CN113999831B

CN113999831B - Gh11家族木聚糖酶基因及其克隆表达及苎麻脱胶应用

Info

Publication number: CN113999831B
Application number: CN202111182414.7A
Authority: CN
Inventors: 余龙江; 吴亚; 舒潼; 李攀登; 王慧慧; 向梦雄; 李雁蓉; 侯梓淇
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-10-11
Also published as: CN113999831A

Abstract

本发明涉及GH11家族木聚糖酶基因及其克隆表达及苎麻脱胶应用，属于基因工程领域。本发明公开了一种土曲霉来源的两个GH11家族木聚糖酶基因的克隆、表达及应用。本发明首次从土曲霉的基因组挖掘到了两个GH11家族木聚糖酶基因，并进行异源表达和进行理化性质分析。本发明中的木聚糖酶催化效率高，pH耐受性较好，能够适应的酸碱范围较广，热稳定性较好，并且对金属离子适应性较强、无明显抑制作用的离子，对大部分溶剂耐受性较好。利用苎麻切片进行催化实验验证，发现其能有效降解苎麻木聚糖组分。综上，这两个酶对苎麻木聚糖组分降解效果较好，且对pH、温度、金属离子及溶剂的耐受性均符合苎麻脱胶需求，能较好的应用于工业生产。

Description

GH11家族木聚糖酶基因及其克隆表达及苎麻脱胶应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及GH11家族木聚糖酶基因及其克隆表达及苎麻脱胶应用，尤其涉及两个木聚糖酶基因的克隆表达、纯化及苎麻脱胶应用。

背景技术

半纤维素几乎占地球上所有可再生有机物的三分之一，是仅次于纤维素的最丰富的生物聚合物群，木聚糖是一种广泛存在于植物细胞壁中的半纤维素，约占比20-30％，是由β-1,4-糖苷键连接而成的木糖聚合物，其侧链可被乙酰基、半乳糖醛酸、阿拉伯糖等侧基取代。

木聚糖酶可将木聚糖分子水解为木糖或木寡糖等低聚木糖，大部分木聚糖酶家族归于GH10和GH11家族，GH10家族木聚糖三维结构显示为(a/β)8桶状折叠，在中心部位是由8个平行且相邻的β折叠并排排列组成的圆柱体，它们表现出多用途底物特异性，因为它们通常能够水解低分子量纤维素底物。GH11家族三维结构成“右手半握型”的形状，主要由β-折叠组成，对纤维素没有水解活性。目前真菌木聚糖酶主要来源是曲霉、青霉菌、木霉菌，细菌产木聚糖酶主要来源是芽孢杆菌属、链霉菌等。丝状真菌是木聚糖酶的有效生产者，其商业生产主要是由木霉属和曲霉属进行的。因而从真菌中挖掘木聚糖酶，更具有工业化应用的前景。

木聚糖酶在一些领域已有较成熟的应用。在造纸业中可用于纸浆漂白，提高纸浆白度，减少化学漂白剂用量。在饲料业中，饲料中加入木聚糖酶后，既可降低肠道内容物的粘性，也可以降解植物性饲料中的木聚糖，从而使营养物质得到充分的吸收。在食品工业中，作为添加剂用于改善烘焙产品的生面团品质；在果蔬汁的加工上，它可以显著提高果蔬汁的透明度、产量和口感。木聚糖酶也能水解低聚木糖(XOS)，使其转化为益生元，促进人体肠道健康。

但是，在纺织领域，特别是在苎麻脱胶生产中，由于脱胶环境粗放，对酶的pH、离子及溶剂的耐受性要求较高。然而，现有的大部分木聚糖酶pH、离子及溶剂的耐受性较差，难以符合苎麻脱胶需求，不能较好的应用于工业生产。因此，需要进一步挖掘性质优良、能应用于苎麻脱胶的木聚糖酶。

