CN105255805A - 一种枯草芽孢杆菌基因工程菌株及其构建方法与在生产乳果糖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌生产乳果糖的方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组枯草芽孢杆菌作为生产菌株，该重组菌包含了能够催化乳糖生产乳果糖的纤维二糖差向异构酶，通过乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，以乳糖或乳清为底物进行生物催化反应。本发明使用枯草芽孢杆菌湿菌体或发酵液进行催化反应，方法简单易行，避免了酶分离纯化过程中的酶活损失和成本浪费；以食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，安全可靠，为工业化绿色生产乳果糖提供了有效的参考与借鉴。

Description

一种枯草芽孢杆菌基因工程菌株及其构建方法与在生产乳果糖中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用表达纤维二糖差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌生产乳果糖的方法。

背景技术

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)又称乳酮糖，是半乳糖和果糖以β-1,4-糖苷键结合而成的二糖。纯乳果糖为白色不规则粉末，相对密度1.35，熔点为169℃，易溶于水。商业化的乳果糖糖浆一般呈淡黄色略透明，甜度仅为蔗糖的48％～70％，它的热值低、安全性高、稳定性好，且不发生美拉德反应。乳果糖不仅仅是一种双歧杆菌增殖因子，还具有促进对矿物质的吸附、影响骨骼、降低血液中谷氨酸、降低胆固醇、减少尿石症患病风险、预防或降低尿路感染等诸多生理功能，因此乳果糖在医药、食品和动物饲料领域都具有十分广泛的应用前景。

目前，商业化的乳果糖一般通过化学法合成。其基本原理是基于还原性乳糖在碱性条件下，热处理过程中乳糖单元上的葡萄糖会被直接异构化成果糖，进而产生乳果糖。但是强碱试剂的使用不仅带来了副产物和色素的产生，降低了乳果糖产率，而且使产物分离复杂繁琐。而利用复合催化剂来生产乳果糖，虽然提高了产率，但催化剂中的硼酸难以完全去除，带来产品的安全性威胁，而且增加了成本和能耗，以上问题制约了化学异构法生产乳果糖的发展。

为了克服化学法带来的问题，一些学者提出了一种新的思路即利用微生物产酶来催化乳糖生产乳果糖。用于生产乳果糖的酶有糖基水解酶和纤维二糖差向异构酶。在糖基水解酶家族中，已报道用β-糖苷酶和β-半乳糖苷酶转化半乳糖基制备乳果糖，但是用糖基水解酶生产乳果糖的转化率很低(<30％)，并不适合乳果糖的产业化生产。而纤维二糖差向异构酶能够直接将乳糖上的葡萄糖基异构成果糖基从而生成乳果糖，是目前已知的酶法合成乳果糖方法中最为有效的酶。纤维二糖差向异构酶是一种嗜热酶，在高温下底物溶解度、反应速率都会提高，应用纤维二糖差向异构酶的好处在于它不需要额外添加底物果糖，成本低廉；而且转化率高、反应过程不易染菌，所以未来利用它进行商业化生产乳果糖的前景十分广阔。目前有研究表明利用重组大肠杆菌产纤维二糖差向异构酶并催化生产乳果糖的转化率较高。但是，乳果糖作为一种功能性低聚糖，在医药、保健、食品等领域有着较广泛的应用，安全性至关重要。大肠杆菌本身会产内毒素，带来很大的安全隐患，不适合在食品领域进行工业化应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一株枯草芽孢杆菌基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备乳果糖中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株枯草芽孢杆菌基因工程菌，该枯草芽孢杆菌中导入了纤维二糖差向异构酶基因。

其中，纤维二糖差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

其中，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilisstr.168或者BacillussubtilisWB800。

上述枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)将纤维二糖差向异构酶基因克隆到pHT-01或pHT-43质粒上，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，即得到重组枯草芽孢杆菌。

具体的构建方法如下：

(1)将纤维二糖差向异构酶基因与经限制性内切酶BamHI和SmaI双酶切的pHT-01质粒在T4连接酶的作用下进行连接得到重组质粒pHT-01-CsCE；或将纤维二糖差向异构酶基因与经限制性内切酶BamHI和SmaI双酶切的pHT-43质粒在T4连接酶的作用下进行连接得到重组质粒pHT-43-CsCE。

(2)将重组质粒pHT-01-CsCE(或pHT-43-CsCE)转化至Bacillussubtilisstr.168或BacillussubtilisWB800，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上，37℃培养12-16小时得到初步阳性克隆；

