CN109628435B

CN109628435B - 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用

Info

Publication number: CN109628435B
Application number: CN201910023301.9A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 王鑫淼
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109628435A

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将SEQ ID NO.2所示的纤维二糖差向异构酶突变体基因连接到pBSMuL3载体上，构建重组质粒pBSMuL3‑ce^(‑)，并转化枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2016536，得到重组枯草芽孢杆菌。以此重组菌为菌种，发酵生产纤维二糖差向异构酶，获得的重组酶酶活达8U/mL。将重组酶用于制备乳果糖，在80℃、pH 7.5、加酶量20U/mL、底物浓度400g/L的反应条件下，CE催化乳糖生成乳果糖的产量为200g/L，转化率可达51％。

Description

一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用

技术领域

本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

乳果糖(Lactulose)是一种不易消化的二糖，其成品为黄色澄明液体，甜度相当于乳糖，但小于蔗糖，约48％-60％蔗糖，口感凉醇，粘度低，热量低，安全性高，稳定性好。此外，乳果糖可增值双歧杆菌的活性，是一种良好的双歧杆菌促进因子，因而，乳果糖在医药行业、食品和动物饲料领域得到了广泛的应用。

商业化的乳果糖主要是通过化学法制备的，但是化学法需要添加大量的催化剂，反应所需要的条件一般也比较激烈，得到的产物副产品较多，这些混合物给后续的产品分离带来了很大的不便。相比之下，生物酶法制备乳果糖具有很多优势，其反应条件温和，卫生安全，符合低碳经济和绿色环保的要求。

目前主要用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase，EC3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(CEs，EC5.1.3.11)。其中，纤维二糖差向异构酶(CEs)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的研究。然而，野生型的纤维二糖差向异构酶活力较低，一般通过构建基因工程菌的方式提高其表达水平。

目前，在大肠杆菌、毕赤酵母中异源表达纤维二糖差向异构酶均出现过相关报道，但效果并不理想。2016年，韩亮等将Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的的纤维二糖差向异构酶CsCEm基因进行密码子优化，然后进行全基因合成，再将其引入到载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-CsCEm，并转化入毕赤酵母GS115，得到酵母工程菌株，该菌株经甲醇诱导144h后，摇瓶发酵液上清酶活达到0.42U/mL(见韩亮，杨瑞金，赵伟等，纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J].工业微生物，2016，46(1):16-21)；以大肠杆菌为宿主时，2015年，汪明明等以E.coli BL21(DE3)为宿主，异源表达Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的纤维二糖差向异构酶，在重组菌菌体培养至OD600＝0.6时加入终浓度为10g/L的乳糖，25℃下诱导20h，最终发酵液中Cs CE酶活达0.801U/mL(见汪明明，杨瑞金，华霄等，乳糖诱导纤维二糖差向异构酶的表达及热处理纯化[J].食品与发酵工业，2015，41(3):1-7)。且大肠杆菌、毕赤酵母都不是食品安全级菌株，由这些菌株获得的重组酶若要进一步应用于食品领域，其安全性存疑。

因此，提供一种条件温和、易于纯化、卫生安全、环保、活力较高的纤维二糖差向异构酶生产方法，对于工业制备乳果糖具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。以嗜热厌氧菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶(NCBI:WP_012547288.1)为野生酶，该纤维二糖差向异构酶突变体是将第8位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺，第26位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第99位的异亮氨酸突变为组氨酸，第161位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第181位的赖氨酸突变为亮氨酸，第197位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第204位的赖氨酸突变为丝氨酸，第231的苯丙氨酸突变为谷氨酸，第292位的亮氨酸突变为精氨酸，突变位点包括D8Q、K26D、I99H、D161E、K181L、F197Y、K204S、F231E和L292R。

本发明的第二个目的是提供编码上述纤维二糖差向异构酶突变体的基因，含SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，表达上述纤维二糖差向异构酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016536为表达宿主。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016536已公开于专利CN201611025858.9中。

在本发明的一种实施方式中，以pBSMuL3为表达载体，pBSMuL3的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