发明内容

本发明解决了现有技术中木聚糖酶催化效率低，pH耐受性差的技术问题，从土曲霉中克隆得到了两种木聚糖酶基因，并表达了两种木聚糖酶，将本发明中的木聚糖酶应用于苎麻脱胶，催化效率高，pH耐受性较好，能够适应的酸碱范围较广，热稳定性好，并且该酶对金属离子适应性较强、无明显抑制作用的离子，对大部分溶剂耐受性较好。

根据本发明第一方面，提供了一种GH11家族木聚糖酶基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

根据本发明另一方面，提供了一种GH11家族木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

根据本发明另一方面，提供了一种重组载体，将所述的木聚糖酶基因插入到表达载体的限制性酶切位点中，使所述木聚糖酶基因的核苷酸序列与表达载体的表达调控序列相连接，得到重组载体。

根据本发明另一方面，提供了一种重组菌株，将所述的重组载体转化进宿主细胞，获得重组菌株。

根据本发明另一方面，提供了所述木聚糖酶基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从土曲霉菌丝体中提取RNA，然后进行逆转录，得到土曲霉cDNA；

(2)合成引物xyl-1F、xyl-1R、xyl-2F和xyl-2R，所述引物xyl-1F、xyl-1R、xyl-2F和xyl-2R的碱基序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；以步骤(1)得到的土曲霉cDNA为模板，以引物xyl-1F和xyl-1R扩增SEQ ID NO.1所示碱基序列的基因，以引物xyl-2F和xyl-2R扩增SEQ ID NO.2所示碱基序列的基因。

优选地，所述土曲霉为保藏编号为CCTCC NO：M 2021945的Aspergillus terreusHG-52，分类命名为土曲霉HG-52，拉丁文学名为：Aspergillus terreus HG-52，保藏该菌种的单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年7月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021945。

根据本发明另一方面，提供了所述木聚糖酶的基因工程表达方法，将所述的重组菌株进行培养，诱导重组木聚糖酶表达，回收并纯化得到的木聚糖酶。

根据本发明另一方面，提供了所述的木聚糖酶用于苎麻脱胶过程中降解木聚糖的应用。

优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO.3的木聚糖酶用于苎麻中木聚糖的降解的温度为30℃-45℃，pH为5-9；氨基酸序列如SEQ ID NO.4的木聚糖酶用于苎麻中木聚糖的降解的温度为40℃-55℃，pH为4-10。

优选地，作为底物的木聚糖浓度为1mg/ml-40mg/ml。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明人首次土曲霉的基因组挖掘到了两个GH11家族木聚糖酶基因并在大肠杆菌BL21进行了异源表达，经测定，xyl-1比酶活为1810u/mg；xyl-2比酶活为166u/mg，二者具有较高的木聚糖酶活性。

(2)本发明中xyl-1在pH 5-9处理24h后仍保留＞80％活性；xyl-2在pH 4-10处理24h后残余酶活均＞70％。这两个酶的pH耐受性较好，能够适应的酸碱范围较广，特别是xyl-2，在酸性条件下也能保持较高的参与酶活，通常情况下，产品的酸性pH值会限制生产过程中木聚糖酶的使用，酸性木聚糖酶应用在果汁和葡萄酒的浸渍和澄清中具有非常重要的价值。

(3)Fe²⁺、Cu²⁺对xyl-1、xyl-2酶活均有一定程度抑制作用；Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Al³⁺对二者有轻微的促进作用，而Mn²⁺对二者酶活促进作用较大，且随着离子浓度增加，酶活继续增强，说明该酶对金属离子适应性较强、无明显抑制作用，Mn²⁺可极大提高二者酶活，具有显著的工业应用优势。

(4)利用苎麻切片进行催化实验验证，两个相同浓度木聚糖酶处理相同时间后，与对照组相比荧光量变少，表明二者皆可去除苎麻纤维木聚糖组分，且xyl-1处理效果相对xyl-2较好，说明其能去除苎麻纤维内大部分木聚糖组分，因而其在苎麻脱胶应用方面具有很大的应用前景。

