CN105779309B - 一株土曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株土曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。本发明提供的土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7‑1，其保藏编号为CGMCC No.11657。本发明还提供了土曲霉菌株在制备木聚糖酶中的应用及生产木聚糖酶的方法，包括如下步骤：将上述的(Aspergillus terreus)菌株FC7‑1在发酵罐中进行液体发酵，收集发酵产物，离心去除菌体后得到的发酵上清液可作为木聚糖酶制剂，该木聚糖酶制剂含有的木聚糖酶的最适pH值为5.5、最适温度为55‑60℃，其水解甘蔗渣木聚糖的主要产物是木二糖。这一发明对于充分利用农业废弃物，提高甘蔗产业的综合经济效益以及减轻环境压力都有着非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株土曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。
背景技术
低聚木糖是由木糖单元通过β-1,4-糖苷键连接起来的二糖到七糖的统称，是功能性低聚糖，不能被人体所消化。人们研究发现，低聚木糖特别是其中的木二糖能够作为益生元刺激人体肠道内的益生菌——双歧杆菌的生长，并且比低聚果糖或其它低聚糖具有更为显著的效果。
目前低聚木糖的生产主要包括物理化学法和生物法。生物法生产低聚木糖的主要工艺为碱法提取得到木聚糖，然后利用木聚糖酶降解木聚糖，生产低聚木糖。目前报道的产生木聚糖酶的真菌大多数集中在曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)。
CN102787080B一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用，公开了一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。该发明提供的曲霉(Aspergillussp.)菌株FC2-2，其保藏编号为CGMCC No.6049。该发明还提供了生产木聚糖酶的方法，包括如下步骤：将曲霉(Aspergillussp.)菌株FC2-2进行液体发酵，收集发酵产物，离心去除菌体后得到的发酵上清液可作为木聚糖酶制剂，该木聚糖酶制剂含有的木聚糖酶的最适pH值为5.5、最适温度为60℃，其在50℃条件下具有较好的稳定性，且其水解甘蔗渣木聚糖的主要产物是木二糖。该木聚糖酶制剂在保健品木二糖的生产中具有应用潜力。
土曲霉是工业中生产洛伐他汀以及植酸酶等的常用菌株，但是利用土曲霉生产木聚糖酶的报道相对较少，而土曲霉所产木聚糖酶能够水解木聚糖，所得产物主要为木二糖的报道尚未见到。
广西作为中国甘蔗的种植大省，每年都有超过1千万吨的甘蔗渣产生，如能利用木聚糖酶将甘蔗渣中所含木聚糖转化为低聚木糖，则对于充分利用农业废弃物，提高甘蔗产业的综合经济效益以及减轻环境压力都有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC No.11657，保藏时间为：2015年11月27日，分类命名为土曲霉(Aspergillus terreus)。
本发明的第二个目的是提供土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1在制备木聚糖酶中的应用。
本发明的第三个目的是提供利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1生产木聚糖酶的方法，该方法为：发酵所述的土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，所述发酵的条件为在26-32℃、200-300rpm培养4-7天。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，所述的发酵使用发酵培养基，所述发酵培养基每L由5-20g酵母粉、5-20g蛋白胨、30-50g玉米芯、0.1-1.0g MgSO4·7H2O、0.1-0.8gCaCl2、1-4g KH2PO4、1-4g吐温80和水组成，用水补足体积。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，所述发酵的条件为在28℃、200-300rpm培养4天。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，所述发酵过程中的pH值为pH4.0-7.0，溶氧控制为20-50％。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，在所述收集发酵产物后还具体包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到木聚糖酶。
进一步，以上所述的生产木聚糖酶的方法，上述离心最适合的条件为8000rpm，离心10min，离心半径为5.5cm。
本发明的第四个目的是提供一种木聚糖酶制剂，其活性成分为所述的土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1或以上所述的木聚糖酶。
进一步，以上所述的木聚糖酶制剂，上述木聚糖酶最适作用pH为pH5.5，最适反应温度为55-60℃。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明的土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1具有独特的基因序列，未见在现有技术文件中有公开的报道或记载。
2.本发明的土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1对甘蔗渣木聚糖具有独特选择性。
3.上述该木聚糖酶能够水解甘蔗渣木聚糖，得到以木二糖为主的水解产物。这对于提高甘蔗渣的综合利用价值具有重要的意义。
附图说明
图1FC7-1发酵所得液态木聚糖酶制剂水解甘蔗渣木聚糖所得产物的HPLC对比图谱。
上图为标准品:X1：木糖；X2：木二糖；X3：木三糖。
下图为FC7-1发酵所得木聚糖酶水解甘蔗渣木聚糖所得产物分析结果。
图2FC7-1菌落形态。
图3分生孢子梗的显微镜照片。
图4液态木聚糖酶制剂最适作用pH曲线。
图5液态木聚糖酶制剂最适作用温度曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的转速，均为在半径为5.5cm的离心半径下的转速。
甘蔗渣木聚糖为利用碱法从甘蔗渣中提取：将粉碎后的甘蔗渣置于10％的KOH溶液里(固液比1:10)，40℃水浴8-12h后,8000rpm离心10min，取上清液，加入4倍体积的乙醇，充分混匀后，4℃静置2h，然后8000rpm离心10min，收集沉淀块，将沉淀块置于60℃烘箱烘干至恒重即为甘蔗渣木聚糖。
