CN105802897A - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶生产菌株及其应用，属于生物工程和酶工程技术领域。本发明的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶生产菌为一株Clostridium sp，是从森林附近土壤中经菌株富集、平板菌落特征初筛，采用摇瓶复筛，测定酶活力，经酶活测定，比较D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶活性大小而得到。该菌生产的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶可以D‑果糖为底物催化生产D‑阿洛酮糖，温度范围广、没有副产物生成、反应方法简便、低能耗、物料成本低等优点，加入Co2+后60℃半衰期长达9h，有较强的耐热优势，而且在高温60℃条件下以果葡糖浆为底物进行反应转化率最高可达33.8％。该菌可用于化妆品、食品、药品等领域。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用，属于生物工程和酶工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-psicose)是自然界一种较为稀有的天然己酮糖，在甜菜糖蜜、甘蔗、小麦和鼠刺植物中首先发现。D-阿洛酮糖作为稀有糖的一种以及稀有糖生产的重要原料在自然界中含量很少，获取困难，制约了其在实际生产中的应用，由此如何大量制备成为研究热点。不同种类的稀有糖具有各自独特的生理功能，在医药、食品、化妆品等领域具有较为广泛的应用前景。
D-阿洛酮糖又名D-核糖-2-己酮糖，是果糖C-3位上的差向异构体，分子式为C6H12O6，分子量为180.156，白色晶体，无臭不易吸潮。D-阿洛酮糖的熔点为96℃，极易溶于水，糖度是蔗糖的70％，热量是蔗糖的0.3％，被称为无热量的糖。美国食品及药品管理员(FDA)于2011年对D-阿洛酮糖的安全性确认后正式批准其为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，这也说明D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。
D-阿洛酮糖的制备方法主要由化学合成法以及生物转化法，生物转化法以廉价单糖为原料通过微生物或者他们的酶进行催化获得，已经成为一项重要的生物工程，是生化工程领域中的研究热点。相对于化学合成法存在副产物多、污染严重等缺点，生物转化法因具有反应条件温和、对环境友好、高度的立体选择性等优点而倍受广大糖类研究者的青睐。
DTEase家族酶可催化己酮糖C-3位的差向异构反应，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，简称DPE)是DTEase家族一员，以D-果糖为底物，催化生产D-阿洛酮糖，无其他副产物生成，便于后续的分离纯化。来源于Clostridium cellulolyticum的DPE在60℃并且Co2+离子浓度0.1mM的半衰期为6.8h，无Co2+离子的情况下为10min。韩国oh团队所研究的DPE来源于Agrobacterium tumefaciens最适温度为50℃，最适pH为8.0，所需金属离子为Mn2+，在60℃下半衰期为3.99min，以D-果糖为底物30℃反应转化率为32％。天津一团队研究的DPE来源于Ruminococcus sphaeroides，在50℃下半衰期为60min，最适反应温度为60℃，最适pH为7.5-8.0，无金属离子依赖性，以D-果糖为底物60℃反应转化率达到28％。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种D-阿洛酮糖生产菌株，所述菌株为：解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04，于2015年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015638。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述菌株生产D-阿洛酮糖的方法，所述方法是以Clostridium sp.WSH15-04发酵所得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为催化剂，以D-果糖为底物，催化生产D-阿洛酮糖。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：在pH 7.5-8.5的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为100g/L～800g/L的D-果糖作为底物，再加入所述Clostridium sp.WSH15-04发酵得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在60℃下反应1-5h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：在pH 7.5-8.5的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，加入果糖含量为300g/L的果葡糖浆作为底物，再加入所述Clostridium sp.WSH15-04发酵得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在55-60℃下反应1-5h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：以果糖含量为570g/L的果葡糖浆为底物，调节pH至8.0，加入所述Clostridium sp.WSH15-04发酵得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在60℃下反应1-5h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是Clostridium sp.WSH15-04经种子培养和液体深层发酵生产得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液或浓缩酶液。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，转化反应是在振荡条件下进行的。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，pH使用氢氧化钠水溶液进行调节。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述Clostridium sp生产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法以Clostridium sp WSH15-04菌株为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