附图说明

图1为木聚糖酶xyl-1、xyl-2的琼脂糖电泳分析结果。

图2为纯化后木聚糖酶xyl-1、xyl-2的SDS-PAGE分析结果。

图3为木聚糖酶xyl-1、xyl-2的最适温度结果。

图4为木聚糖酶xyl-1、xyl-2最适pH结果。

图5为木聚糖酶xyl-1、xyl-2的pH稳定性结果。

图6为木聚糖酶xyl-1、xyl-2的热稳定性结果。

图7为木聚糖酶xyl-1、xyl-2的动力学分析结果。

图8为木聚糖酶xyl-1、xyl-2对苎麻切片处理结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

1)菌株和质粒：土曲霉Aspergillus terreus HG-52由本实验室筛选并保存至中国典型培养物保藏中心CCTCC，编号为M2021945，并上传至GeneBank，编号为MZ569606.1。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株购自天根生化科技(北京)有限公司，载体pET22b+载体购自上海拜力生物科技有限公司。

2)酶类及试剂盒：RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；限制性内切酶、DNA连接酶、纯化试剂盒均购自诺唯赞公司。山毛榉木木聚糖购自源叶公司；蛋白纯化柱购自GE公司；苎麻原材料来自湖北精华纺织集团有限公司；一抗(LM10)购买自Megazyme公司，二抗购买自Thermo公司；其它均为国产生化试剂。

3)培养基：LB培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，pH自然，定容至1L。马铃薯汁培养基：马铃薯200g，20g葡萄糖，20g琼脂，pH自然，定容至1L。

本发明的目的之一是提供性质优良且能被广泛工业应用的木聚糖酶。

本发明的另一目的是提供编码上述木聚糖的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述性质优良木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的是提供上述木聚糖酶在苎麻脱胶、纺织、食品中的应用。

本发明首次从土曲霉中Aspergillus terreus HG-52中克隆到两个GH11家族木聚糖酶基因，将其异源表达到大肠杆菌，并将纯化后的酶应用于苎麻脱胶应用。

本发明提供了一种性质优良的木聚糖酶xyl-1、xyl-2，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

其中，木聚糖酶xyl-1包括220个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列，该成熟木聚糖酶xyl-1理论分子量为22.83KDa。

其中，木聚糖酶xyl-2包括231个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列，该成熟木聚糖酶xyl-2理论分子量为23.58KDa。

本发明从土曲霉中挖掘的木聚糖酶xyl-1、xyl-2。其中xyl-1最适温度45℃、最适pH为5、比酶活为1810u/mg；xyl-2最适温度55℃，最适pH为6、比酶活为166u/mg。二者在pH5-9孵育24h后残余酶活＞80％，对大部分常见金属离子及溶剂具有良好的耐受性。

本发明提供了编码上述内木聚糖酶基因xyl-1、xyl-2。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

其中，木聚糖酶基因xyl-1共663bp，将基因xyl-1成熟编码序列及推导出的氨基酸序列进行Blast比对，其与Aspergillus leporis来源的木聚糖酶(KAB8068817.1)相似性为75.68％，确定该酶xyl-1是一种新的木聚糖酶。

其中，木聚糖酶基因xyl-2共696bp，将基因xyl-2成熟编码序列及推导出的氨基酸序列进行Blast比对，其与Aspergillus lentulus来源的木聚糖酶(XP_033417723.1)相似性为85.78％，确定该酶xyl-2是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包括上述木聚糖酶基因xyl-1、xyl-2的重组载体，称为pET22b-xyl-1、pET22b-xyl-2。将本发明的木聚糖酶xyl-1、xyl-2基因分别插入到表达载体合适的限制性酶切位点BamH I、EcoR I和Hind III之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，得到重组表达载体pET22b-xyl-1、pET22b-xyl-2。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xyl-1、xyl-2的重组菌株，优选所述菌株为重组大肠杆菌，称为重组菌株E.coli BL21/xyl-1、E.coli BL21/xyl-2。

