CN113046252B - 一株乙醛脱氢酶高产菌株的分离与鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株乙醛脱氢酶高产菌株的分离与鉴定，属于微生物技术领域。本发明分离筛选到的一株具有乙醛脱氢酶活性的热带假丝酵母(Candida tropicalis)LBBE‑W1，其产乙醛脱氢酶的酶活力达20.06U/mL，乙醛的降解率为98.13％，直接证明了该粗酶液中具有能够催化乙醛降解的乙醛脱氢酶。于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61401。

Description

一株乙醛脱氢酶高产菌株的分离与鉴定

技术领域

本发明涉及一株乙醛脱氢酶高产菌株的分离与鉴定，属于微生物技术领域。

背景技术

大量的细胞和动物试验充分表明乙醛具有高毒性、致癌性和致突变性，现如今国际癌症研究机构(IARC)已把乙醛列为Ⅰ类致癌物。人体内乙醛脱氢酶(Acetaldehydedehydrogenase，ALDH，EC 1.2.1.10)以四聚体的形式存在，其依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NAD+)将外源性或内源性的乙醛氧化为对人体没有危害的乙酸。肝细胞线粒体内的乙醛脱氧酶2(ALDH2)参与人体内60％以上的乙醛代谢。

目前众多学者尝试在以大肠杆菌为主的原核系统以及以毕赤酵母为主的真核系统中表达人源乙醛脱氢酶ALDH2，其中2005年裘丽珍将人源ALDH2基因导入到大肠杆菌Escherichia coli BL21中，高效的表达出了人源的ALDH2。ALDH2的比酶活达到331.7U·mL^-1。2010年黄锟等将人源ALDH2基因连接到pPIC9K质粒，构建重组质粒pPIC9K-ALDH2，将其电转至毕赤酵母P.Pastoris SMD1168中，纯化后的ALDH酶活达到0.115U·mL^-1。2010年赵锦等人在上述实验的基础上，去除了pPIC9K-ALDH2的信号肽，经甲醇诱导，使目的基因ALDH2在细胞内进行表达，纯化后的ALDH酶活达到0.944U·mL^-1。但是，大肠杆菌是一种致病菌，毕赤酵母表达目的基因时需要用甲醇诱导，这对产物的安全性都有一定的影响。

ALDH也广泛存在于动物、植物和微生物中，研究者们开始对不同微生物来源的以及相同来源但不同分类的ALDH进行了相关研究。2009年黄瑞等人对酿酒酵母的ALDH基因进行克隆表达，将ALDH基因与表达载体pEtac连接获得重组质粒pEtac-ALDH，转化大肠杆菌JM109中进行有效表达ALDH。ALDH的比酶活力达到15U·mg^-1。2011年，姚正颖从南京果园马奶葡萄中筛到一株陆生伊萨酵母菌Issatchenkia terricola XJ-2并对其所产的ALDH进行了研究，粗酶液酶活力达到了6.28U·mL^-1；然后将陆生伊萨酵母菌XJ-2中的ALDH基因构建融合表达载体在JM109中进行异源表达，重组ALDH的酶活力达到44.23U·mL^-1，比酶活力达到10.95U·mg^-1。2011年陈贵佺从雪峰低糖型干酵母中提取的ALDH粗酶液酶活力为3.56U·mL^-1。2013年杨亚平利用S.Cerevisiae INVsl表达系统分别表达啤酒酵母Beer.yeast中的ADH2基因和ALDH6基因，得到的ADH2比酶活力为0.49U·mg^-1；重组菌的ALDH6比酶活力为0.11U·mg^-1。并且将ADH2基因和ALDH6基因一起连接到表达载体pYES2上，将其在INVs1中实现ADH2和ALDH6的共表达，实验得出重组菌I-ADH2-ALDH6最高的ADH酶活力为0.32U·mg^-1，最高大的ALDH6酶活力为0.082U·mg^-1。由于不同来源的乙醛脱氢酶均存在表达量和酶活较低的问题，故一直无法真正投入实际应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能高产乙醛脱氢酶的菌株。

本发明第一个目的是提供一株热带假丝酵母(Candida tropicalis)LBBE-W1，已于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61401。

本发明第二个目的是提供一种酵母菌剂，所述酵母菌剂含有上述热带假丝酵母LBBE-W1。

在一种实施方式中，所述酵母菌剂的制备方法：将上述热带假丝酵母LBBE-W1接种于YPD液体培养基中，28-35℃，200-250rpm，培养30-40h成为液体菌剂。

