CN111411117B

CN111411117B - 一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

Info

Publication number: CN111411117B
Application number: CN202010342196.8A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 夏伟; 盛玲玲; 黄燕
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111411117A; JP2022535648A; WO2021217960A1; JP7297924B2

Abstract

本发明公开了一种耐热β‑葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Thermotoga sp.KOL6的β‑葡萄糖苷酶TSBGl的基因以Bacillus subtilis WSH11为表达宿主，实现tsbgl基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达。所述β‑葡萄糖苷酶TSBGl的最适温度为90℃，最适pH为6.0，在90℃下具有较高的热稳定性。将所述β‑葡萄糖苷酶添加至以1200g/L葡萄糖为底物的反应体系中，在pH6.0，90℃下进行酶反应，低聚龙胆糖的产量达到178.2g/L。此酶适合食品等工业应用的需要，可用于低聚龙胆糖的工业化生产。

Description

一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够特异性的水解非还原末端的β-D-葡萄糖苷键释放葡萄糖和相应配基的一类糖苷水解酶(Glycoside hydrolysase,，GH)。β-葡萄糖苷酶广泛存在于生物体内并在其中发挥重要的作用，根据其氨基酸序列特征差异，主要分布于GH1、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116六个家族中，其中大多数β-葡萄糖苷酶属于GH1，GH3家族。GH1和GH3家族的β-葡萄糖苷酶在蛋白质折叠，理化性质，催化特性和底物特异性等方面都存在差异。β-葡萄糖苷酶可以应用在各种行业中，例如在生物乙醇行业降解纤维二糖，消除产物抑制作用；作为水解果汁中的风味前体糖苷的增味剂；一部分β-葡萄糖苷酶因其具有的转糖苷能力而具有一定的合成活性，可以很好的替代传统的化学方法，合成稀有寡糖和烷基糖苷等应用于食品和化妆品工业中，其中由β-葡萄糖苷酶产生的低聚龙胆糖可以诱导人体肠道益生菌的生长，对人体有益。

低聚龙胆糖是一种新的功能低聚糖，是由两个及以上β-1.6-葡萄苷键连接的葡萄糖组成，主要成分是龙胆二糖及少量的龙胆三糖和四糖。低聚龙胆糖的热量低，用在食品中引起龋齿的风险低，另外还有抑制肿瘤及促进营养吸收和代谢等功能。

制取低聚龙胆糖方法较多，早期的研究从龙胆属植物的根、茎中提取，也可以利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯获得；但由于原料、市场价格等的限制，使其难以工业化生产。酶法制备是目前低聚龙胆糖工业化生产的主要途径，其常用的反应条件是在低水活度，高底物浓度下，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性合成低聚龙胆糖，其得到的低聚龙胆糖的产量都不高，基本都在50g/L，转化率在8％左右。其中影响低聚龙胆糖产量的两个重要的因素是反应温度和酶的转糖苷活性。低聚龙胆糖的产量会随着温度的增加而增加，其原因主要是底物葡萄糖在较高的温度下溶解度会增加，并且此时作为受体的水分子也会相应减少，促进了转糖苷反应的发生，增加低聚龙胆糖的积累量，同时高温也能够防止杂菌污染，从工业生产的角度，在长时间运作的连续生产系统下，酶的失活现象会更加明显，严重影响生产。所以，天然耐受高温的β-葡萄糖苷酶对工业化生产非常重要。此外，目前大多数研究制备低聚龙胆糖主要使用GH3家族的β-葡萄糖苷酶，对GH1家族的β-葡萄糖苷酶研究甚少，GH1家族的β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用前景还有待开发。

发明内容

本发明提供了一种编码β-葡萄糖苷酶TSBGl的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶TSBGl的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种载体，所述载体携带编码β-葡萄糖苷酶TSBGl的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述载体的出发载体为表达载体pBSMμL3，载体序列记载于公布号为CN107058205A的专利中。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶TSBGl。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilisWSH11，记载于公布号为CN108102997A的专利中。

