MX2008007066A - Procedimiento para la preparacion de una sal de potasio de penicilina - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de una sal de potasio de penicilina G (Pen G K) o penicilina V (Pen V K) en forma cristalina a partir de una suspensión que comprende Pen G K o penicilina V (Pen V K), un disolvente orgánico y un alcohol C1 a C3.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE UNA SAL DE POTASIO DE PENICILINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una sal de potasio de penicilina G (Pen G K) o penicilina V (Pen V K) en forma cristalina .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las penicilinas se obtienen normalmente a partir de un procedimiento de fermentación usando cepas microbianas que pueden producir penicilina en presencia de un precursor de cadena lateral adecuado. La penicilina G, por ejemplo, se produce medíante cepas seleccionadas de Penicilli um chrysogenu en presencia del precursor de cadena lateral, ácido fenilacético. Tras la fermentación, se recupera la penicilina del caldo de fermentación según métodos conocidos dependiendo del tipo de penicilina. En un procedimiento de recuperación de penicilina G típico de la técnica anterior, se filtra el caldo de fermentación obtenido y se lava la torta de filtración tras lo que se extrae la penicilina G presente en el filtrado recogido con un disolvente orgánico tal como acetato de n-butilo o metil isobutil cetona tras la acidificación del filtrado. El extracto así obtenido puede decolorarse entonces con la ayuda de carbón activado y la penicilina G acida se retroextrae con agua mediante la neutralización con una disolución acuosa de sal de potasio tal como acetato de potasio. Esta disolución se mezcla con una cantidad suficiente de un segundo disolvente tal como n-butanol tras lo que se reduce el contenido en agua usando evaporación del azeótropo de n-butanol-agua, con lo que los cristales de penicilina G K formados se recuperan mediante la filtración y el lavado y secado posteriores. Una desventaja de este procedimiento de recuperación de la técnica anterior es que durante la evaporación del azeótropo de n-butanol-agua se producen pérdidas sustanciales de Pen G K debido a la degradación de Pen G K, lo que da como resultado un rendimiento significativamente reducido de Pen G K (por ejemplo, < 92%) . En otro procedimiento de la técnica anterior, se obtiene directamente Pen G K cristalina del extracto descrito anteriormente, mediante la adición de acetato de potasio u otras fuentes de potasio adecuadas seguido por la evaporación del azeótropo, con lo cual los cristales de Pen G K que se forman se filtran, se suspenden en n-butanol, se filtran y se secan. Una desventaja de este procedimiento de recuperación de la técnica anterior es que tras el aislamiento del producto final (Pen G K) las aguas madres comprenden tanto n-butanol como acetato de n-butilo. Es necesario recuperar ambos disolventes; sin embargo, dado que n-butanol y acetato de n-butilo son difíciles de separar, esta etapa de recuperación del disolvente requiere un equipo caro. Además, en este procedimiento en el que se obtienen cristales de Pen G K mediante cristalización en acetato de n-butilo, seguido por la suspensión de los cristales de Pen G K en n-butanol, se requieren dos etapas de aislamiento de los cristales de Pen G K en lugar de una. Para la penicilina V, en principio pueden aplicarse los mismos procedimientos. Sin embargo, debido a la mejor estabilidad de la penicilina V en condiciones acidas, la penicilina V también puede cristalizarse en la forma acida en lugar de la forma de sal de potasio, sin pérdidas económicas inaceptables.

