CN110438015A - 产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法 - Google Patents

产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产橙皮苷酶的枳实内生真菌，该菌株为溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002，已于2019年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18105。上述方案中，利用微生物产生的酶作催化剂催化橙皮苷转化生成橙皮素，反应效率高、专一性强、副产物少、步骤简单、绿色环保无污染。

Description

产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法
技术领域
本发明涉及菌株领域，具体涉及一株产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法。
背景技术
橙皮素具有抗炎，抗菌，抗氧化，抗过敏，抗病毒，抗细菌，抗原生动物，抗真菌和抗致癌作用可预防骨质流失的作用。橙皮素是橙皮苷脱掉了一分子鼠李糖和葡萄糖的水解产物，其药效基本与橙皮苷相似，但其溶解性较好，通过橙皮苷酶酶解橙皮苷而得到的橙皮素的抗癌活性在动物实验中得到验证。目前，橙皮素主要应用于食品和医药，化妆品。近年来，随着橙皮素研究的不断深入，发现橙皮素对信血管疾病化有着较好的预防和治疗的作用，国外利用化学法生产橙皮素的工艺已经很成熟，目前国内橙皮素主要是作为一种药物原料在使用，相关的药物物具有保健等疗效，但生产技术不是很成熟，因此，橙皮素的生产有较大的空间。
橙皮苷酶是一种由鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶组成的复合酶，主要来自青霉和黑曲霉。橙皮苷经过该酶的作用后可以转化为橙皮素单葡萄糖苷和橙皮素。在橙皮苷的生物转化过程中，橙皮苷酶起到很重要的作用，所以生产高活力的橙皮苷酶成为制备橙皮苷水解产物的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其制备方法和应用。
为实现上述目的，发明人从新鲜枳实果实中采用内生真菌分离纯化技术分离得到一株产橙皮苷酶的枳实内生真菌，通过SDS法提取本发明菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段并测序，序列经Genbank中Blast同源性比对，结果表明本菌株与溜曲霉（Aspergillus tamarii）同源性最高，相似性为99%，可以判定本菌株为溜曲霉（Aspergillus tamarii），命名为溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002，已于2019年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18105，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述的枳实内生真菌发酵产橙皮苷酶的方法，包括如下步骤：
S1、将所述的溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002接种到PDA斜面培养基中活化96~120 小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至液体发酵培养基中，25~35℃，100~200 r/min培养48~96 小时，然后在10000 r/min，4℃条件下冷冻离心10 min，收集上清液即为橙皮苷酶的初酶液;其中液体发酵培养基的组成为：每升培养基中含马铃薯150~250 g，蔗糖10~20g，胰蛋白胨5~15 g，磷酸氢二钾2~4 g，橙皮苷2~6 g，其余为水，调节pH 为5.0~7.0；
S2、取步骤S1中的初酶液，按照5%用量加入含0.1 mg/mL橙皮苷的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液（0.02 mol/L，pH为5.0），然后在35℃、转速180 r/min条件下培养1小时，即得含有橙皮苷酶的培养液。
优选地，所述步骤S1中，发酵培养基组成为：每升培养基中含马铃薯200 g，蔗糖15g，胰蛋白胨10 g，磷酸氢二钾3 g，橙皮苷5 g，其余为水，调节pH为6。
优选地，所述步骤S1中，培养条件为：温度34℃，摇床转速150 r/min，培养96小时。
上述方案中，利用微生物产生的酶作催化剂催化橙皮苷转化生成橙皮素，反应效率高、专一性强、副产物少、步骤简单、绿色环保无污染。
附图说明
图1 为橙皮苷的分子结构。
图2为初始pH对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响。
图3为发酵温度对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响。
图4为摇床转速对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响。
图5为诱导剂浓度（橙皮苷浓度）对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
枳实内生真菌的分离筛选
选取适量大小相等且无病害的新鲜枳实，有蒸馏水清洗干净;将所得枳实在无菌条件下用75％的酒精浸泡120 秒，无菌水冲洗3次; 然后用10％的次氯酸钠浸泡60秒，再用无菌水冲洗6次。无菌条件下用最后一遍冲洗的无菌水涂布于PDA平板培养基，培养后无微生物长出，表明表面消毒彻底。然后将消毒后的的枳实用粉碎机将枳实进行粉碎，将枳实的粉末置于培养皿中，加无菌水使其润湿，然后置于培养箱中，通过自然固态发酵，使其霉变。然后取适量自然霉变的枳实粉末，用无菌水制成菌悬液，用无菌水进行梯度稀释，用涂布平板法接种于PDA平板，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于含橙皮苷浓度5g/L为的查氏固体培养基在30℃分离培养4d，挑取长势较好的菌落，经反复划线获得枳实内生真菌，采用划线法进行多次的分离纯化，获得可以转化橙皮苷的枳实内生菌纯培养物。
通过SDS法提取所得枳实内生菌纯培养物中菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段并测序，序列经Genbank中Blast同源性比对，结果表明本菌株与溜曲霉（Aspergillus tamarii）同源性最高，相似性为99%，可以判定本菌株为溜曲霉（Aspergillus tamarii）。
