CN110468115B - 一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明一方面提供了一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽及其编码基因，另一方面提供了该编码基因在生产L(+)‑酒石酸或其盐中的应用，利用本发明能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，为工业化生产L(+)‑酒石酸奠定了基础。

Description

一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用。

背景技术

酒石酸，一种α-羧酸，又名2,3-二羟基琥珀酸或2,3-二羟基丁二酸。1769年，瑞典化学家Carl Wilhelm Scheele最早在葡萄酒的下脚料粗酒石中发现了L(+)-酒石酸的存在，故名“酒石酸”。L(+)-酒石酸广泛存在于自然界中，故又被称为“天然酒石酸”，特别是罗望子果和葡萄中含量较高，是重要的食品乳化剂、饮料酸味剂、医药拆分剂、石膏缓凝剂、印染防染剂、照相显影剂、金属抛光剂，广泛应用于食品工业、医药化工及建筑业中。微生物转化法是目前L(+)-酒石酸工业化生产的主流方法，即以顺酐为原料，通过水解和环氧化反应变为顺式环氧琥珀酸或其盐，然后利用含有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物，生物催化顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。

目前已报道的可用于生产L(+)-酒石酸或其盐的微生物有：诺卡氏菌属(Nocardia)、棒杆菌属(Coryncbacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas) 、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和双头菌(Labrys)。其中，来源于诺卡氏菌属、红球菌属和克雷伯氏菌属的顺式环氧琥珀酸水解酶的基因序列及其编码的氨基酸序列已报道，并构建了基因工程菌，用于L(+)-酒石酸或其盐的生产。这些已报道的生产L(+)-酒石酸或其盐的菌种均为细菌，未见利用真菌生产L(+)-酒石酸或其盐的报道。

一般认为，微生物转化法生产L(+)-酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点。但是由于微生物体内固有的酶系统非常复杂，顺式环氧琥珀酸水解酶的表达量不高，其活性也受到胞内胞外多种因素的制约，导致L(+)-酒石酸生产效率低下。利用基因工程技术构建具有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的基因工程菌，可以实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，这也成为工业生产L(+)-酒石酸的关键。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用的技术方案。

本发明具体通过以下技术方案实现：

所述的一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列 ；或

2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述的一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。

所述的编码黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因，其特征在于其核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因序列。

所述的编码基因在调控微生物生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。

所述的包含编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽基因的重组表达载体。

所述的表达黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的重组微生物菌株。

所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，利用所述的黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。

所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，利用所述的重组微生物菌株与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。

所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于具体为：

1）在合适的培养基中培养重组微生物菌株；

2）将步骤1）中得到的重组微生物菌株的细胞、细胞抽提物或无细胞抽提物或由所述重组微生物菌株纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶固定在固体支持物上或包埋在固定载体中；

3）将步骤1）中得到的重组微生物菌株或步骤2）中得到的制备物与顺式环氧琥珀酸或其盐在适于水解的条件下反应以生产L(+)-酒石酸或其盐；和

4）任选地重复利用上述固定或包埋的酶和/ 或细胞。

本发明一方面提供了一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽及其编码基因，另一方面提供了该编码基因在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用，利用本发明能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，为工业化生产L(+)-酒石酸奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例4中的重组工程菌经过IPTG诱导后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效, 以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。本发明的整体思路包括以下几点：从黑曲霉发酵液中分离纯化顺式环氧琥珀酸水解酶，对顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端进行测序，根据此N-末端和C-末端的氨基酸序列设计简并引物，从黑曲霉中克隆顺式环氧琥珀酸水解酶基因，构建原核表达载体，转化大肠杆菌，对转入顺式环氧琥珀酸水解酶基因的大肠杆菌进行培养，验证顺式环氧琥珀酸水解酶基因的功能。以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例并配合附图作进一步详细说明。

实施例1：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化

本发明采用菌株为黑曲霉WH-2(Aspergillus niger WH-2)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏登记号为CGMCC No.16799,命名为黑曲霉(Aspergillus niger)WH-2，保藏日：2018年12月03日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所（邮编：100101）。该黑曲霉(Aspergillus niger)WH-2已在公开号为CN109609388A的发明专利中公开。

取黑曲霉(Aspergillus niger)WH-2保存于PDA斜面培养基，该斜面培养基的配置方法为：称取200g去皮的新鲜土豆，将土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，保持30min。再用双层纱布趁热在量杯上过滤，留下滤液。加入20g葡萄糖和15～20g的琼脂，并将滤液补充至1000ml，121℃高压灭菌20 min。灭菌完成后，在紫外线灭菌过的超净台上倒入已灭菌的茄形瓶，待茄形瓶中斜面培养基冷却凝固后，将其密封并室内倒置放一夜。若斜面培养基上没有长菌，将其放入4℃冰箱备用。

1：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化

(1)在长满黑曲霉WH-2浓密孢子的斜面培养基上，加入5mL孢子悬浮液，用接种铲刮取孢子，使孢子充分被洗下，用无菌的三层擦镜纸过滤除去菌丝体。该孢子悬浮液配方为0.1% Tween80和0.9% NaCl。