所述种子培养，在本发明的一种实施方式中，其种子培养基配方为蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，pH 7.0，培养条件为：37℃、摇瓶转速200r/min、培养10～14h。
所述液体深层发酵，在本发明的一种实施方式中，是在发酵培养基(蛋白胨5.0，牛肉膏2.0，K2HPO41.0，NaH2PO41.0，MgSO40.5，pH7.0)中，于25℃、200r/min发酵2～3d。
本发明筛选得到了一株表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的Clostridium spWSH15-04。用该菌生产的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化D-果糖生产D-阿洛酮糖，能在100g/L～800g/L底物浓度下催化反应，反应方法简便，具有低能耗、物料成本低、加酶量低、生产强度高，产物产量高等优点，而且在高温60℃条件下，以果葡糖浆为底物进行反应，转化率可达33.7％，高于同类型酶，而且果葡糖浆简单易得，可以有效地控制生产成本；同时，此来源DPE酶的另一优点便是反应温度高，避免糖类物质为底物容易导致的染菌现象，为工业化放大生产奠定基础；同时它的半衰期长，加入Co2+后60℃半衰期长达10h，为工业化中连续生产提供基础，并且在pH5-9范围内稳定性好。
生物材料保藏
解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04，于2015年10月23日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015638。
具体实施方式
培养基：
(1)富集及分离培养基(g/L)：酵母膏0.01，Fe2(SO4)30.005，MnSO40.0025，CaCl20.05，MgSO40.2，NH4Cl 0.3，NaCl 1.0，苹果酸1.5，乙酸钠1.0，pH7.0；
(2)纯化培养基(g/L):酵母膏0.01，Fe2(SO4)30.005，MnSO40.0025，CaCl20.05，MgSO40.2，NH4Cl 0.3，NaCl 1.0，NaHCO32.5，pH7.0；
(3)种子培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，pH 7.0；
(4)发酵培养基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉膏2.0，K2HPO41.0，NaH2PO41.0，MgSO40.5，pH7.0。
酶活定义及测定：以D-果糖为底物，用HPLC测定该酶的酶活。酶活测定体系为1mL(含终浓度为5％(W/V)的D-果糖，1mmol/L Co2+，150mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0)，在60℃下加入100μL适当稀释的酶液反应2min后，沸水浴10min终止酶反应，10000r/min离心20min，用HPLC测定生成的D-阿洛酮糖含量。该条件下每min生成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
实施例1菌株的筛选
从多个森林附近分别采集土样15份。用灭过菌的药匙取1g土样加入100mL肉汤蛋白胨液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养36h，富集菌株；然后将富集后的菌液依次梯度稀释(10-1、10-2、……10-7_)涂布于含有平板分离培养基的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶筛选平板上，30℃培养箱中培养2d，挑取大小、形状、颜色不一的具有典型特征的单菌落在固体肉汤蛋白胨培养基上划线分离，再挑取单菌落进行分离纯化，反复3次，挑取典型单菌落在试管斜面上划线，30℃培养10～14h后于冰箱中4℃保存。
将筛选到的菌株接种到发酵培养基中进行液体振荡培养，培养温度为30℃，摇床转速为200r/min，培养时间为2～3d。培养液经过12000r/min离心5min收集菌体，将菌体悬浮于pH8.0的150mmol/L的TriS-HCl缓冲液中，超声破碎10min，12000r/min离心10min收集上清进行酶活测定，用HPLC测定生成的D-阿洛酮糖含量。选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株WSH15-04。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4℃保藏。
实施例2发酵产酶
将实施例1中筛选得到的产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的菌株接种于种子培养基中，在37℃下培养10～14h后以5％的接种量转接至发酵培养基中，25℃恒温培养2～3d产酶。发酵液6000r/min离心15min，收集菌体，用150mmol/L、pH8.0的TriS-HCl缓冲液洗涤后离心，收集菌体，配成菌悬液，进行超声处理，超声破碎功率200W，超声时间2s，间隔3s，总超声时间10min，所得处理液10000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。
实施例3粗酶液的浓缩
将实施例2中获得的发酵液6000r/min离心15min，收集菌体，用150mmol/L、pH8.0的TriS-HCl缓冲液洗涤后离心，收集菌体，加入1/30发酵液体积的缓冲液配成菌悬液，高压匀浆破壁，所得处理液10000r/min离心15min，上清液即为浓缩酶液。该酶加入Co2+后60℃半衰期长达10h，有较强的耐热优势。
实施例4以D-果糖为底物酶法制备D-阿洛酮糖
酶法生产工艺：
在反应器中投入用50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制的终浓度为500g/L的D-果糖，加入实施例3中获得的浓缩酶液0.01U/g果糖，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应1小时。
HPLC检测产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000r/min离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝80:20；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
结果表明，D-阿洛酮糖对底物D-果糖的转化率达33.2％，阿洛酮糖产量为166g/L。
实施例5以D-果糖为底物酶法制备D-阿洛酮糖
酶法生产工艺：
