CN107699556A - 利用枯草芽孢杆菌制备d‑阿洛酮糖差向异构酶的方法 - Google Patents

利用枯草芽孢杆菌制备d‑阿洛酮糖差向异构酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用枯草芽孢杆菌制备D‑阿洛酮糖差向异构酶的方法。枯草芽孢杆菌制备D‑阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下：玉米浆粉，葡萄糖，萘乙酸，七水硫酸镁，磷酸氢二铵，硫酸锰，硫酸铜，氯化铁，余量水。本发明首次在培养枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加了萘乙酸，萘乙酸有加速核糖核酸代谢的作用，应用于枯草芽孢杆菌培养时，萘乙酸参与到核糖核酸代谢中来，提高了RNA合成的效率和RNA转录酶蛋白质的效率，从而提高了枯草芽孢杆菌表达D‑阿洛酮糖差向异构酶的水平。

Description

利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法
技术领域
本发明涉及利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属。革兰氏阳性菌，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色，需氧菌。
D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D- 阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，早期的D-阿洛酮糖合成方法是通过多级化学转化普通单糖或非糖的前体物质，但多次的保护和脱保护操作会导致收率偏低，且合成过程繁杂，存在很大的局限性。目前，虽已有以D-果糖为原料，可通过生物转化法制备D-阿洛酮糖的报道，但是目前已报道的微生物，产生的D-阿洛酮糖差向异构酶转化能力仍较差，且分离纯化过程较难。
中国专利文献CN106434494A(申请号201611095535.7)公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY 005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13152。本发明还涉及该枯草芽孢杆菌的培养方法与应用。本发明首次获得的高产D-阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌BLCY-005，其发酵液中的D-阿洛酮糖差向异构酶酶活可达到143U/ml，较传统D-阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.5～6.5，与传统菌株产D-阿洛酮糖差向异构酶最适pH偏中性相比，有利于生产中对污染的控制。
萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，简称NAA，是一种有机化合物，是一种易溶于有机溶剂的无色固体。它的结构为萘的1号位置以羧甲基取代。它是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。但目前未有用于微生物培养的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，可显著降低生产成本。
本发明的技术方案如下：
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。
利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，进行种子培养，制得种子液；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比1～2％的接种量接种于上述发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、洗涤菌体，再经干燥、粉碎，制得D- 阿洛酮糖差向异构酶干粉。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13152。
该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的原始菌株分离于山东德州百龙创园研发中试车间附近的土壤，并经过诱变后，获得。该菌株在LB培养基上形成的菌落呈污白色，半透明，菌落边缘不规整，呈波浪状，中心高凸。经显微镜观察，该菌株长约1.0～1.5微米，宽约0.6～0.9微米，无荚膜，不产鞭毛，芽孢位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后具体不膨大。该菌株可高产D-阿洛酮糖差向异构酶，产生的D-阿洛酮差向异构酶为胞内酶，可用于生产 D-阿洛酮糖。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨0.8～1.2％，玉米浆粉：0.4～0.6％，甘油：0.8～1.2％，余量水，pH6.8～7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养条件为：温度35～37℃、220rpm震荡培养8h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，洗涤为采用纯净水进行洗涤。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，干燥条件为：温度-40～-45℃、压力-80～-100kpa。
上述方法制备的D-阿洛酮糖差向异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。
上述应用，步骤如下：
(i)配制质量百分比为25～35％的果糖溶液；
(ii)向步骤(i)中配制的果糖溶液中添加上述D-阿洛酮糖差向异构酶干粉，添加量为每公斤果糖原料添加0.5～1.0gD-阿洛酮糖差向异构酶干粉，在60℃反应8～12小时，制得阿洛酮糖粗液；
(iii)将步骤(ii)制得的阿洛酮糖粗液经脱色、离交、浓缩、色谱分离、浓缩后，制得阿洛酮糖。
上述脱色、离交、浓缩、色谱分离、浓缩均可采用本领域常规技术。
有益效果
1、本发明首次在培养枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加了萘乙酸，萘乙酸有加速核糖核酸代谢的作用，应用于枯草芽孢杆菌培养时，萘乙酸参与到核糖核酸代谢中来，提高了RNA 合成的效率和RNA转录酶蛋白质的效率，从而提高了枯草芽孢杆菌表达D-阿洛酮糖差向异构酶的水平；
2、本发明通过利用添加了萘乙酸的发酵培养基，并适应性的优化了其他培养条件，大幅提高了酶的表达量，同时通过结果检测发现，单位酶活也由30％提高至30.5％以上，对于降低D-阿洛酮糖的生产成本具有显著的影响；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13152。
D-阿洛酮糖酶活检测方法：
取400ul的100g/L D-果糖作为底物，加入100ul发酵液，恒温水浴55℃下反应5min，于沸水中煮沸10min终止反应。用10000r/min的转速进行离心，离心后取上清液稀释2倍后，用高效液相色谱仪检测D-阿洛酮糖含量，以每毫升发酵液每分钟内产生1μmol的D-阿洛酮糖定义为一个酶活单位。
实施例1
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0。
实施例2
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉3％，葡萄糖1.5％，萘乙酸0.08％，七水硫酸镁0.025％，磷酸氢二铵0.01％，硫酸锰0.02％，硫酸铜0.015％，氯化铁0.12％，余量水，pH6.8。
实施例3
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉8％，葡萄糖0.8％，萘乙酸0.12％，七水硫酸镁0.015％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸锰0.015％，硫酸铜0.018％，氯化铁0.08％，余量水，pH7.2。
