CN107418909B - 一株海洋来源地衣芽孢杆菌用于食醋生物强化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株海洋来源地衣芽孢杆菌用于食醋生物强化的方法，属于食品酿造技术领域。本发明从海洋环境中筛选到了一株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CCTCC NO:M 2017209该菌可在65℃下生长，且具有高产淀粉酶能力。将该菌株制作成菌粉用于强化食醋醋酸发酵，该方法具有提高原料利用率，改善食醋的产品风味和提升食醋品质等优点。

Description

一株海洋来源地衣芽孢杆菌用于食醋生物强化的方法
技术领域
本发明涉及一株海洋来源地衣芽孢杆菌用于食醋生物强化的方法，属于食品酿造技术领域。
背景技术
传统酿造食醋主要以糯米、高粱或甘薯等淀粉含量较高的粮谷类为主要原料，以谷糠、麸皮为辅料，通过开放式多菌种混合发酵方式酿造而成。目前在食醋酿造中存在酿醋原料的原料利用率比较低，产生的风味物质有待提高的问题。
目前，工业生产中多采用醋渣二次发酵、粉碎原料增加淀粉利用率和液体回流发酵等方法来提高食醋酿造中原料的利用率及增强风味。有研究从山西老陈醋的大曲中筛选到了包括地衣芽孢杆菌在内的10株淀粉酶活力较高的芽孢杆菌，其酶活力最高为41.01U/mL粗酶液。目前虽然有酿醋曲中分离得到地衣芽孢杆菌的相关报道，但将地衣芽孢杆菌利用于食醋氨基酸和风味强化方面的研究尚无。
因此，利用现代生物技术，筛选优良性能的微生物对于生产出高质量、高产量、风味独特的优质食醋具有重要意义，对我国酿造食醋产业化道路具有重要推动作用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有食醋固态酿造技术的不足，提供一种性能优良的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CCTCC NO:M 2017209用于固态酿造食醋的发酵过程中进行生物强化，以改善食醋的产品风味，提升食醋品质，提高原料利用率，更好的发挥海洋来源微生物在食醋酿造中的应用。
本发明的第一个目的是提供一株地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017209。
本发明的地衣芽孢杆菌，具有如下优良性能：
(1)应用于食醋发酵体系，不会影响到食醋的正常发酵；
(2)用于强化食醋发酵，不仅可以提高原料利用率而且可以提升食醋风味和品质；采用地衣芽孢杆菌强化后，醋醅中的淀粉利用率提高了19.1％，出醋率(总酸含量)提升了10％，部分风味物质也有显著提升。
(3)是从海洋沉积物中分离，能适应65℃高温环境生长，并且具有产淀粉酶的能力。
本发明的第二个目的是提供所述含有所述地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209菌株的微生物菌剂。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂含有地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209菌体的活细胞、冷冻干燥得到的地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209干菌体、固定化的地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209细胞、地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209的液体菌剂、地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的地衣芽孢杆菌CCTCCNO:M 2017209菌株。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂为地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209的冻干粉。
在一种实施方式中，所述冻干粉的制备：先采用活化培养基进行多级活化培养得到种子液，然后离心、洗涤多次得到菌泥；然后使用冻干保护剂溶解菌泥，预冻，再采用冻干机中进行冻干，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干后取出。
在一种实施方式中，所述保护剂使用量为种子液的10％。
本发明的第三个目的是提供所述地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209菌株或者微生物菌剂的应用。
在一种实施方式中，所述应用是指用于酿造技术领域。
在一种实施方式中，所述酿造是食醋酿造。
在一种实施方式中，所述应用是用于提升食醋风味或原料利用率。
本发明的第四个目的是提供一种食醋生物强化的方法，所述生物强化方法是采用地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209直接与酿醋原料混合后进行发酵。
在一种实施方式中，所述生物强化方法是采用地衣芽孢杆菌的菌粉直接与酿醋原料混合后进行发酵。
在一种实施方式中，所述生物强化方法，是在发酵起始将地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209菌粉按照0.5-1％的接种量在发酵池中与酒醪、麸皮等原料混匀后进行发酵，发酵采用传统的逐层醅扩大培养的工艺。
本发明的有益效果：
(1)本发明从海洋环境中筛选高产淀粉酶的高温菌，然后基于微生物强化技术，对食醋醋酸发酵过程中添加高产淀粉酶菌粉，达到提高原料利用率，改善食醋的产品风味，提升食醋品质，提高生产效率的目的。
(2)采用地衣芽孢杆菌强化后，醋醅中的淀粉利用率提高了19.1％，出醋率(总酸含量)提升了10％，部分风味物质也有显著提升。
生物材料保藏
一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，分类学命名为芽孢杆菌AMY1Bacillus sp.AMY1，所述地衣芽孢杆菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017209。
附图说明
图1：添加B.licheniformis的实验组与对照组中总酸含量变化情况；
图2：添加B.licheniformis的实验组与对照组中淀粉含量变化情况；
图3：添加B.licheniformis的实验组与对照组中还原糖含量变化情况；
