CN105073990A - 使用了重组酵母的乙醇的制造方法 - Google Patents
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Abstract
在具有木糖代谢能力的酵母的木糖同化和乙醇发酵时代谢培养基中的乙酸，降低乙酸浓度。乙醇的制造方法，具有以下工序：将导入了木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有木糖的培养基进行培养，从而进行乙醇发酵木。
Description
技术领域
本发明涉及使用了具有木糖代谢能力的重组酵母的乙醇的制造方法。
背景技术
纤维素系生物质作为乙醇等有用醇和/或有机酸的原料而被有效利用。为了在利用了纤维素系生物质的乙醇制造中提高乙醇生产量，开发了作为底物能够利用5碳单糖木糖的酵母。例如，专利文献1公开了染色体中插入了来源于树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因以及来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶基因的酵母。
另外，已知乙酸在纤维素系生物质的水解物中大量含有，抑制酵母的乙醇发酵。特别地，已知在导入了木糖同化基因的酵母中，显著地抑制以木糖为糖源的乙醇发酵(非专利文献1和2)
另一方面，将用纤维素酶糖化纤维素系生物质而得的物质进行发酵后的醪中，主要包含未发酵残渣、难发酵残渣、酶和发酵用微生物。通过将包含醪的反应液在接着进行的发酵中利用，可以实现发酵用微生物的再利用，降低发酵用微生物的新加入量，实现低成本化。但是，此时，醪所含的乙酸也同时被带入，其结果是有时发酵培养基所含的乙酸的浓度上升，抑制乙醇发酵。另外，即使在将发酵槽内的醪送入保持减压的闪蒸罐，在闪蒸罐内除去乙醇后，将醪送回发酵槽这样的连续发酵法中，也难以从醪中去除乙酸，因而由乙酸产生的发酵抑制成为重要的问题。
为了避免由乙酸产生的发酵抑制，有通过乙醇发酵中一般使用的菌株酿酒酵母的LPP1基因和/或ENA1基因的过表达(非专利文献3)、FPS1基因的破坏(非专利文献4)来改善在乙酸存在下乙醇的发酵能力的报告。然而，这些报告是以葡萄糖作为底物时的乙醇发酵的结果，对由于乙酸而发酵被显著抑制的以木糖作为底物时的乙醇发酵的效果不明。另外，即使使用这些报告的突变酵母，也不能实现减少在如上所述的发酵菌体再利用和/或连续发酵时成为问题的乙酸的带入量。
作为避免由乙酸产生的发酵抑制的其他方法，考虑使培养基中的乙酸在乙醇发酵的同时代谢。但是，乙酸的代谢是需氧的反应，与乙醇的代谢途径重复。因此，虽然如果在需氧条件下进行发酵则可能使乙酸代谢，但同时目的物质乙醇也被代谢。
为了在乙醇不被代谢的厌氧条件下使乙酸代谢，有通过在破坏了酿酒酵母的甘油生产途径的GPD1·GPD2基因的菌株中导入编码乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)的mhpF基因，从而同化乙酸的报告(非专利文献5、专利文献2)。此外，乙醛脱氢酶催化以下的可逆反应。
此外，利用GPD1·GPD2基因的甘油生产途径如下述式所示，是将代谢中产生的剩余的辅酶NADH氧化成NAD+的途径。
0.5葡萄糖+NADH+H++ATP→甘油+NAD++ADP+Pi
于是通过破坏GPD1·GPD2基因来破坏该反应途径，通过导入mhpF来供给剩余的辅酶NADH，进行下述的反应。
乙酰辅酶A+NADH+H+→乙醛+NAD++辅酶A
另外，乙酰辅酶A由乙酸通过乙酰辅酶A合成酶而合成，乙醛被转换成乙醇，因而最终形成下述反应式，在剩余的辅酶NADH被氧化的同时，乙酸也被代谢。
乙酸+2NADH+2H++ATP→乙醇+NAD++AMP+Pi
如上所述，对酵母赋予乙酸代谢能力的机理，需要破坏甘油途径。然而，已知GPD1基因和GPD2基因的重复破坏株发酵能力大幅降低，产业水平上的实用性低。另外，非专利文献5和专利文献2不是关于木糖同化酵母的报告，在木糖同化时是否有效果是不明的。
此外，还有对GPD1基因和GPD2基因的非破坏株导入mhpF基因的报告(非专利文献6)。然而，非专利文献6中虽然通过mhpF基因的导入而乙酸的生产量减少，但没有培养基中的乙酸减少这样的报告。进而，该非专利文献6也还不是关于木糖同化酵母的报告。
此外，有关于导入了木糖异构酶(XI)基因(来源于白蚁的肠内原生生物)的木糖同化酵母的报告(专利文献3)、以及对导入有XI基因(来源于Piromycessp.E2)的木糖同化酵母进一步导入了乙醛脱氢酶基因(来源于青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis0)的报告(专利文献4)。但是，这些文献中关于木糖同化时的乙酸同化几乎没有报告。
如上，现有技术中并未报告在同化木糖的同时进行乙醇发酵的条件下，使乙酸高效地代谢·分解的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-195220号公报
专利文献2：WO2011/010923
专利文献3：日本特开2011-147445号公报
专利文献4：日本特开2010-239925号公报
非专利文献
非专利文献1：FEMSYeastResearch,vol.9,2009,358-364
非专利文献2：EnzymeandMicrobialTechnology33,2003,786-792
非专利文献3：Biotechnol.Bioeng.2009103(3):500-512
非专利文献4：Biotechnol.Lett.201133:277-284
非专利文献5：Appl.Environ.Microbiol.201076:190-195
非专利文献6：Biotechnol.Lett.201133:1375-1380
发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明鉴于上述事实，目的是特别地提供乙醇的制造方法，其中，使用了具有木糖代谢能力的酵母中的在木糖同化和乙醇发酵时能够代谢培养基中的乙酸而降低乙酸浓度的重组酵母。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，对具有木糖代谢能力的酵母导入特定的乙醛脱氢酶基因而得的重组酵母，在包含木糖的培养基中进行乙醇发酵时，能够代谢培养基中的乙酸，从而完成了本发明。
本发明包含以下内容。
(1)乙醇的制造方法，具有以下工序：将导入了木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有木糖的培养基进行培养，从而进行乙醇发酵。
(2)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述木糖异构酶基因是编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因，
(a)具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号4所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有将木糖变为木酮糖的酶活性的蛋白质。
(3)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶。
(4)根据(3)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号2或20所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号2或20所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
(5)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶。
(6)根据(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号22所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号22所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
(7)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶。
(8)根据(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号24所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号24所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
(9)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是进一步导入了木酮糖激酶基因的重组酵母。
(10)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是导入了下述基因的重组酵母，所述基因编码选自构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶群中的酶。
(11)根据(10)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶群是核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶。
(12)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述培养基含有纤维素，在所述乙醇发酵中，至少同时进行所述纤维素的糖化。
(13)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因。
(14)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是具有将乙醇转换为乙醛的活性的醇脱氢酶基因的表达量降低了的重组酵母。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-037501号和日本特愿2014-36652号的说明书和/或附图所记载的内容。。
发明的效果
在本发明的乙醇的制造方法中，可以降低培养基中的乙酸浓度，从而可以有效地避免由乙酸引起的发酵抑制。其结果是，本发明的乙醇的制造方法可以较高地维持以木糖作为糖源的乙醇发酵的效率，可以实现优异的乙醇收率。因此，本发明的乙醇的制造方法，例如，在再利用重组酵母时和/或在连续培养中使用时可以降低乙酸的带入量，维持优异的乙醇收率。
附图说明
图1是显示pUC-HIS3U-P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D的构成示意图。
