ES2224392T3 - Proceso mejorado para la produccion fermentativa de penicilina. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un procedimiento mejorado para la preparación de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de una penicilina N-sustituida producida por fermentación, que comprende las etapas de extracción del compuesto de penicilina N-sustituido tal como se presenta en el caldo o fluido de fermentación en un disolvente orgánico, de nuevo extracción del compuesto de penicilina N-sustituido en agua, tratamiento de la fase acuosa con una acilasa de penicilina y aislamiento del 6-APA a partir de la solución de conversión así obtenida por cristalización. Otras mejoras comprenden la extracción de la cadena lateral en un disolvente orgánico y el aislamiento del 6-APA a partir de la fase acuosa así obtenida empleando un procedimiento de cristalización específico.

Description

Proceso mejorado para la producción fermentativa de penicilina.

Campo y antecedentes de la invención

La invención se refiere a un proceso para la preparación de penicilinas, las cuales están desaciladas en el grupo 6-amino, mediante fermentación de un microorganismo productor de penicilina en presencia de un precursor de cadena lateral, y mediante desacilación de la penicilina N-sustituida producida por medio de la fermentación.

El ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) es un intermedio importante en la industria farmacéutica que normalmente se obtiene mediante lisis química o enzimática (desacilación) de la penicilina G o de la penicilina V.

Las penicilinas se obtienen a partir de la fermentación utilizando cepas de Penicillium chrysogenum. En un proceso típico de recuperación de la penicilina G, el caldo es filtrado y lavado, y la penicilina G se extrae en acetato de butilo o en metil isobutil cetona después de la acidificación del filtrado. El disolvente es entonces clarificado con ayuda de carbono activado y el ácido de penicilina G es extraído otra vez en agua en medio neutro con una disolución acuosa de sal potásica, como acetato de potasio. Esta solución se mezcla con una cantidad suficiente de butanol, el contenido de agua se reduce por evaporación del azeótropo butanol-agua, con lo cual se recuperan los cristales de penicilina G formados por filtración y lavado y secado posteriores.

En otro proceso, el material cristalino se obtiene directamente de la solución orgánica mediante adición de acetato de potasio o de otras sales potásicas y evaporación del azeótropo, después de lo cual los cristales se filtran, se lavan con butanol, se filtran y secan. Para la penicilina V pueden aplicarse los mismos procesos. Sin embargo, debido a la mayor estabilidad de la penicilina V en condiciones ácidas, la penicilina V también puede cristalizar en su forma ácida en lugar de la forma de sal potásica, sin que se produzcan pérdidas económicas inaceptables.

En general, el ácido 6-aminopenicilánico se obtiene a partir de una disolución de penicilina G o V sólidas disueltas, que entonces se pone en contacto con la penicilina G acilasa inmovilizada, o con la penicilina V acilasa respectivamente. La solución de conversión se alimenta a continuación en un cristalizador, donde el producto sólido se forma por precipitación a un pH de aproximadamente 3,5 a 4,5. Generalmente, en este proceso de cristalización el pH se va disminuyendo poco a poco para evitar la contaminación del producto final 6-APA con altos niveles de compuestos de cadena lateral y coloreados. Además, se adicionan solventes como metanol, etanol, alcohol isopropílico, para evitar esta contaminación inaceptable. Claramente estos tipos de vía de producción de 6-APA son largos y costosos.

La presente invención describe un método mejorado para la producción de 6-APA, donde no se requiere el aislamiento de la penicilina G o V como sólido intermedio y donde las medidas de corrección del color se vuelven superfluas.

Descripción de la invención

La presente invención describe un proceso mejorado para la producción de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de un caldo fermentativo de un microorganismo productor de penicilina.

En general, el nuevo proceso de producción y purificación comprende las siguientes etapas:

Un microorganismo productor de penicilina se fermenta en presencia de un precursor de cadena lateral adecuado. El caldo de fermentación se filtra, después de lo cual el filtrado se extrae con un disolvente orgánico, con lo que se obtiene una fase orgánica que contiene la mayor parte del ácido penicilánico N-sustituido. A continuación, el ácido penicilánico N-sustituido se vuelve a extraer en agua. La fase acuosa es sometida opcionalmente a un proceso de depuración para eliminar las trazas de disolvente. La fase restante de la solución acuosa se trata enzimáticamente para dar 6-APA y una cadena lateral, como por ejemplo ácido fenoxiacético o fenilacético.

Posteriormente, el 6-APA precipita a partir de la solución de conversión acuosa, después de la acidificación de dicha solución, y se aísla como un producto cristalino. Sin embargo, una realización preferente de la invención comprende la acidificación de la solución de conversión y la posterior extracción de la cadena lateral en un disolvente orgánico antes de la precipitación del 6-APA de la fase acuosa mediante ajuste del pH.

En el proceso según la invención se describen las siguientes etapas con mayor detalle.

Se obtiene un caldo de fermentación, que contiene la penicilina N-sustituida, mediante cualquier proceso adecuado de fermentación; esto es, a partir de la fermentación de una cepa de Penicillium chrysogenum en presencia de un precursor de cadena lateral adecuado, tal como ácido fenilacético o ácido fenoxiacético.

