético

10

<400> 4

5

<210> <211> <212> <213> 5 376 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

5

5

<210> <211> <212> <213> 6 376 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 316 PRT Escherichia coli

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 968 ADN Artificial

<220> <223>

mhpF de E.coli optimizado en codones sintético

10

<400> 8

15

<210> <211> <212> 9 891 PRT

<213>

Escherichia coli

<400>

9

5

<210> <211> <212> <213> 10 2690 ADN Artificial

<220> <223>

adhE de E. coli optimizado en codones sintético

10

<400>

10

5

<210> <211> <212> <213> 11 870 RPT Entamoeba histolítica

<400>

11

5

<210> <211> <212> <213> 12 2627 ADN Artificial

<220> <223>

ADH2 de E. histolítica optimizado en codones sintético

10

<400> 12

5

<210> <211> <212> <213> 13 312 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

13

5

<210> <211> <212> <213> 14 584 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

14

5

<210> <211> <212> <213> 15 591 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

15

5

<210> <211> <212> <213> 16 560 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

16

5

<210> <211> <212> <213> 17 609 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

17

5

<210> <211> <212> <213> 18 669 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

18

5

<210> <211> <212> <213> 19 713 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

19

5

<210> <211> <212> <213> 20 683 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

20

5

<210> <211> <212> <213> 21 440 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

21

5

<210> <211> <212> <213> 22 391 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

22

74

5

<210> <211> <212> <213> 23 2058 ADN Artificial

<220> <223>

interrupción de GPD2

10

<400> 23

5

<210> <211> <212> <213> 24 816 ADN Saccharomyces cerevisiae

<400>

24

5

<210> <211> <212> <213> 25 954 ADN Artificial

<220> <223>

fragmento de PCR de GCY1

10

<400> 25

<210>

26

<210>

<211> <212> <213>

2986 ADN Artificial

5

<220> <223> fragmento de PCR de DAK1

<400>

26

5

<210> <211> <212> <213> 27 2651 ADN Artificial

<220> <223>

fragmento de GUP1 de PCR

10

<400> 27

5

<210> <211> <212> <213> 28 3037 ADN Artificial

<220> <223>

fragmento de FPS1 de PCR

10

<400> 28

5

<210> <211> <212> <213> 29 12954 ADN Artificial

<220> <223>

plásmido pRN605 para la sobre-expresión de GCY1, DAK1 y GUP1

10

<400> 29

5

<210> <211> <212> <213> 30 10329 ADN Artificial

<220> <223>

plásmido pRN608 para la sobre-expresión de DAK1 y GCY1

10

<400> 30

<211>

<212> 5 <213>

<220>

<223>

10 <400> 31 11163 ADN Artificial

pRN616

5

<210> <211> <212> 32 7830 ADN

102

<213>

Artificial

5

<220> <223> <400> pRN619 32

5

<210> <211> <212> <213> 33 9695 ADN Artificial

<220> <223>

pRN620

10

<400> 33

5

<210> <211> <212> <213> 34 14159 ADN Artificial

<220> <223>

pRN618

10

<400> 34

<210>

35

<211>

31

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador FDHuf

<400>

35

<210>

36

<211>

33

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador FDHur

<400>

36

<210>

37

<211>

27

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador FDHdf

<400>

37

<210>

38

<211>

30

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223> cebador FDHdr

<400>

38

<400>

43

10

<210> <211> <212> <213> 39 5577 ADN Artificial

<220> <223>

pRN621

15

<400> 39

5

<210> <211> <212> <213> 40 5830 ADN Artificial

<220> <223>

pRN622

10

<400> 40

5

<210> <211> <212> <213> 41 7690 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> pRN558 41

5

<210> <211> <212> <213> 42 9416 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> pRN595 42

5

<210> <211> <212> <213> 43 9352 ADN Artificial

<220> <223>

pRN596

136

<210>

44

<211>

29

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador GPD2uf

<400>

44

<210>

45

<211>

42

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador GPD2ur

<400>

45

<210>

46

<211>

28

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador GPD2df

<400>

46

<210>

47

<211>

39

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

cebador GPD2dr

<400>

47

<210>

48

<211>

4397

<212>

ADN

<213>

Artificial

<220>

<223>

pRN594

<400>

48

5

<210> <211> <212> <213> 49 367 PRT Escherichia coli

<400>

49

5

<210> <211> <212> <213> 49 367 PRT Escherichia coli

10

<400> 49

5

<210> <211> <212> <213> 50 1120 ADN Artificial

<220> <223>

Secuencia de nucleótidos que codifica gldA de E. coli optimizada en codones para levadura

5

<210> <211> <212> <213> 51 1949 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> pRNgldA 51

5

<210> <211> <212> <213> 52 552 PRT Citrobacter freundii

<400>

52

5

<210> <211> <212> <213> 53 1678 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> Secuencia de nucleótidos que codifica dhaK de C. freundii optimizada en codones para levadura 53

5

<210> <211> <212> <213> 54 2951 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> pRNdhaK 54