本发明提供了一种生产β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)将所述重组菌在35～40℃培养2～5h，得到菌液；

(2)将菌液在2500～3500rpm离心3～6min，去除60～90％体积的上清，将剩余10～40％体积的上清涂布于LB平板上，35～40℃培养箱培养10～16h；

(3)在LB平板上挑取单菌落至LB液体培养基中培养7～11h后，取2～6mL培养液转接到100mL TB培养基中，35～40℃培养1.5～3h，再30～34℃培养45～50h；

(4)培养结束后，将培养得到的菌液在7000～9000rpm离心15～25min收集菌体；

(5)向菌体中加入45～55mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，重悬菌体；

(6)使用高压匀浆机破壁，9000～12000rpm离心15～25min后，收集破壁上清液即为粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)和(3)培养基中的含有5～15μg/mL的四环素。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为40～60mM，pH为5.0～7.0。

本发明提供了一种提高低聚龙胆糖产量的方法，所述方法是将所述重组菌发酵得到的β-葡萄糖苷酶在以葡萄糖为底物的体系中反应得到反应液，将反应液纯化后得到低聚龙胆糖。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为300～700U/g。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为400～600U/g。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为800～1500g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为1000～1300g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在60～100℃下进行反应20～30h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在80～100℃下进行反应22～25h。

本发明还保护所述基因在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述载体pBSMμL3-tsbgl在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述生产β-葡萄糖苷酶的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述提高低聚龙胆糖产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述重组菌在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了β-葡萄糖苷酶的高效表达方法。由化学法合成编码来源于Thermotoga sp.KOL6的β-葡萄糖苷酶TSBGl的核苷酸序列，以穿梭质粒pBSMμL3为表达载体，以Bacillus subtilis WSH11为表达宿主，实现了tsbgl基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达；β-葡萄糖苷酶TSBGl的最适温度为90-100℃，最适pH为6.0，在90℃下具有较高的热稳定性。β-葡萄糖苷酶TSBGl可以利用葡萄糖并转化生成低聚龙胆糖，尤其能够在1200g/L葡萄糖的高浓度条件下利用葡萄糖进行生产，此时低聚龙胆糖的产量能达到178.2g/L，为β-葡萄糖苷酶法合成低聚龙胆糖的最高产量。因此此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能由于低聚龙胆糖的工业化生产。

附图说明

图1是tsbgl基因表达载体的构建过程。

图2是β-葡萄糖苷酶纯化前后的电泳图；M为marker，泳道1为纯化前的β-葡萄糖苷酶TSBGl粗酶液，泳道2为纯化后的β-葡萄糖苷酶TSBGl纯酶。

图3是不同温度下β-葡萄糖苷酶的相对酶活。

图4是不同pH下β-葡萄糖苷酶的相对酶活。

图5是β-葡萄糖苷酶在不同温度下的酶活稳定性。

图6是β-葡萄糖苷酶不同添加量下的低聚龙胆糖转化率。

图7是不同底物浓度下β-葡萄糖苷酶制备低聚龙胆糖的转化率。

具体实施方式

β-葡萄糖苷酶酶活力分析：

(1)酶活单位定义：每毫升酶液每分钟水解pNPG产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。

相对酶活计算方法：酶活＝(A₄₀₅+0.002)*反应体系*稀释倍数/(0.0074*反应时间*加酶量)。

(2)酶活力测定步骤

反应体系为1mL，pH 5.0的醋酸缓冲液960μL，加入适度稀释(以反应终止时反应液405nm吸光值在0.2-1.2范围为宜)的粗酶液20μL，再加入20μL 100mmol/L的pNPG，在60℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入200μL的1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，冰浴5min，于405nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。

LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。

TB培养基：酵母粉24g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，KH₂PO₄2.31g/L。

RM培养基：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，山梨醇90.0g/L，甘露醇70.0g/L。