本发明中，木聚糖酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylate,DNS)法。
实施例1、土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1的分离获取及鉴定
1.菌株的获得
(1)土壤样品的采集：采集中国广西某自然保护区内8-20cm浅土层的土壤。
(2)菌株的分离筛选
①用蒸馏水配制筛选培养基；每升筛选培养基中含有:甘蔗渣木聚糖10g，NaNO32g，KH2PO4 1g，FeSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂15g；pH7.0；加水至1L，121℃湿热灭菌20min，混匀，倒平板。
②取1g土样放入150mL锥形瓶，加入19mL无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min,取悬浊液做梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4和10-5)，各取100μL涂布在筛选培养基平板上，28℃培养。
③5天后，观察菌落生长情况，选择菌落数适量的稀释样品大量涂布在分离平板上，28℃培养。
④3天后，挑选分离平板上生长旺盛的真菌，转接至新的分离平板，纯化为单菌落。
⑤配制基本发酵培养基：每升基本发酵培养基由5-20g酵母粉、5-20g蛋白胨、30-50g玉米芯、0.1-1.0g MgSO4·7H2O、0.1-0.8g CaCl2、1-4g KH2PO4、1-4g吐温80和水组成。调节pH为4.0-7.0，加水至1L，121℃湿热灭菌20min。
⑥将步骤(4)得到的目的菌株接种至基本发酵培养基中，26-32℃、200-300rpm摇床震荡培养4-6天，12,000rpm离心5min，取发酵上清液。
⑦在指形瓶中加入2mL发酵上清液及2mL 1％甘蔗渣木聚糖悬液，在50℃水浴摇床中，100rpm震荡24h后取样，沸水煮5min灭活木聚糖酶，冷却；12,000rpm离心5min，取上清液，HPLC检测上清液中的糖组分(色谱仪器为岛津CBM-10A系统，色谱柱型号为Aminex HPX-87P，检测器型号为RID-10A，柱温保持在80℃，流动相为水，体积流量为0.6mL/min)。标准样品为木糖、木二糖和木三糖。
从中筛选出能够水解甘蔗渣木聚糖产生以木二糖为主要产物的木聚糖酶，该木聚糖酶的生产菌株为FC7-1，结果见图1。
2.菌株的鉴定
菌株FC7-1的分生孢子梗的光学显微镜照片见图2，光学显微镜下观察可见分生孢子梗顶端膨大呈球形，小梗双层轮生，分生孢子为圆形。
菌株FC7-1的分子鉴定；具体鉴定步骤如下：提取菌株FC7-1的总DNA并作为模板，应用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’–TCCTCCGCTTATTGATATG-3’，PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条580bp的核苷酸序列(序列表中的序列1)，同源性比对分析表明：其与土曲霉(Aspergillus terreus)菌株的同源性最高。具体DNA基因序列为：
5’-TTGGCTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAAACAAGTTGCAAATAAATGCGTCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACGGAGCGGAAGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGCCGGGGGACGAGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCAAAGAATCACACTCAGACTGCAAGCTTTCAGAACAGGGTTCATGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGCGAGTCGCCCCCCGGCGGCCAGCAACGCTGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACAATAGTCACGGGTGGGAGGTTGGGCCATAAAGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGGTTCACCCAACGGAAG-3’
根据该菌株的形态特征，参照《真菌鉴定手册》(魏景超，上海:上海科学技术出版社，1979)，并结合分子鉴定结果，将菌株FC7-1初步鉴定为土曲霉(Aspergillus terreus)。
上述菌株FC7-1已2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.11657，分类命名为土曲霉(Aspergillus terreus)，保藏检测结果为“存活”。
土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1在制备木聚糖酶中的应用，即利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1生产木聚糖酶。
实施例2、
一、木聚糖酶制剂的获得
(1)发酵培养基的配制：每L所述发酵培养基由5g酵母粉、5g蛋白胨、30g玉米芯、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g CaCl2、1g KH2PO4、1g吐温80和水组成，用水补足体积。
(2)50L发酵罐中装入35L发酵培养基，121℃灭菌20min，将土曲霉(Aspergillusterreus)菌株FC7-1按1％的接种量接种至发酵罐，26℃、200rpm发酵4天，发酵过程中控制pH为4.0，控制溶氧为20％。发酵结束所得发酵液(即木聚糖酶制剂)的木聚糖酶活力为388U/mL。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
1、发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度
1)、最适作用pH值
检测不同pH条件下土曲霉菌株FC7-1发酵液酶活力的差异：分别用不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)及磷酸缓冲液(pH7.0、7.5及8.0)配制1％的桦木木聚糖溶液，37℃下测定各pH值下该发酵液的酶活力。木聚糖酶活力定义为：37℃条件下水解桦木木聚糖，每min释放出1μmol还原糖(相当于等量的木糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力为100％，其它pH下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，木聚糖酶活力在不同pH值下的测定结果见图3。结果表明，土曲霉菌株FC7-1发酵液作为木聚糖酶最适作用pH为pH5.5。
