CN105112303B - 一种产酒用复合酶的黑曲霉菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产酒用复合酶的黑曲霉菌株，属于发酵技术领域。本发明的黑曲霉菌株已于2015年7月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.11064。经培养基优化，固体发酵48h小时后获得的粗酶液中含有多种酶，其中，酯化酶活力为615.8mg·100mL^‑1、糖化酶活力为7828.9U·g^‑1、纤维素酶活力为106.68U·g^‑1。利用该菌所产酯化酶催化合成的酯化液馏出液，具有典型浓郁的浓香型白酒的香气，香味纯正，己酸乙酯含量达到总风味成分的82.04％。且该复合酶中的各种酶能够提高酿酒原料中淀粉类物质的利用率，提高出酒率，同时增加酒体中酯类物质含量，改善酒体风味，提高优质酒率，促进酿酒产业的发展。

Description

一种产酒用复合酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明涉及一种产酒用复合酶的黑曲霉菌株，属于发酵技术领域。

背景技术

近几年来，随着复合酶制剂在酿酒领域的应用，大大提高了酿酒原料的利用率，并起到了改进酒体风味的作用。在白酒的制曲、发酵等生产环节中，需要多种酶共同作用来完成，若通过单一酶复配的方式添加，存在成本高，酶系不全，难以满足复杂酿酒原料的需要。

酯化酶具有多向合成功能，能受控同时合成浓香型酒以己酸乙酯为主体香的四大酯，也可单一合成纯己酸乙酯，还可合成稀有酯类。酯化酶的反应特性与酯化菌有关。在白酒生产中应用的酯化酶制剂是生物酶和活菌体的生态混合体，在发酵过程中既有传统大曲的糖化功能，也有生香功能。

目前黑曲霉在酿酒过程中的应用主要是用于制备糖化酶、淀粉酶、果胶酶等酶制剂，有关微生物酯化酶制剂在酿酒方面主要集中在红曲霉及一些产酯酵母，黑曲霉的相关报道很少。若筛选能够同时高产纤维素酶、糖化酶和酯化酶的菌株，可以拓宽黑曲霉在酿酒方面的应用，该菌生产的酶可以达到破坏原料细胞间质的结构，使原料中的淀粉和纤维素成分得到很好的利用，利于糖化酶发生作用，从而提高原料出酒率；此外，酯化酶可以促进酒体中己酸乙酯、乳酸乙酯等物质的合成，从而达到改善酒体风味，达到提高优质品率的目的。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株黑曲霉(Aspergillus niger)菌株SXG-Z-6，该菌株能产复合酶包括酯化酶、糖化酶和纤维素酶，该菌株制备的曲粉的酯化酶、糖化酶、纤维素酶酶活分别达615.8mg·100mL^-1、106.68U·g^-1、7828.9U·g^-1。利用该菌制备的复合酶制剂，可以广泛用于酿酒生产中，能够提高原料利用率，提高酒体中酯类物质含量，从而达到提高酒质和出酒率的目的。

所述Aspergillus niger，于2015年7月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.11064，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所。

所述的Aspergillus niger分离某知名酒厂的大曲中，该菌株测序分析，其18SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上BLAST搜索，与黑曲霉有最高匹配度。

所述黑曲霉(Aspergillus niger)SXG-Z-6从大曲样品中筛选所得，在PDA平板上生长迅速，经2d后形成黄色菌丝，3d后呈黄褐色并逐渐长出黑色孢子，4d后菌落呈厚绒状，外圈为黄色菌丝中间为黑色孢子，用牙签从平板上挑取少量菌丝制片，在显微镜下观察，菌丝多分枝，具隔，分生孢子呈球形，一般700～800μm。顶囊近球形，小梗双层。分生孢子球形，直径多为4～5μm黑褐色，粗糙。

本发明的第二个目的是提供所述Aspergillus niger在酿酒方面的应用。

所述的应用，在本发明的一种实施方式中，所述应用是在酿酒过程中加入Aspergillus niger纯种固体发酵所得曲粉。

本发明的第三个目的是提供一种利用所述Aspergillus niger生产复合酶制剂(即曲粉)的方法，所述方法是将Aspergillus niger种子液接入麸皮固体培养基中，于35-38℃培养42-54h，然后取出、烘干、粉碎，即得复合酶制剂。

所述麸皮固体培养基，在本发明的一种实施方式中，按以下比例制成：麸皮10g，玉米粉1.5g，酵母粉2g，硫酸铵0.2g，大豆油0.1g，蒸馏水10mL，初始pH 6。

所述培养，在本发明的一种实施方式中，是培养44h。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将甘油管保藏的Aspergillusniger接入霉菌液体培养基中，在36℃180r·min^-1摇床培养24h，作为种子液接入麸皮固体培养基，于35-38℃培养42-54h，然后取出、烘干、粉碎。

所述霉菌液体培养基，在本发明的一种实施方式中，为：黄豆粉20g L^-1，玉米粉20gL^-1，蛋白胨10g·L^-1，磷酸二氢钾1g·L^-1，硫酸铵2.5g·L^-1，氯化钙0.1g·L^-1，硫酸镁0.5g·L^-1，自然pH。