图2是显示pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d-R45的构成示意图。
图3是显示pUC-LEU2U-P_HOR7-TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3-LEU2D的构成示意图。
图4是显示pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3-P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2-GRE3D的构成示意图。
图5是显示pCR-ADH2U-URA3-ADH2D的构成示意图。
图6是显示pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D的构成示意图。
图7pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D的构成示意图。
图8是显示pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D的构成示意图。
图9是显示pCR-ADH2U-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D的构成示意图。
图10是显示pCR-ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D的构成示意图。
图11是显示pCR-ADH2part-T_CYC1-URA3-ADH2D的构成示意图。
具体实施方式
以下，使用附图和实施例更详细地说明本发明。
本发明的乙醇的制造方法是，使用具有木糖代谢能力、且导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，由培养基所含的糖源合成乙醇的方法。在本发明的乙醇的制造方法中，具有能够通过上述重组酵母来代谢培养基所含的乙酸，随着乙醇发酵而培养基中的乙酸浓度降低这样的特征。
＜重组酵母＞
本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，是导入了木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的酵母，并且是具有木糖代谢能力的酵母。这里，具有木糖代谢能力的酵母，包含通过对本来不具有木糖代谢能力的酵母导入木糖异构酶基因从而被赋予了木糖代谢能力的酵母、通过对本来不具有木糖代谢能力的酵母导入木糖异构酶基因和其他木糖代谢相关基因从而被赋予了木糖代谢能力的酵母酵母、本来具有木糖代谢能力的酵母的任一者的含义。
具有木糖代谢能力的酵母可以同化培养基中所含的木糖而生产乙醇。此外，培养基中所含的木糖，既可以是通过将以木糖作为构成糖的木聚糖和/或半纤维素等进行糖化的工艺而得的，也可以是培养基所含的木聚糖和/或半纤维素等被糖化酶糖化而供给至培养基中的。后者的情况下，是指所谓同时糖化发酵的体系。
作为木糖异构酶基因(XI基因)，不特别限定，可以使用来源于任何生物种的基因。例如，可以不特别限制地使用日本特开2011-147445号公报所公开的来源于白蚁的肠内原生生物的多种木糖异构酶基因。另外，作为木糖异构酶基因，还可以利用来源于作为厌氧性的霉的Piromycessp.E2种(特表2005-514951号公报)、来源于作为厌氧性的霉的Cyllamycesaberensi、来源于作为细菌的多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、来源于作为细菌的Clostridiumphytofermentans、来源于鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)簇的基因。
具体地，作为木糖异构酶基因，优选使用来源于黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠内原生生物的木糖异构酶基因。该来源于黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠内原生生物的木糖异构酶基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号3和4。
但是，作为木糖异构酶基因，不限于序列号3和4所特定的，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，木糖异构酶基因不限于这些序列号3和4所特定的，例如，还可以是编码具有相对于序列号4的氨基酸序列有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列，且具有木糖异构酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，木糖异构酶基因不限于这些序列号3和4所特定的，还可以是例如，编码具有相对于序列号4的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有木糖异构酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，木糖异构酶基因不限于这些序列号3和4所特定的，也可以是例如，与包含序列号3的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有木糖异构酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southernhybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southernhybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mMNaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号3不同的碱基序列的基因、或编码与序列号4不同的氨基酸序列的基因是否作为木糖异构酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如大肠杆菌等宿主，测定表达的蛋白质的木糖异构酶活性即可。木糖异构酶活性是指将木糖异构化为木酮糖的活性。因此，木糖异构酶活性可以如下评价：作为底物准备包含木糖的溶液，使检查对象蛋白质在适当温度下作用，测定木糖的减少量和/或木酮糖的生成量。
特别是，作为木糖异构酶基因，优选使用编码包含对序列号4所示的氨基酸序列中的特定的氨基酸残基导入了特定的突变的氨基酸序列、且木糖异构酶活性提高了的突变型木糖异构酶的基因。具体地，作为编码突变型木糖异构酶的基因，可以列举编码序列号4所示的氨基酸序列中的第337位的天冬酰胺被替换为半胱氨酸的氨基酸序列的基因。包含序列号4所示的氨基酸序列中的第337位的天冬酰胺被替换为半胱氨酸的氨基酸序列的木糖异构酶，与野生型的木糖异构酶相比具有优异的木糖异构酶活性。此外，突变型木糖异构酶不限于将上述第337位的天冬酰胺替换为半胱氨酸的突变体，既可以是将上述第337位的天冬酰胺替换成了除了半胱氨酸以外的氨基酸的突变体，也可以是除了上述第337位的天冬酰胺之外进而将不同的氨基酸残基替换成了其他氨基酸的突变体，还可以是替换了除了所述第337位的天冬酰胺以外的其他的氨基酸残基的突变体。
另一方面，除了木糖异构酶基因以外的木糖代谢相关基因，是包含编码将木糖转换为木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转换为木酮糖的木糖醇脱氢酶的木糖醇脱氢酶基因和编码将木酮糖磷酸化而生成木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因的含义。此外，通过木酮糖激酶而生成的木酮糖5-磷酸进入戊糖磷酸途径而被代谢。
作为木糖代谢相关基因，不特别限定，可列举来源于树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因、来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的木酮糖激酶基因(参照EliassonA.etal.,Appl.Environ.Microbiol,66:3381-3386和ToivariMNetal.,Metab.Eng.3:236-249)。此外，作为木糖还原酶基因，可利用来源于热带假丝酵母(Candidatropicalis)和/或近平滑假丝酵母(Candidaprapsilosis)的木糖还原酶基因。作为木糖醇脱氢酶基因，可利用来源于热带假丝酵母(Candidatropicalis)和/或近平滑假丝酵母(Candidaprapsilosis)的木糖醇脱氢酶基因。作为木酮糖激酶基因，可利用来源于树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的木酮糖激酶基因。
另外，作为本来具有木糖代谢能力的酵母，不特别限定，可列举树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和近平滑假丝酵母(Candidaprapsilosis)等。
另一方面，作为导入具有木糖代谢能力的酵母中的乙醛脱氢酶基因，不特别限定，可以使用来源于任何生物的基因。另外，在乙醛脱氢酶基因使用来源于除了酵母等真菌以外的生物，例如，细菌和/或动物、植物、昆虫、藻类的基因的情况下，优选使用根据导入的酵母中的密码子使用频率而改变了碱基序列的基因。
更具体地，作为乙醛脱氢酶基因，可以使用大肠杆菌中的mhpF基因，和/或如AppliedandEnvironmentalMicrobiology,May2004,p.2892-2897,Vol.70,No.5中所公开的那样使用溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)中的ALDH1基因。这里，大肠杆菌中的mhpF基因的碱基序列和由mhpF基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1和2。
但是，作为乙醛脱氢酶基因，不限于序列号1和2所特定的，只要是EC编号1.2.1.10所定义的酶，就也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。作为乙醛脱氢酶基因，可列举例如，大肠杆菌中的adhE基因、来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因和来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因。这里，大肠杆菌中的adhE基因的碱基序列和由adhE基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号19和20。另外，来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因的碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号21和22。进而，来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因乙醛脱氢酶基因的碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号23和24。