(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆；分别挑取初步阳性克隆于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，提取质粒，经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，根据电泳结果判断，含有1182bp片段的质粒对应的菌株即为含有纤维二糖差向异构酶基因的重组枯草芽孢杆菌。

上述重组枯草芽孢杆菌在制备乳果糖中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，枯草芽孢杆菌基因工程菌的培养方法如下：

将活化后的重组枯草芽孢杆菌转接到LB培养基中，10～50℃、50～500rpm培养至OD600为0.3～1.2时，向培养基中加入诱导剂，继续培养1～48h，得到重组枯草芽孢杆菌发酵液。

其中，所述的诱导剂为乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.01～1.2mmol/L，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为优选为0.2～1.0mmol/L，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为最优选为0.6mmol/L；所述乳糖的浓度为0.1～50g/L，所述乳糖的浓度优选为10～30g/L，所述乳糖的浓度最优选为10g/L。

其中，利用枯草芽孢杆菌基因工程菌催化乳糖转化为乳果糖，其催化温度为50～100℃，催化温度优选为60～80，催化温度最优选为65℃。

其中，利用枯草芽孢杆菌基因工程菌催化乳糖转化为乳果糖，其催化时间为1～100h，催化时间优选3～24h，催化时间最优选为24h。

其中，利用枯草芽孢杆菌基因工程菌催化乳糖转化为乳果糖，其反应体系中乳糖的浓度为10～700g/L。

具体的重组枯草芽孢杆菌的培养方法如下：

将重组枯草芽孢杆菌接种于添加了100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜；再以0.1～5％的接种量转接到含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃发酵2～4小时，使OD₆₀₀达到0.3～1.2时，加入0.01～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或0.1～50g/L的乳糖继续诱导表达5～48小时后，离心收集菌体。

具体的催化方法如下：

以10-700g/L的乳糖为底物，加入经上述表达方法诱导后的产纤维二糖差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilispHT-01-CsCE，菌体用量为10～100g/L(湿重)，反应温度20～100℃，反应时间1～100h，其中，反应温度优选为60～80℃，反应时间优选为3～24h。

或者，将底物乳糖10～700g/L，直接加入经上述表达方法诱导后的产纤维二糖差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilispHT-43-CsCE的发酵液中进行转化反应，反应温度20～100℃，反应时间1～100h，其中，反应温度优选为60～80℃，反应时间优选为3～24h。

有益效果：

(1)本发明采用食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，安全无毒，操作简单，为重组枯草芽孢杆菌工业化生产乳果糖提供了借鉴。

(2)直接在发酵液中进行转化，避免了酶分离纯化过程中的酶活损失，有效降低成本，提高产率。

(3)本发明通过生物法制备乳果糖，安全无毒，操作方便，分离纯化相对简单且能耗低，绿色环保；符合节约资源，环境友好的生产理念。为安全、高效的生物法生产乳果糖提供了参考与借鉴。

附图说明

图1为重组质粒pHT-01-CsCE的构建示意图。

图2为重组纤维二糖差向异构酶SDS-PAGE电泳图，泳道1为枯草芽孢杆菌全细胞，泳道2为枯草芽孢杆菌破碎离心上清液、泳道3为枯草芽孢杆菌细胞发酵液(不含细胞)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：纤维二糖差向异构酶基因的合成。

根据已报道的纤维二糖差向异构酶的基因序列，通过基因全合成的方法合成SEQIDNO.1所示的基因序列。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的构建。

以实施例1获得的DNA为模板，扩增纤维二糖差向异构酶基因片段。PCR扩增体系为：合成得到的DNA2μL，引物Primer1和Primer2各1μL，dNTP2μL,10×Ex-Tag缓冲液2.5μL，Ex-Tag聚合酶0.5μL，ddH₂O14μL。PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸1min。

将扩增条带切胶后用柱式割胶回收试剂盒回收，PCR产物用BamHI和SmaI双酶切。酶切体系为：PCR产物或质粒50μL，XhoI1μL，NdeI1μL，10×缓冲液10μL，ddH₂O38μL，总体积100μL。

经酶切后的PCR产物和经相同酶切处理的pHT-01质粒(或pHT-43质粒)进行连接。连接反应体系为：酶切PCR产物4μL，酶切质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接得到重组质粒pHT-01-CsCE，其主要结构如图1所示。

取1μL重组质粒pHT-01-CsCE于200μL感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴热激90秒，快速置于冰上1～3分钟。加入新鲜的LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45分钟，取200μL菌体涂布于LB固体培养基表面，37℃培养12-16h。将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，对重组质粒进行单双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。经电泳结果证明，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含纤维二糖差向异构酶基因的重组枯草芽孢杆菌。

