CN103695447B - 一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型内酰胺类抗生素合成酶，根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列（Genebank：AY919310.1），有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。本发明还公开了所述新型内酰胺类抗生素合成酶的优化编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶在合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛合成中的应用。该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低、应用广泛等优点，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术，具体的说涉及一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素类和头孢菌素等类抗生素，是目前国内外主要使用的抗生素。该类抗生素在医药产业中占有重要的份额，约占全球抗生素年销售额的65％以上。2012年5月，中国市场调查网对医院头孢类抗菌素用量预测：中国目前医药市场容量约为1200亿元人民币，其中头孢菌素类抗生素约为130亿元左右。国外头孢菌素类抗生素药费占抗感染药费总额的40％（薛雨等，中国抗生素杂志，36(2)：86-92，2011．）。

国内抗生素制药企业在高端品种和前沿技术方面的创新能力与发达国家相比存在较大差距，特别是酶法氨苄西林、阿莫西林、头孢菌素等需要加快技术创新产业化。目前采用的化学合成法生产成本高，反应条件苛刻，低温反应，能耗大，使用大量的有机溶剂，污染严重。与之相比，酶法能在更为温和的条件下酶促合成半合成青霉素、头孢菌素，在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，被称为绿色工艺，并且经过多年的研究，采用酶法合成阿莫西林、头孢氨苄等品种的工艺已经成熟，产品收率达到或超过了传统的化学合成法，随着各国对环保问题的重视，要求的提高，酶法技术替代化学法制备抗生素已经势在必行。

酶法合成内酰胺类抗生素目前应用主要为青霉素酰化酶（E.C.3.5.1.11），又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。应用最广的为青霉素G酰化酶，即PGA，主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β-内酰胺类抗生素（Chandel,A.K.et al.Enzyme and Microbial technology,42,199-207，72008）。

青霉素酰化酶最早是利用其催化水解反应得到中间体6-APA和7-ACA，而该反应为可逆反应，所以可以利用该特性进行半合成青霉素和头孢菌素,具体的是利用青霉素酰化酶催化酰基侧链和β-内酰胺核的缩合反应。

酶法合成β-内酰胺类抗生素的产量取决于三方面：：(1)β-内酰胺类化合物的合成反应；(2)活化的酰基供体（侧链）的水解反应；(3)合成的抗生素（产物）的水解反应。这三方面的反应决定了最终的反应收率和产率。β-内酰胺类抗生素的水解反应和合成反应的相对速率，一方面可以通过合成反应条件的调整进行调节，另一方面可以通过改进合成用酶从而 实现有利合成反应的方面。

Alkema等将E．coli PGA进行突变，结果E.coli PGA的β亚基24位上的苯基丙氨酸突变为丙胺酸，该酶在合成氨苄青霉素及头孢菌素的过程中，表现出较高的合成／水解相对速率。但该酶的酶活活性较低，不具有工业化的效果（Alkema W B L,et al.Eur J Biochem,269：2093-2l00,2002）。专利CN101177688提供了一种巨大芽孢杆菌PGA的突变体，该酶可以促进合成反应但其合成活性较低，也不具备工业化潜力。专利CN102264904提供了一种大肠杆菌青霉素酰化酶突变体，该酶具有一个或者多个突变位点，该酶可以用于阿莫西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄或者头孢拉定的合成，其在阿莫西林合成中6-APA和HPGME的摩尔比最优可以达到≤1.02，而6-APA的转化率更优选的可以达到≥99%，但该酶的活性不得而知。