另外，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2所特定的，只要是由EC编号1.2.1.10所定义的酶，也可以是碱基序列、氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。作为乙醛脱氢酶基因，可列举例如，大肠杆菌中的adhE基因、来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因和来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因。这里，大肠杆菌中的adhE基因的碱基序列和adhE基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号19和20。另外，来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因的碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号21和22。进而，来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因的碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号23和24。
另外，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2、19和20、21和22以及23和24所特定的，也可以是例如，编码具有相对于序列号2、20、22或24的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2、19和20、21和22以及23和24所特定的，还可以是例如，编码具有相对于序列号2、20、22或24的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2、19和20、21和22以及23和24所特定的，也可以是例如，与包含序列号1、19、21或23的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southernhybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southernhybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mMNaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号1、19、21或23不同的碱基序列的基因、或编码与序列号2、20、22或24不同的氨基酸序列的基因是否作为乙醛脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如大肠杆菌等宿主，测定表达的蛋白质的乙醛脱氢酶活性即可。乙醛脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含乙醛、辅酶A和NAD+的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，将生成的乙酰磷酸通过磷酸乙酰转移酶的作用而转换为乙酰磷酸，从而测定，或者将生成的NADH进行分光学测量而测定。
此外，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母也可以是具有木糖代谢能力、且至少导入了乙醛脱氢酶基因、进而导入了其他基因的酵母。作为其他基因不特别限定，例如，可以是导入了参与葡萄糖等的糖代谢的基因的酵母。作为一例，重组酵母可以通过导入β-葡糖苷酶基因而制成具有β-葡糖苷酶活性的酵母。
这里β-葡糖苷酶活性是指催化糖的β-糖苷键水解的反应的活性。即，β-葡糖苷酶可以将纤维二糖等纤维寡糖分解成葡萄糖。β-葡糖苷酶基因也可以作为细胞表层呈递型基因而导入。这里，细胞表层呈递型基因，是指进行了改变而使得由该基因所编码的蛋白质以在细胞的表层展示的方式表达的基因。例如，细胞表层呈递型β葡糖苷酶基因，是将β葡糖苷酶基因与细胞表层定位蛋白质基因融合而得的基因。细胞表层定位蛋白质是指固定于酵母的细胞表层、存在于细胞表层的蛋白质。可列举例如作为凝集性蛋白质的α-或a-凝集素、FLO蛋白质等。通常细胞表层定位蛋白质在N-末端侧具有分泌信序列号并在C-末端侧具有GPI锚附着识别信号。虽然在具有分泌信号方面与分泌性蛋白质相同，但细胞表层定位蛋白质在介由GPI锚而被固定输送到细胞膜上这方面与分泌性蛋白质不同。细胞表层定位蛋白质在通过细胞膜时，GPI锚附着识别序列信号被选择性地切断，在新突出的C末端部分与GPI锚结合从而被固定在细胞膜上。之后GPI锚的根部被磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C(PI-PLC)切断。接着，从细胞膜被切下的蛋白质插入细胞壁并被固定在细胞表层，从而定位于细胞表层(例如，参照日本特开2006-174767号公报)。
作为β-葡糖苷酶基因，不特别限定，可列举例如来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的β-葡糖苷酶基因(Muraietal.,Appl.Environ.Microbiol.64:4857-4861)。此外，作为β-葡糖苷酶基因，还可利用来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的β-葡糖苷酶基因、来自噬纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)的β-葡糖苷酶基因和来自扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibligera)的β-葡糖苷酶基因等。
另外，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，还可以是在β葡糖苷酶基因的基础之上，或者除了β葡糖苷酶基因以外，还导入了编码构成纤维素酶的其他酶的基因的重组酵母。作为除了β葡糖苷酶以外的构成纤维素酶的酶，可以列举从结晶纤维素的末端使纤维二糖游离的外切型的纤维二糖水解酶(CBH1和CBH2)、不能分解结晶纤维素但随机切断非结晶纤维素(无定形纤维素)链的内切型的内切葡聚糖酶(EG)。
另外，作为导入重组酵母的其他基因，可列举具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因(ADH1基因)、具有将乙酸转换为乙酰辅酶A的活性的乙酰辅酶A合成酶基因(ACS1基因)、具有将乙醛转换为乙酸的活性的基因(ALD4基因、ALD5基因和ALD6基因)。此外，还可以破坏具有将乙醇转换为乙醛的活性醇脱氢酶基因(ADH2基因)。
进而，在本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，优选为具有以下特征的重组酵母，所述特征是高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因(ADH1基因)。为了高表达该基因，可列举将内在的该基因的启动子置换为高表达用启动子、将能表达地具有该基因的表达载体导入酵母这样的方法。
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ADH1基因的碱基序列和由该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号5和6。但是，作为高表达对象的醇脱氢酶基因，不限于由序列号5和6所特定的基因，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号5和6所特定的，也可以是例如，编码具有相对于序列号6的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号5和6所特定的，也还可以是例如，编码具有相对于序列号6的氨基酸序列的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号5和6所特定的，也可以是例如，与包含序列号5的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southernhybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southernhybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mMNaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号5不同的碱基序列的基因、或编码与序列号6不同的氨基酸序列的基因是否作为具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如酵母等宿主，测定表达的蛋白质的醇脱氢酶活性即可。将乙醛转换为乙醇的醇脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含醛和NADH或NADPH的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，测量生成的醇，或者分光测量NAD+或NADP+，从而测定。
进而，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母优选具有如下特征，所述特征是具有将乙醇转换为醛的活性的醇脱氢酶基因(ADH2基因)的表达量下降了。为了使该基因的表达量下降，可列举改变内在的该基因的启动子、使该基因缺失这样的方法。使该基因缺失时，既可以使二倍体的重组酵母中存在的一对ADH2基因中的一方缺失，也可以使两方缺失。作为抑制基因表达的方法，可列举所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的衰减(Nonsensemediateddecay,NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(micro-RNA，微RNA)法、siRNA(smallinterferingRNA，小干扰RNA)法等。
