CN109371006B - 一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法 - Google Patents

一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3作为生产菌株，LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为7.75U/g，酶活回收率达到110.85％；LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为9.54U/g，酶活回收率达到101.82％。在相同的转化时间内，以0.5M蔗糖和0.5M葡萄糖为底物连续操作11次，氨基化树脂LX‑1000EA固定化SPase保持39.15％的转化率，94％的残留酶活；氨基化树脂LX‑1000HA固定化SPase保持42.5％的转化率，91％的残留酶活。结果表明，该固定化方法操作简单，固定化酶酶活没有损失，且应用效果很好，具有很高的工业化应用潜力。

Description

一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPase)具有水解和转苷作用，能以蔗糖为底物，将蔗糖水解为1-磷酸葡萄糖和果糖，且可将葡萄糖基转移至不同受体，是一种很有潜力的糖基化酶。目前广泛应用于曲二糖、熊果苷、L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷、多酚类的糖基化和α-葡萄糖基甘油的制备。
由于游离的蔗糖磷酸化酶存在无法重复利用、使用效率低的缺点，人们尝试通过物理或化学的方法将SPase固定化，使其具备高活力并可以重复利用，从而实现生产的连续化、自动化、可控化；同时，使用固定化的酶还可以使得产品易于分离和精制。2011年，KarelDe Winter等将热处理后的蔗糖磷酸化酶(Spase)加入到四氯化碳中，然后与树脂混合，填充装柱，酶的固定化率达到60％，利用固定化酶水解蔗糖制备α-葡萄糖-1-磷酸，产物α-葡萄糖-1-磷酸的收率为86％。2013年，张奥以戊二醛和三羟甲基为交联剂，实现长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶在壳聚糖微球载体上的固定化。2017年，Juan M.Bolivar等通过将蔗糖磷酸化酶与聚阳离子结合模块Zbasic2融合，实现了非共价固定化蔗糖磷酸化酶，应用该固定化酶制备葡萄糖基甘油产物的产率为85％以上，固定化酶的活力为游离酶的酶活的90％以上，其载体聚阳离子结合模块Zbasic2可再生。但是，由于以上方法存在固定化酶活回收率较低或价格昂贵等问题，因此，获得一种酶活回收率高且应用效果很好的固定化方法以实现工业化生产具有非常重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的是提供一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，所述固定化酶的方法步骤如下：
(1)将产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌经发酵培养，离心收集上清，制得蔗糖磷酸化酶粗酶液；
(2)以5～15g氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA为固定化载体，加入35～45mL、0.1M、pH 8的PBS缓冲液，在25～28℃温度下，200rpm震荡15min后在室温静置0.5～1.5h，用滤纸过滤后加入45～55mL的2％戊二醛中，在25～28℃温度下，200rpm震荡4～6h，用蒸馏水洗3次，洗去残留戊二醛，过滤得到处理后的氨基化树脂LX-1000EA和LX-1000HA；
(3)称取1g步骤(2)中处理过的氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA，加入步骤(1)中得到的蔗糖磷酸化酶，加酶量为4～19U/g，于25～28℃，100rpm震荡固定4～24h，得到LX-1000EA固定化SPase和LX-1000HA固定化SPase。
本发明以产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌为重组菌，重组枯草芽孢杆菌是本研究室前期构建的枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3(吴敬，吴丹，王淼淼，张康：一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，CN107236696A)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是以枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3为生产菌株，在LB培养基中37℃培养8～10h，然后转接至TB发酵培养基中30℃、200rpm培养48h。
在本发明的一种实施方式中，所述加酶量为4U/g、6U/g、7U/g、9U/g、11U/g或19U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述固定时间为4h、8h、12h、16h、20h或24h。
在本发明的一种实施方式中，所述戊二醛为50mL的2％戊二醛。
