CN1253594A - 青霉素发酵发生的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于从发酵生产的N－取代青霉素化合物制备6－氨基青霉烷酸(6－APA)的改进的方法,包含将存在于发酵培养基或发酵液中的N－取代青霉素化合物萃取入有机溶剂中、反萃取N－取代青霉素化合物入水中、用青霉素酰化酶对水相的处理及通过结晶从由此得到的转化溶液中分离6－APA。进一步的改进包含将侧链萃取入有机溶剂和用特殊的结晶方法从由此得到的水相中分离6－APA。
Description
发明领域和背景
本发明涉及一种制备于6-氨基处去酰基化的青霉素的方法，其是在侧链前体存在下发酵青霉素产生菌并将发酵产生的N-取代青霉素脱酰基。
在制药工业中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)是重要的中间体，一般通过化学法或酶法对青霉素G或青霉素V的裂解(“脱酰基”)获得。
青霉素本身获自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌株的发酵。在一般的青霉素G回收方法中，将培养液过滤并洗涤，酸化滤液后将青霉素G萃取到乙酸丁酯或甲基异丁基酮中。然后溶剂用活性炭脱色，经钾盐水溶液如乙酸钾中和将青霉素G酸反萃取到水中。此溶液与足量的丁醇混合，通过蒸馏丁醇-水共沸混合物减少水分的含量，形成的青霉素G晶体通过过滤和随后的洗涤并干燥得到回收。
在另外一种方法中，通过添加乙酸钾或其它钾盐并蒸馏共沸混合物直接从有机溶液中获得晶体物质，籍此过滤晶体、用丁醇洗涤、随后过滤并干燥。对于青霉素V，可以应用同样的方法。不过，由于青霉素V在酸性条件下稳定性较好，青霉素V也可以以酸的形式而不是钾盐的形式结晶，而没有经济上无法接受的损失。
6-氨基青霉烷酸(6-APA)一般从溶解的固体青霉素G或青霉素V的溶液中获得，然后溶液分别与固定化的青霉素G酰化酶或青霉素V酰化酶接触。随后，将转化溶液投入结晶器中，在pH大约3.5-4.5时通过沉淀形成固体产品。通常，在此结晶过程中，逐步地降低pH值以避免终产品6-APA被高侧链水平的和有色的化合物污染。此外，加入溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇也可避免这种无法接受的污染。很明显，这几种6-APA的生产路线周期长而成本高。
本发明公开了一种用于生产6-APA的改进方法，其中不需要将青霉素G或青霉素V作为固体中间体分离，而且其中省去了颜色调整措施。
发明描述
本发明公开了一种用于从青霉素产生菌的发酵培养液中生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)的改进方法。
新的生产和纯化方法主要包含以下步骤：
在合适侧链前体存在下发酵青霉素产生菌。过滤发酵培养液，籍此滤液用有机溶剂萃取以获得含有大部分N-取代青霉烷酸的有机相。随后，将N-取代青霉烷酸反萃取到水中。将水相任选地剥离以除去残留溶剂。将剩余的溶液相用酶法处理产生6-APA和一种侧链，如苯氧基乙酸或苯乙酸。
然后，酸化所述溶液，6-APA从转化的水溶液中沉淀，并以一种晶状产品得到分离。不过，更优选的本发明的一个实施方案包含对转化溶液的酸化，以及随后的在通过pH转换使6-APA从水相中沉淀之前先将侧链转移到有机溶剂中的萃取。
根据本发明的方法，下列步骤得到更详细地说明。
含有N-取代青霉素的发酵培养液由任何合适的发酵方法获得，例如来自一株产黄青霉菌在合适侧链前体如苯乙酸或苯氧基乙酸存在时的发酵。
采用任何合适技术从发酵培养液分离菌体，比如离心或过滤，产生一种含有青霉素的发酵液，优选采用过滤步骤实现所述分离。任选地洗涤残留固体。
通过加一种酸，如硫酸、盐酸或硝酸或其组合，将发酵培养基或发酵液酸化到pH2-4，优选pH2.5-3范围内。然后通过萃取到有机溶剂中使N-取代青霉素从酸化的水相中分离。所用的有机溶剂优选乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。合适的去乳化剂的加入可以显著地改善萃取效果。
在本发明的一个实施方案中，部分有机溶剂可以在酸化之前加入到发酵培养基或发酵液中。已发现此法在避免沉淀方面是令人满意的，所述沉淀有时作为酸化发酵培养基或发酵液时不希望的副作用出现。沉淀是不希望的，因为它将导致产品的损失且可以引起随后的操作上的困难。
在下一步骤中，将存在于有机溶剂中的N-取代青霉素于pH6-10，优选于pH7-9反萃取到水中。用于pH调节的碱可以为比如氨水或碱金属的或碱土金属的氢氧化物溶液。
相分离之后，任选地剥离水相以去除有机溶剂。
随后，用合适的青霉素酰化酶处理水相或溶液。
已发现的产生青霉素酰化酶的生物为，例如，乙酸杆菌属(Acetobacter)、气单孢菌属(Aeromonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、丝枝霉属(Aphanocladium)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、头孢霉属(Cephalosporium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、克鲁菌属(Kluyvera)、枝动菌属(Mycoplana)、朊杆菌属(Protaminobacter)、普罗威登斯菌属(Providentia)、假单孢菌属(Pseudomonas)或黄单孢菌属(Xanthomonas)的种。在一种根据本发明的方法中，来源于巴氏乙酸杆菌(Acetobacter pasteurioanum)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、雷氏普罗威登斯菌(Providentia rettgeri)和柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citrii)的酶已经特别地得到证明是成功的。在文献中，青霉素酰化酶也被称为青霉素酰胺酶。