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ADH2基因的碱基序列和由该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号7和8。但是，作为对象的醇脱氢酶基因，不限于序列号7和8所特定的，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号7和8所特定的，也可以是例如，编码具有相对于序列号8的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号7和8所特定的，也还可以是例如，编码具有相对于序列号8的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，醇脱氢酶基因不限于这些序列号7和8所特定的，也可以是例如，与包含序列号7的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southernhybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southernhybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mMNaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，包含与序列号7不同的碱基序列的基因、或编码与序列号8不同的氨基酸序列的基因是否作为具有将乙醇转换为醛的活性的醇脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如酵母等宿主，测定表达的蛋白质的醇脱氢酶活性即可。将乙醇转换为醛的醇脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含醇和NAD+或NADP+的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，测量生成的醛，或者分光测量NADH或NADPH，从而测定。
进而，作为导入重组酵母中的其他基因，可列举参与构成生物质的半纤维素所含的5碳糖L-阿拉伯糖的代谢途径的基因。作为这样的基因，可列举例如，来源于原核生物的L-阿拉伯糖异构酶基因、L-核酮糖激酶基因、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因、和/或来源于真核生物的L-阿糖醇-4-脱氢酶基因、L-木糖还原酶基因。
特别是作为导入重组酵母中的其他基因，可列举能够促进培养基中的木糖的利用的基因。具体地，可列举编码具有以木酮糖作为底物生成木酮糖-5-磷酸的活性的木酮糖激酶的基因。通过导入木酮糖激酶基因，能够提高戊糖磷酸途径的代谢通量。
进而重组酵母中可以导入编码选自构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶群中的酶的基因。作为构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶，可列举核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶。优选导入1种以上编码这些酶的基因。另外，更优选将这些基因中的2种以上组合导入，进一步优选3种以上组合导入，最优选导入全种类的基因。
更具体地作为木酮糖激酶(XK)基因，可以不特别限制来源生物地使用。此外XK基因由同化木酮糖的细菌、酵母等大量微生物保持。关于XK基因的信息可以通过NCBI的HP等的检索来适宜获得。优选列举来源于酵母、乳酸菌、大肠杆菌、植物等的XK基因。作为XK基因，可列举例如，来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288C株的XK基因XKS1(GenBank：Z72979)(CDS的编码区的碱基序列和氨基酸序列)。
另外，更具体地，转醛醇酶(TAL)基因、转酮醇酶(TKL)基因、核酮糖-5-磷酸差向异构酶(RPE)基因、核糖-5-磷酸酮异构酶(RKI)基因可以不特别限定来源生物地使用。这些基因在具有戊糖磷酸途径的大量生物中保持。例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)等通用酵母也保持这些基因。关于这些基因的信息可以通过登录NCBI等的HP来适宜获得。优选列举来源于真核细胞或酵母等与宿主真核细胞同一属、更优选与宿主真核细胞同一种的各基因。作为TAL基因优选使用TAL1基因，作为TKL基因优选使用TKL1基因和TKL2基因，作为RPE基因优选使用RPE1基因，作为RKI基因优选使用RKI1基因。例如，作为这些基因，可列举作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TAL1基因的TAL1基因(GenBank：U19102)、来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TKL1基因(GenBank：X73224)、来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RPE1基因(Genbank：X83571)、来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RKI1基因(GenBank：Z75003)。
＜重组酵母的制作＞
可以通过将上述的木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因导入成为宿主的酵母基因组中，来制作能够在本发明中使用的重组酵母。这里，木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因既可以导入不具有木糖代谢能力的酵母中，也可以导入本来具有木糖代谢能力的酵母中，还可以与木糖代谢相关基因一起导入不具有木糖代谢能力的酵母中。另外，将木糖异构酶基因、乙醛脱氢酶基因和上述的基因导入酵母时，既可以将全部基因同时导入，也可以利用不同的表达载体逐次导入。
作为能用作宿主的酵母，不特别限定，可列举休哈塔假丝酵母(CandidaShehatae)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromycespombe)等酵母，特别优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。此外，作为酵母，既可以是为了实验方面的方便性而使用的实验株，也可以是为了实用方面的有用性而使用的工业株(实用株)。作为工业株，可列举例如用于葡萄酒、清酒和/或烧酎制作的酵母株。
此外，作为成为宿主的酵母，优选使用具有同宗配合性的酵母。根据日本特开2009-34036号公报所公开的方法，通过利用具有同宗配合性的酵母，可以简便地向基因组中导入多拷贝基因。具有同宗配合性的酵母与同宗配合酵母为同义。作为具有同宗配合性的酵母，不特别限定，也可以使用任何酵母。作为具有同宗配合性的酵母，可列举酿酒酵母OC-2株(NBRC2260)，但不限于此。此外，作为具有同宗配合性的酵母，可列举醇酵母(台研396号、NBRC0216)(出处：“アルコール酵母的諸特性(醇酵母的诸特性)”酒研会报、No37、p18-22(1998.8))、在巴西和冲绳分离出的乙醇生产酵母(出处：“ブラジルと沖縄で分離したSaccharomycescerevisiae野生株的遺伝学的性質(在巴西和冲绳分离的酿酒酵母野生株的遗传学性质)”日本农艺化学会志、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4))和180(出处：“アルコール発酵力の強い酵母的スクリーニング(醇发酵能力强的酵母的筛选)”日本酿造协会志、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6))等。另外，即使是显示异宗配合的表型的酵母，也可通过以可表达的方式导入HO基因而制成具有同宗配合性的酵母来使用。因此，在本发明中，具有同宗配合性的酵母是也包含以可表达的方式导入了HO基因的酵母的含义。
其中，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC-2株是一直以来在葡萄酒酿酒的现场被利用的被确认了安全性的菌株，因而优选。此外酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC-2株如后述实施例所述的那样，是在高糖浓度的条件下启动子活性优异的菌株，因而优选。特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC-2株在高糖浓度条件下丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子活性优异，因而优选。
另外，作为导入的基因的启动子，不特别限定，可利用例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子、高渗透压应答7基因(HOR7)的启动子等。其中，丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子高表达下游的目的基因的能力高，因而优选。
即，上述基因可以与调控表达的启动子和/或其他表达调控区一起导入酵母的基因组中。或者，上述基因也可以以通过成为宿主的酵母的基因组中本来存在基因的启动子和/或其他表达调控区而进行表达调控的方式导入。
作为导入上述基因的方法，可以应用已知作为酵母的转化方法的现有公知的任何方法。具体来说，例如，可以以例如电穿孔法“Meth.Enzym.,194,p182(1990)”、原生质球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology,153,p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methodsinyeastgenetics,2000Edition:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual等记载的方法实施，但不限于此。
＜乙醇制造＞
在使用以上所说明的重组酵母制造乙醇时，用至少含有木糖的培养基进行乙醇发酵培养。即，进行乙醇发酵的培养基，作为碳源至少含有木糖。此外，培养基中也可以预先含有葡萄糖等其他碳源。
另外，在乙醇发酵中利用的培养基所含的木糖可以来源于生物质。换句话说，在乙醇发酵中利用的培养基也可以是包含纤维素系生物质、糖化纤维素系生物质所含的半纤维素而生成木糖的半纤维素酶的组成。这里，作为纤维素系生物质，可以是实施了现有公知的前处理的物质。作为前处理，不特别限定，可列举例如，将木质素用微生物分解的处理、和/或纤维素系生物质的粉碎处理等。另外，作为前处理，也可以应用例如，将粉碎了的纤维素系生物质浸渍于稀硫酸溶液和/或碱溶液、离子液体中的处理、水热处理、微粉碎处理这样的处理。通过这些前处理，可以提高生物质的糖化率。