本发明第三个目的是提供一种制备乙醛脱氢酶的方法，具体步骤如下：

(1)将上述热带假丝酵母LBBE-W1或酵母菌剂接种于培养基，在28～32℃，200～240rpm条件下发酵30～40h获得发酵液；

(2)离心并收集菌体，破碎菌体细胞，离心收取上清。

在一种实施方式中，所述培养基的组成为：蛋白胨18～22g/L，酵母粉8～12g/L，葡萄糖18～22g/L。

在一种实施方式中，上述方法步骤(2)中所述破碎的方法为超声破碎。

在一种实施方式中，所述超声破碎的条件为：开4s，关5s，工作时间6min。

本发明的第四个目的是提供一种降解乙醛的方法。

在一种实施方式中，以乙醛为底物加入上述制备得到的乙醛脱氢酶，置于37℃反应10～14h。

本发明还保护所述热带假丝酵母LBBE-W1或酵母菌剂制备的乙醛脱氢酶在乙醛降解方面的应用。

生物材料保藏

本发明所提供的热带假丝酵母LBBE-W1，分类学名称为Candida tropicalis。现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO:61401，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1.添加2.5、3、3.5mg/mL双硫仑的平板菌株生长情况。

图2.基于26S rDNAD1/D2区域序列的菌株LBBE-W1的系统发育树。

图3复筛菌株酶活测定结果。

图4YPD平板菌落形态。

图5双硫仑平板菌落形态。

图6酵母细胞在显微镜下形态(×400)。

图7乙醛标准曲线。

图8顶空进样气相色谱法检测乙醛结果，A为不添加酶液的对照组，B为添加酶液的实验组。

具体实施方式

酶活定义：在35℃下，每分钟OD340 nm发生0.001(1μmol)的数量变化定义为1个活力单位。

酶活(U·mL^-1)＝(ΔA340 nm×稀释倍数)/(酶液加入量×10^-3)

表1酶活测定组分

实施例1：菌株的筛选

1)采样：从江苏省无锡市度家村自然葡萄园取回葡萄和土壤；

2)初筛：双硫仑平板筛选

在含有双硫仑的、以乙醇为唯一碳源的培养基上，双硫仑通过抑制乙醛脱氢酶的活性而抑制酵母的生长，然而酶活性相对较高的菌株由于乙醛脱氢酶活性只受到部分抑制因而能继续在双硫仑平板上生长。

无碳培养基：(NH₄)₂SO₄5 g/L，KH₂PO₄1 g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO₄·7H₂00.5 g/L，CaCl₂0.1g/L，酵母膏0.1g/L。

双硫仑平板：在无碳培养基的基础上，添加琼脂20g/L、无水乙醇20g/L及一定浓度双硫仑。

称取10g果园土壤加入90mL无菌水制成土壤悬液；称取10g左右的葡萄用无菌研钵研磨制成汁液。分别吸取1mL接入YPD培养基中，于30℃，220rpm富集培养48h。用无菌生理盐水将菌液梯度稀释至10％，分别吸取0.1mL 10^-4、10^-5和10^-6稀释度的菌液分别涂布含0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L、3.5mg/L或4mg/L双硫仑的平板，于30℃培养。如图1所示，双硫仑浓度越高，菌株生长的数量越少，将含有4mg/L双硫仑平板上的酵母菌挑出，于YPD平板划线分离纯化后，保存于YPD斜面备用。

3)复筛：酶活测定

YPD配方(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

将初筛得到的菌株进行96孔板发酵，从YPD斜面挑单菌落接种于装有1mLYPD液体培养基的96孔板，30℃，220rpm，发酵36h，获得发酵液。

发酵液12000rpm离心2min，去除上清收集菌体，将生理盐水稀释菌体后进行超声破碎(开4s，关5s，工作时间6min)，12000rpm离心2min获取上清得到粗酶液，然后进行酶活测定。

如图3结果所示，其中20号菌株乙醛脱氢酶酶活最高，达到13.26U/mL。

实施例2：产乙醛脱氢酶酵母菌株的鉴定

(1)形态特征、培养特征及生理生化试验

根据产生菌的菌落和菌体形态进行初步分类鉴定。结果如图4-6所示，菌落为乳白色至奶油白，无光泽，有些菌株的菌落有皱褶或表面菌丝状，边缘不整齐或丝状。

(2)26S rDNAD1/D2区域序列分析鉴定

1)菌株26S rDNAD1/D2区域序列的PCR扩增与序列测定：

将菌株LBBE-W1的单菌落加入10μL无菌水溶解，备用。

采用酵母26S rDNA D1/D2区域的通用引物，即NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)进行PCR扩增。

扩增体系为：2×Taq DNAPolymerase 12.5μL，10mmol/LNL1和NL4各1μL，菌液1uL，最后加双蒸水至25uL，混合后瞬间离心。

PCR扩增程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸10min反应结束。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经电泳后送至上海生工生物技术公司进行测序。