所述烘干，在本发明的一种实施方式中，是在45-55℃进行。

本发明还要求保护按上述方法得到的复合酶制剂及其在酿酒方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的黑曲霉菌株，可以同时产酯化酶、糖化酶和纤维素酶，酶活分别达615.8mg·100mL^-1、7828.9U·g^-1、106.68U·g^-1，从而形成一种针对酒曲原料的多酶复合体系，这种酒用复合酶可以广泛用于酿酒生产中，能够提高原料利用率，提高酒体中酯类物质含量，从而达到提高酒质和出酒率的目的；本发明的黑曲霉SXG-Z-6的酯化液制备过程中蒸馏得到的馏出液具有典型浓郁的浓香型白酒的香气，香味纯正，经检测己酸乙酯含量达到总风味成分的82.04％，在酯化酶催化下形成的主产物以及副产物都是构成白酒风味的组成部分，说明本发明的黑曲霉酯化酶催化的反应对白酒风味形成具有一定的影响，适合用于浓香型白酒的酿造。

(2)本发明黑曲霉菌株可采用固体发酵生产高效廉价的酒用复合酶制剂，所用固态发酵培养基原料来源广泛、成本低，生产工艺简单且酶系酶活高。

(3)本发明的菌株黑曲霉从大曲中筛选得到，黑曲霉为国家卫生部和FDA公布的食品安全菌株，不存在安全性问题，因此，本发明黑曲霉菌株用于制备酒用复合酶安全可靠。

生物材料保藏：

一株Aspergillus niger，分类学命名为黑曲霉Aspergillus niger，于2015年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11064，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1：SXG-Z-6菌株基于18S rRNA同源性构建的系统进化树；

图2：酯化液中挥发性成分总离子流图。

具体实施方式

实施例1：菌株的鉴定

鉴定主要通过：

1)形态学鉴定：观察菌株SXG-Z-6在PDA平板上生长情况，经2d后菌落呈黄色菌丝，3d后呈黄褐色并逐渐长出黑色孢子，4d后菌落呈厚绒状，外圈为黄色菌丝中间为黑色孢子；用牙签从平板上挑取少量菌丝制片，在显微镜下观察，菌丝多分枝，具隔，分生孢子呈球形，一般700～800μm，顶囊近球形，小梗双层，分生孢子球形，直径多为4～5μm黑褐色，粗糙。

2)18S rRNA分子鉴定：利用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SK8259柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒来提取菌株基因组DNA并扩增。

PCR引物序列：NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；

NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)。

PCR扩增的反应体系为：50μL的总反应体积中包含1μL DNA模板，每个引物0.5μL(10μM)，0.5μL dNTP Mixture(10mM each)，2.5μL 10*Taq reaction Buffer，加水至25μL。

PCR循环程序：96℃预变性5min，93℃变性35s，56℃退火30s，72℃延伸70s，30个循环后延伸7min。

将测得的SXG-Z-6的18S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)与NCBI数据库内其他菌株的18S rRNA基因序列应用Blast软件进行比对，发现该菌株与黑曲霉菌(Aspergillus niger)的同源性较高，因此初步鉴定为黑曲霉属。应用MEGA5.2软件构建NJ(Neighbor-joining)系统发育树，菌株SXG-Z-6的系统发育树如图1所示。

实施例2：黑曲霉固态发酵产酒用复合酶及酶活力测定

将所述黑曲霉(Aspergillus niger)SXG-Z-6从PDA培养基上取少量生长良好的菌落移入新鲜的霉菌液体培养基中，36℃摇床培养24h，然后接入麸皮固体培养基发酵44h，将获得的发酵产物在50℃烘干粉碎，得到酒用复合酶曲粉。以同样从大曲中筛选得到的黑曲霉TGG-Z-2为对照。

所述霉菌液体培养基为：黄豆粉20g·L^-1，玉米粉20g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，磷酸二氢钾1g·L^-1，硫酸铵2.5g·L^-1，氯化钙0.1g·L^-1，硫酸镁0.5g·L^-1，自然pH。

所述的麸皮固体培养就为：麸皮10g，玉米粉1.5g，酵母粉2g，硫酸铵0.2g，大豆油0.1g蒸馏水10mL，初始pH 6。

(一)酯化酶活力的测定：

(1)酯化液的制备

吸取1mL己酸于100mL容量瓶中，用20％的乙醇溶液定容至刻度，混匀后转入150mL具塞三角瓶中，加入5g烘干曲粉，于36℃保温酯化100h。然后加入50mL蒸馏水或无水乙醇，于500mL蒸馏烧瓶中加热蒸馏，并接收馏出液100mL。

(2)酯含量的测定

采用皂化法测定总酯含量，准确吸取50.0mL馏出液于250mL磨口三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定至粉红色，记录消耗NaOH标准溶液的毫升数。再准确加入氢氧化钠标准溶液25.0mL摇匀，装上冷凝管，加热回流皂化30min，取下冷却至室温。然后用0.05mol/L H₂SO₄硫酸标准溶液进行滴定，使粉红色刚好完全消失为其终点，记录消耗硫酸标准溶液的体积。