OBJETO DE LA INVENCIÓN El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento simplificado y por tanto económicamente más atractivo para la preparación de una sal de potasio de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina con rendimiento suficientemente alto y preferiblemente mejorado y buena calidad preferiblemente mejorada.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN "Rendimiento" se define en el presente documento como el % de rendimiento de penicilina en la sal de potasio de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina con respecto a la penicilina presente en el extracto. Suficientemente alto se define en el presente documento preferiblemente como al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 92%, más preferiblemente al menos el 94%, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 96%, más preferiblemente al menos el 97%, lo más preferiblemente al menos el 98%. "Buena calidad" se define en el presente documento como que la sal de potasio final de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina contiene muy pocas o ninguna impureza, por ejemplo, menos del 5% (p/p), más preferiblemente menos del 4%, más preferiblemente menos del 3%, más preferiblemente menos del 2%, más preferiblemente menos del 1%, más preferiblemente menos del 0,5%, más preferiblemente menos del 0,25%, incluso más preferiblemente menos del 0,1%. Las impurezas pueden ser, por ejemplo, ácido 6-aminopenicilánico (6 -APA), ácido fenilacético (PA), parahidroxipenicilina G, ácido penicílico de penicilina G, ácidos peniciloicos de penicilina G y ácidos peniloicos de penicilina G y las impurezas correspondientes para la penicilina V. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una sal de potasio de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina a partir de una suspensión que comprende la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, un disolvente orgánico y un alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3. Preferiblemente la penicilina es penicilina G. Se encontró sorprendentemente que el rendimiento de la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina en el procedimiento según la presente invención era suficientemente alto tal como se definió anteriormente en el presente documento y tan alto como, o incluso más alto que en los procedimientos conocidos en la técnica, mientras que al mismo tiempo la calidad de los cristales obtenidos era buena tal como se definió anteriormente en el presente documento. Otra ventaja del procedimiento de la presente invención es que sólo se requiere una etapa de aislamiento de los cristales, lo que no sólo contribuye a los rendimientos suficientemente altos, sino también a una ventaja económica sustancial. El disolvente orgánico en el procedimiento según la presente invención puede ser cualquier disolvente orgánico conocido por el experto en la técnica. Ejemplos de tales disolvente orgánicos adecuados son acetato de amilo, acetato de n-butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciciohexanona, iso-butanol o n-butanol. Preferiblemente el disolvente orgánico es acetato de n-butilo . El alcohol en el procedimiento según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en un C1( C2 y C3 y preferiblemente es metanol, etanol, n-propanol o iso-propanol . Lo más preferiblemente, el alcohol es metanol . La penicilina en el procedimiento para la preparación de la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina según la presente invención puede obtenerse a partir de cualquier procedimiento de producción adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la penicilina G puede producirse mediante la fermentación de un microorganismo que produce penicilina G, por ejemplo, una cepa de Penicilliu chrysogenu preferiblemente en presencia del precursor de cadena lateral ácido fenilacético, según métodos conocidos en la técnica. La biomasa puede separarse del caldo de fermentación usando cualquier tecnología adecuada, tal como centrifugación o filtración, produciendo así una penicilina que contiene fluido de fermentación. Preferiblemente, se aplica una etapa de filtración para separar la biomasa del caldo. Opcionalmente, se lavan los sólidos residuales. El fluido o caldo de fermentación se acidifica hasta un pH dentro de un intervalo de 2 a 4, preferiblemente hasta un pH dentro de un intervalo de 2,5 a 3, mediante la adición de al menos un ácido, tal como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido nítrico o cualquier combinación de cualquiera de ellos. Se separa entonces la penicilina de la fase acuosa acidificada mediante la extracción con un disolvente orgánico. Puede usarse cualquier disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, acetato de amilo, acetato de n-butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciciohexanona, iso-butanol o n-butanol . Preferiblemente el disolvente orgánico es acetato de n-butilo. La adición de un desemulsionante adecuado puede mejorar