实施例3：纤维二糖差向异构酶的诱导表达。

将构建的重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilisstr.168(pHT-01-CsCE)接种于5ml添加了氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养；再以5％接种量转接200ml含氨苄青霉素的LB培养基，发酵培养2～4小时至OD₆₀₀达到0.6时，加入0.6mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或10g/L的乳糖继续诱导表达24h。

实施例4：发酵液的酶活的测定。

取0.5ml含有重组菌的细胞发酵液，0.5ml乳糖溶液，使乳糖浓度为200g/L，混合均匀后在75℃反应2小时，沸水浴灭酶5min后取样HPLC法测定样液体系中的乳果糖的生成量，以等量的50mMpH7.5Tris-HCl缓冲液代替发酵液作为空白对照，以每分钟催化乳糖生成1μmol乳果糖所需的发酵液定义为1U，后续生产中以发酵液的酶活力计量。

实施例5：重组枯草芽孢杆菌的催化稳定性实验。

取反应结束的发酵液离心收集菌体，配制缓冲液，将菌体重悬，加入底物乳糖，浓度不变，进行第二轮转化反应，反应结束后测发酵液的酶活，如此循环，分别测定2、3、4、5个周期后发酵液的酶活。发现酶活基本不变(>95％)，证明重组菌的催化稳定性良好。

实施例6：发酵液转化乳糖为乳果糖。

取甘油管中保存的菌种，接入种子培养液37℃，200rpm活化10-16h作为种子培养液，以LB液体培养基作为发酵培养基，121℃，20min分钟灭菌，待冷却后加入IPTG至终浓度为1mM，按5％加入种子培养液，37℃、200rpm培养2-4小时至OD₆₀₀长到0.3-1.2，加入0.01～1.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或0.1～40g/L的乳糖继续诱导表达1-48小时。根据发酵液体积，以700g/L的乳糖为底物，加入发酵液中进行转化反应；反应温度65℃，转化时间6h。通过HPLC法测定发酵液中乳果糖的含量。经测定，转化液中乳果糖浓度达476g/L,转化率达68％。

实施例7：重组菌转化乳糖为乳果糖。

取甘油管中保存的菌种，接入种子培养液37℃，200rpm活化10～16h作为种子培养液，以LB液体培养基作为发酵培养基，121℃，20min分钟灭菌，待冷却后加入IPTG至终浓度为1mM，按5％加入种子培养液，37℃、200rpm培养3-4小时至OD₆₀₀长到0.3-1.2，加入0.01～1.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或0.5～20g/L的乳糖继续诱导表达12-48小时,离心收集菌体。以700g/L的乳糖为底物，加入重组的枯草芽孢杆菌(湿菌体10-100g/L)进行转化反应；反应温度65℃，转化时间6h。通过HPLC法测定发酵液中乳果糖的含量。经测定，转化液中乳果糖浓度达472g/L,转化率达67.4％。

实施例8：发酵液中乳果糖的分离纯化。

将反应结束的发酵液，5000rpm离心10min收集菌体。离心后的乳果糖溶液经纳滤操作脱除盐分，再经过真空浓缩。将体系温度加热到65℃后开始降温，降温速度为1℃/h，加入0.1％(w/w)结晶乳果糖作为晶种，直至有晶体析出即为乳果糖结晶，干燥后即得到高纯度的结晶乳果糖成品。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该枯草芽孢杆菌中导入了纤维二糖差向异构酶基因。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，纤维二糖差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilisstr.168或者BacillussubtilisWB800。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将纤维二糖差向异构酶基因克隆到pHT-01或pHT-43质粒上，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备乳果糖中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌基因工程菌的培养方法如下：

将活化后的枯草芽孢杆菌基因工程菌转接到培养基中，10～50℃、50～500rpm培养至OD₆₀₀为0.3～1.2时，向培养基中加入诱导剂，继续培养1～48h，得到重组枯草芽孢杆菌发酵液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的诱导剂为乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.01～1mmol/L，所述乳糖的浓度为0.1～40g/L。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用重组枯草芽孢杆菌催化乳糖转化为乳果糖，其催化温度为20～100℃。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用重组枯草芽孢杆菌催化乳糖转化为乳果糖，其催化时间为1～60h。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用重组枯草芽孢杆菌催化乳糖转化为乳果糖，反应体系中乳糖的浓度为10～700g/L。