相对与大肠杆菌青霉素酰化酶，无色杆菌属青霉素酰化酶具有更高的合成/水解比，而且该酶特性稳定，耐受较高温度，最高可以耐受65℃，具有很好的工业化应用前景（K.Plhackova et al.Applied Microbial Technology,32:507-516,2001；Skrob et al.Enzyme Microbial Technology32:738-744,2003；S,et al.Appl Microbiol Biotechnol May 15[Epub ahead of print],2013）。专利CN101563459提供一种由无色杆菌属CCM4824克隆到的青霉素酰化酶基因，将其转化到了大肠杆菌中，构建成为工程菌。通过后期专利CN101802212提供工程菌制备青霉素酰化酶的方法，该酶可以用于阿莫西林、头孢氨苄的合成，其在阿莫西林合成中6-APA和HPGME的摩尔比更优可以达到1.5-1.8之间，头孢氨苄合成中7-ADCA和PGME的摩尔比更优的在1.5-1.7之间；相应转化率未提及，其与CN102264904提及的大肠杆菌青霉素酰化酶存在一定差距，并且目前对于无色杆菌属青霉素酰化酶的改造工作尚未见到相关报道，人们希望能够对原始无色杆菌属青霉素酰化酶进行分子改造优化，以构建一种性能更好并具有好的工业化应用前景的内酰胺类抗生素合成用酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型内酰胺类抗生素合成酶、其编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶的应用,该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低等优点，具有很好的工业化应用前景。

本发明的目的之一是按如下的技术方案实现的：

一种新型内酰胺类抗生素合成酶的编码基因，其特征是，其为下述核苷酸序列之一：

（a）具有SEQ ID NO:3所示的DNA序列；

（b）与SEQ ID NO:3所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质；

（c）在高严谨条件下可以与SEQ ID NO:3所限定的DNA序列杂交，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质的DNA序列。

SEQ ID NO:3所示DNA序列是按如下步骤设计的：

1）根据Genebank提供的无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：1，Genebank：AY919310.1），在该序列中引入3个突变位点（将330位的苯丙氨酸替换为丙氨酸、将415位的赖氨酸替换为精氨酸、将770位的亮氨酸替换为苯丙氨酸），得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

2）根据SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，使用在线设计工具Jcat反向设计出核苷酸序列，然后根据宿主大肠杆菌内基因高效表达所需的优选密码子和G+C碱基含量，对设计出的核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列（如SEQ ID NO:3所示）与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶的核苷酸序列（如SEQ ID NO:4所示）相比，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中稀有密码子的数量从55个降低到了2个，G+C碱基含量从68.75%下降到了57.25%；同时SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列去除了原有序列中间的BamHI酶切位点。

本发明的目的之二是按如下的技术方案实现的：

一种新型内酰胺类抗生素合成酶，其是在如SEQ ID NO:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。

优选的，所述新型内酰胺类抗生素合成酶，其是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

所述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是在SEQ ID NO:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下三个位点的突变：第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸。

更优选的，所述新型内酰胺类抗生素合成酶，其是在所述SEQ ID NO:2所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。

本发明的目的之三是按如下的技术方案实现的：

含有所述新型内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组载体。

进一步的，所述重组载体所用到的质粒为PET系列诱导型载体，优选PET28质粒。

所述重组载体是按如下步骤获得的：

1）将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成，获得ASPGA基因；

2）将所述PET28质粒和所述ASPGA基因分别使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切体系进行酶切，分别得到ASPGA基因片段和PET28质粒片段； 

3）使用T4连接酶对ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接，将连接后的产物转化到宿主菌中，然后涂布到LB培养抗性平板，然后挑取生长出的阳性克隆接种到LB液体培养基培养后，提取质粒即得到所构建的重组载体——表达载体PET28-ASPGA。

本发明的目的之四是按如下的技术方案实现的：

含有所述内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组菌株。

进一步的，构建所述重组菌株所用到的宿主菌为E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)。

在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)感受态细胞悬液中加入所述重组载体混匀，然后经过冷却、热激、冷却、复苏等步骤，完成转化，吸取转化后的细胞涂布加有抗生素的平板，倒置培养，生长出的菌株即为重组菌株——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA或转化体JM109(DE3)/PET28-ASPGA。