此外，使用以上所说明的重组酵母制造乙醇时，上述培养基还可以是进一步包含纤维素和纤维素酶的组成。此时，上述培养基中含有纤维素酶作用于纤维素而生成的葡萄糖。在乙醇发酵中利用的培养基含有纤维素的情况下，该纤维素可以来源于生物质。换句话说，在乙醇发酵中利用的培养基还可以是包含能够糖化纤维素系生物质所含的纤维素的纤维素酶的组成。
另外，在乙醇发酵中利用的培养基，还可以添加将纤维素系生物质糖化处理后的糖化液。此时，糖化液包含残存的纤维素和/或纤维素酶、以及来源于纤维素系生物质所含的半纤维素的木糖。
如上，本发明的乙醇的制造方法包含至少以木糖作为糖源的乙醇发酵的工序。本发明的乙醇的制造方法能够通过以木糖作为糖源的乙醇发酵来制造乙醇。在本发明的利用了重组酵母的乙醇的制造方法中，在乙醇发酵之后从培养基中回收乙醇。对乙醇的回收方法没有特别限制，可采用现有公知的任何方法。例如，在上述乙醇发酵结束后，通过固液分离操作将含有乙醇的液层、与含有重组酵母和/或固体成分的固层分离。然后将液层中所含的乙醇通过蒸馏法进行分离·纯化，从而可以回收纯度高的乙醇。此外，乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的而适宜调整。
一般地，在利用来源于生物质的糖来制造乙醇的情况下，在上述的前处理和/或糖化处理中有时产生乙酸和/或糠醛这样的发酵抑制物质。特别地关于乙酸，已知其抑制酵母的生长·增殖，使以木糖作为糖源的乙醇发酵的效率下降。
然而，在本发明中，由于使用导入了木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的重组酵母，因而可以代谢培养基所含的乙酸，从而可以将培养基所含的乙酸浓度抑制得较低。因此，本发明的乙醇的制造方法，与使用了未导入木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的酵母时相比，可以实现优异的乙醇收率。
另外，根据本发明的乙醇的制造方法，由于即使在将重组酵母培养规定时间之后培养基中的乙酸浓度也低，因而，即使在利用培养规定时间之后的培养基的一部分重新开始培养的连续培养体系中使用，也能够降低乙酸的带入量。另外，根据本发明的乙醇的制造方法，即使在乙醇发酵工序结束之后回收菌体而再利用的情况下，也由于同样的理由而能够降低乙酸的带入量。
另外，本发明的乙醇的制造方法，可以成为将培养基所含的纤维素用纤维素酶进行糖化的工序、与以木糖和糖化所生成的葡萄糖作为糖源的乙醇发酵的工序同时进行的所谓同时糖化发酵处理。这里，同时糖化发酵处理是指将糖化纤维素系生物质的工序与乙醇发酵工序不区分地同时实施的处理。
此外，作为糖化方法没有特别限制，可列举利用纤维素酶和/或半纤维素酶等纤维素酶制剂的酶法等。纤维素酶制剂含有参与纤维素链和半纤维素链的分解的多种酶，显示内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性、纤维二糖水解酶活性、葡糖苷酶活性和木糖苷酶活性等多种活性。作为纤维素酶制剂，没有特别限制，可列举例如，由里氏木霉(Trichodermareesei)、和/或解纤维顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)等所生产的纤维素酶。作为纤维素酶制剂，也可以使用市售品。
在同时糖化发酵处理中，向包含纤维素系生物质(也可以在前处理后)的培养基中加入纤维素酶制剂和上述重组微生物，在规定的温度范围内培养该重组酵母。作为培养温度没有特别限制，考虑乙醇发酵的效率可以为25～45℃，优选为30～40℃。此外培养液的pH值优选为4～6。此外，培养时也可以进行搅拌和/或振荡。进而，也可以是先在酶的最适温度(40～70℃)下进行糖化，然后，使温度下降至规定的温度(30～40℃)再添加酵母这样的不规则的同时糖化发酵。
实施例
以下使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限制于以下实施例。
〔实施例1〕
在本实施例中，制作导入了木糖异构酶基因和大肠杆菌的乙醛脱氢酶基因(mhpF基因)的重组酵母，评价该重组酵母的乙酸代谢能力。
＜导入载体的制作＞
(1)XKS1基因导入用载体
作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶(XK)基因的酵母导入用载体，制作图1所示的pUC-HIS3U-P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)NBRC304株的XK基因的XKS1基因(genebank：X61377)、成为向酵母基因组上的同源重组区域的组氨酸合成酶(HIS3)基因的上游约500bp的区域(HIS3U)以及该基因内的约500bp的区域(HIS3D)、以及5’侧添加了TDH2启动子和3’侧添加了CYC1终止子的潮霉素磷酸转移酶(hph)基因(标志物基因)。此外，同源重组区域的外侧导入了限制性酶Sse8387I的位点。另外，来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)NBRC304株的XKS1基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的木酮糖激酶的氨基酸序列分别示于序列号9和10。
(2)XI基因导入用载体
作为来源于黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠内原生生物的木糖异构酶(RsXI-C1、参照日本特开2011-147445)基因的酵母导入用载体，制作图2所示的pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d-R45。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的RsXI-C1基因、成为向酵母基因组上的同源重组区域的rRNA基因(rDNA)的同源序列R45和R67、以及缺失启动子部分而降低了表达量的TRP1d标志物基因。此外，同源重组区域的外侧导入了限制性酶Sse8387I的位点。通过R45和R67，包含RsXI-C1的基因被多拷贝导入到第12号染色体上的rDNA座。进而TRP1d标志物在以多拷贝被导入染色体上的情况下才作为标志物发挥功能。因此，通过利用本载体，多拷贝导入成为可能。此外，在本实施例中RsXI-C1基因，使用将全区域设计成根据酵母的密码子使用频率而转换了使用的密码子的碱基序列，基于该碱基序列全合成而得的基因。本实施例中设计的RsXI-C1基因的碱基序列和该基因所编码的木糖异构酶的氨基酸序列分别示于序列号3和4。
(3)TAL1·TKL1基因导入用载体
作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的转醛醇酶1(TAL1)基因和转酮醇酶1(TKL1)基因的酵母导入用载体，制作图3所示的pUC-LEU2U-P_HOR7-TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3-LEU2D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TAL1基因的TAL1基因(genebank：U19102)；5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TKL1基因的TKL1基因(genebank：X73224)；成为向酵母基因组上的同源重组区域的亮氨酸合成酶(LEU2)基因从3’侧末端到上游约500bp的区域(LEU2U)以及该基因5’侧末端上游的约450bp的区域(LEU2D)；以及组氨酸合成酶(HIS3)基因(标志物基因)。此外，同源重组区域的外侧导入了限制性酶Sse8387I的位点。另外，来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TAL1基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的转醛醇酶1的氨基酸序列分别示于序列号11和12。进而来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的TKL1基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的转酮醇酶1的氨基酸序列分别示于序列号13和14。
(4)RPE1·RKI1基因导入、GRE3基因破坏用载体
作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的核酮糖磷酸差向异构酶1(RPE1)基因和核糖磷酸酮异构酶(RKI1)基因的酵母导入用载体，制作了图4所示的pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3-P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2-GRE3D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的作为来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RPE1基因的RPE1基因(genebank：X83571)；5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了TDH3终止子的来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RKI1基因(genebank：Z75003)；成为向酵母基因组上的同源重组和用于破坏醛糖还原酶3(GRE3)基因的区域的包含GRE3基因的3’末端区域约500bp的约800bp的区域(GRE3U)和GRE3基因的上游约1000bp的区域(GRE3D)；以及亮氨酸合成酶(LEU2)基因(标志物基因)。此外，同源重组区域的外侧导入了限制性酶Sse8387I的位点。另外，来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RPE1基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的核酮糖磷酸差向异构酶1的氨基酸序列分别示于序列号15和16。进而，来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的RKI1基因的编码区的碱基序列和该基因所编码的核糖磷酸酮异构酶的氨基酸序列分别示于序列号17和18。
(5)ADH2基因破坏用载体