β-葡萄糖苷酶TSBGl的纯化：

(1)将500mL重组菌的破壁上清液中加入50mL、35％的固体硫酸铵盐析过夜(12h)；

(2)将盐析后的粗酶液4℃、10000rpm离心20min，取沉淀用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜(12h)后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；

(3)Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用100mL缓冲液A、100mL含有20-480mM咪唑的缓冲液A、100mL含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速为1mL/min，，目的蛋白β-葡萄糖苷酶被含480mM咪唑的缓冲液A洗脱下来，收集该部分洗脱液；

(4)上述含480mM咪唑的蛋白洗脱液在pH6.0，50mM的磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化β-葡萄糖苷酶酶制品。

(5)纯化后重组β-葡萄糖苷酶进行电泳。纯化电泳图见图2。

实施例1：含有tsbgl基因表达载体的构建

根据Genbank数据库中热袍菌(Thermotoga spKOL6)β-葡萄糖苷酶Tsbgl氨基酸序列(WP_101510358)，化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。

将合成的基因片段与pET-24a酶切后(酶切位点：Nde I和EcoR I)连接得到连接产物；将连接产物通过热激转化法转化至大肠杆菌E.coli.JM109。得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有0.05mg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子。

热激转化法：

(1)将E.coli.JM109感受态细胞提前放在冰上5min中，待感受态完全融化后，向其中加入10μL完整质粒或者PCR产物，轻柔吹吸均匀后，置于冰上放置45min。

(2)将感受态放置到42℃水浴锅中热激90s，热激结束后，放置在冰上5min。

(3)冰浴结束后，向感受态中加入0.8mL LB液体培养基，混匀后放到37℃摇床中震荡培养60min左右。

(4)培养结束的感受态3000rpm离心5min，弃部分上清液，留200μL左右的发酵液将菌体重新吹吸重悬，涂布到含10μg/mL氨苄抗生素的LB固体平板上，37℃培养箱静置培养10h左右，等待平板长出单菌落。

挑取单克隆菌落接种至含10μg/mL氨苄青霉素抗性LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET24a-tsbgl。

以质粒pET24a-tsbgl和pBSMμL3为模板，分别设计上下游包含15bp同源臂的目的基因引物和载体引物，PCR扩增带同源臂的目的基因片段tsbgl(引物1和2)及模板片段pBSMμL3(引物3和4)；

引物1：TAAGGAGTGTCAAGAATGAGCATGAAAAAGTTTCCGGAAG(SEQ ID NO.3)；

引物2：TTTATTACCAAGCTTTTAATCTTCCAGGCCGTTATTTTTAATAAC(SEQ ID NO.4)；

引物3：AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTC(SEQ ID NO.5)；

引物4：CATTCTTGACACTCCTTATTTG(SEQ ID NO.6)。

PCR体系为：2×Super Pfx MasterMix 25μL，两条引物各1.25μL，ddH₂O 22μL，模板0.5μL。

反应条件为：①94℃、4min，②94℃、1min，③55℃、1min，④72℃、2min，将②～④扩增35个循环后，⑤72℃、5min，⑥4℃保温；分别扩增得到目的基因片段tsbgl及模板片段pBSMμL3。

扩增的片段通过(天根生化科技有限公司)胶回收试剂盒回收，进行测序验证，将测序验证正确的两条回收片段通过In-Fusion HD Cloning Plus kit试剂盒连接，连接体系为：基因片段400ng，载体片段200ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，用水补足至10μL；将连接体系在50℃下反应25min后，得到连接产物，将连接产物转化克隆宿主JM109(具体实施方式参见上文热激转化法)，涂布到LB固体培养基上(含10μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养8-10h后，挑单菌落至含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h后收集菌体提取质粒(质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司)，得到pBSMμL3-tsbgl质粒(图1)，酶切验证并送公司测序验证。