本发明的重组菌株经诱导表达后，采用离心、超声破壁、加热、pH调整、盐析等步骤进行纯化，之后进行固定化，即得到固定化酶。

本发明的目的之五是按如下的技术方案实现的：

本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在内酰胺类抗生素合成中的应用。

本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在阿莫西林合成中的应用。

本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在头孢菌素合成中的应用。

本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在头孢克洛合成中的应用。

本发明所述新型内酰胺抗生素合成酶经上述处理后用于内酰胺抗生素的酶法合成中，主要优点：该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低等优点，具有很好的工业化应用前景。

主要表现在： 

（1）在阿莫西林合成中：使用6-APA和HPGME·HCL为原料进行合成，其中6-APA与 HPGME·HCL的摩尔比范围为1.0-3.0之间，最优的在1.0-1.02，6-APA转化率≥98％，最优的≥99％。

（2）在头孢氨苄合成中：使用7-ADCA和PGME·HCL为原料进行合成，其中7-ADCA和PGME·HCL的摩尔比范围为1.0-3.0之间，最优的在1.05-1.2，7-ADCA转化率≥97％，最优的≥98％。

（3）在头孢克洛合成中：使用7-ACCA和PGME·HCL为原料进行合成，其中7-ACCA和PGME·HCL的摩尔比范围为1.1-3.0之间，最优的在1.2-1.3，7-ADCA转化率≥97％，最优的≥98％。

附图说明

图1是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组载体

图2是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化阿莫西林合成的HPLC谱图。

图3是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化头孢氨苄合成的HPLC谱图。

图4是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化头孢克洛合成的HPLC谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，但并不意味着以任何方式作为对本发明的限制。

缩写说明：PGA：青霉素G酰化酶；6-APA：6-氨基青霉烷酸；7-ADCA：7-氨基去乙氧基头孢烷酸；7-ACCA：7-氨基-3-氯-3-头孢环-4-羧酸；HPGME·HCL：D-对羟基苯甘氨甲酯酸盐酸盐；PGME·HCL：D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐。

实施例1：基因设计及基因合成

（1）基因设计：

（1.1）根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列（SEQ ID NO：1，Genebank：AY919310.1），将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第415位赖氨酸替换为精氨酸，第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸，这些位点引入突变位点后，得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，然后利用在线设计工具Jcat（http://www.jcat.de/）反向设计出核苷酸序列；

（1.2）根据宿主大肠杆菌基因表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G＋C碱基含量，优化上述反向设计出的核苷酸序列，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该序列与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶核苷酸序列（如SEQ ID NO:4所示）相比：①大肠杆菌稀有密码子从55个降低到了2个；②G＋C碱基含量由68.75％下降到57.25％；③优化设 计过程中去除了序列中间出现的BamHⅠ酶切位点，有利后期基因操作。通过上述优化设计后，有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因。

（2）基因合成：根据SEQ ID NO:3所示基因序列进行全基因合成（由生工生物工程（上海）有限公司完成），获得ASPGA基因。

实施例2：表达载体PET28-ASPGA（即重组载体）的构建

（1）对实施例1获得的ASPGA基因使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切体系如下：

其中ASPGA基因的浓度为2μg/5μL；

将上述酶切体系在37℃下保温4h，然后采用DNA凝胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）纯化得到目的ASPGA基因片段。

（2）对PET28质粒（Novagen公司）使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切体系如下：

其中PET28质粒的浓度为2μg/5μL；

将上述酶切体系在37℃下保温4h，然后采用DNA凝胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）纯化得到目的PET28质粒片段。

（3）使用T4连接酶对所得ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接，连接体系如下：

将上述连接体系在16℃下保温4h，然后采用热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，然后涂布到LB培养抗性平板，37℃下培养8～10h。