作为宿主中内在的ADH2基因的破坏用载体，制作了图5所示的pCR-ADH2U-URA3-ADH2D。该载体中，作为向酵母基因组上的同源重组和用于破坏醇脱氢酶2(ADH2)基因的区域，包含ADH2基因的上游约700bp的区域(ADH2U)、ADH2基因的下流约800bp的区域(ADH2D)、以及乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(URA3)基因(标志物基因)。
(6)ADH1基因导入用载体
作为醇脱氢酶1(ADH1)基因的酵母导入用载体，制作了图6所示的pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D。该载体包含：5’侧添加了TDH3启动子和3’侧添加了ADH1终止子的来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的ADH1基因(genebank：Z74828.1)、成为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从3’侧末端到上游约450bp的区域(ADH2part)和从3’侧末端到下流的约700bp的区域(ADH2D)、作为ADH2的终止子的CYC1终止子、以及URA3基因(标志物基因)。
(7)mhpF基因导入用载体
作为来源于大肠杆菌(E.coli)的乙醛脱氢酶(mhpF)基因的酵母导入用载体，制作了图7所示的pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了ERO1终止子的来源于大肠杆菌(E.coli)的乙醛脱氢酶基因(mhpF基因)、成为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从3’侧末端到上游约450bp的区域(ADH2part)和从3’侧末端到下流的约700bp的区域(ADH2D)、作为ADH2的终止子的CYC1终止子、以及包含URA3基因的基因(标志物基因)。此外，本实施例中，mhpF基因使用将全区域设计成根据酵母的密码子使用频率而转换了使用的密码子的碱基序列，基于该碱基序列全合成而得的基因。本实施例中设计的mhpF基因的碱基序列和该基因所编码的乙醛脱氢酶的氨基酸序列分别示于序列号1和2。
(8)mhpF·ADH1基因导入用载体
作为mhpF基因和ADH1基因的酵母导入用载体，制作了图8所示的pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了ERO1终止子的mhpF基因(与上述(7)相同)、5’侧添加了TDH3启动子和3’侧添加了ADH1终止子的来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的ADH1基因(与上述(6)相同)、成为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从3’侧末端到上游约450bp的区域(ADH2part)、和从3’侧末端到下流的约700bp的区域(ADH2D)、作为ADH2的终止子的CYC1终止子、以及URA3基因(标志物基因)。
(9)mhpF基因导入、ADH2破坏用载体
作为mhpF基因的酵母导入和ADH2基因破坏用载体，制作了图9所示的pCR-ADH2U-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了ERO1终止子的mhpF基因(与上述(7)相同)、成为向酵母基因组上的同源重组和用于破坏ADH2基因的区域的ADH2基因的上游约700bp的区域(ADH2U)和ADH2基因的上游约800bp的区域(ADH2D)、以及URA3基因(标志物基因)。
(10)mhpF基因和ADH1基因导入、ADH2破坏用载体
作为mhpF基因和ADH1基因的酵母导入以及ADH2基因破坏用载体，制作了图10所示的pCR-ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D。该载体包含：5’侧添加了HOR7启动子和3’侧添加了ERO1终止子的mhpF基因(与上述(7)相同)、5’侧添加了TDH3启动子和3’侧添加了ADH1终止子的来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)S288株的ADH1基因(与上述(6)相同)、成为向酵母基因组上的同源重组和用于破坏ADH2基因的区域的ADH2基因的上游约700bp的区域(ADH2U)和ADH2基因的上游约800bp的区域(ADH2D)、以及URA3基因(标志物基因)。
(11)对照载体(仅标志物基因)
作为仅导入标志物基因的对照载体，制作了图11所示的pCR-ADH2part-T_CYC1-URA3-ADH2D。该载体包含：成为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从3’侧末端到上游约450bp的区域(ADH2part)和从3’侧末端到下流的约700bp的区域(ADH2D)、作为ADH2的终止子的CYC1终止子、以及URA3基因(标志物基因)。
＜载体导入酵母株的制作＞
用添加了5-氟乳清酸的培养基筛选作为2倍体酵母的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC2-T株(Saitoh,S.等，J.Ferment.Bioeng.1996年、81卷98-103)(Boeke,J.D.,etal.1987MethodsEnzymol.；154:164-75.)，以成为尿嘧啶营养缺陷型的菌株作为宿主。
酵母的转化使用Frozen-EZYeastTransformationII(ZYMORESEARCH)，按照附带的实验步骤进行。首先，使用将pUC-HIS3U-P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段，进行OC2-T株的转化，涂布于YPD+HYG琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株命名为OC100株。接下来，使用将pUC-LEU2U-P_HOR7-TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3-LEU2D载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段，进行OC100株的转化，涂布于不含组氨酸的SD琼脂培养基(MthodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress)，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株命名为OC300株。接下来，使用将pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3-P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2-GRE3D载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段，进行OC300株的转化，涂布于不含亮氨酸的SD琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株命名为OC600株。接下来，使用将pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d-R45载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段，进行OC600株的转化，涂布于不含色氨酸的SD琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株命名为OC700株。如上制作的OC700株中导入有RsXI-C1基因、XK基因、TAL1基因、TKL1基因、RPE1基因和RKI1基因。
接下来，使用将pCR-ADH2U-URA3-ADH2D、pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D、pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D、pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D、pCR-ADH2U-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D、pCR-ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D、pCR-ADH2part-T_CYC1-URA3-ADH2D的各载体的同源重组部位之间用PCR扩增而得的片段，进行OC700株的转化，涂布于不含尿嘧啶的SD琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株分别命名为Uz1048、Uz1047、Uz928、Uz1012、Uz926、Uz736和Uz1049株。
＜发酵试验＞
从如上所得的Uz1048、Uz1047、Uz928、Uz1012、Uz926、Uz736和Uz1049系统的菌株中分别挑选发酵能力高的菌株，如下实施烧瓶发酵试验。首先，在分装有20ml葡萄糖浓度20g/L的YPD液体培养基(酵母提取物10g/L、胨20g/L、葡萄糖20g/L)的100ml容量的带挡板的烧瓶中接种供试株，以30℃120rpm进行24小时培养。集菌后，接种于分装有10mlD20X60YAc6培养基(葡萄糖20g/L、木糖60g/L、酵母提取物10g/L、乙酸6g/L)的20ml容量的烧瓶中(菌浓度0.3g干燥菌体/L)，以振荡培养(80rpm、振幅35mm、30℃)进行发酵试验。此外，盖在烧瓶上的塞子是通有内径1.5mm的针的橡胶制，通过在针的最前部安装止回阀而使得烧瓶保持厌氧环境。
发酵开始65小时后进行取样，对于发酵液中的葡萄糖、木糖、乙酸、乙醇，使用HPLC(LC-10A；岛津制作所)，在下述条件测定。
柱：AminexHPX-87H
移动相：0.01NH2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
检测器：差示折射率检测器RID-10A
＜发酵试验结果＞
上述发酵试验的结果示于表1。
表1
如由表1判断的那样，与mhpF过表达株相比，在过表达mhpF基因和ADH1基因的同时破坏了ADH2基因的Uz736株中，木糖的同化速度大幅提高，其结果乙醇的生产性提高。由于仅ADH2破坏的菌株、仅ADH1过表达的菌株的木糖的同化速度不改善，因而考虑存在协同效果。另外，在Uz736株中，培养基中的乙酸的浓度有意义地减少，明确了乙酸同化能力也提高。
〔实施例2〕