La biomasa se separa del caldo fermentativo mediante cualquier técnica adecuada, como centrifugación o filtración, dando un fluido de fermentación que contiene la penicilina. Preferiblemente se aplica una etapa de filtración para obtener esta separación. Opcionalmente se lavan los sólidos residuales.

El caldo o fluido fermentativo se acidifica hasta un pH dentro del rango de 2-4, preferentemente hasta un pH dentro del intervalo 2,5-3, mediante adición de un ácido, como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido nítrico, o una combinación de los mismos. La penicilina N-sustituida es entonces separada de la fase acuosa acidificada mediante extracción en un disolvente orgánico. El disolvente orgánico utilizado es, preferentemente, acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol o n-butanol. La adición de un compuesto antiemulsificante adecuado puede mejorar la extracción significativamente.

En una realización de la invención, parte del disolvente orgánico puede ser adicionado al caldo o fluido fermentativo antes de la acidificación. Se encontró que esto era satisfactorio para evitar la precipitación, a veces esta precipitación es un efecto secundario no deseado de la acidificación del caldo o fluido fermentativo. La precipitación es no deseable debido a que conduce a la pérdida de producto y puede ocasionar posteriores problemas operativos.

En paso siguiente, la penicilina N-sustituida tal como se encuentra en el disolvente orgánico se re-extrae en agua a pH de 6-10, preferentemente a pH 7-9. La base empleada para ajustar el pH puede ser, por ejemplo, amoniaco o una disolución de hidróxido alcalino o alcalinotérreo.

Después de la separación de fases, opcionalmente la fase acuosa se purifica para eliminar el disolvente orgánico.

A continuación, la fase o solución acuosa se trata con una acilasa de la penicilina adecuada.

Organismos que se ha encontrado son productores de la acilasa de la penicilina son, por ejemplo, especies de Acetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Aphanocladium, Bacillus sp., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas o Xanthomonas. Las enzimas derivadas de Acetobacter pasteurioanum, Alcaligenes faecalis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Providentia rettgeri y Xanthomonas citrii han demostrado ser particularmente adecuadas en un método según la invención. En la literatura, las penicilina acilasas también se denominan penicilina amidasas.

La penicilina acilasa puede ser empleada como enzima libre, pero también en cualquier forma inmovilizada adecuada, por ejemplo como se describe en EP 0 222 462 y WO 97/04086.

La presente invención muestra ventajosamente que es factible someter un compuesto derivado por fermentación de penicilina N sustituida, como penicilina G, a una conversión enzimática hasta 6-APA sin necesidad de un aislamiento previo del compuesto en forma cristalina de penicilina N-sustituida.

La presente invención también prevé la opción de tratar directamente el fluido fermentativo con la acilasa de la penicilina, es decir sin una etapa previa de extracción y reextracción.

La solución de conversión resultante de la reacción enzimática indicada anteriormente contiene 6-APA, una cadena lateral como ácido fenilacético o fenoxiacético y trazas de producto no convertido.

En una realización de la invención, el producto 6-APA se aísla de la solución de conversión mediante cristalización en condiciones ácidas. Típicamente, la cristalización de 6-APA a partir de una solución acuosa de 6-APA se lleva a cabo ajustando el pH de la solución de 6-APA hasta un valor ácido mediante adición de una disolución titulada a la solución de 6-APA hasta que el pH haya alcanzado un valor dentro del rango 2,5 a 4,5, preferentemente un valor de 3-4.

En una realización preferente de la invención, la cristalización del 6-APA a partir de una solución acuosa se realiza adicionando la solución de 6-APA a un recipiente de cristalización que se mantiene a un pH fijo en un intervalo de 2,5-4,5 mediante una disolución titulada adecuada.

En una realización aún más preferente de la invención, la cristalización se lleva a cabo ajustando poco a poco el pH de la solución de 6-APA hasta un valor final dentro del intervalo 2,5-4,5, adicionando la solución de 6-APA a una serie de recipientes de cristalización interconectados; es decir, adicionando la solución de 6-APA a un primer recipiente, adicionando simultáneamente el contenido del primer recipiente a un segundo, adicionando simultáneamente el contenido del segundo recipiente a un tercero, etc., donde se obtiene un intervalo de pH en los recipientes interconectados con una disolución titulada adecuada; iniciando a un pH, en el primer recipiente, que se desvía aproximadamente de 0,5-2 unidades del pH de la solución de 6-APA, y finalizando a un pH, en el recipiente final, que se encuentra en el intervalo 2,5-4,5. Preferentemente, el pH de la solución acuosa de 6-APA se ajusta hasta el valor final deseado utilizando una serie de 2-6 recipientes interconectados.

Por ejemplo, para obtener la cristalización del 6-APA a partir de la solución de conversión, puede aplicarse un intervalo descendente de pH de 8 a 3, utilizando una disolución titulada ácida, como de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y/o ácido nítrico, aplicando una serie de recipientes de cristalización interconectados.