la extracción significativamente. "Extracto" se define en el presente documento como el disolvente orgánico con el que se ha extraído la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V. El extracto que comprende la penicilina puede tratarse opcionalmente con carbón activado para eliminar las impurezas según métodos conocidos en la técnica. En una realización de la invención, el extracto que comprende la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V tal como se definió anteriormente en el presente documento, tratado opcionalmente con carbón activado, puede mezclarse posteriormente con una fuente de potasio adecuada para convertir la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en la sal de potasio correspondiente de la penicilina obteniendo de este modo una mezcla que comprende el disolvente orgánico y la sal de potasio de la penicilina. La cantidad de la fuente de potasio adecuada mezclada con el extracto que comprende la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, es preferiblemente de manera que se añaden entre 0,4 y 3 equivalentes molares de potasio con respecto a la penicilina. Preferiblemente, se añaden entre 0,6 y 2 equivalentes molares, más preferiblemente entre 0,7 y 1,6 equivalentes molares, más preferiblemente entre 0,8 y 1,4 equivalentes molares, más preferiblemente entre 0,9 y 1,2 equivalentes molares de potasio con respecto a la penicilina. Lo más preferiblemente, se añade 1 equivalente molar de potasio con respecto a la penicilina. Una fuente de potasio adecuada es cualquier sal de potasio de un ácido preferiblemente débil. Ejemplos de tales fuentes de potasio adecuadas son acetato de potasio o carbonato de potasio. La fuente de potasio puede usarse en forma sólida o puede disolverse primero en agua para formar una disolución acuosa de la fuente de potasio. Una concentración adecuada de la fuente de potasio en la disolución acuosa es, por ejemplo, entre el 10 y el 60% p/v, por ejemplo, entre el 15 y el 55% p/v, por ejemplo, entre el 20 y el 50%. Posteriormente, puede eliminarse de la mezcla que comprende el disolvente orgánico y la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V parte del agua o parte de un azeótropo que comprende agua y el disolvente orgánico, por ejemplo, un azeótropo de agua y acetato de n-butilo. El agua que está presente en la mezcla puede originarse a partir del caldo de fermentación o del disolvente orgánico o puede haberse introducido con la fuente de disolución acuosa de potasio. Preferiblemente el contenido en agua de la mezcla que comprende el disolvente orgánico y la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V tras la eliminación de parte del agua o el azeótropo es < 10% (v/v) , más preferiblemente < 5% (v/v) , más preferiblemente < 2,5% (v/v), más preferiblemente < 1% (v/v), más preferiblemente < 0,5% (v/v) y lo más preferiblemente < 0,2% (v/v) . Tras la evaporación de parte del agua o de un azeótropo de agua/disolvente orgánico originalmente tal como se describió anteriormente, se añade a la mezcla un alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci , C2 y C3 para obtener una suspensión que comprende una sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, un disolvente orgánico y el alcohol. El alcohol puede ser metanol, etanol, n-propanol o iso-propanol . Preferiblemente, el alcohol es metanol. Preferiblemente, el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3 es seco. Tal como se usa en el presente documento, seco significa que el alcohol contiene menos del 10% (v/v) de agua, preferiblemente menos del 5% (v/v) de agua, preferiblemente menos del 2% (v/v) . Lo más preferiblemente, el alcohol seco contiene el 0% (v/v) de agua. La suspensión que comprende la sal de potasio de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, el disolvente orgánico y el alcohol puede agitarse durante un cierto periodo de tiempo tras haberse puesto en contacto entre sí. Preferiblemente, se agita la suspensión durante un periodo de tiempo de entre 5 min y 24 horas, preferiblemente de entre 10 min y 12 h, más preferiblemente de entre 20 min y 8 h, más preferiblemente de entre 0,5 h y 6 h, más preferiblemente de entre 45 min y 3 h. Preferiblemente, se agita la suspensión hasta que se forman cristales blancos de la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V. Más preferiblemente, se agita la suspensión hasta que se forman cristales blancos sin grumos de la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V. La suspensión puede agitarse a cualquier temperatura adecuada, preferiblemente entre 0 y 40CC, más preferiblemente entre 5 y 30 °C, lo más preferiblemente entre 10 y 25°C. En la suspensión del procedimiento según la presente invención, la razón del volumen del alcohol con respecto al volumen de la mezcla que comprende un disolvente orgánico y la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, puede ser cualquier razón adecuada. Preferiblemente esta razón es de entre 1:20 y 1:3, preferiblemente