图4：添加B.licheniformis的实验组与对照组中挥发性物质总含量变化情况。
具体实施方案
食醋理化指标的检测：总酸按照GB/T 5009.41(2003)NaOH中和法进行检测；淀粉、还原糖测定按照GB/T 5009.7(2008)中采用直接滴定法进行测定；有机酸采用HPLC进行检测；风味物质种类采用气质联用仪器进行检测。
实施例1：海洋沉积物中高产淀粉酶菌株的筛选
(1)海洋沉积物样品预处理
将2g海洋沉积物置于18mL含5％脱脂牛奶、10mM天冬酰胺、10mM葡萄糖10mM果糖、10mM KCl的海水中，将锥形瓶置于85℃热激10分钟后，置于摇床上55℃、200rpm富集培养7天。
(2)菌株分离纯化
预处理结束后，用移液管吸取0.2ml上清液涂布于PYA，AMGM，Casein，BPGS培养基上别置于55℃培养。通过形态观察挑选不同的菌落进行四区划线纯化，纯化的菌株在PYA培养基上培养1-3天，进行甘油管(-80℃)、冻干管(4℃)同步保藏。
分离培养基(PYA)：蛋白胨0.8％，酵母膏0.3％，K2HPO40.1％，EDTA3.5mg，ZnSO4·7H2O 3mg，FeSO4·7H2O 10mg，MgSO4·7H2O 2mg，CuSO4·5H2O 1mg，CoNO3·6H2O 2mg，H3BO31mg，琼脂1.2％，溶于pH值为10的碳酸盐缓冲液中，115℃灭菌20min。
分离培养基(AMGM)：海藻酸钠0.05％，甘露醇0.05％，葡萄糖0.05％，乳糖0.05％，麦芽糖0.05％，可溶性淀粉1％，脱脂奶粉2％，琼脂1.2％，pH 7.2-7.4，115℃灭菌20min。
分离培养基(Casein)：蛋白胨1％，酪素0.5％，葡萄糖0.1％，L-酪氨酸0.01％，NaCl 0.5％，CaCl2 0.01％，琼脂1.2％，pH 7.2-7.4，115℃灭菌20min。
分离培养基(BPGS)：牛肉膏0.1％，蛋白胨0.1％，葡萄糖0.05％，丙酸钠0.1％，Na2S2O3·5H2O 0.248％，谷氨酸，脯氨酸，精氨酸天门冬氨酸，甘氨酸各0.05％，琼脂1.2％，pH 7.5，115℃灭菌20min。
(3)菌株复筛
将生长良好的待测菌株用点接法接种到筛选培养基上，55℃培养48h后，在平板上倒入5mL碘液，淀粉酶阳性菌株产生的淀粉酶能将淀粉水解成寡糖，遇碘不产生蓝色，从而形成透明圈，倾出碘，测量透明圈直径(Rt)和菌落直径(Rs)，计算圈径比K，K＝Rt/Rs。选择圈径比较大的菌落进行划线纯化2-3次，镜检确定纯培养后接种至斜面4℃保存，菌悬液与10％甘油中-20℃保存。
筛选培养基：可溶性淀粉10g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，碳酸镁1g/L，氯化钠0.5g/L，硝酸钾1g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2-7.4)。
根据筛选培养基中透明圈大小，得到1株高产淀粉酶菌株，经测定发现该菌株淀粉酶活性可达到100U/mL发酵液，初步确定该菌株为兼性嗜热菌，属于芽孢杆菌属，地衣芽孢杆菌种(其16s DNA序列如SEQ ID NO:1所示)，并保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209。
实施例2：高产淀粉酶菌株B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209冻干粉的制备
(1)高产淀粉酶菌株B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209的活化培养
将菌株B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209的菌粉接入150mL液体活化培养基中，50℃摇床培养40-48h，得到一级种子液；将一级种子按照6％(v/v)接种量接入400mL液体培养基中，50℃摇床培养40-48h，得到二级种子液；
二级种子液按照8％(v/v)接种量接入6000mL液体培养基中，50℃摇床培养46-48h，得到三级种子液。
活化培养基(Marine agar 2216E)：酵母粉0.1％，胰蛋白胨0.5％，柠檬酸铁0.1g/L，海水1L，pH 7.2-7.4。
(2)菌体收集
将三级发酵液倒入500mL离心杯(用75％酒精擦拭晾干后使用)中，4500r/min离心15min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤两次菌泥，以同样的条件离心，弃去上清液，沉淀即为菌株B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209的菌泥。
(3)菌泥冻干
用冻干保护剂溶解菌泥，保护剂使用量为三级种子液的10％，充分震荡，然后倒入无菌培养皿中，液体高度为1cm左右，用保鲜膜密封后放入-80℃冰箱中预冻3h。将预冻好的浓缩液迅速转移到冻干机中进行冻干，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干48h后取出敲碎封装并放入-20℃保存待用。
实施例3：食醋发酵过程的生物强化
(1)原料
本实施例所选取的发酵食醋原料配比为：
酒醪：130kg/缸(酒度：9.6，总酸：4.4g/L)；麸皮：50kg/缸；大糠：24kg/缸；水：15kg/缸；NaCl：3kg/缸。
(2)传统食醋酿造过程
[1]向缸中加入130kg酒醪和50kg麸皮，搅拌混匀。
[2]向缸中加入8kg种醅。
[3]提热阶段：在醅上适当漂水，加糠，并进行翻醅，但并不往下切麸，等待品温上升至40℃以上。
[4]过杓阶段：提热结束后，根据品温，每天向下切麸、漂水、加糠、翻醅。过杓开始一两天后，开始分缸。在这一阶段，将水和糠全部添加完毕。
[5]露底阶段：过杓结束后，开始露底，即每天将已翻至底部的醋醅进行全部翻醅。同时每天测定下层卤汁中的卤酸，根据测定值，确定封醅日期。
[6]封醅阶段：露底结束后，将醋醅压实，上盖塑料膜，扎紧塑料膜边缘，然后在边缘处均匀撒上一层食盐。封醅持续时间为7天。
(3)强化策略
对照组：按照本实施例(2)进行发酵；
高产淀粉酶B.licheniformis菌粉强化组(即实验组)是将本实施例中(2)[1]调整为：[1]：加入130kg酒醪和50kg麸皮于大缸中，搅拌混匀；将B.licheniformis菌粉按1％的比例添加到原料中混合均匀；
实施例4：高产淀粉酶B.licheniformis CCTCC NO:M 2017209强化效果分析
(1)总酸含量分析