2、最适作用温度
检测不同温度条件下土曲霉菌株FC7-1发酵液酶活力的差异：分别在不同的反应温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃)以及pH5.5条件下测定土曲霉菌株FC7-1发酵液的酶活力，酶活力定义为：pH5.5条件下水解桦木木聚糖，每min释放出1μmol还原糖(相当于等量的木糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力作为100％，其它温度下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，木聚糖酶活力在不同温度下的测定结果见图4。结果表明，土曲霉菌株FC7-1发酵液作为木聚糖酶最适反应温度为55-60℃。
三、土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖
分析方法同实施例1中的1.⑦。结果为：土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖。对比分析结果参阅图1。
实施例3、利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1制备木聚糖酶
一、木聚糖酶制剂的获得
(1)发酵培养基的配制：每L所述发酵培养基由10g酵母粉、10g蛋白胨、40g玉米芯、0.5g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2g KH2PO4、2g吐温80和水组成，用水补足体积。
(2)50L发酵罐中装入35L发酵培养基，121℃灭菌20min，将土曲霉(Aspergillusterreus)菌株FC7-1按2％的接种量接种至发酵罐，28℃、250rpm发酵5天，发酵过程中控制pH为5.0，控制溶氧为30％。发酵结束所得发酵液(即木聚糖酶制剂)的木聚糖酶活力为263U/mL。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度分析方法同实施例2。
结果表明：发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值为5.5，,最适作用温度为55-60℃。
三、土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖
分析方法同实施例1中的1.⑦。
结果表明：土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖。
实施例4、利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1制备木聚糖酶
一、木聚糖酶制剂的获得
(1)发酵培养基的配制：每L所述发酵培养基由15g酵母粉、15g蛋白胨、50g玉米芯、1.0g MgSO4·7H2O、0.8g CaCl2、3g KH2PO4、3g吐温80和水组成，用水补足体积。
(2)50L发酵罐中装入35L发酵培养基，121℃灭菌20min，将土曲霉(Aspergillusterreus)菌株FC7-1按3％的接种量接种至发酵罐，30℃、300rpm发酵6天，发酵过程中控制pH为6.0，控制溶氧为40％。发酵结束所得发酵液(即木聚糖酶制剂)的木聚糖酶活力为246U/mL。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度分析方法同实施例2。
结果表明：发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值为5.5，,最适作用温度为55-60℃。
三、土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖
分析方法同实施例1中的1.⑦。
结果表明：土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖。对比分析结果参阅图1。
实施例5、利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1制备木聚糖酶
一、木聚糖酶制剂的获得
(1)发酵培养基的配制：每L所述发酵培养基由20g酵母粉、20g蛋白胨、35g玉米芯、0.8g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、4g KH2PO4、4g吐温80和水组成，用水补足体积。
(2)50L发酵罐中装入35L发酵培养基，121℃灭菌20min，将土曲霉(Aspergillusterreus)菌株FC7-1按4％的接种量接种至发酵罐，32℃、230rpm发酵4-7天，发酵过程中控制pH为7.0，控制溶氧为50％。发酵结束所得发酵液(即木聚糖酶制剂)的木聚糖酶活力为246U/mL。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度分析方法同实施例2。
结果表明：发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值为5.5，,最适作用温度为55-60℃。
三、土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖
分析方法同实施例1中的1.⑦。
结果表明：土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖。对比分析结果参阅图1。
实施例6、利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株FC7-1制备木聚糖酶
一、木聚糖酶制剂的获得
(1)发酵培养基的配制：每L所述发酵培养基由10g酵母粉、10g蛋白胨、40g玉米芯、0.3g MgSO4·7H2O、0.5g CaCl2、2g KH2PO4、2g吐温80和水组成，用水补足体积。
(2)50L发酵罐中装入35L发酵培养基，121℃灭菌20min，将土曲霉(Aspergillusterreus)菌株FC7-1按2％的接种量接种至发酵罐，28℃、280rpm发酵4-7天，发酵过程中控制pH为6.0，控制溶氧为30％。发酵结束所得发酵液(即木聚糖酶制剂)的木聚糖酶活力为246U/mL。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度分析方法同实施例2。