实施例2：枯草芽孢杆菌表达宿主转化培养和粗酶液的提取

将酶切验证及测序正确的重组质粒pBSMμL3-tsbgl线性化后电转化至BacillussubtilisWSH11(Bacillus subtilisWSH11记载于公布号为CN108102997A的专利中)。重组质粒pBSMμL3-tsbgl电击转化Bacillus subtilisWSH11感受态细胞：

(1)将Bacillus subtilisWSH11感受态细胞提前放在冰上5min，待感受态完全融化后，向其中加入10μL重组质粒，轻柔吹吸均匀后，置于冰上放置15min；

(2)电转仪提前打开预热30min，电击电压设置为2400V，将冰浴结束的感受态缓慢加入到提取预冷的直径为2mm规格的电击杯中，将电击杯外壁的水擦干净后，将电击杯放到转化仪中电击；

(3)电击结束后将快速向其中加入1mL提前预冷好的RM培养基，吹吸均匀后将菌液转移到1.5mL的灭菌的EP管中，置于37℃摇床中，200rpm震荡培养3h；

(4)培养结束的菌液3000rpm离心5min，弃部分上清液，留200μL左右的上清液将菌体重新吹吸重悬，涂布到含四环素抗性的LB固体平板上，37℃培养箱培养10h左右，等待平板长出单菌落；

(5)挑取单菌落，测序验证，得到含有质粒pBSMμL3-tsbgl的阳性转化子。

将含有重组质粒pBSMμL3-tsbgl的阳性转化子接种至LB液体培养基中(含10μg/mL四环素)培养8-10h后，取5mL培养液转接到100mL TB培养基中，37℃培养2h，再33℃培养48h，发酵结束后，8000rpm离心20min收集菌体。向菌体中加入50mL的50mM pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，充分重悬菌体后，使用高压匀浆机破壁，10000rpm离心20min后，收集破壁上清液即为粗酶液，OD₆₀₀为5时的粗酶液酶活为10.41U/mL。

将收集到的粗酶液进行纯化，并进行电泳，纯化电泳图见图2。

实施例3：β-葡萄糖苷酶TSBGl应用条件的确定

(1)β-葡萄糖苷酶TSBGl最适温度

以pNPG为底物，将实施例3中获得的纯化后的β-葡萄糖苷酶加入酶活测定反应体系中，pH为6.0，在不同温度下进行反应，测定酶活，并计算其相对酶活，结果见图3，具体数据见表1，可见在β-葡萄糖苷酶最适温度为90℃，在90-100℃时，相对酶活可达85％以上。

表1β-葡萄糖苷酶TSBGl在不同温度下的相对酶活

(2)β-葡萄糖苷酶TSBGl最适pH

以pNPG为底物，将实施例3中获得的纯化后的β-葡萄糖苷酶加入酶活测定反应体系中，不同pH下、90℃恒温水浴中反应10min。测定反应后的酶活，并计算其相对酶活，结果见图4，具体数据见表2，可见在β-葡萄糖苷酶最适pH为6.0。

表2β-葡萄糖苷酶TSBGl在不同pH下的相对酶活

(3)β-葡萄糖苷酶TSBGl热稳定

以pNPG为底物，将实施例3中获得的纯化后的β-葡萄糖苷酶加入酶活测定反应体系中，在pH为6.0，分别在70℃、80℃、90℃温水浴中反应60分钟，在60分钟内测定酶的酶活，并计算其相对酶活，结果见图5，在第60分钟时，β-葡萄糖苷酶TSBGl在70℃、80℃、90℃的相对酶活分别为99.18％、99.31.35％、99.81％。在β-葡萄糖苷酶在90℃下具有较高的热稳定性。

表3β-葡萄糖苷酶TSBGl在不同温度下的相对酶活(％)

实施例4：β-葡萄糖苷酶TSBGl在低聚龙胆糖制备中的应用

以800g/L的葡萄糖为底物，在pH 6、90℃下反应24h，设置不同加酶量300U/g、400U/g、500U/g、600U/g、700U/g，探究以高浓度葡萄糖为底物利用逆水解活性合成低聚龙胆糖时加酶量。