实施例2
枳实内生真菌发酵产橙皮苷酶发酵条件的优化
初始pH对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响
将试管斜面保存的菌株活化后，接种到PDA培养基中，于30℃恒温培养箱中培养120 h后，待孢子形成后，用无菌水制成106 cfu/mL的孢子悬液。
将孢子悬液按5%接种量分别接种于橙皮苷浓度为5g/L的液体发酵培养基(100mL/250mL三角瓶) 中，用氢氧化钠和盐酸调节pH，置于34℃的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养96h。通过冷冻离心机离心获得发酵液（粗酶液）。将粗酶液接种于含橙皮苷的液体转化培养基于35℃ ,180r/min培养箱中振荡培养1h。然后向转化液中加入20 mL无水甲醇混合稀释，然后用0.22μm 的微孔滤膜过滤后进行HPLC色谱分析。结果如附图2所示。
发酵温度对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响
将试管斜面保存的菌株活化后，接种到PDA培养基中，于30℃恒温培养箱中培养120 h后，待孢子形成后，用无菌水制成106 cfu/mL的孢子悬液。
将孢子悬液按5%接种量分别接种于橙皮苷浓度为5g/L的液体发酵培养基(100mL/250mL三角瓶)中，pH为4.5，置于不同温度的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养96 h。通过冷冻离心机离心获得发酵液（粗酶液）。将粗酶液接种于含橙皮苷的液体转化培养基于35℃,180r/min培养箱中振荡培养1h。然后向转化液中加入20ml无水甲醇混合稀释，然后用0.22μm 的微孔滤膜过滤后进行HPLC色谱分析。结果如附图3所示。
摇床转速对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响
将试管斜面保存的菌株活化后，接种到PDA培养基中，于30℃恒温培养箱中培养120 h后，待孢子形成后，用无菌水制成106 cfu/mL的孢子悬液。
将孢子悬液按5%接种量分别接种于橙皮苷浓度为5g/L的液体发酵培养基中(100mL/250mL三角瓶)，pH为4.5，置于34℃的恒温水平摇床上不同转速条件下振荡培养96h。通过冷冻离心机离心获得发酵液（粗酶液）。将粗酶液接种于含橙皮苷的液体转化培养基于35℃ ,180 r/min培养箱中振荡培养1h。然后向转化液中加入20ml无水甲醇混合稀释，然后用0.22 μm 的微孔滤膜过滤后进行HPLC色谱分析。结果如附图4所示。
诱导剂（橙皮苷）浓度对ZS002菌株发酵产橙皮苷酶的影响
将试管斜面保存的菌株活化后，接种到PDA培养基中，于30℃恒温培养箱中培养120 h后，待孢子形成后，用无菌水制成106 cfu/mL的孢子悬液。
将孢子悬液按5%接种量分别接种于橙皮苷浓度为0g/L，1g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L，9 g/L，的液体发酵培养基(100 mL/250 mL三角瓶)中，pH为4.5，置于34℃的恒温水平摇床上150 r/min振荡培养96h。通过冷冻离心机离心，获得发酵液（粗酶液）。将粗酶液接种于含橙皮苷的液体转化培养基于35℃ ,180 r/min培养箱中振荡培养1 h。然后向转化液中加入20 mL无水甲醇混合稀释，然后用0.22 μm 的微孔滤膜过滤后进行HPLC色谱分析。结果如附图5所示。
综上所述，所述的枳实内生真菌发酵产橙皮苷酶的发酵条件为：
液体发酵培养基的组成为：每升培养基中含马铃薯150~250 g，蔗糖10~20 g，胰蛋白胨5~15 g，磷酸氢二钾2~4 g，橙皮苷2~6 g，其余为水，调节pH 为5.0~7.0；
培养条件： 25~35℃，100~200 r/min培养48~96 小时，然后在10000 r/min，4℃条件下冷冻离心10 min，收集上清液即为橙皮苷酶的初酶液;其中
诱导条件：按照5%用量加入含0.1 mg/mL橙皮苷的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液（0.02 mol/L，pH为5.0），然后在35℃、转速180 r/min条件下培养1小时，即得含有橙皮苷酶的培养液。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 桂林理工大学
<120> 产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 679
<212> DNA
<213> 溜曲霉(Aspergillus tamarii)
<400> 1
ggggtttcgg gagtgtaggt tctagcgagc ccaacctccc acccgtgttt actgtaacct 60
tagttgcttc ggcgggcccg cctttaaggc cgccgggggg catcagcccc cgggcccgcg 120
cccgccggag acaccacgaa ctctgtctga tctagtgaag tctgagttga ttgtatcgca 180
atcagttaaa actttcaaca atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga 240
aatgcgataa ctagtgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat 300
tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcattgctgc ccatcaagca 360
cggcttgtgt gttgggtcgt cgtcccctct tcggggggga cgggccccaa aggcagcggc 420
ggcaccgcgt ccgatcctcg agcgtatggg gctttgtcac ccgctctgta ggcccggccg 480
gcgcttgccg aacgcaaaac aaccattctt tccaggttga cctcggatca ggtagggata 540
cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaagatca ttcccgacgc aagggtccta 600
ggggtcaacc accccccgtg tttaccgcaa cattatctga tttggccgcc ctcctttaag 660
tcgccggggt tatcacccc 679