对比例1
发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，乙烯利0.1％、七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0。
对比例2
发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH6.5。
对比例3
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.05％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0。
对比例4
枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.15％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0。
实施例4
利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度35℃、 220rpm的条件下进行种子培养8h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1.0％，玉米浆粉：0.5％，甘油：1.0％，余量水，pH7.0。
(2)取步骤(1)制得的种子液，分别按照体积百分比2％的接种量接种于实施例1～3 及对比例1～4所述的发酵培养基中，在温度35℃、pH7.0，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速300rpm，溶氧35％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、纯净水洗涤菌体，在温度-40～-45℃、压力-80～-100kpa的条件下干燥，粉碎，制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。
对获得的D-阿洛酮糖差向异构酶干粉的转化率进行检测，结果如表1所示。转化率测定方法如下：用pH8.0，50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制，30％(w/w)的D-果糖溶液作底物，加入适量的酶制剂，55℃水浴振荡反应3h后，立即于100℃沸水浴中15min，用高效液相色谱法测定D-阿洛酮糖含量。
转化率定义：D-阿洛酮糖质量/底物(D-果糖)质量。
酶活检测方法：取400μl的100g/L D-果糖作为底物，加入100μl发酵液，恒温水浴55℃下反应5min，于沸水中煮沸10min终止反应。用10000r/min的转速进行离心，离心后取上清液稀释2倍后，用高效液相色谱仪检测D-阿洛酮糖含量，以每毫升发酵液每分钟内产生1μmol的D-阿洛酮糖定义为一个酶活单位。
表1
OD600 湿重g/100ml 干重g/100ml 酶活 转化率％
实施例1 141 4.0982 1.1943 3040 30.67
实施例2 135 4.0755 1.1521 2870 30.21
实施例3 136 4.0896 1.1635 2886 30.33
对比例1 105 3.4532 0.9247 2250 26.87
对比例2 102 3.4478 0.9125 2235 26.35
对比例3 115 3.5823 1.0687 2530 28.22
对比例4 116.7 3.5941 1.0724 2540 28.31
对比例5
利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度32℃、 160rpm的条件下进行种子培养6h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比2％的接种量接种于实施例1的发酵培养基中，在温度32℃、pH6.5，罐压0.04Mpa，通风比1.0vvm，转速150rpm，溶氧25％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、纯净水洗涤菌体，在温度-40～-45℃、压力-80～-100kpa的条件下干燥，粉碎，制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。
发酵结束后检测各项指标，OD600＝121，湿重3.6523g/100ml，干重1.1187g/100ml。转化率为29.12％。
对比例6
利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度38℃、 160rpm的条件下进行种子培养6h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比1％的接种量接种于实施例1的发酵培养基中，在温度38℃、pH6.3，罐压0.03Mpa，通风比1.0vvm，转速150rpm，溶氧25％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、纯净水洗涤菌体，在温度-40～-45℃、压力-80～-100kpa的条件下干燥，粉碎，制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。
发酵结束后检测各项指标，OD600＝122.7，湿重3.6641g/100ml，干重1.1294g/100ml。转化率为29.25％。
结果分析
通过上述实施例和对比例的数据可以看出，影响枯草芽孢杆菌生长和酶活的主要影响因素为发酵培养基中是否增加萘乙酸，而在都增加萘乙酸的前提下，其他优化条件对菌体生长和产物转化率也具有影响作用。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，其特征在于，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。
3.利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，进行种子培养，制得种子液；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比1～2％的接种量接种于权利要求1所述的发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、洗涤菌体，再经干燥、粉碎，制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13152。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨0.8～1.2％，玉米浆粉：0.4～0.6％，甘油：0.8～1.2％，余量水，pH6.8～7.0。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养条件为：温度35～37℃、220rpm震荡培养8h。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，洗涤为采用纯净水进行洗涤。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，干燥条件为：温度-40～-45℃、压力-80～-100kpa。
9.权利要求3所述方法制备的D-阿洛酮糖差向异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(i)配制质量百分比为25～35％的果糖溶液；
(ii)向步骤(i)中配制的果糖溶液中添加上述D-阿洛酮糖差向异构酶干粉，添加量为每公斤果糖原料添加0.5～1.0gD-阿洛酮糖差向异构酶干粉，在60℃反应8～12小时，制得阿洛酮糖粗液；
(iii)将步骤(ii)制得的阿洛酮糖粗液经脱色、离交、浓缩、色谱分离、浓缩后，制得阿洛酮糖。
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