本发明的第五个目的是提供一种生产纤维二糖差向异构酶的方法，应用了上述重组枯草芽孢杆菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，是挑取单菌落接种到LB培养基中，35-39℃、200-220rpm，培养8-10h；将培养液按5-10％的接种量接种到TB培养基中，先于35-39℃、200-220rpm，培养1.5-3h，当菌体OD₆₀₀在0.5-1.0时转至30-34℃、200-220rpm进行摇瓶诱导发酵45-50h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组纤维二糖差向异构酶。

本发明的第六个目的是提供一种生产乳果糖的方法，以乳糖为底物，以上述纤维二糖差向异构酶突变体或表达上述纤维二糖差向异构酶突变体的细胞为催化剂。

在本发明的一种实施方式中，初始反应温度为75-82℃，起始pH为7.0-7.5，乳糖浓度为350-450g/L，加酶量控制为15-25U/mL反应体系；设置温度为75-82℃、转速140-160r/min，反应1-4h。

本发明的第七个目的是提供上述纤维二糖差向异构酶突变体或表达纤维二糖差向异构酶突变体的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。

本发明通过将嗜热厌氧菌来源的纤维二糖差向异构酶突变体基因连接到表达载体pBSMuL3载体上，构建重组质粒pBSMuL3-ce^(-)，并转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCCTCC NO:M 2016536，得到重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC NO:M 2016536/pBSMuL3-ce^(-)。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产纤维二糖差向异构酶，获得的重组酶酶活可达8.0U/mL，酶活至突变前的4.4倍。将重组CE用于制备乳果糖，具有良好的效果。在80℃、pH 7.5、加酶量20U/mL、底物浓度400g/L的反应条件下，CE催化乳糖生成乳果糖的产量为207g/L，转化率可达51.87％，比突变前转化率提高了21％。

附图说明

图1：pBSMuL3-ce^(-)重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳，1：破壁上清液；M：标准蛋白质中分子量Marker。

图2：不同反应时间下生成乳果糖的含量。

图3：突变体(枯草芽孢杆菌表达)酶转化HPLC色谱图。

图4：野生型(枯草芽孢杆菌表达)酶转化HPLC色谱图。

图5：突变体(大肠杆菌表达)酶转化HPLC色谱图。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5，NaCl 10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄ 2.31。

(二)酶活的定义及测定方法

将0.9mL乳糖溶液(100g/L)、0.1mL酶液、pH 8.5的50mmol/L Tris-HCl混合均匀，于80℃下反应20min，然后煮沸15min终止反应后，HPLC法测定乳果糖含量。以等量pH 8.5的50mmol/L Tris-HCl缓冲液代替酶液作为空白对照。

酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生1μmol乳果糖所需的酶量。

酶活计算公式：酶活(U/mL)＝稀释倍数×转化生成的乳果糖的量(μg/mL)/转化时间(min)。

(三)HPLC检测乳果糖含量

HPLC色谱条件为：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，ShodexTMAsahipakTM NH2P-50 4E色谱柱，Agilent示差检测器流，流动相采用82％(v/v)乙腈和18％的磷酸盐的混合溶液(磷酸缓冲液：称取无水磷酸二氢钠1.15g，用水溶解后定容至1000mL)，柱温设定为40℃，流速为0.8mL·min^-1。采用外标法，根据峰的保留时间和峰面积来确定乳果糖的产量。

实施例1：重组质粒pBSMuL3-ce^(-)的构建过程

合成嗜热厌氧菌来源的纤维二糖差向异构酶(NCBI:WP_012547288.1)基因，将基因片段连接到pET-24a载体上，得到质粒pET-24a-ce。以质粒pET-24a-ce为模板，设计正反向引物为F1/R1(序列信息分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)扩增CE基因片段。PCR得到的目的片段ce与pMD-19T Simple载体连接后转化至E.coli JM109，挑选单克隆转化子至LB液体培养基中培养8-10h，提取质粒，双酶切验证正确后进行基因测序，测序正确的质粒记为pMD-19T-ce。使用限制性内切酶HindⅢ和BamHΙ对质粒pMD-19T-ce进行双酶切，胶回收得到ce片段，在T4连接酶的作用下将目的基因ce与表达载体pBSMuL3在16℃过夜连接，将连接产物转化至E.coli JM109，抽提质粒后测序正确的重组质粒记为pBSMuL3-ce。以pBSMuL3-ce为模板，通过定向突变得到pBSMuL3-ce^(-)，纤维二糖差向异构酶突变体突变位点包括D8Q、K26D、I99H、D161E、K181L、F197Y、K204S、F231E和L292R。