Claims (5)

1.一株产橙皮苷酶的枳实内生真菌，其特征在于：该菌株为溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002，已于2019年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18105。
2.如权利要求1所述的枳实内生真菌，其特征在于：所述溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.如权利要求1所述的枳实内生真菌发酵产橙皮苷酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、将所述的溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002接种到PDA斜面培养基中活化96~120 小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至液体发酵培养基中，25~35℃，100~200 r/min培养48~96 小时，然后在10000 r/min，4℃条件下冷冻离心10 min，收集上清液即为橙皮苷酶的初酶液;其中液体发酵培养基的组成为：每升培养基中含马铃薯150~250 g，蔗糖10~20g，胰蛋白胨5~15 g，磷酸氢二钾2~4 g，橙皮苷2~6 g，其余为水，调节pH 为5.0~7.0；
S2、取步骤S1中的初酶液，按照5%用量加入pH为5.0的含0.1 mg/mL橙皮苷的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液，然后在35℃、转速180 r/min条件下培养1小时，即得含有橙皮苷酶的培养液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，培养条件为：温度34℃，摇床转速150 r/min，pH 4.5。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：该枳实内生真菌所产的橙皮苷酶具有催化橙皮苷转化生成橙皮素的功能。
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Application publication date: 20191112

Assignee: Guangxi Guilin Pengyu Brothers Citrus Industry Development Co.,Ltd.

Assignor: GUILIN University OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2022450000229

Denomination of invention: The Endophytic Fungus Producing Hesperidinase from Aurantium aurantium and Its Fermentation Method for Hesperidinase Production

Granted publication date: 20220916

License type: Common License

Record date: 20221206