青霉素酰化酶不但可以以游离酶使用，而且还可以以任何一种适当的固定化酶的形式使用，例如这一点已在EP0222462和WO97/04086得到说明。
本发明优越地显示出N-取代青霉素化合物不需要以晶体形式预先分离N取代青霉素化合物，而使由发酵来源的N-取代青霉素化合物如青霉素G经过酶法转化得到6-APA是可行的。
本发明也包括直接用青霉素酰化酶处理发酵液的选择，也就是不采用在先的萃取及反萃取步骤。
由上述酶法反应产生的转化溶液含有6-APA、侧链如苯乙酸或苯氧基乙酸、有色产物和微量未转化的产物。
在本发明的一个实施方案中，产品6-APA是在酸性条件下通过结晶从转化溶液中分离的。通常，从6-APA水溶液中结晶6-APA是通过将滴定剂加入到6-APA溶液中来调节6-APA溶液的pH至酸性值，直至达到值为2.5-4.5，优选值为3-4实现的。
在本发明的一个优选的实施方案中，从水溶液中结晶6-APA是通过将6-APA溶液加入到一个结晶容器中，用合适的滴定剂保持容器中pH值保持在2.5-4.5范围内而进行的。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述的结晶是通过将6-APA溶液加入到一系列相互连接的结晶容器中，逐步调节6-APA溶液的pH到2.5-4.5范围内的终值而进行的，即，将6-APA溶液加入到第一个容器，同时第一个容器中的溶液进入到第二个容器中，同时第二个容器中的溶液进入到第三个容器中，依此类推，其中在相互连接的容器中，一定的pH范围通过合适的滴定剂得以实现，在第一容器中的起始pH值与6-APA溶液相差0.5-2个pH单位，而在最后一个容器中终点pH值为2.5-4.5。方便地，应用一系列2-6个相互连接的容器将6-APA的水溶液的pH值调节到希望的终点值。
例如，要从转化溶液中实现6-APA的结晶，可以应用一系列3-4个相互连接的结晶容器，采用一种酸性滴定剂如硫酸、盐酸和/或硝酸，将pH从8降低到3。
上述两项优选实施方案优选以连续的方式进行。
在本发明的进一步的优选实施方案中，在结晶6-APA之前，苯乙酸或苯甲基乙酸侧链通过萃取到有机溶剂中得到去除。转化溶液酸化后用有机溶剂萃取，例如乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。转化溶液的酸化用酸实现，例如硫酸、盐酸或硝酸或其组合，优选硫酸，直到pH低于3，优选低于2。已意外发现一旦应用本提取步骤也获得了对有色杂质的高去除效率。
在本发明的一个实施方案中，有机溶剂的萃取在2到4个紧密接触萃取的过程中进行，例如高强度混合器的组合，如带有离心分离的高剪切混合器，所述各过程优选以逆流方式操作。
含有苯乙酸或苯氧基乙酸和有色化合物的有机溶剂，可能含有少量的6-APA。所述6-APA可以优选在2到4个萃取阶段以逆流的方式任选地反萃取到水中。将用于反萃取的水酸化到pH低于6，最好低于3。优选的水∶溶剂比例为1∶5，更优选1∶20，最优选1∶10。由此获得的水相可以投入6-APA的结晶或返回到侧链的提取。
有机溶剂萃取侧链后，6-APA产品可以从水相中采用几种方法结晶，如在此前面已有说明的用于从水溶液中结晶6-APA的方法。
在操作的优选方式中，通过一步将6-APA溶液加入到保持理想pH值的结晶容器中或加入到一系列2-6个相互连接的、pH逐步升高的结晶容器中，将水相的pH增加到2.5-5的范围内，优选3.5-4.5。这些方法可以以连续的方式方便地操作。
当应用本发明方法的此项时，与侧链未经萃取及从中性溶液中分批方式结晶的传统方法相比，在6-APA晶体中，侧链如苯乙酸或苯氧基乙酸及有色化合物的含量较低。
所有上面提及的步骤，即萃取、反萃取以及结晶，可以以分批或分批投料的方式进行，但是由于稳定性的原因，优选的方法为连续的方式。
所得6-APA晶体通过过滤或离心得到，并在传统的连续或分批干燥器中干燥。
Claims (9)
1.用于从发酵生产的N-取代青霉素制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)的方法，包含步骤：
将存在于发酵培养基或发酵液中的N-取代青霉素化合物萃取入有机溶剂、反萃取N-取代青霉素化合物到水中、用青霉素酰化酶处理水相和通过结晶从由此得到的转化溶液中分离6-APA。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步的特征在于在通过结晶从水相中分离6-APA之前，将存在于酰化酶处理后得到的转化溶液中的侧链萃取到有机溶剂中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中萃取之前先酸化转化溶液到pH低于3。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的方法，其中6-APA从转化溶液或水相中的结晶是通过将6-APA溶液加入结晶容器进行的，其中pH值采用合适的滴定剂保持在2.5-4.5范围内。
5.根据要求1-3中任何一项所述的方法，其中6-APA从转化溶液或水相中的结晶是将6-APA溶液加入到一系列互相连接的结晶容器中进行的，通过合适的滴定剂使容器中采用一个pH范围，第一容器中的起始pH大约与6-APA溶液相差0.5-2个pH单位而在最后一个容器中的终点pH达到2.5-4.5。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其中萃取之前，将发酵培养基或发酵液酸化到pH2-4，优选到2.5-3。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在酸化所述发酵培养基或发酵液之前加入部分有机溶剂到发酵培养基或发酵液中。
8.根据权利要求1-7中任何一项所述的方法，其中在用青霉素酰化酶处理之前，先剥离水相。
9.根据权利要求1-8中任何一项所述的方法，其中有机溶剂为乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。
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