实施例2：重组质粒pBSMuL3-ce^(-)的转化

将质粒pBSMuL3-ce^(-)转化到提前制备好的Bacillus subtilis CCTCC NO:M2016536中，得到基因工程菌Bacillus subtilis CCTCC NO:M 2016536/pBSMuL3-ce^(-)，涂布含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，经37℃培养10-12h。挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/mL)抗性的10mL液体LB培养基中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3：摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至50mL TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，在菌体OD600在0.5-1.0时转至33℃、200rpm进行摇瓶诱导发酵48h。发酵结束后，将发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组CE。测得重组酶活力可达8.0U/mL，蛋白电泳结果显示在43kDa处有一条与理论分子量一致的条带(图1)。

实施例4：酶转化

在初始反应温度85℃，起始pH 8.5，乳糖浓度为400g/L的情况下，加酶量控制为20U/mL反应体系。设置水浴摇床温度为80℃、转速150r/min，每隔1h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。用HPLC检测产物的含量。

在上述条件下进行酶转化反应，如图2所示，当反应进行到4h后转化率可达到51％，产量为200g/L色谱峰图见图3。

对比例1野生型纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中重组表达

以野生型纤维二糖差向异构酶基因ce为目的基因，在枯草芽孢杆菌中重组表达。其余条件同实施例1-4。得到的重组酶酶活为1.8U/mL，重组酶催化乳糖生成乳果糖的产量为123g/L，转化率为30.75％。如图4所示。

对比例2野生型纤维二糖差向异构酶在大肠杆菌中重组表达

以野生型纤维二糖差向异构酶基因ce为目的基因，在大肠杆菌中重组表达。其余条件同

实施例1-4。得到的重组酶酶活为1.2U/mL，重组酶催化乳糖生成乳果糖的产量为115g/L，转化率为28.9％。如图5所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asp Leu Lys His Leu Lys Gln Glu Ile Phe Glu Gln Leu Asn Asn

1 5 10 15

Lys Ile Ile Pro Phe Trp Glu Asn Leu Asp Asp Glu Asn Asn Gly Gly

20 25 30

Tyr Ile Ser Tyr Val Gly Phe Asp Leu Lys Pro Asp Pro Tyr Ala Pro

35 40 45

Lys Gly Leu Val Leu Thr Ser Arg Ile Leu Trp Phe Phe Ser Arg Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln Leu Arg Lys Glu Glu Phe Ile Glu Phe Ala Asp His Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Phe Leu Thr Asp Lys Leu Leu Asp Lys Glu Asn Gly Gly Phe

85 90 95

Phe Trp His Val Asp Tyr Lys Gly Asp Pro Leu Asp Lys Arg Lys His

100 105 110

Leu Tyr Gly Gln Ala Phe Ala Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Tyr Tyr Lys

115 120 125

Ala Thr Lys Lys Lys Glu Ser Leu Glu Leu Ser Leu Glu Leu Tyr Lys

130 135 140

Thr Ile Glu Glu Arg Cys Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Lys Glu Glu Phe

145 150 155 160

Glu Glu Lys Trp Thr Pro Lys Glu Asn Ile Ile Val Ser Glu Tyr Gly

165 170 175

Ile Ile Cys Glu Leu Ser Met Asn Thr Leu Leu His Leu Leu Glu Ala

180 185 190

Tyr Thr Asn Leu Tyr Thr Ala Thr Tyr Asp Leu Ser Val Arg Lys Glu

195 200 205

Leu Glu Asn Leu Ile Ile Leu Phe Lys Glu Lys Ile Tyr Asn Pro Lys

210 215 220

Thr Asp His Leu Tyr Val Glu Phe Asp Asn Lys Met Lys Pro Ile Ile

225 230 235 240

Asp Ala Ile Ser Tyr Gly His Asp Ile Glu Ala Thr Trp Leu Ile Asp

245 250 255

Glu Ala Leu Arg Tyr Ile Glu Asn Asn Thr Leu Ile Lys Asp Met Thr

260 265 270

Glu Ile Asn Leu Arg Ile Ala Glu Arg Val Leu Glu Glu Ala Phe Glu

275 280 285

Asn Asn Ser Arg Leu Asn Glu Lys Val Arg Gly Glu Val Asn Lys Asp

290 295 300

Arg Val Trp Trp Val Gln Ala Glu Ala Leu Leu Gly Phe Leu Asn Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Lys Thr Lys Ser Asp Lys Phe Leu Lys Ala Val Leu Ser Leu