de entre 1:15 y 1:4, preferiblemente entre 1:10 y 1:6. La sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V puede cristalizar parcial o totalmente durante el procedimiento de la presente invención. Por ejemplo, la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V puede comenzar a cristalizar con la adición de la fuente de potasio adecuada al extracto que comprende la penicilina y/o durante la evaporación de parte del agua o parte del azeótropo de agua/disolvente orgánico de la mezcla que comprende el disolvente orgánico y la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V. La sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V también puede cristalizar adicionalmente o volver a cristalizar cuando la mezcla que comprende el disolvente orgánico y la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, parcial o totalmente cristalizada de manera opcional, se pone en contacto con el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol C± , C2 y C3 y/o durante la agitación de la suspensión que comprende la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, el disolvente orgánico y el alcohol. En otra realización, se recogen los cristales de la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V obtenidos tras la adición de una fuente de potasio adecuada a un extracto que contiene una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V obtenido y definido tal como se describió anteriormente en el presente documento y la evaporación del azeótropo que comprende el disolvente orgánico y agua, por ejemplo, mediante filtración. Los cristales así obtenidos se resuspenden en una mezcla que comprende el disolvente orgánico tal como se describió anteriormente en el presente documento y el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3 en las mismas condiciones (por ejemplo, con respecto a la razón de alcohol/disolvente orgánico, tiempo, temperatura) tal como se describió en la realización anterior. La sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina puede aislarse de la suspensión en cualquier realización de la invención mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración. Entonces puede obtenerse una torta húmeda de la sal de potasio de la penicilina en forma cristalina. Opcionalmente, se lava la torta húmeda con disolvente orgánico o una mezcla de disolvente orgánico y el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3. Si se aplica una etapa de lavado, el disolvente orgánico es preferiblemente el mismo disolvente orgánico que se utilizó en el extracto y el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol C1; C2 y C3 es preferiblemente el mismo que se utilizó en la suspensión. La torta húmeda de la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V en forma cristalina puede secarse usando cualquier tecnología adecuada conocida en la técnica. En esta realización de la invención, la penicilina es preferiblemente penicilina G.

Opcionalmente, la torta húmeda que comprende los cristales de la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V se mezcla con agua para obtener una disolución acuosa de la sal de potasio de penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V. La disolución acuosa puede someterse entonces a separación para eliminar las trazas de disolvente orgánico y/o el alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3. La separación comprende la evaporación del agua, el disolvente orgánico y/o el alcohol . La disolución acuosa de la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V puede usarse para la conversión enzimática en el ácido 6-aminopenicilánico (6 -APA) mediante métodos conocidos descritos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP 0977 883. La disolución que comprende la sal de potasio disuelta de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V puede tratarse con una penicilina acilasa adecuada, por ejemplo, una penicilina G acilasa adecuada para desacilar la penicilina G y una penicilina V acilasa adecuada para desacilar la penicilina V. Microorganismos que se ha encontrado que producen penicilina acilasas adecuadas son, por ejemplo, especies de ?cefcobacter, Aeromonas, Alcaligenes , Aphanocladiuw, Bacillus sp . , Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas o Xanthomonas . Las enzimas derivadas de ?cetobacfcer pasteurioanuw, Alcaligenes faecalis , Bacillus megaterium, Escherichia coli , Providentia rettgeri y Xanthomonas ci trii han demostrado particularmente que son satisfactorias en un método según la invención. En la bibliografía, las penicilina acilasas también se han denominado penicilina amidasas . La penicilina acilasa puede usarse como una enzima libre, pero también en cualquier forma inmovilizada adecuada, por ejemplo, tal como se ha descrito en los documentos EP 0 222 462 y WO 97/04086. La conversión enzimática de Pen G K disuelta por una penicilina acilasa da como resultado la formación del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) y el ácido fenilacético.