上述热激方法的具体操作步骤参照J.萨姆布鲁克等，《分子克隆试验指南第三版》第1章方案25或方案26进行。

上述涂布到LB培养抗性平板时所用到的LB抗性平板的培养基的配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章。

（4）随机挑取步骤（3）培养的抗性平板上生长的阳性克隆菌落，接种到LB液体培养基，37℃、200rpm条件下培养8～10h后，使用质粒快速提取试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）提取质粒，即得到所构建的表达载体PET28-ASPGA（见图1）。

上述LB液体培养基的配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章。

实施例3：转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA（即重组菌株）的构建

（1）挑取大肠杆菌BL21（DE3）单菌落接种到LB试管，37℃下震荡培养8～10h后，取培养液0.5ml加入到含50mlLB的三角瓶中，37℃下剧烈震荡培养约2h使菌体生长到对数前期。

（2）将处于生长对数前期的大肠杆菌培养液转移到用冰预冷的聚丙烯管（容量50ml）中，在冰上放置10min后，4℃、4000rpm低温离心，然后弃去上清，加入6ml用冰预冷的CaCl₂溶液（浓度0.1mol/L）重悬菌体沉淀，然后在冰上放置30min，再次4℃、4000rpm低温离心，然后弃去上清，加入1.2ml冰预冷的CaCl₂溶液（浓度0.1mol/L）重悬菌体沉淀，即得大肠杆菌感受态细胞。

如果需要制备于-70℃保存的感受态细胞，则用含20%甘油的CaCl₂溶液（浓度0.1mol/L）代替上述CaCl₂溶液（浓度0.1mol/L）。

所制备的感受态细胞于4℃下放置5～24h后可用于转化。

（3）取200μl感受态细胞悬液，加入实施例2所制备的重组质粒（体积＜10μl，所含重组质粒＜50ng），轻轻混匀，在冰上放置30min，然后放42℃热水浴静止热激90s，再立即放冰上冷却，然后加入500μl的LB液体培养基（配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章），混匀后放37℃低速摇床复苏45min，然后吸取转化后的菌体细胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板上（配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章），放37℃下倒置培养，生长出的菌落即为转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA。

实施例4：转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA的诱导表达

挑取上述转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA的单菌落于含Kan（浓度50μg/ml）的LB液体培养基（配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章）中，37℃、200r/min条件下培养8～10h后成为活化种子，然后将活化种子以2%的接种量接种到M9培养基中（装液量为50ml/250ml），23℃、200r/min条件下培养14h后，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）使其终浓度为0.05mM，进行诱导表达，继续培养12h，得菌液。

上述M9培养基的配制如下：

①配制1M的MgSO₄:MgSO₄·7H₂O 2.46g，加双蒸水10ml溶解，高压灭菌备用；

②配制1M的CaCl₂:CaCl₂·6H₂O 2.191g，加双蒸水10ml溶解，高压灭菌备用；

③配制5×M9盐溶液：Na₂PO₄·7H₂O 12.8g、KH₂PO₄ 3.0g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 1.0g，加双蒸水200ml溶解，121℃灭菌15分钟备用；

④配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20ml溶解，0.22微米滤器过滤除菌；

量取上述5×M9盐溶液200ml、1M的MgSO₄ 2ml、20%的葡萄糖溶液20ml、1M的CaCl₂ 0.1ml混匀，然后加灭菌双蒸水至1000ml，即为M9培养基。

实施例5：内酰胺类抗生素合成酶活性测定

将实施例4得到的菌液离心，收集菌体，然后加入与菌液等体积的磷酸盐缓冲液（0.02M，PH8.0）重悬，使用超声细胞破壁仪破壁20min，然后离心取上清，即为粗制酶液，备用。