本发明还提供了一种制备上述木聚糖酶xyl-1、xyl-2的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化进宿主细胞，获得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶xyl-1、xyl-2。

本发明还提供了上述木聚糖酶的应用，由其适合对苎麻中木聚糖的降解。

本发明中，来源于土曲霉Aspergillus terreus HG-52的木聚糖酶xyl-1、xyl-2具有优良的酶学性质，xyl-1最适温度45℃、最适pH为5、比酶活为1810u/mg；xyl-2最适温度55℃，最适pH为6、比酶活为166u/mg。二者在pH 5-9孵育24h后残余酶活＞80％，对大部分常见金属离子及溶剂具有良好的耐受性。

实施例1：土曲霉来源木聚糖酶xyl-1、xyl-2的基因克隆

将培养3-4天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入液氮研磨，同时加入提取液，后加入0.2ml三氯甲烷，冰浴10min后12000rpm离心15min。后将离心上清液加入提取管，分别加入RNA wash buffer 1和2进行离心，最后用DPEC水溶解，离心回收液体，置于-20℃冰箱备用。

将提取的RNA热变性5min，再加入反应液去除基因组DNA，后进行逆转录PCR反应(37℃反应15min，50℃反应5min，98℃反应5min)即可获得cDNA序列，置于-80℃保存。

根据土曲霉(Aspergillus terreus NIH2624)基因组设计2个木聚糖酶xyl-1、xyl-2的引物(去除信号肽)，分别为xyl-1F、xyl-1R、xyl-2F和xyl-2R，对应的序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

以提取的cDNA序列为模板进行常规PCR扩增，扩增后跑琼脂糖凝胶电泳，如图1所示。利用限制性内切酶Xho1、Nde1分别对目的基因xyl-1、xyl-2和pET22b+进行双酶切，构建重组表达载体pET22b-xyl-1、pET22b-xyl-2。将构建好的重组载体转化进大肠杆菌BL21，并利用氨苄抗生素进行筛选，挑选单菌落进行菌液PCR鉴定，后送往擎科公司进行测序。

测序结果拼接后表明，xyl-1全长663bp，编码220个氨基酸，用SignalP 4.0进行分析，预测其N端存在19个氨基酸组成的信号肽。将xyl-1氨基酸序列在GenBank中进行Blast比对，结果表明该基因与来源于Aspergillus leporis的木聚糖酶(KAB8068817.1)相似性为75.68％；测序结果拼接后表明，xyl-2全长696bp，编码231个氨基酸，用SignalP 4.0进行分析，预测其N端存在19个基酸组成的信号肽。将xyl-2氨基酸序列在GenBank中进行Blast比对，结果表明该基因与来源于Aspergillus lentulus的木聚糖酶(XP_033417723.1)氨基酸序列一致性为85.78％。

实施例2：重组木聚糖酶xyl-1、xyl-2异源表达

将重组菌株E.coli BL21/xyl-1、E.coli BL21/xyl-2接种到100ml液体LB培养基于37℃、180rpm培养，当OD_6oo达到0.6-0.8左右时，加入IPTG诱导酶的表达。后转入16℃、100rpm培养16h，后10000rpm离心10min，收集菌体。用适量pH为7.0的PBS缓冲液悬浮菌体，在冰浴条件下利用超声细胞破碎仪破碎细胞，4℃，8000rpm/min条件下离心10min，上清液即为粗酶液。

实施例3：木聚糖酶xyl-1、xyl-2纯化

先用10倍柱体积Binding buffer平衡柱子，后进行粗酶液上样，流速为20倍柱体积/小时；用15倍柱体积(10mM咪唑)的洗脱液冲洗柱子，洗去杂蛋白；用5倍柱体积Elutionbuffer(200mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱液；后用15倍柱体积(500mM咪唑)洗脱液冲洗柱子；最后使用脱盐离心柱对纯化蛋白进行脱盐处理。