本实施例中，制作导入了木糖异构酶基因和大肠杆菌的mhpF基因、adhE基因、来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因或来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因的重组酵母。本实施例中制作的重组酵母中，破坏了内在的一对ADH2基因中的一方或两方。
＜导入载体的制作＞
(1)XI·XKS1·TKL1·TAL1·RKI1·RPE1基因导入和GRE3基因破坏用质粒
制作在GRE3基因座破坏GRE3基因、同时包含将来源于黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠内原生生物的木糖异构酶基因的第377位的氨基酸从天冬酰胺替换为半胱氨酸、木糖的同化速度提高了的突变基因(XI_N337C)、来源于酵母的木酮糖激酶(XKS1)基因、戊糖磷酸途径的转酮醇酶1(TKL1)基因、转醛醇酶1(TAL1)基因、核酮糖磷酸差向异构酶1(RPE1)基因和核糖磷酸酮异构酶(RKI1)基因导入酵母所需的序列的质粒pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3。
该质粒以包含5’侧添加了HOR7启动子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的TKL1基因、添加了FBA1启动子的TAL1基因、添加了ADH1启动子的RKI1基因、添加了TEF1启动子的RPE1基因、添加了TDH1启动子和DIT1终止子的XI_N337C(全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、添加了TDH3启动子和HIS3终止子的XKS1基因、作为向酵母基因组上的同源重组区域的GRE3基因的从5’侧末端到上游约700bp的区域的基因序列(GRE3U)和GRE3基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(GRE3D)、以及作为标志物的包含G418基因的基因序列(G418标志物)的方式构建。此外，标志物基因是能够通过在两侧导入LoxP序列而除去标志物的序列。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表2的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表2的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742基因组、XI_N337C合成基因DNA、LoxP序列的合成DNA为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit(タカラバイオ)等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表2
(2)mhpF·ADH1基因导入和ADH2基因破坏用质粒
制作在ADH2基因座破坏ADH2基因、同时包含将来源于大肠杆菌(E.coli)的乙醛脱氢酶基因(mhpF)和来源于酵母的醇脱氢酶1(ADH1)基因导入酵母所需的序列的质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2。
该质粒以包含5’侧添加了TDH3启动子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的ADH1基因、添加了HOR7启动子和DIT1终止子的mhpF基因(全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、作为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从5’侧末端到上游约700bp的区域的基因序列(ADH2U)和ADH2基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(ADH2D)、以及作为标志物的包含URA3基因的基因序列(URA3标志物)的方式构建。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表3的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表3的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742基因组或mhpF合成基因DNA为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表3
(3)adhE·ADH1基因导入和ADH2基因破坏用质粒
制作在ADH2基因座破坏ADH2基因、同时包含将来源于大肠杆菌(E.coli)的乙醛脱氢酶基因(adhE)和来源于酵母的醇脱氢酶1(ADH1)基因导入酵母所需的序列的质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2。
该质粒以包含5’侧添加了TDH3启动子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的ADH1基因、添加了HOR7启动子和DIT1终止子的adhE基因(NCBI登录号NP_415757.1、全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、作为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从5’侧末端到上游约700bp的区域的基因序列(ADH2U)和ADH2基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(ADH2D)、以及作为标志物的包含URA3基因的基因序列(URA3标志物)的方式构建。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表4的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表4的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2或adhE合成基因DNA为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表4
(4)来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因·ADH1基因导入和ADH2基因破坏用质粒
制作在ADH2基因座破坏ADH2基因、同时包含将来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因和来源于酵母的醇脱氢酶1(ADH1)基因导入酵母所需的序列的质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-CloADH-HOR7_P-URA3-3U_ADH2。
该质粒以包含5’侧添加了TDH3启动子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的ADH1基因、添加了HOR7启动子和DIT1终止子的来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢酶基因(NCBI登录号YP_001310903.1、全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、作为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从5’侧末端到上游约700bp的区域的基因序列(ADH2U)和ADH2基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(ADH2D)、以及作为标志物的包含URA3基因的基因序列(URA3标志物)的方式构建。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表5的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表5的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2或来源于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醛脱氢的合成基因DNA为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表5
(5)来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因·ADH1基因导入和ADH2基因破坏用质粒
制作在ADH2基因座破坏ADH2基因、同时包含将来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因和来源于酵母的醇脱氢酶1(ADH1)基因导入酵母所需的序列的质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-ChlaADH1-HOR7_P-URA3-3U_ADH2。
该质粒以包含5’侧添加了TDH3启动子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的ADH1基因、添加了HOR7启动子并添加了DIT1终止子的来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢酶基因(NCBI登录号5729132,全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、作为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因的从5’侧末端到上游约700bp的区域的基因序列(ADH2U)和ADH2基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(ADH2D)、以及作为标志物的包含URA3基因的基因序列(URA3标志物)的方式构建。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表6的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表6的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2或来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的乙醛脱氢的合成基因DNA为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表6