325 330 335

Trp Glu Phe Ile Asn Asn Phe Leu Leu Asp Lys Arg Pro Asn Gly Glu

340 345 350

Trp Phe Asn Lys Leu Asp Glu Asn Cys Ile Pro Phe Pro Met Pro Glu

355 360 365

Val Asp Leu Trp Lys Cys Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Tyr Leu Glu

370 375 380

Val Ile Arg Arg Ile

385

<210> 2

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggatctta aacatcttaa acaagaaatc tttgaacaac ttaataacaa aatcattccg 60

ttttgggaaa atctggatga tgaaaacaat gggggctata ttagctatgt cggctttgat 120

cttaaacccg atccgtatgc acctaaagga cttgtcctga cgtctcgcat cctgtggttc 180

ttcagccggt tgtataatca actgcgcaaa gaagagttta tcgaatttgc ggatcatgcg 240

tatgaatttc tgacagataa actgctggat aaagaaaatg gcggcttctt ctggcatgtc 300

gattataagg gagatccgtt agataaacgc aaacatctgt atggccaagc gtttgcgctg 360

tatggccttt cagaatatta caaggcgacg aagaaaaagg aatctctgga actgagcctt 420

gaactttaca aaacaatcga agaacggtgc aaagataata tcggctataa ggaagaattt 480

gaagaaaagt ggacacctaa agaaaatatt attgtctcag aatatggcat tatttgcgaa 540

ctttctatga atacgttact tcatctgctt gaagcgtata cgaatttgta tacagcaact 600

tacgatctta gcgttcgcaa agaactggaa aatctgatca tcctgtttaa agaaaaaatc 660

tataatccta aaacggatca tctgtatgtg gaattcgata acaagatgaa accgattatc 720

gatgcgatta gctatggcca tgatattgaa gcgacgtggt tgattgatga agcacttcgg 780

tatatcgaaa ataacacact tatcaaagat atgacggaaa tcaacttacg catcgcggaa 840

cgggtcctgg aagaagcgtt tgaaaataac tcacggctta acgaaaaagt tcggggcgaa 900

gtcaacaaag atagagtgtg gtgggtccaa gcagaagcgc tgttgggctt tcttaatgca 960

tatcaaaaaa cgaaatcaga taaatttctt aaagcagtgc tgagcctgtg ggagtttatc 1020

aacaactttc tgttagataa acgccctaat ggcgaatggt ttaacaaact ggatgaaaat 1080

tgcattccgt ttccgatgcc ggaagtcgat ttgtggaaat gcccgtatca taatggccgc 1140

atgtatcttg aagtcattcg tcgcatt 1167

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aagcttaagg aggatattat ggatcttaaa catcttaaag atgaaa 46

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggatccttaa atgcgacgaa tgacttcaag a 31

<210> 5

<211> 5748

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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aaaaaaaaga aaggtcttaa aggttttatg gttttggtcg gcactgccga cagcctcgca 180

gagcacacac tttatgaata taaagtatag tgtgttatac tttacttgga agtggttgcc 240

ggaaagagcg aaaatgcctc acatttgtgc cacctaaaaa ggagcgattt aggcggcgtt 300

ctgtttctgc ttcggtatgt gattgtgaag ctggcttaca gaagagcggt aaaagaagaa 360

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acaaagaact ccaatcataa aaggtatatt tttccctaat ccgggatcaa caaaaggatc 1620

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tacgagtgct ggaaatgcag ctgcaccagc cccttgaata aaacgagcca taataagtaa 2040