实验组醋酸发酵的总酸含量在7天之后显著高于对照组中的总酸含量，发酵结束(第18天)时添加B.licheniformis的实验组的总酸含量为6.80g/100g干醅，相比于对照组(6.15g/100g干醅)总酸提升了10％(图1)。
(2)淀粉含量分析
醋醅中的淀粉含量变化不大，整体有略微的下降趋势。从发酵起始10g/100g干醅变为发酵结束时的8g/100g干醅。添加B.Licheniformis CCTCC NO:M 2017209的实验组醋酸发酵过程中，淀粉含量明显低于对照组，发酵结束后，实验组的淀粉含量为6.71g/100g干醅，相当于对照组(8.29g/100g干醅)，淀粉利用率提高了19.1％(图2)。
(3)还原糖含量分析
对照组的还原糖含量在发酵前期(第0-4天)，明显的下降，但后期却又回升。添加了B.licheniformis的实验组醋酸发酵过程中，还原糖一直呈现呈先下降趋势；发酵结束时实验组的还原糖含量为0.98g/100g干醅，相当于对照组(2.21g/100g干醅)，还原糖的利用率提高了55.7％(图3)。
(4)有机酸含量分析
采用HPLC对醋酸发酵过程中的醋醅中9种有机酸含量进行分析，结果如表1所示。发酵结束后，实验组的有机酸总含量为8638.18mg/100g干醅，相比于对照组中有机酸总含量(7818.27mg/100g干醅)提升了9.5％。其中乳酸和乙酸的含量增加的比例比较大，发酵结束时二者在实验组中的含量分别为2543.41mg/100g干醅和5417.02mg/100g干醅，相比于对照实验组提高了14.8％和14.5％(表1和表2)。
(4)挥发性风味物质含量分析
通过GC-MS方法分析醋酸发酵过程中醋醅的挥发性风味成分，如图4所示。在添加B.licheniformis实验组和对照组中均检测到60种挥发性风味物质，包括醇类、羧酸类、酯类、醛类、酮类、杂环类以及其他。其中酯类物质最多，检测到25种，其次为醇类和羧酸类，均有9种物质；再次为醛类包括7种物质，酮类包括4种物质，杂环类以及其他均有3种物质。除了乙醇和乙酸外，其他58种挥发性物质的总含量相对较低，添加B.licheniformis实验组中挥发性物质的总含量为2541.90μg/100g干醅，相比于对照组(2413.18μg/100g干醅)提升了5.06％。在每类风味物质中，羧酸类物质在实验组中的含量提高幅度相对较大，发酵结束时羧酸类的总含量为270.52μg/100g干醅，相比于对照组(240.48μg/100g干醅)提升了11.1％(图4)。
表1对照组醋酸发酵过程中有机酸的变化情况
表2添加B.licheniformis实验组醋酸发酵过程中有机酸的变化情况
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株海洋来源地衣芽孢杆菌用于食醋生物强化的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1498
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct 60
tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact 120
gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa 180
cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt 240
gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360
gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc 420
tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660
attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720
tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 840
gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg 1020
ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa 1260
gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1320
tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380
acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag 1440
gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag agctttgg 1498

Claims (9)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017209。
2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209的液态菌剂或固体菌剂。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209的冻干粉。
5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在酿造技术领域的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酿造是食醋酿造。
7.一种食醋生物强化的方法，其特征在于，所述生物强化方法是采用地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209直接与酿醋原料混合后进行发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物强化方法是采用地衣芽孢杆菌的菌粉直接与酿醋原料混合后进行发酵。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物强化方法，是在发酵起始将地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209菌粉按照0.8-1.2％的接种量在发酵池中与酒醪、麸皮原料混匀后进行发酵，发酵采用传统的逐层醅扩大培养的工艺。
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