(6)mhpF基因导入用质粒
制作不在ADH2基因座破坏ADH2基因、并包含在ADH2基因座附近将来源于大肠杆菌(E.coli)的乙醛脱氢酶基因(mhpF)导入酵母所需的序列的质粒pUC-ADH2-T_CYC1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2。
该质粒以包含5’侧添加了HOR7启动子并添加了DIT1终止子的来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742株的mhpF基因(全合成将全长根据酵母的密码子使用频率而转换了密码子的序列而得的基因)、作为向酵母基因组上的同源重组区域的ADH2基因和ADH2基因从3’侧末端到下流的约800bp的区域的DNA序列(ADH2D)、以及作为标志物的包含URA3基因的基因序列(URA3标志物)的方式构建。
此外，本质粒所含的各DNA序列可以使用表7的引物来扩增。为了使各DNA片段结合，使用对表7的引物以与邻接DNA序列重复约15bp的方式添加了DNA序列的引物，以质粒pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742基因组为模板扩增目的DNA片段，使用In-FusionHDCloningKit等依次使DNA片段结合，克隆到质粒pUC19中而制成最终目的质粒。
表7
＜载体导入酵母株的制作＞
用添加了5-氟乳清酸的培养基筛选作为2倍体酵母的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC2株(NBRC2260)(Boeke,J.D.,etal.1987MethodsEnzymol.；154:164-75.)，以成为尿嘧啶营养缺陷型的菌株(OC2U)作为宿主。酵母的转化使用Frozen-EZYeastTransformationII(ZYMORESEARCH)，按照附带的实验步骤进行。
使用将上述(1)中制作的质粒：pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3的同源重组部位用PCR扩增而得的片段，进行OC2U株的转化，涂布于包含G418的YPD琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株命名为Uz1252株。使本菌株在胞子形成培养基(1％磷酸钾、0.1％酵母提取物、0.05％葡萄糖、2％琼脂)中形成胞子，利用同宗配合性进行2倍化。获得在作为2倍体的染色体的GRE3基因座区域插入了突变型XI基因、TKL1基因、TAL1基因、RPE1基因、RKI1基因和XKS1基因、且GRE3基因被破坏的菌株。将此作为Uz1252-3株。
并且，使用将上述(2)中制作的质粒：pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2、上述(3)中制作的质粒：pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2、上述(4)中制作的质粒：pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-CloADH-HOR7_P-URA3-3U_ADH2、上述(5)中制作的质粒：pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-ChlaADH1-HOR7_P-URA3-3U_ADH2、和上述(6)中制作的质粒：pUC-ADH2-T_CYC1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2的各质粒的同源重组部位之间用PCR扩增而得的片段，进行上述Uz1252-3株的转化，涂布于不含尿嘧啶的SD琼脂培养基，将生长的集落纯化。将纯化后的选择株分别命名为Uz1317株、Uz1298株、Uz1296株、Uz1330株、和Uz1320株。
此外，确认了这些全部菌株发生了杂合(1拷贝)重组。对于所得的Uz1317株、Uz1298株和Uz1296株，使其在胞子形成培养基中形成胞子，利用同宗配合性进行2倍化，将所得的菌株分别命名为Uz1319株、Uz1318株和Uz1311株。
另外，作为对照，使用以OC2基因组为模板用PCR扩增而得的尿嘧啶基因，进行OC2U株的转化，涂布于不含尿嘧啶的SD琼脂培养基，将生长的集落纯化，命名为Uz1313株。使Uz1313株在胞子形成培养基中形成胞子，利用同宗配合性进行2倍化，命名为Uz1323株。
此外，本实施例中制作的株的基因型归纳于表8。
表8
＜发酵试验＞
从如上制成的菌株中分别选择发酵能力高的2株，如下实施烧瓶发酵试验。首先，在分装有20ml葡萄糖浓度20g/L的YPD液体培养基(酵母提取物10g/L、胨20g/L、葡萄糖20g/L)的100ml容量的带挡板的烧瓶中接种供试株，以30℃120rpm进行24小时培养。集菌后，接种于分装有8mlD60X80YPAc4培养基(葡萄糖60g/L、木糖80g/L、酵母提取物10g/L、胨20g/L、乙酸4g/L)或D40X80YPAc2培养基(葡萄糖40g/L、木糖80g/L、酵母提取物10g/L、胨20g/L、乙酸2g/L)的10ml容量的烧瓶中，通过振荡培养(80rpm、振幅35mm、30℃)进行发酵试验。此外，盖在烧瓶上的塞子是通有内径1.5mm针的橡胶制，通过在针的最前部安装止回阀来使烧瓶保持厌氧环境。
对于发酵液中的葡萄糖、木糖、乙醇，使用HPLC(LC-10A；岛津制作所)，在下述条件测定。
柱：AminexHPX-87H
移动相：0.01NH2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
检测器：差示折射率检测器RID-10A
＜发酵试验结果＞
将使用D60X80YPAc4培养基、发酵时间为66小时的发酵试验(加入菌浓度0.3g干燥菌体/L)的结果示于表9和10。此外，表9和10所示的数据是独立获得的重组株3株的数据平均值。
表9
表10
将使用D40X80YPAc2培养基、发酵时间为42小时的发酵试验(加入菌浓度0.24g干燥菌体/L)的结果示于表11和12，另外将对于杂合导入株使用D40X80YPAc2培养基、发酵时间为42小时的发酵试验(加入菌浓度0.3g干燥菌体/L)的结果示于表13。此外，表11～13所示的数据是独立获得的重组株3株的数据平均值。
表11
表12
表13
如由表9～13可知的那样，与对照相比，杂合或纯合地破坏了ADH2、同时过表达ADH1和3种乙醛脱氢酶的任一种的菌株，木糖的同化速度大幅提高，乙酸的减少量也多，其结果乙醇的生产性提高。此外，关于乙酸的减少量，与ADH2的杂合导入株相比，ADH2的纯合导入株更多。另一方面，仅表达乙醛脱氢酶mhpF的菌株，木糖的同化速度降低，乙酸基本不减少，乙醇的生产性不提高。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
Claims (14)
1.乙醇的制造方法，具有以下工序：将导入了木糖异构酶基因和乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有木糖的培养基进行培养，从而进行乙醇发酵。
2.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述木糖异构酶基因是编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因，
(a)具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号4所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有将木糖变为木酮糖的酶活性的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号2或20所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号2或20所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于拜氏梭菌的乙醛脱氢酶。
6.根据权利要求5所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于拜氏梭菌的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号22所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号22所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
7.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述乙醛脱氢酶基因编码来源于莱茵衣藻的乙醛脱氢酶。
8.根据权利要求5所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述来源于莱茵衣藻的乙醛脱氢酶是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号24所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号24所示的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
9.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是进一步导入了木酮糖激酶基因的重组酵母。
10.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是导入了下述基因的重组酵母，所述基因编码选自构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶群中的酶。
11.根据权利要求10所述的乙醇的制造方法，其特征在于，构成戊糖磷酸途径中的非氧化过程的途径的酶群是核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶。
12.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述培养基含有纤维素，在所述乙醇发酵中，至少同时进行所述纤维素的糖化。
13.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因。
14.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述重组酵母是具有将乙醇转换为乙醛的活性的醇脱氢酶基因的表达量降低了的重组酵母。
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