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aaataggagt aaccttttga tgcctaattg atcagatagc tttccatata cagctgttcc 2160

aatggaaaag gttaacataa aggctgtgtt cacccagttt gtactcgcag gtggtttatt 2220

aaaatcattt gcaatatcag gtaatgagac gttcaaaacc atttcattta atacgctaaa 2280

aaaagataaa atgcaaagcc aaattaaaat ttggttgtgt cgtaaattcg attgtgaata 2340

ggatgtattc acatttcacc ctccaataat gagggcagac gtagtttata gggttaatga 2400

tacgcttccc tcttttaatt gaaccctgtt acattcatta ttcattacac ttcataatta 2460

attcctccta aacttgatta aaacatttta ccacatataa actaagtttt aaattcagta 2520

tttcatcact tatacaacaa tatggcccgt ttgttgaact actctttaat aaaataattt 2580

ttccgttccc aattccacat tgcaataata gaaaatccat cttcatcggc tttttcgtca 2640

tcatctgtat gaatcaaatc gccttcttct gtgtcatcaa ggtttaattt tttatgtatt 2700

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tattttgcag tttcgtcaat tgccgattgt atatccgatt tatatttatt tttcggtcga 2880

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atccattgtt tttgattcac gtagttttct gtattcttaa aataagttgg ttccacacat 3000

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atcaagataa gaaagaacaa gttcaaaacc atcaaaaaaa gacacctttt caggtgcttt 3780

ttttatttta taaactcatt ccctgatctc gacttcgttc tttttttacc tctcggttat 3840

gagttagttc aaattcgttc tttttaggtt ctaaatcgtg tttttcttgg aattgtgctg 3900

ttttatcctt taccttgtct acaaacccct taaaaacgtt tttaaaggct tttaagcgtc 3960

tgtacgttcc ttaaggaatt attccttagt gctttctagg ttaatgtcat gataataatg 4020

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtcc gcggaacccc tatttgtatt 4080

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 4140

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 4200

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 4260

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 4320

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 4380

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 4440

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 4500

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 4560

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 4620

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 4680

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 4740

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 4800

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 4860

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 4920

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 4980

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 5040

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 5100

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 5160

gagcgtcaga ccccttaata agatgatctt cttgagatcg ttttggtctg cgcgtaatct 5220

cttgctctga aaacgaaaaa accgccttgc agggaggttt ttcgaaggtt ctctgagcta 5280

ccaactcttt gaaccgaggt aactggcttg caggagcgca gtcaccaaaa cttgtccttt 5340

cagtttagcc ttaaccggcg catgacttca agactaactc ctctaaatca attaccagtg 5400

gctgctgcca gtggtgcttt tgcatgtctt tccgggttgg actcaagacg atagttaccg 5460

gataaggcgc agcggtcgga ctgaacgggg ggttcgtgca tacagtccag cttggagcga 5520

actgcctacc cggaactgag tgtcaggcgt ggaatgagac aaacgcggcc ataacagcgg 5580

aatgacaccg gtaaaccgaa aggcaggaac aggagagcgc acgagggagc cgccaggggg 5640

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac cactgatttg agcgtcagat 5700

ttcgtgatgc ttgtcagggg gcggagccta tggaaaaacg ctttgccc 5748

Claims

1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。

3.含权利要求2所述基因的载体。

4.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体。

5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2016536为表达宿主。

6.一种生产纤维二糖差向异构酶的方法，其特征在于，应用了权利要求4或5所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，挑取重组枯草芽孢杆菌单菌落接种到LB培养基中，35-39℃、200-220rpm，培养8-10h；将培养液按5-10％的接种量接种到TB培养基中，先于35-39℃、200-220rpm，培养1.5-3h，当菌体OD₆₀₀在0.5-1.0时转至30-34℃、200-220rpm进行摇瓶诱导发酵45-50h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组纤维二糖差向异构酶。

8.一种生产乳果糖的方法，其特征在于，以乳糖为底物，以权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体或权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌为催化剂。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，初始反应温度为75-82℃，起始pH为7.0-7.5，乳糖浓度为350-450g/L，加酶量控制为15-25U/mL反应体系；温度为75-82℃、转速140-160r/min，反应1-4h。

10.权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体或权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌在食品、饲料或制药领域中的应用。