Las dos realizaciones preferentes descritas anteriormente se llevan a cabo, preferiblemente, de modo continuo.

En otra realización adicional preferente de la invención, la cadena lateral del ácido fenil o fenoxi acético se elimina antes de la cristalización de 6-APA mediante extracción en un disolvente orgánico. La solución de conversión es acidificada y luego extraída con un disolvente orgánico, por ejemplo acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol o n-butanol. La acidificación de la solución de conversión se consigue con un ácido, como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido nítrico, o una combinación de los mismos, preferentemente ácido sulfúrico, a un pH inferior a 3, preferentemente inferior a 2. Inesperadamente se encontró que también se obtenía una elevada eficiencia de eliminación de impurezas coloreadas aplicando esta etapa de extracción.

En una realización de la invención, la extracción con el disolvente orgánico se desarrolla en dos a cuatro etapas de extracción de contacto intensivas, por ejemplo, una combinación de mezcla intensa, por ejemplo en un mezclador de alto cizallamiento, con una separación por centrifugación, donde estas etapas se realizan preferiblemente en modalidad contracorriente.

El disolvente orgánico, que contiene ácido fenil o fenoxiacético y los compuestos coloreados, puede contener una pequeña cantidad de 6-APA. Esta cantidad de 6-APA puede ser reextraída, opcionalmente, en agua, preferiblemente en dos a cuatro etapas de extracción, en modalidad contracorriente. El agua utilizada para esta reextracción se acidifica hasta un pH inferior a 6, preferente inferior a 3. La relación preferente agua: disolvente es 1:5, especialmente 1:20, en particular 1:10. La fase acuosa así obtenida puede ser alimentada a la cristalización del 6-APA o reciclarse en la etapa de extracción de la cadena lateral.

Después de la extracción del disolvente orgánico de la cadena lateral, el producto 6-APA puede cristalizar a partir de la fase acuosa de varias formas, tales como las técnicas indicadas anteriormente para la cristalización del 6-APA a partir de una solución acuosa.

En un modo operacional preferente, el pH de la fase acuosa se incrementa hasta un valor dentro del intervalo 2,5-5, preferentemente de 3,5-4,5, mediante adición de la solución de 6-APA, en una etapa, a un recipiente de cristalización que se mantiene al valor pH deseado o a una serie de 2-6 recipientes de cristalización interconectados aplicando un intervalo de pH ascendente. Estos procesos pueden llevarse a cabo, de manera conveniente, en modalidad continua.

Cuando se aplica este aspecto del proceso de la invención, la cantidad de cadena lateral, es decir de ácido fenil o fenoxi acético, y de compuestos coloreados presentes en los cristales 6-APA es bajo comparado con los procesos convencionales, donde la cadena lateral no se extrae y se aplica una cristalización por lotes a partir de una solución neutra.

Todas las etapas mencionadas anteriormente, es decir extracción, reextracción y cristalización, pueden efectuarse en una modalidad por lotes o por lotes alimentados, pero, debido a razones de estabilidad, el método preferente es una modalidad continua.

Los cristales de 6-APA obtenidos se aíslan mediante filtración o centrifugación y se secan en un secador convencional continuo o por lotes.

Claims (9)

1. Proceso para la preparación de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de una penicilina N-sustituida obtenida mediante fermentación, donde el proceso comprende las etapas de:

extracción del compuesto de penicilina N-sustituida tal como está presente en un caldo o fluido de cultivo en un disolvente orgánico, reextracción del compuesto de penicilina N-sustituida en agua, tratamiento de la fase acuosa con una penicilina acilasa y aislamiento de 6-APA de la solución de conversión así obtenida mediante cristalización.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado además porque la cadena lateral tal como está presente en la solución de conversión obtenida después del tratamiento con la acilasa, se extrae en un disolvente orgánico antes del aislamiento de 6-APA de la fase acuosa por cristalización.

3. Proceso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la solución de conversión se acidifica hasta un pH inferior a 3 antes de la extracción.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cristalización de 6-APA a partir de la solución de conversión o fase acuosa se realiza adicionando la solución de 6-APA a un recipiente de cristalización que se mantiene a un pH fijo, cuyo valor está en el rango 2,5-4,5, utilizando una titulación adecuada.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cristalización de 6-APA de la solución de conversión o fase acuosa se realiza mediante la adición de la solución de 6-APA a una serie de recipientes de cristalización interconectados mientras se aplica un intervalo de pH, usando una titulación adecuada, iniciando a un pH, en el primer recipiente, que se desvía aproximadamente 0,5-2 unidades del valor de pH de la solución de 6-APA y que termina a un pH, en el recipiente final, que tiene un valor en el intervalo 2,5-4,5.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el caldo o fluido fermentativo es acidificado a un pH dentro de un rango de 2-4, preferentemente dentro del rango 2,5-3, antes de la extracción.

7. Proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque parte del disolvente orgánico se adiciona al caldo o fluido fermentativo antes de la acidificación de dicho caldo o fluido.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la fase acuosa se purifica antes del tratamiento con la penicilina acilasa.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el disolvente orgánico es acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol o n-butanol.