2)26S rDNAD1/D2序列分析及系统发育树绘制：

将测得的26S rDNAD1/D2序列通过NCBI数据库中的BLAST程序与GenBank数据库中已登录的序列进行在线同源性分析。在此基础上通过Clustal X1.83软件进行多重比较后，利用MEGA7.0软件以距离矩阵法中的邻接法neighborjining method构建系统发育树，并进行bootstrap分析，重复次数为10000次。结果如图2所示，酵母菌株LBBE-W1的26S rDNAD1/D2区域序列与热带假丝酵母(Candida tropicalis)MYA-3404的26S rDNAD1D2区域序列同源性达99.65％；在系统发育树中，菌株LBBE-W1与C.tropicalis在同一分支，亲缘关系最近。结合常规形态特征、生理和生化特征，鉴定该菌株为热带假丝酵母(C.tropicalis)。现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO:61401，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例3热带假丝酵母(Candida tropicalis)LBBE-W1发酵生产乙醛脱氢酶

1)菌种培养：从YPD斜面挑单菌落接种于装有5mLYPD液体培养基的50mL离心管，30℃，220rpm，过夜培养(12h)，再以2％(v/v)的接种量接种于装有50mLYPD液体培养基的250mL摇瓶中30℃，220rpm，发酵36h，获得发酵液。

2)粗酶液的提取：将上述获得的发酵液12000rpm离心2min，去除上清收集菌体，将生理盐水稀释菌体后进行超声破碎(开4s，关5s，工作时间6min)，12000rpm离心2min获取上清得到粗酶液，然后进行酶活测定。酶活测定为20.06U/mL。

实施例4乙醛脱氢酶降解乙醛的应用

使用实施例3获得的粗酶液与底物乙醛进行反应，对照组反应体系(3mL)：100mmol·L^-1乙醛200μL，加超纯水至3mL；实验组反应体系(3mL)：100mmol·L^-1乙醛200μL，粗酶液100μL，加超纯水至3mL。将对照组和实验组的反应液加入到20mL的顶空瓶中，加盖密封，置于37℃水浴锅反应12h后取出用气相色谱法检测乙醛含量。

乙醛脱氢酶等催化脱氢反应的氧化还原酶类的一个酶活单位(U)被定义为催化辅酶NAD(P)⁺的氧化生成1μmolNAD(P)H所需要的酶量。

乙醛标准曲线制备：精密配制乙醛系列标准溶液，浓度分别为5，10，15，20，25mg/L。在20mL的顶空瓶中分别加入3mL乙醛标准溶液，置于75℃水浴加热30min，用2mL注射器吸取1mL液上气体，迅速注入气相色谱进行检测。以峰面积y对乙醛浓度x作线性回归方程，见图7。

通过手动顶空进样气相色谱法检测酶反应液中底物乙醛的变化，测试条件：色谱柱：HP-INNOWax毛细管柱(30m×0.25mm×0.5μm)；柱温：40℃恒温5min，以5℃/min程序升温至150℃后按20℃/min升至250℃恒温2min结束分析；检测器：200℃；进样口：200℃；载气(高纯氮气)流速1.2mL/min；分流比：25：1；氢气40mL/min，空气400mL/min，氮气45mL/min。乙醛标准品的出峰时间为2.97min。根据保留时间定性，从图8可以看出，酶反应液(B)中的乙醛峰(1号峰)与其对照(A)(对照不加酶液)相比显著降低；说明菌株LBBE-W1的粗酶液中具有能够催化乙醛降解的乙醛脱氢酶。结合乙醛标准曲线(图7)计算出乙醛脱氢酶作用后乙醛的残留量，其中对照组乙醛测定含量为33.645mg/L，实验组乙醛测定含量为0.625mg/L，乙醛降解率达到98.13％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株热带假丝酵母( Candida tropicalis ) LBBE-W1，已于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61401。

2.一种酵母菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的热带假丝酵母LBBE-W1。

3.权利要求2所述酵母菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述热带假丝酵母LBBE-W1接种于培养基中，28-35℃，200-250 rpm，培养30-40 h成为液体菌剂。

4.一种制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于，应用权利要求1所述热带假丝酵母LBBE-W1或权利要求2所述的酵母菌剂进行发酵生产。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的热带假丝酵母LBBE-W1或权利要求2所述的菌剂接种于培养基，在28~32℃，200~240 rpm条件下发酵30~40 h获得发酵液；

（2）离心并收集菌体，破碎菌体细胞，离心收取上清。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成为：蛋白胨18~22 g/L，酵母粉18~12 g/L，葡萄糖18~22 g/L，余量为水。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用超声破碎菌体细胞。

8.权利要求1所述热带假丝酵母LBBE-W1在乙醛降解方面的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

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