采用碱滴定方法测定上述粗制酶液中的酶活性：

仪器用具：分析天平，机械搅拌器，PH计（精度±0.1PH），酶水解反应瓶（四口烧瓶）。

试剂溶液： 

氢氧化钠滴定液：C(NaOH)＝0.1mol/L；

磷酸盐缓冲液：称取KH₂PO₄0.68g于250ml纯化水中得溶液Ⅰ；称取K₂HPO₄·3H₂O2.28g于500ml纯化水中得溶液Ⅱ；用溶液Ⅰ调节溶液Ⅱ使其PH值为8.0，即为磷酸盐缓冲液；

青霉素钾盐溶液(10%)：称取青霉素钾盐50.0g，溶于约400ml的磷盐缓冲液中，并用氢氧化钠滴定液调节PH至8.0，然后用磷酸盐缓冲液定容至500ml(临用时配制)。

测定步骤：精密量取制备好的粗制酶液5ml、预热至28℃的青霉素钾盐溶液（10%）100ml于酶水解反应瓶中，28℃下开始反应并不断搅拌，反应过程中用0.1mol/L氢氧化钠滴定液保持反应液PH为8.0，同时记录10min内氢氧化钠滴定液消耗的体积。

酶活性计算： 

式中：V表示测定10min内氢氧化钠滴定液消耗量，单位为ml；C表示氢氧化钠滴定液的浓度，单位为mol/L；1000表示折微摩尔浓度换算系数；t表示测定酶反应时间，单位为min；m表示加入的粗制酶液的体积（单位为ml）或表示固化酶的质量（单位为g）；

酶活性定义：单位体积（ml）的酶液或单位质量的（g）的固定话酶1min内每水解1μmol青霉素G为1个单位（U）。

使用上述公式，计算得所制备的粗制酶液的活性为5U/ml。

实施例6：内酰胺类抗生素合成酶的分离纯化及固定化

（1）分离纯化：取实施例5制备的粗制酶液1L，使用0.01M的盐酸调整PH至5.5，于50℃下保温30min，然后离心除去沉淀；在上清液中加入15%（质量体积比）的硫酸铵，充分混合后离心除去沉淀，然后在上清液中再次加入15%（质量体积比）的硫酸铵，充分混合后离心收集沉淀；将沉淀溶解于200ml磷酸盐缓冲液（0.2M，PH8.0）中，即得到浓缩酶液；

使用实施例5中给出的测定方法和计算公式，计算出浓缩酶液的活性为18U/ml。

（2）载体活化：

（2.1）量取戊二醛（浓度为50%）40ml、磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）4.76g，加去离子水溶解，然后定容至1L；然后用40%磷酸调节PH至7.8～8.2；

（2.2）称取LX-1000HA型载体（西安蓝晓科技有限公司）250g加入到（2.1）步所配制的溶液中，在25℃、PH7.8～8.2条件下搅拌活化1h后，过滤收集载体，用去离子水冲洗后滤干；

（3）固定化：取浓缩酶液200ml，加入磷酸盐使其终浓度为0.4M，并调节PH至6.8～7.2，然后加入活化好的LX-1000HA载体20g，于25℃、150rpm条件下搅拌固定化24h，真空抽滤收集固定化酶,然后用2倍体积去离子水冲洗3～5遍，过滤收集得到固定化酶。

使用实施例5中给出的测定方法和计算公式，计算出固定化酶（湿重）的活性为30U/g。

实施例7：内酰胺类抗生素合成酶固定化酶在阿莫西林合成中的应用

试验一：在四口烧瓶中加入6.25g(28.9mmol)6-APA、6.29g(28.9mmol)HPGME·HCL和75ml蒸馏水，使用40％氢氧化钠调节PH到6.2～6.5，控制温度在20℃；加入5g实例6制备的固定化酶，进行搅拌混合，开始反应并计时，反应过程中使用40%氢氧化钠控制PH在6.2～6.5之间，从45min开始，每隔15min取样进行高压液相色谱（HPLC）检测，测定反应液中6-APA浓度，计算转化率。