5

<210> <211> <212> <213> <220> <223> 55 14200 ADN Artificial pRN957

<400>

55

5

<210> <211> <212> <213> 56 11289 ADN Artificial

<220> <223>

pRN958

10

<400> 56

5

<210> <211> <212> <213> 57 11102 ADN Artificial

10

<220> <223> <400> pRN607 57

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una célula de levadura, que comprende:

   a) un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad de convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil-CoA; b) una modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica

   en la célula;

   c) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, gen que confiere a la célula la capacidad de reducir acetil-CoA en acetaldehído; y d) una modificación genética que aumenta la actividad específica de glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+.
2. 2. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula comprende, además, una modificación genética seleccionada del grupo que consiste en:

   a) una modificación genética que aumenta la capacidad específica de dihidroxiacetona quinasa;

   b) una modificación genética que aumenta el transporte de glicerol a la célula; codificando un gen exógeno una enzima para la activación de la piruvato formiato liasa;

   c) una modificación genética que aumenta la actividad de acetil-CoA sintetasa específica en la célula; y

   d) una modificación genética que reduce la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula, al tiempo que la célula de levadura comprende una ruta de respuesta de glicerol de alta osmolaridad funcional.
3. 3. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la célula comprende al menos uno de:

   i) un gen xilosa isomerasa exógeno, gen que confiere a la célula la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa; y

   ii) genes exógenos que codifican una L-arabinosa isomerasa, una L-ribuloquinasa y una L-ribulosa-5— fosfato 4-epimerasa, genes que juntos confieren a la célula la capacidad de convertir L-arabinosa en Dxilulosa 5-fosfato.
4. 4. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde al menos uno de:

   a) la modificación genética que reduce la actividad de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula comprende la inactivación de al menos una copia endógena de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa en el genoma de la célula;

   b) la modificación genética que aumenta la actividad específica de la glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+ es la expresión de un gen heterólogo que codifica una glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+;

   c) la modificación genética que aumenta el transporte del glicerol a la célula es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de una proteína de absorción de glicerol y un canal de glicerol; y

   d) la modificación genética que reduce la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ específica en la célula comprende la inactivación de al menos una copia endógena de un gen que codifica una glicerol 3-fosfato deshidrogenasa en el genoma de la célula; y

   e) la modificación genética que aumenta la actividad de acetil-CoA sintetasa específica es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa; y

   f) la modificación genética que aumenta la actividad específica de dihidroxiacetona quinasa es la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa.
5. 5. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:

   a) el gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 57% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1;

   5 b) el gen exógeno que codifica una enzima con actividad de piruvato formiato liasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 3;

   c) el gen que codifica una formiato deshidrogenasa, cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es un gen que codifica una formiato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al

   10 menos 70% de identidad de secuencia con al menos una de SEQ ID NO: 5 y 6;

   d) el gen exógeno que codifica la enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos uno de:

   i) al menos 64% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 7,

   ii) al menos 76% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 9 y

   15 iii) al menos 61% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 11;

   e) la secuencia de nucleótidos que codifica la glicerol deshidrogenasa enlazada a NAD+ comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 49,

   f) la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa comprende una secuencia de nucleótidos que

   20 codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NO: 14, 15 y 52:

   g) la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de absorción de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una SEQ ID NO: 16 y 17, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el canal de

   25 glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 30% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de SEQ ID NO: 18;

   h) la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de SEQ ID NOs: 19 y 20; e

   30 i) el gen que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa, cuya actividad se ha de reducir o inactivar en la célula de la invención es un gen que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21, mientras que la célula tiene al menos una copia funcional de un gen endógeno que codifica una glicerol fosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 22.

   35 6. Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la célula de levadura comprende al menos una modificación genética adicional que resulta en una característica seleccionada del grupo que consiste en:

   a) actividad específica para xilulosa quinasa incrementada;

   b) flujo incrementado de la vía de pentosa fosfato

   40 c) actividad específica para reductosa aldosa inespecífica reducida

   d) transporte incrementado de al menos una de xilosa y arabinosa a la célula huésped;

   e) sensibilidad disminuida a la represión de catabolitos; f) tolerancia incrementada a etanol, osmolaridad o ácidos orgánicos; y

   g) producción reducida de sub-productos.

6. 7.

   Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula de levadura es de un género seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia.

7. 8.

   Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula de levadura pertenece a una especie seleccionada del grupo que consiste en S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombes.

8. 9.

   Una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos una de las secuencias de nucleótidos codificadoras de la enzima con actividad de piruvato formiato liasa, la enzima con actividad de piruvato formiato liasa, la enzima con actividad de acetaldehído deshidrogenasa, la xilosa isomerasa, la L-arabinosa isomerasa, la L-ribuloquinasa y la L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa es una secuencia de nucleótidos, cuyo uso de codones ha sido optimizado para la expresión en la célula de levadura.

9. 10.

   Un procedimiento para producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-propanodiol, un butanol y un producto derivado de isoprenoides, en donde el procedimiento comprende las etapas de:

   a) fermentar un medio con una célula de levadura según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el medio contiene o es alimentado con una fuente de glicerol y con una fuente de al menos una de una hexosa y una pentosa, en donde la célula de levadura fermenta el glicerol y la al menos una de la hexosa y pentosa para dar el producto de fermentación y formiato; y, opcionalmente,

   b) recuperar al menos uno del producto de fermentación y formiato.

10. 11.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el producto de fermentación es etanol.

11. 12.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que el medio contiene o es alimentado con un hidrolizado lignocelulósico.

12. 13.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la célula de levadura fermenta en condiciones anaerobias.

13. 14.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el pH del medio se regula durante el proceso de fermentación para mantener una concentración de ácido fórmico no disociado que no es mayor que 20,0 mM.