收集到的酶液利用SDS-PAGE检测，结果如图2所示。并以牛血清白蛋白(BSA)为标准进行蛋白浓度测定。

实施例4：木聚糖酶xyl-1、xyl-2比酶活测定

采用二硝基水杨酸(DNS)法测定其木聚糖酶酶活力。木聚糖酶活测定：取0.9mL木聚糖溶液(1％)于试管中，加入0.1mL酶液，37℃反应10min，然后加入1.5mL DNS溶液混合均匀于沸水浴条件下5min，冰水冷却10min后测定吸光值OD₅₄₀。

酶活性定义：在特定条件(37℃、pH 7.0)下，每分钟内转化生成1μmol还原糖所需酶量为一个酶活性单位U。酶比酶活定义：代表酶的纯度，用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示(U/mg)。

求得xyl-1酶活为2109.24u/ml、比酶活为1810.5u/mg；xyl-2酶活为41.68u/ml、比酶活为166u/mg。

实施例5：木聚糖酶xyl-1、xyl-2酶学性质分析

1)木聚糖酶xyl-1、xyl-2最适温度测定：

在pH＝7.0条件下，重组酶xyl-1、xyl-2分别在30℃-70℃(每5℃为一个梯度)反应10min，通过测定OD₅₄₀确定最适反应温度，以最高酶活为100％，计算在其他温度下的残余酶活。如图3所示，xyl-1最适温度为45℃、xyl-2最适温度为55℃。

2)木聚糖酶xyl-1、xyl-2最适pH测定：

重组酶xyl-1、xyl-2分别在45℃、55℃进行最适pH测定，pH范围为4-10，pH 4-7为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 7-9为Tris-HCl缓冲液，pH 9-10为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。以最高酶活为100％，计算在其他pH下的残余酶活。如图4所示，xyl-1最适pH为5、xyl-2最适pH为6。

3)木聚糖酶xyl-1、xyl-2pH稳定性测定：

将xyl-1、xyl-2酶液用不同pH缓冲液(4-10)稀释后置于常温反应24h，再分别在各自最适温度、最适pH条件下测定残余酶活性。如图5所示，xyl-1、xyl-2在pH 5-9处理24h后仍保留＞80％活性；xyl-2在pH 4-10处理24h后残余酶活均＞70％，说明这两个酶的pH耐受性较好，能够适应的酸碱范围较广。

4)木聚糖酶xyl-1、xyl-2温度稳定性测定：

将xyl-1、xyl-2酶液在30℃-60℃分别孵育10min-60min(每10min为一个梯度)再分别在各自最适温度、最适pH条件下测定残余酶活性。如图6所示，xyl-1温度耐受性较差，60℃孵育10min基本已经失活；xyl-2在30-50℃处理60min后残余酶活＞70％，说明其具有较好的热稳定性。

5)不同金属离子对xyl-1、xyl-2活性影响：

在酶液体系中加入不同浓度的金属离子(Fe²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Al³⁺)和使其反应终浓度为1mM和5mM，孵育半小时后再分别在各自最适温度、最适pH条件下测定残余酶活性。如下所示，Fe²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺对xyl-1、xyl-2酶活有一定抑制作用；Mn²⁺对二者酶活有促进作用，且随着离子浓度增加，酶活继续增强。说明该酶对金属离子适应性较强、无明显抑制作用的离子。

6)不同有机溶剂对xyl-1、xyl-2活性影响：

加入不同浓度的有机溶剂(EDTA、SDS、PEG、尿素、吐温80、DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇)使其终浓度为1％和3％，孵育半小时后再分别在各自最适温度、最适pH条件下测定残余酶活性。如下所示，SDS、乙醇、异丙醇对二者酶活有明显的抑制作用，残余酶活＜70％，其余溶剂在不同溶剂浓度下残余酶活均＞70％，说明该酶对大部分溶剂耐受性较好。