上述HPLC检测方法如下：

（1）色谱条件：

高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱；柱温35℃；

流动相A：30%乙腈，流动相B：50mM NaH₂PO₄，PH=5；

0～2min，A∶B=2∶98；2～10min，A∶B=10∶90；流速为1ml/min；

检测波长：210nm；

进样：20μl。

（2）样品制备：取500μl反应液，加水稀释定容至25ml，然后取加水稀释过的反应液500μl加流动相B定容至25ml，过0.45μm滤膜过滤后，取滤液进样。

检测结果如表1：

表1：阿莫西林合成中6-APA浓度检测结果（6-APA/HPGME·HCL摩尔比＝1∶1）

试验二：按照试验一给出的条件，仅仅将HPGME·HCL用量增加至6.42g（29.5mmol），其它条件不变，然后进行反应并测定反应液中6-APA浓度，结果如表2所示：

表2：阿莫西林合成中6-APA浓度检测结果（6-APA/HPGME·HCL摩尔比＝1∶1.02）

注：“－”表示未检出。

6-APA的初始浓度是指加入固定化酶刚刚开始反应时，反应体系内6-APA的浓度。

通过以上两次反应可以得出以下结论：本发明提供的内酰胺类抗生素合成酶在使用6-APA和HPGME·HCL为原料进行阿莫西林合成时，6-APA与HPGME·HCL的摩尔比范围为1.0～1.02， 6-APA转化率≥98％，最优的≥99％。而且通过HPLC检测，无其它杂质物质出现（见图2），证明该酶可以很好的应用到阿莫西林合成中，具有巨大的工业化应用价值。

实施例8：内酰胺类抗生素合成酶固定化酶在头孢氨苄合成中的应用

试验一：在四口烧瓶中加入25g(116.7mmol)7-ADCA、25g实例6制备的固定化酶和200ml蒸馏水，进行搅拌混合，控制温度在20℃；使用40%氢氧化钠控制PH在6.8～7.2之间；称取25.8g(127.9mmol)PGME·HCl，在30min内分5次加入反应体系中，反应过程中使用40％氢氧化钠和0.1M盐酸调节PH在6.9～7.2之间；45分钟后，每隔15分钟取样进行高压液相色谱（HPLC）检测，测定反应液中7-ADCA浓度，计算转化率。

上述HPLC检测方法如下：

（1）色谱条件：

高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱；柱温35℃；

流动相A:甲醇，流动相B：50mM NaH₂PO₄，PH=5；

0～2min，A∶B=5∶95；2～20min，A∶B=25∶75；20～30min，A∶B＝2∶98；流速为1ml/min；

检测波长：225nm；

进样：20μl。

（2）样品制备：取200μl反应液，加水稀释定容至25ml，然后取加水稀释过的反应液1250μl加流动相B定容至25ml，过0.45μm滤膜过滤后，取滤液进样。

检测结果如表3：

表3：头孢氨苄合成中7-ADCA浓度检测结果（7-ADCA/PGME·HCL摩尔比＝1∶1.1）

试验二：按照试验一给出的条件，仅仅将PGME·HCL用量降低至24.71g(123.7mmol)，其它条件不变，然后进行反应并测定反应液中7-ADCA浓度，结果如表4所示：

表4：头孢氨苄合成中7-ADCA浓度检测结果（7-ADCA/PGME·HCL摩尔比＝1∶1.05）

7-ADCA的初始浓度是指加入固定化酶刚刚开始反应时，反应体系内7-ADCA的浓度。

通过以上两次反应可以得出以下结论：本发明提供的新型内酰胺类抗生素合成酶在使用7-ADCA和PGME·HCL为原料进行头孢氨苄合成中，其中7-ADCA与PGME·HCL的最佳摩尔比范围为1.05～1.1，7-ADCA转化率≥97％，最优的≥98％。而且通过HPLC检测，无其它杂质物质出现（见图3），证明该酶可以很好的应用到头孢氨卞合成中，具有巨大的工业化应用价值。