实验结果如图6所示，在一定范围内，底物的转化率随着加酶量的增加不断提高，当加酶量达到500U/g葡萄糖时，底物转化率可达到10.94％；进一步增加酶量，转化率几乎保持不变。综合考虑，选择500U/g的加酶量，此时底物转化率可达到10.94％，低聚龙胆糖的产量能达到73g/L。

实施例5：β-葡萄糖苷酶TSBGl在高底物浓度下低聚龙胆糖制备中的应用

具体实施方参见实施例4，区别在于，加酶量为500U/g葡萄糖，且β-葡萄糖苷酶TSBGl的高温反应特点可允许在高温下以更高底物浓度下进行逆水解合成反应，故探究葡萄糖底物浓度(分别为800g/L、900g/L、1000g/L、1100g/L、1200g/L)对逆水解合成低聚龙胆糖的产量和转化率的影响。

实验结果如图7所示，葡萄糖底物终浓度为800g/L、900g/L 1000g/L和1100g/L，底物转化率分别为10.42％、12.72％、14.43％、14.82％；葡萄糖底物终浓度为1200g/L，此时低聚龙胆糖的产量能达到178.2g/L，底物转化率为14.85％，为已知该方法合成低聚龙胆糖的最高产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcatga aaaagtttcc ggaaggtttt ctgtggggtg ttgcaaccgc gagctatcag 60

attgaaggta gcccgctggc cgatggtgcg ggtatgagca tttggcatac ctttagccat 120

acgccgggca atgttaaaaa tggtgatact ggtgatatcg catgcgatca ttataatcgt 180

tggaaagaag atatcgaaat catgaaagaa ctgggtgtta aagcatatcg ttttagcatc 240

agctggccgc gtatcctgcc ggaaggtaca ggtcgcgtta atcagaaagg tatcgatttt 300

tatagccgta ttatcgatac cctgctggaa cagggtatta ccccgtttgt tacaatttat 360

cattgggatc tgccgtttga actgcagctg aaaggtggct gggcaaatcg cgaagttgca 420

gattggtttg cggaatatag ccgtgtgctg tttgaaaact ttggtgatcg tgtgaaacat 480

tggattaccc tgaatgaacc ttgggttgtg gcgattgttg gtcatctgta tggtgttcat 540

gcgccgggta tgaaagatat ttatgttgcc tttcatgtgg ttcataatct gctgcgtgct 600

catgcgaaat cagtgaaaat ttttcgtgaa attgtgaaag atggcaaaat tggtattgtt 660

tttaacaacg gttattttga accggcaagc gaaaaagaag aagatgttcg tactgcagaa 720

tttgcacatc agtttaccaa ttatccgctg tttctgaatc cgatctataa aggtgattat 780

ccggaactgg ttcgtgaatt tgcacgtgaa tttctgccga aagattataa aaaggatatg 840

gaagaaatcc aggaacgcat taattttgtt ggtatcaatt attatagcgg ccacatggtt 900

aaatatgatc ctaaaagccc gggtggtgtt agctttgtgg aacgtgatct gccgaaaacc 960

gaaatgggtt gggaagttgt tccggaaggt ctgtattata tcctgaaagg tgtgaaagat 1020

gaatataatc cggaagaaat ttatgtgacc gaaaatggtg cagcatataa tgatgtggtt 1080

agcgaagatg gtaaagtgca tgatcagaat cgtattgatt atctgaaagc acatatcggt 1140

caggcgtgga aagcactgca ggatggtgtg ccgctgcgtg gttattttgt ttggagtctg 1200

ctggataatt ttgaatgggc agaaggctat agcaaacgct ttggtattgt ttatgttgat 1260

tatcagacgc agaaacgtat tattaaagat tctggtcatt ggtatgcgaa tgttattaaa 1320

aataacggcc tggaagatta a 1341

<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> Thermotoga sp.