7)木聚糖酶xyl-1、xyl-2动力学参数测定：

xyl-1、xyl-2分别在最适温度、最适pH条件下反应5min，底物木聚糖浓度为1-40mg/ml。根据米氏方程利用Graph pad8.0进行绘图，如图7所示，求得xyl-1Km为6.95mg/ml，Kcat为55.8S^-1；xyl-2Km为3.44mg/ml，Kcat为5.18S^-1。

实施例6：木聚糖酶xyl-1、xyl-2对苎麻切片处理

用新鲜苎麻梗进行横向切片，再利用石蜡包埋技术制备。苎麻横向切片首先利用商业果胶酶孵育12h，目的是去除苎麻纤维表面果胶对木聚糖的覆盖，后用PBS缓冲液冲洗3次；再加入6mM纯化酶xyl-1、xyl-2在40℃分别处理8h，用PBS缓冲液冲洗3次；加入脱脂奶粉进行孵育，目的是降低杂质非特异性吸附。分别加入一抗(LM10特异性结合木聚糖)在黑暗条件下孵育1h，用PBS缓冲液冲洗三次；二抗同样在黑暗条件下孵育1h，利用PBS缓冲液冲洗三次；后切片用荧光增白剂在黑暗中孵育5分钟。最后利用共聚焦显微镜进行显色观察，通过软件(Olympus,FV31SSW)将其标记为黄色进行区分。如图8所示(左边为对照组、中间为xyl-1处理、右边为xyl-2处理)，二者均能去除苎麻木聚糖，且xyl-1相较于xyl-2效率较高，因而其在苎麻脱胶应用方面具有很大的应用前景。

本发明提供了一种来自土曲霉的木聚糖酶xyl-1、xyl-2，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，且本发明提供编码该酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，以及包含该基因的重组载体pET22b-xyl-1、pET22b-xyl-2和重组菌株E.coli BL21/xyl-1、E.coli BL21/xyl-2。本发明中该木聚糖酶xyl-1、xyl-2经过纯化后达到电泳纯级别，分子量分别约为22.83KDa、23.58KDa，最适pH分别为5和6，最适温度分别为45℃、55℃；在pH 5-9范围内于常温下处理24h后仍能维持70％以上相对残余酶活；对pH具有良好的耐受性；该酶对金属离子适应性较强、无明显抑制作用的离子。本发明的2个木聚糖酶稳定性较好，耐受性强，能够广泛应用于苎麻脱胶应用，同时在酿酒、造纸、纺织及饲料等工业领域具有很好的应用潜力。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> GH11家族木聚糖酶基因及其克隆表达及苎麻脱胶应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

atggtctctt tctcgtctct cgccgttgct ttctccatcg cctccggggc cctcgctgct 60

cctaatggca tgttggagct gttcaagcgc caacagatta ccagctccga gactggcacc 120

aacaacggat actactattc cttctggacc gacggcggcg gccaggtgac ctacaccaac 180

ggtgatgccg gtgcttacag tgtcgaatgg tccaacagtg gcaactttgt ggctggaaag 240

ggctggaacc ctggaagctc tcaaaccatc acctacagcg gcgagtggaa ccccaacgga 300

aacagctacc tgtcagtcta cggctggacc cagaacccgc tggtcgagta ttacattgtt 360

gaatcgttca gcacctacga tccttccacc ggcgcccagg agctcggcac cgtggagacc 420

gacgacggca cctacaagat ctacaagacc acccgcgaga atgcgccgtc tatcgaaggc 480

actgcgacct tcaaccagta ctggtcggtc cgcaccgacc accgcgtggg cggtaccgtc 540

accacgcaga accatttcga tgcttggaaa aatgctggcc tcgagatggg aaccgccaac 600

tacatgattg tcgcgaccga gggctaccag tcgagcggat cggcctccat cactgtgcag 660

taa 663

<210> 2

<211> 696

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 2

atggtctcct tccttcgtct tgccgttgcc tgcttcgctg ctgtcggagc tctggcagcc 60

cctgtcgagt ctcttgaaga gcgctccgac gagctgttca acagcaccct ccacgagttc 120

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tggtccaacg tcggcaactt tgtcggcgga aagggctgga acccgggttc tgccagaacc 300