实施例9：内酰胺类抗生素合成酶固定化酶在头孢克洛合成中的应用

试验一：在四口烧瓶中加入13.9g(59.25mmol)7-ACCA、加入25g实例6制备的固定化酶和200ml蒸馏水，进行搅拌混合，控制温度在20℃；称取14.34g(71.11mmol)PGME·HCL，在30分钟内分5次加入反应体系中，反应过程中使用40％氢氧化钠和0.1M盐酸调节PH在6.9～7.2之间。45分钟后，每隔15分钟取样进行高压液相色谱（HPLC）检测，测定反应液中7-ACCA浓度，计算转化率。

上述HPLC检测方法如下：

（1）色谱条件：

高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱；柱温35℃；

流动相A:甲醇，流动相B：50mM NaH₂PO₄，PH=5；

0～2min，A∶B=5∶95；2～30min，A∶B=25∶75，30～35min，A∶B=5∶95；流速为1ml/min；

检测波长：225nm；

进样：20μl。

（2）样品制备：取500μl反应液，加水稀释定容至25ml，然后取加水稀释过的反应液500μl加流动相B定容至25ml，过0.45μm滤膜过滤后，取滤液进样。

检测结果如表5：

表5：头孢克洛合成中7-ACCA浓度检测结果（7-ACCA/PGME·HCL摩尔比＝1∶1.2）

试验二：按照试验一给出的条件，仅仅将PGME·HCL用量增加至15.53g(77.03mmol)，其它条件不变，然后进行反应并测定反应液中7-ACCA浓度，结果如表6所示：

表6：头孢克洛合成中7-ACCA浓度检测结果（7-ACCA/PGME·HCL摩尔比＝1∶1.3）

7-ACCA的初始浓度是指加入固定化酶刚刚开始反应时，反应体系内7-ACCA的浓度。

通过以上两次反应可以得出以下结论：本发明提供的新型内酰胺类抗生素合成酶在使用7-ACCA和PGME·HCL为原料进行头孢氨苄合成中，其中7-ACCA与PGME·HCL的最佳摩尔比范围为1.2～1.3，7-ACCA转化率≥97％，最优的≥98％。而且通过HPLC检测，无其它杂质物质出现（见图4），证明该酶可以很好的应用到头孢氨卞合成中，具有巨大的工业化应用价值。

以上实施例1～9给出了SEQ ID NO:2所示的合成酶的基因设计、重组载体的构建、重组菌株的构建、酶的固定化以及在阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛合成中的具体实施方式。对于本发明所提及的在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上所做的进一步突变（即有如下至少一个位点发生突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第790位甘氨酸替换为丙氨酸）所得到的合成酶，或者在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上做出的任意突变（即有如下至少一个位点发生突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸）所得到的合成酶，均可按照以上实施例1～9给出的方法与条件进行，并且该进一步突变的合成酶具有与SEQ ID NO:2所示的合成酶相似的活性、催 化效果、应用范围等。

序列表

<110>华北制药河北华民药业股份有限公司

<120>一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>863

<212>PRT

<213>无色杆菌属野生型青霉素酰化酶

<400>1

<210>2

<211>863

<212>PRT

<213>在野生型序列基础上进行了3个位点的突变

<400>2

<210>3

<211>2592

<212>DNA

<213>在蛋白突变序列基础上进行优化处理后的新型基因

<400>3

<210>4

<211>2592

<212>DNA

<213>无色杆菌属野生型青霉素酰化酶基因序列

<400>4

Claims (3)

1.一种新型内酰胺类抗生素合成酶，其特征是，其是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1所述新型内酰胺类抗生素合成酶在内酰胺类抗生素合成中的应用。

3.权利要求1所述新型内酰胺类抗生素合成酶在阿莫西林、头孢菌素和头孢克洛合成中的应用。