<400> 2

Met Ser Met Lys Lys Phe Pro Glu Gly Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ser Pro Leu Ala Asp Gly Ala Gly Met

20 25 30

Ser Ile Trp His Thr Phe Ser His Thr Pro Gly Asn Val Lys Asn Gly

35 40 45

Asp Thr Gly Asp Ile Ala Cys Asp His Tyr Asn Arg Trp Lys Glu Asp

50 55 60

Ile Glu Ile Met Lys Glu Leu Gly Val Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile

65 70 75 80

Ser Trp Pro Arg Ile Leu Pro Glu Gly Thr Gly Arg Val Asn Gln Lys

85 90 95

Gly Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Ile Asp Thr Leu Leu Glu Gln Gly

100 105 110

Ile Thr Pro Phe Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Phe Glu Leu

115 120 125

Gln Leu Lys Gly Gly Trp Ala Asn Arg Glu Val Ala Asp Trp Phe Ala

130 135 140

Glu Tyr Ser Arg Val Leu Phe Glu Asn Phe Gly Asp Arg Val Lys His

145 150 155 160

Trp Ile Thr Leu Asn Glu Pro Trp Val Val Ala Ile Val Gly His Leu

165 170 175

Tyr Gly Val His Ala Pro Gly Met Lys Asp Ile Tyr Val Ala Phe His

180 185 190

Val Val His Asn Leu Leu Arg Ala His Ala Lys Ser Val Lys Ile Phe

195 200 205

Arg Glu Ile Val Lys Asp Gly Lys Ile Gly Ile Val Phe Asn Asn Gly

210 215 220

Tyr Phe Glu Pro Ala Ser Glu Lys Glu Glu Asp Val Arg Thr Ala Glu

225 230 235 240

Phe Ala His Gln Phe Thr Asn Tyr Pro Leu Phe Leu Asn Pro Ile Tyr

245 250 255

Lys Gly Asp Tyr Pro Glu Leu Val Arg Glu Phe Ala Arg Glu Phe Leu

260 265 270

Pro Lys Asp Tyr Lys Lys Asp Met Glu Glu Ile Gln Glu Arg Ile Asn

275 280 285

Phe Val Gly Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly His Met Val Lys Tyr Asp Pro

290 295 300

Lys Ser Pro Gly Gly Val Ser Phe Val Glu Arg Asp Leu Pro Lys Thr

305 310 315 320

Glu Met Gly Trp Glu Val Val Pro Glu Gly Leu Tyr Tyr Ile Leu Lys

325 330 335

Gly Val Lys Asp Glu Tyr Asn Pro Glu Glu Ile Tyr Val Thr Glu Asn

340 345 350

Gly Ala Ala Tyr Asn Asp Val Val Ser Glu Asp Gly Lys Val His Asp

355 360 365

Gln Asn Arg Ile Asp Tyr Leu Lys Ala His Ile Gly Gln Ala Trp Lys

370 375 380

Ala Leu Gln Asp Gly Val Pro Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu

385 390 395 400

Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Glu Gly Tyr Ser Lys Arg Phe Gly Ile

405 410 415

Val Tyr Val Asp Tyr Gln Thr Gln Lys Arg Ile Ile Lys Asp Ser Gly

420 425 430

His Trp Tyr Ala Asn Val Ile Lys Asn Asn Gly Leu Glu Asp

435 440 445

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taaggagtgt caagaatgag catgaaaaag tttccggaag 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttattacca agcttttaat cttccaggcc gttattttta ataac 45

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcttggta ataaaaaaac acctc 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cattcttgac actccttatt tg 22

Claims

1.一种提高低聚龙胆糖产量的方法，其特征在于，利用重组菌表达的β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生成低聚龙胆糖，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主；所述葡萄糖浓度为900～1500g/L；所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为500～800U/g葡萄糖；所述方法是在90～100℃、pH 5.0～7.0下反应20～30h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌以pBSMμL3为表达载体，以Bacillus subtilis WSH11为出发菌株。

3.权利要求1或2所述方法在制备低聚龙胆糖中的应用。