计算公式：

式中：X—样品中总酯的含量，mg·100mL^-1；

C1、C2—分别为NaOH和H₂SO₄浓度，mol·L_- ¹；

V2—H₂SO₄标准溶液的体积，mL；

25—NaOH标准溶液的体积，mL；

50—从蒸出液100mL中取50mL测酯；

144—己酸乙酯的换算系数。

(二)纤维素酶活力的测定：

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测还原糖。

酶活力的定义为：每小时水解CMC-Na底物，产生1mg葡萄糖所需的酶量，为1个酶活力单位。

计算公式：

X＝A×1/0.5×n×2

式中：X—纤维素酶活力，U·g^-1；

A—吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg；

1/0.5—换算成酶液1mL；

N—稀释倍数；

2—时间换算系数。

(三)糖化酶活力的测定：

采用次碘酸钠法测定糖化酶活力。

酶活力的定义为：单位时间内分解α–1,4糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。

计算公式：

式中：X—糖化酶活力，U·g^-1；

VA—对照组消耗的硫代硫酸钠体积，mL；

VB—样品消耗的硫代硫酸钠体积，mL；

C—硫代硫酸钠浓度，mol/L；

90.05—1mL 1mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量，mg；

60/30—转化为1小时的反应量；

1/2—加入2mL酶液，换算成每毫升中的酶单位数；

32.2—反应液总体积，mL；

5—测定葡萄糖时吸取的反应液体积，mL；

n—样品稀释倍数。

各酶活力测定结果如表1所示：

表1 酒用复合酶酶活

注：“—”代表没有测定。

同时，本发明发现黑曲霉SXG-Z-6的酯化液制备过程中蒸馏得到的馏出液具有典型浓郁的浓香型白酒的香气，故利用GC/MS分析了SXG-Z-6的酯化液中的香气成分组成(如图2所示)，以分析酯化液香味纯正的原因。结果如表2所示。

表2 酯化液中香气成分相对含量

由表2可知，共检测出34种挥发性成分(除乙醇外)：其中酯类物质15种、烷烃类4种、酮类3种、醇类3种、烯烃类3种、腈类3种、酸类2种、苯类1种，分别占总成分的89.369％，1.296％，0.095％，0.091％，0.487％，0.319％，8.193％，0.042％。从香气化合物种类和相对含量来看，样品中酯类化合物的香气占主导地位，其次为酸类，样品中己酸乙酯含量达到82.04％。结果表明，其主要产物与酯化力之间存在相关性，由于酯化液中分析测得的酯类物质在白酒中都有存在，说明酯化酶催化的反应对白酒风味形成具有一定的影响，在酯化酶催化下形成的主产物以及副产物都是构成白酒风味的组成部分。

实施例3：复合酶制剂在酿造方面的应用

将本发明黑曲霉SXG-Z-6制备的曲粉，应用于浓香型白酒的酿造过程。结果发现，出酒率和原料利用率都得到提高。而且，感官评定结果显示，本发明的黑曲霉SXG-Z-6制备得到的白酒具有更加浓郁的浓香型白酒的香气。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (13)

1.一株Aspergillus niger，于2015年7月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.11064，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所。

2.一种利用权利要求1所述Aspergillus niger生产复合酶制剂的方法，其特征在于，所述方法是将Aspergillus niger种子液接入麸皮固体培养基中，于35-38℃培养42-54h，然后取出、烘干、粉碎，即得复合酶制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述麸皮固体培养基按以下比例制成：麸皮10g，玉米粉1.5g，酵母粉2g，硫酸铵0.2g，大豆油0.1g，蒸馏水10mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是将甘油管保藏的Aspergillusniger接入霉菌液体培养基中，在36℃180r·min^-1摇床培养24h，作为种子液接入麸皮固体培养基；所述霉菌液体培养基为：黄豆粉20g·L^-1，玉米粉20g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，磷酸二氢钾1g·L^-1，硫酸铵2.5g·L^-1，氯化钙0.1g·L^-1，硫酸镁0.5g·L^-1，自然pH；所述的麸皮固体培养基为：麸皮10g，玉米粉1.5g，酵母粉2g，硫酸铵0.2g，大豆油0.1g，蒸馏水10mL，初始pH 6。

5.根据权利要求2所述方法得到的复合酶制剂。

6.根据权利要求3所述方法得到的复合酶制剂。

7.根据权利要求4所述方法得到的复合酶制剂。

8.权利要求5所述复合酶制剂在酿酒方面的应用。

9.权利要求6所述复合酶制剂在酿酒方面的应用。

10.权利要求7所述复合酶制剂在酿酒方面的应用。

11.权利要求1所述Aspergillus niger在酿酒方面的应用。

12.权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用是将Aspergillus niger纯种固体发酵所得曲粉在酿酒过程中加入。

13.权利要求1所述Aspergillus niger在生物催化合成己酸乙酯方面的应用。