本发明的另一个目的是提供一种应用固定化蔗糖磷酸化酶制备曲二糖的方法，将固定化蔗糖磷酸化酶加入到5～15mL含蔗糖和果糖的底物溶液中，在50℃、100rpm的条件下反应45～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述底物溶液是用pH7.0的MOPS缓冲液配置0.5M葡萄糖和0.5M蔗糖得到的。
本发明的有益效果：
本发明构建一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，蔗糖磷酸化酶经本发明固定化方法固定化后，LX-1000EA固定化SPase酶活回收率为110.85％，酶活为7.75U/g。LX-1000HA固定化SPase酶活回收率依然可达到101.82％，酶活为9.54U/g。
将蔗糖磷酸化酶固定化后可以反复回收利用，在实现连续化生产的同时还能简化下游的分离纯化等操作，具有很大的优越性。应用所得固定化蔗糖磷酸化酶生产曲二糖时，第1个批次转化后，利用LX-1000EA固定化SPase生产的曲二糖的转化率为41.23％，利用LX-1000HA固定化SPase生产的曲二糖的转化率为46.62％。连续转化11个批次后，氨基化树脂LX-1000EA固定化SPase的残留酶活为94％，生产曲二糖的转化率保持在39.15％；氨基化树脂LX-1000HA固定化SPase的残留酶活为91％，生产曲二糖转化率保持在42.5％。因此，该固定化方法操作简单易行，可以获得高酶活回收率的固定化蔗糖磷酸化酶，能够为工业化应用提供参考。
附图说明
图1固定化时间对酶活回收率的影响。其中A表示LX-1000HA固定化SPase；B表示LX-1000HA固定化SPase。
图2加酶量对酶活回收率的影响。其中A表示LX-1000HA固定化SPase；B表示LX-1000HA固定化SPase。
图3固定化酶生产曲二糖的操作稳定性。其中A表示LX-1000HA固定化SPase；B表示LX-1000HA固定化SPase。
具体实施方式
LX-1000EA和LX-1000HA的生产厂家：西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基及缓冲液如下：
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。
TB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L，KH2PO42.31g/L。
PBS缓冲液：NaCl 9g/L，NaH2PO4·2H2O 31.2g/L，Na2HPO4·12H2O 71.632g/L，调节pH 8.0。
MOPS缓冲液：3-(N-吗啉)丙磺酸10.463g/L，NaOH 2g/L，调节pH 7.0。
曲二糖转化率的计算公式：
Figure BDA0001902466380000031
固定化酶酶活回收率的计算公式：
酶活回收率(％)＝固定化酶酶活/加入游离酶酶活×100％
实施例1：摇瓶发酵产酶
(1)发酵培养
将重组枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3菌株(吴敬，吴丹，王淼淼，张康：一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，CN107236696A)接种于LB培养基中，在37℃下培养8-10h，以5％接种量转接至TB发酵培养基中，33℃、200rpm恒温培养48h。培养结束后，将所得发酵液在8000rpm，4℃条件下离心15min、收集上清液即为SPase粗酶液。
(2)酶活测定
酶活测定方法：将1mL的5％(w/v)蔗糖溶液和0.9mL的50mmol/L、pH 7.5的磷酸缓冲液充分混匀，在55℃预热10min后，加入100μL的粗酶液，反应10min后加入3mL DNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15mL，540nm下测吸光度。
空白对照：将1mL的5％(w/v)蔗糖溶液和0.9mL的50mmol/L、pH 7.5的磷酸缓冲液充分混匀，在55℃预热10min后，加入100μL的灭活的粗酶液，反应10min后加入3mL DNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15mL，540nm下测吸光度。
酶活单位定义：在上述酶活测定方法下，每分钟水解蔗糖生成1μmol果糖所需要的酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(U)。
实施例2：氨基化树脂的预处理
取10g氨基化树脂LX-1000EA，加入40mL、0.1M、pH 8.0的PBS缓冲液中，放置于25℃恒温水浴摇床，200rpm、15min后室温静置1h，用滤纸过滤后称取10g树脂加入到50ml的2％戊二醛中，在25℃恒温水浴摇床，200rpm交联处理5h，然后用蒸馏水洗3次，洗去残留的戊二醛，过滤得到处理后的氨基化树脂LX-1000EA，放置冰箱保存备用。
用同样的方法处理氨基化树脂LX-1000HA。
实施例3：固定化时间对固定化酶酶活回收率的影响
取1g实施例1中得到的粗酶液，加入至实施例2处理后的1g氨基化树脂LX-1000EA或氨基化树脂LX-1000HA中，放置于25℃恒温水浴摇床，100rpm条件下分别培养4h、8h、12h、16h、20h或24h。培养结束后，用去离子水清洗固定化酶2～3次，抽滤后得到LX-1000EA固定化SPase或LX-1000HA固定化SPase，称取0.1g LX-1000EA固定化SPase或LX-1000HA固定化SPase，利用实例1中的酶活测定方法测定酶活，并计算酶活回收率。