atcaactacg gcggcagctt caaccccagc ggcaacgggt acctggctgt gtacggatgg 360

accaccaacc cgctcgtcga gtactacgtg gtggagtcct acggcaccta caaccccggc 420

agcggtggca cctacaaagg caccgtcaac agcgacggcg gcacctacaa catctacact 480

gccacgcgct acaatgcgcc ttcgatcatc ggcaccgcga ccttcacgca gtactggtcg 540

gtgcggacgt cgaagcggac cggcggtacc gtgacgatgg cgaatcactt caatgcgtgg 600

gccagccatg gaatgaacct gggaacccac aactaccaga ttgttgccac tgagggatac 660

cagagcagtg gatcttcgtc cattactgtg tactga 696

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 3

Met Val Ser Phe Ser Ser Leu Ala Val Ala Phe Ser Ile Ala Ser Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Asn Gly Met Leu Glu Leu Phe Lys Arg Gln Gln

20 25 30

Ile Thr Ser Ser Glu Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe

35 40 45

Trp Thr Asp Gly Gly Gly Gln Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Ala Gly

50 55 60

Ala Tyr Ser Val Glu Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys

65 70 75 80

Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ser Gln Thr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu Trp

85 90 95

Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Gln Asn

100 105 110

Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Phe Ser Thr Tyr Asp Pro

115 120 125

Ser Thr Gly Ala Gln Glu Leu Gly Thr Val Glu Thr Asp Asp Gly Thr

130 135 140

Tyr Lys Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Glu Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly

145 150 155 160

Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Asp His Arg Val

165 170 175

Gly Gly Thr Val Thr Thr Gln Asn His Phe Asp Ala Trp Lys Asn Ala

180 185 190

Gly Leu Glu Met Gly Thr Ala Asn Tyr Met Ile Val Ala Thr Glu Gly

195 200 205

Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Gln

210 215 220

<210> 4

<211> 231

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 4

Met Val Ser Phe Leu Arg Leu Ala Val Ala Cys Phe Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Glu Ser Leu Glu Glu Arg Ser Asp Glu Leu

20 25 30

Phe Asn Ser Thr Leu His Glu Phe Ala Glu Arg Ser Thr Pro Ser Ser

35 40 45

Thr Gly Trp Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly

50 55 60

Gly Ser Val Thr Tyr Thr Asn Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Ser Val Gln

65 70 75 80

Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly

85 90 95

Ser Ala Arg Thr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn

100 105 110

Gly Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr

115 120 125

Tyr Val Val Glu Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Tyr Lys Gly Thr Val Asn Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Ile Tyr Thr

145 150 155 160

Ala Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Thr

165 170 175

Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Gly Gly Thr Val Thr

180 185 190

Met Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Ser His Gly Met Asn Leu Gly

195 200 205

Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly

210 215 220

Ser Ser Ser Ile Thr Val Tyr

225 230

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccgg ctcctaatgg catgttggag 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttc tgcacagtga tggaggccg 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccag cccctgtcga gtctcttga 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagcttg tacacagtaa tggacgaaga 30

Claims

1.一种木聚糖酶在苎麻脱胶过程中的应用，其特征在于，木聚糖酶的氨基酸序列如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3的木聚糖酶用于苎麻中木聚糖的降解的温度为30℃-45℃，pH为5-9；氨基酸序列如SEQ ID NO.4的木聚糖酶用于苎麻中木聚糖的降解的温度为40℃-55℃，pH为4-10。

3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，作为底物的木聚糖浓度为1 mg/ml-40mg/ml。