结果表明：发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值为5.5，,最适作用温度为55-60℃。
三、土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖
分析方法同实施例1中的1.⑦。
结果表明：土曲霉菌株FC7-1发酵液水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖。对比分析结果参阅图1。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.土曲霉（Aspergillus terreus）菌株FC7-1，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.11657；所述的菌株FC7-1的DNA基因序列为：
5’-ttggctcctacctgatccgaggtcaacctggaaaaaaacaagttgcaaataaatgcgtcggcgggcgccggccgggcctacggagcggaagacgaagccccatacgctcgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccgggagccgggggacgagggcccaacacacaagccgggcttgagggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaattctgcaattcacattagttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccattgttgaaagttttaactgattgcaaagaatcacactcagactgcaagctttcagaacagggttcatgttggggtctccggcgggcacgggcccgggggcgagtcgccccccggcggccagcaacgctggcgggcccgccgaagcaacaaggtacaatagtcacgggtgggaggttgggccataaagacccgcactcggtaatgatccttccgcagggttcacccaacggaag-3’。
2.权利要求1所述的土曲霉（Aspergillus terreus）菌株FC7-1在制备木聚糖酶中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的土曲霉（Aspergillus terreus）菌株FC7-1生产木聚糖酶的方法，其特征是：权利要求1所述的土曲霉（Aspergillus terreus）菌株FC7-1，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。
4.如权利要求3所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述发酵的条件为在26-32℃、200-300 rpm培养4-7天。
5.如权利要求3或4所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述的发酵使用发酵培养基，所述发酵培养基每L由5-20 g酵母粉、5-20 g蛋白胨、30-50 g玉米芯、0.1-1.0gMgSO4•7H2O、0.1-0.8 g CaCl2、1-4 g KH2PO4、1-4g吐温80和水组成，用水补足体积。
6.如权利要求5所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述发酵的条件为在28℃、200-300 rpm培养4天。
7.如权利要求3-4任一所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述发酵过程中的pH值为pH4.0-7.0，溶氧控制为20-50%。
8.如权利要求5所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述发酵过程中的pH值为pH4.0-7.0，溶氧控制为20-50%。
9.如权利要求8所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：在所述收集发酵产物后还具体包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到木聚糖酶。
10.一种木聚糖酶制剂，其特征在于：其活性成分为权利要求1所述的土曲霉（Aspergillus terreus）菌株FC7-1或权利要求3所述的木聚糖酶。
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Denomination of invention: An Aspergillus terreus strain and its application in the preparation of xylanase Effective date of registration: 20221229 Granted publication date: 20200207 Pledgee: Nanning United Innovation Financing Guarantee Co.,Ltd. Pledgor: GUANGXI DUODELE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022450000241 |
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Date of cancellation: 20231221 Granted publication date: 20200207 Pledgee: Nanning United Innovation Financing Guarantee Co.,Ltd. Pledgor: GUANGXI DUODELE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022450000241 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A strain of Aspergillus terroiris and its application in the preparation of xylanase Effective date of registration: 20231225 Granted publication date: 20200207 Pledgee: Nanning United Innovation Financing Guarantee Co.,Ltd. Pledgor: GUANGXI DUODELE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023450000142 |