结果如图1所示，LX-1000EA固定化SPase和LX-1000HA固定化SPase的酶活回收率均随着固定化时间的增加呈现先升高后降低的趋势，当LX-1000EA固定化时间为20h时酶活回收率最大；当LX-1000EA固定化时间为16h时酶活回收率最大。
实施例4：加酶量对固定化酶酶活回收率的影响
在实施例2处理后的1g氨基化树脂LX-1000EA中加入实施例1中获得的粗酶液，加酶量为4U/g、6U/g、7U/g、9U/g、11U/g或19U/g，放置25℃的恒温水浴中摇床培养，转速为100rpm，培养时间为20h。
在实施例2处理后的1g氨基化树脂LX-1000HA中加入实施例1中获得的粗酶液，加酶量为4U/g、6U/g、7U/g、9U/g、11U/g或19U/g，放置25℃的恒温水浴中摇床培养，转速为100rpm，在相同条件下分别培养16h。
培养结束后，用去离子水清洗固定化酶2～3次，抽滤后得到LX-1000EA固定化SPase或LX-1000HA固定化SPase，称取0.1g LX-1000EA固定化SPase或LX-1000HA固定化SPase，利用实例1中的酶活测定方法测定酶活，并计算酶活回收率。
结果如图2所示，当处理后的氨基化树脂LX-1000EA加酶量为7U/g，固定20h时得到的LX-1000EA固定化SPase酶活回收率为110.85％，酶活为7.75U/g。当处理后的氨基化树脂LX-1000HA加酶量为9U/g，固定16h时得到的LX-1000HA固定化SPase酶活回收率依然可达到101.82％，酶活为9.54U/g。
实施例5：固定化细胞的应用
将实施例4中所制备的LX-1000EA固定化SPase(加酶量为7U/g)或LX-1000HA固定化SPase(加酶量为9U/g)用于催化蔗糖和果糖生产曲二糖；用pH7.0的MOPS缓冲液配置0.5M葡萄糖和0.5M蔗糖的底物溶液；将2g固定化酶加入到10mL底物溶液中，在温度为50℃，摇床转速为100rpm的条件下反应48h。反应结束后，取1mL上清液作为样品测定曲二糖的转化率。反应后的固定化酶用去离子水反复清洗2-3次后过滤，过滤所得的固定化酶加入到10ml的新鲜底物溶液中，继续在相同条件下反应。
反应体系中的蔗糖、葡萄糖、果糖以及曲二糖的量采用HPLC测定。色谱条件为：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH2-50 4E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为35℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应曲二糖的浓度。
如图3所示，当转化第1次时LX-1000EA固定化SPase的曲二糖转化率为41.23％，LX-1000HA固定化SPase的曲二糖转化率为46.62％。当连续转化11个批次时，氨基化树脂LX-1000EA固定化SPase的曲二糖转化率保持在39.15％，残留酶活为94％；氨基化树脂LX-1000HA固定化SPase的曲二糖转化率保持在42.5％的，残留酶活为91％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种固定化蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌经发酵培养，离心收集上清，制得蔗糖磷酸化酶粗酶液；
（2）以5~15g氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA为固定化载体，加入35~45mL、0.1 M、pH 8的PBS缓冲液，在25~28℃温度下，200 rpm震荡15 min后在室温静置0.5~1.5 h，用滤纸过滤后加入45~55ml的2%戊二醛中，在25~28℃温度下，200 rpm震荡4~6 h，用蒸馏水洗3次，洗去残留戊二醛，过滤得到处理后的氨基化树脂LX-1000EA和LX-1000HA；
（3）称取1 g步骤（2）中处理过的氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA，加入步骤（1）中得到的蔗糖磷酸化酶，加酶量为4~11 U/g，于25~28℃，100 rpm震荡固定4~24 h，得到LX-1000EA固定化SPase和LX-1000HA固定化SPase。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是以枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3为生产菌株，在LB培养基中35~40℃培养8~10h，然后转接至TB发酵培养基中25~35℃培养45~50h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加酶量为4 U/g、6 U/g、7 U/g、9 U/g或11 U/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定时间为4 h、8 h、12 h、16 h、20 h或24 h。
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