Ejemplo de realización de la invención No.l Ejemplo comparativo A 1000 mi de un extracto tratado con carbón activado que contenía aproximadamente 100.000 unidades Oxford de penicilina G por mi (1 unidad Oxford equivale a alrededor de 0,6 microgramos de penicilina G) en acetato de n-butilo, se añadió una disolución al 30% (p/p) de K2C03 en agua de manera que la mezcla contenía aproximadamente 1,0 equivalente molar de potasio con respecto a penicilina G.

Se mezcló este extracto de la retroextracción con 200 mi de n-butanol y se calentó a vacío la mezcla resultante usando un evaporador de película giratorio (baño a 50-60°C) . Durante la evaporación se añadió n-butanol en porciones, mediante lo cual la cantidad total de n-butanol añadida fue de 200 mi. En total se evaporaron 250 mi de n-butanol/agua y se enfrió el residuo hasta temperatura ambiente. Se aislaron los cristales de Pen G K que se formaron mediante filtración, se lavaron con n-butanol y se secaron. El rendimiento (tal como se definió anteriormente en el presente documento) fue del 91%.

Ejemplo 2 Se llevaron a cabo una serie de experimentos en los que a 1000 mi de un extracto tratado con carbón activado que contenía aproximadamente 100.000 unidades Oxford de penicilina G por mi en acetato de n-butilo, se añadió una disolución al 50% (p/p) de K2C03 en agua de manera que la mezcla contenía aproximadamente 1,0 equivalente molar de potasio con respecto a penicilina G.

Se calentó a vacío la mezcla resultante usando un evaporador de película giratorio (baño a 45-48°C) mediante lo cual se evaporó una cierta cantidad de la mezcla (véase la tabla 1 para comprobar la cantidad de cada experimento) . Posteriormente, se añadió metanol al residuo y se agitó la mezcla durante 1 h a 25°C. Se filtró la suspensión y se lavó la torta húmeda con 70 mi de acetato de n-butilo tras lo que se secó la torta húmeda Tabla 1: cristalización de Pen G K en acetato de n-butilo + adición de metanol al residuo El volumen evaporado es el volumen total evaporado y el valor entre paréntesis representa el volumen de la fase acuosa en el destilado. La columna con el contenido en agua representa el contenido en agua del residuo tras la evaporación. Todos los experimentos dieron cristales blancos de Pen G K con alto rendimiento (tal como se definió anteriormente en el presente documento) con respecto al contenido en penicilina en el extracto tratado con carbón (=100%) y sólo pérdidas limitadas de penicilina para las aguas madres. Los cristales del experimento 1 contenían el 99,3% de Pen G K (es decir, buena calidad) .

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la preparación de una sal de potasio de una penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, en forma cristalina a partir de una suspensión que comprende la sal de potasio de la penicilina seleccionada del grupo de penicilina G y penicilina V, un disolvente orgánico y un alcohol seleccionado del grupo que consiste en un alcohol Ci, C2 y C3.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la penicilina es penicilina G.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en acetato de amilo, acetato de n-butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciciohexanona, iso-butanol o n-butanol, preferiblemente es acetato de n-butilo.
4. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el alcohol se selecciona del grupo que consiste en metanol, etanol, n-propanol o iso-propanol , preferiblemente metanol.
5. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque la sal de potasio de la penicilina en forma cristalina se aisla de la suspensión para obtener una torta húmeda de la sal de potasio de la penicilina en forma cristalina y opcionalmente se lava y/o se seca.
6. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la torta húmeda se mezcla con agua para obtener una disolución acuosa de la sal de potasio de la penicilina y posteriormente se usa en la conversión enzimática a ácido 6-aminopenicilánico (6 -APA) .