在反应器中投入用50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制的终浓度为800g/L的D-果糖，加入实施例3中获得的浓缩酶液0.01U/g果糖，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应1小时。
HPLC检测产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000r/min离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝80:20；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
结果表明，D-阿洛酮糖对底物D-果糖的转化率达33.1％，阿洛酮糖产量为265g/L。
实施例5以果葡糖浆(稀释)为底物酶法制备D-阿洛酮糖
酶法生产工艺：
以厂家提供的果葡糖浆为底物，经液相检测，其中果糖浓度：570g/L，经50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液稀释后，其果糖底物浓度：300g/L，加入实施例3中获得的浓缩酶液0.01U/g果糖，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应2小时。
HPLC检测产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000r/min离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝80:20；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
结果表明，D-阿洛酮糖对底物D-果糖的转化率达33.8％，阿洛酮糖产量为101g/L。
实施例6以果葡糖浆为底物酶法制备D-阿洛酮糖
以厂家提供的果葡糖浆为底物，经液相检测，其中果糖浓度：570g/L，用10mol/L的氢氧化钠水溶液将果葡糖浆的pH调到8.0，加入实施例3中获得的浓缩酶液0.01U/g果糖，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应3小时。
HPLC检测产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000r/min离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝80:20；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
结果表明，D-阿洛酮糖对底物D-果糖的转化率达33.7％，阿洛酮糖产量为192g/L。
本发明菌株生产的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，反应效率高且无副产物生成，可在高温下反应，可以避免采用糖类底物导致的容易染菌的问题，适合工业化应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04，于2015年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015638。
2.一种利用权利要求1所述解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，以解纤维素梭菌WSH15-04发酵所得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为催化剂，以D-果糖为底物，催化生产D-阿洛酮糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：在pH 7.5-8.5的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为100g/L～800g/L的D-果糖作为底物，再加入解纤维素梭菌WSH15-04发酵得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在60℃下反应1-5h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：在pH 7.5-8.5的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，加入果糖含量为300g/L的果葡糖浆作为底物，再加入解纤维素梭菌WSH15-04发酵得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在55-60℃下反应1-5h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在pH8.0的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，以果糖含量为570g/L的果葡糖浆为底物，加入解纤维素梭菌WSH15-04发酵得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶0.005-0.02U/g，在60℃下反应1-5h。
6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是解纤维素梭菌WSH15-04经种子培养和液体深层发酵生产得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液或浓缩酶液。
7.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，转化反应是在振荡条件下进行的。
8.一种利用权利要求1所述解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04生产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，其特征在于，以解纤维素梭菌WSH15-04菌株为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其种子培养基配方为蛋白胨10.0％，酵母粉5.0％，氯化钠10.0％，pH 7.0；种子培养条件为：37℃、摇瓶转速200r/min、培养10～14h；所述液体深层发酵，是在发酵培养基中，于25℃、200r/min发酵2～3d，发酵培养基配方为蛋白胨5.0％，牛肉膏2.0％，K2HPO4 1.0％，NaH2PO4 1.0％，MgSO4 0.5％，pH7.0。
10.权利要求1所述解纤维素梭菌(Clostridium sp.)WSH15-04生产的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
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