(2)过滤后的上述孢子液经稀释后用血球计数板计数，按3x10⁶个/mL的浓度接种孢子至装有50mL的种子培养基的250mL锥形瓶中，28℃ 180rpm振荡培养24～36h，得到所述的黑曲霉菌株种子液。种子培养基为自制PDB培养基，配制方法为：称取200g去皮的新鲜土豆，将土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，保持30min。再用双层纱布趁热在量杯上过滤，留下滤液。加入10g葡萄糖，并将滤液补充至1000ml，121℃高压灭菌20 min。

(3)取上述20ml黑曲霉的种子液接种装有200mL产酶培养基的1000mL锥形瓶中，28℃ 180rpm振荡培养2～3天，获得相应的黑曲霉细胞和发酵液。产酶培养基为自制PDB无机盐培养基，配制方法为：称取200g去皮的新鲜土豆，将土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，保持30min。再用双层纱布趁热在量杯上过滤，留下滤液。加入10g葡萄糖，1.4g硝酸铵，20g酵母粉，1g三水磷酸氢二钾，pH6.0，并将滤液补充至1000ml，121℃高压灭菌20min。

(4)过滤除去菌体，得发酵液。

(5)发酵液中加硫酸铵至30%饱和度，10000rpm离心20min,收集上清液1。

(6)上清液1中加硫酸铵至70%饱和度，10000rpm离心20nin，收集沉淀并用预冷的0.1mol/L磷酸钾缓冲液溶解。

(7)4℃于0.1mol/L磷酸钾缓冲液中透析48h，期间更换3～4次透析液。

(8)透析后的酶液过DEAE-Sepharose柱,过柱流出液具有酶活。

(9)过柱流出液进行超滤浓缩，得浓缩液1，将浓缩,1过Pheny-Sepharose柱，用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱，收集具有酶活性的流出液，并超滤浓缩，得浓缩液2。

(10)浓缩液2过MonoQ HR5/5柱，并用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱，收集具有酶活性的流出液，并超滤浓缩，得浓缩液3。

(11)取浓缩液3进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝R250染色，结果显示，纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中条带单一，并且分子量约为30kDa。

2：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶活力的测定

取10 mL发酵液，加入1mL 1mol/L的顺式环氧琥珀酸钠(pH8.0)溶液，37℃反应1h，测定反应液中酒石酸的含量。

反应液中酒石酸含量的检测方法如下：取2.5ml1%的偏钒酸铵溶液，置于一个25ml的容量瓶中，加适量的上述反应液后，再加1ml1mol/L的硫酸，用蒸馏水定容至25ml，混匀后取一部分用分光光度计测定480nm处的吸光值，并根据制定的L(+)-酒石酸标准曲线计算反应液中酒石酸的含量。

L(+)-酒石酸标准曲线的制作方法如下：取0.25g L-酒石酸钠，溶解于25ml蒸馏水中，制成浓度为10 mg/ml的L(+)-酒石酸钠溶液。分别在11个25ml的容量瓶中加入2.5ml1%的偏钒酸铵溶液，然后分别取0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml上述L(+)-酒石酸钠溶液，依次加入到上述11个容量瓶中，再分别加入1ml1mol/L的硫酸，用蒸馏水定容至25ml，混匀后分别取一部分用分光光度计测定其480nm处的吸光值，制作L(+)-酒石酸标准曲线。

酶活单位定义为：在上述反应条件下，1 mL发酵液1h产生1μmol酒石酸所需的酶量。

实施例2：对黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端进行测序

黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶N-末端氨基酸序列和C-末端氨基酸序列通过常用的方法检测，其方法如下：将上述分离纯化后得到的黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过Western杂交转移到PVDF膜上。该膜用考马斯亮蓝染色液染色，切割黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶对应的条带并回收，然后用蛋白测序仪分别测其N-末端和C-末端的10个氨基酸序列。测序结果显示，该顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端10个氨基酸序列为MSISPLPKAL (SEQ ID NO:3),C-末端10个氨基酸序列为RLGILKETRP(SEQID NO:4)。

实施例3：设计简并引物，克隆黑曲霉WH-2顺式环氧琥珀酸水解酶基因

根据上述黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列(SEQ ID NO:3)、 C-末端序列(SEQ ID NO:4)和不编码氨基酸的终止密码子序列(TAA/TGA/TAG)设计两条简并引物如下：

引物1：5'-ATGWSNATNGWSCCNYTNCC-3'(SEQ ID NO:5)；

引物2：5'-YYANGGNCMNGTYTCYTTNA -3'(SEQ ID NO:6)；

其中,R:A/G，Y:C/T，W:A/T，S:G/C，M:G/T，N:A/G/C/T。

用简并引物克隆黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因的步骤如下：

（1）接种孢子液于自制的PDB培养基中，28℃ 180rpm振荡培养48h，收集黑曲霉菌球，按照Ezup Column Fungi Genomic DNA Purification Kit（Sangon Biotech）中所述的方法抽题黑曲霉WH-2的基因组。

（2）以上述基因组为模板，以引物1和引物2为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:步骤1所得的模板2µL，Taq DNA聚合酶(5Μ/μL)1μL，10×PCR buffer 5µL，引物1(10μmol/µL)1µL，引物2(10μmol/µL)1µL，dNTP(100mmol/L)1μL，H₂O 39µL，总体积50µL。

（3）上述50μL PCR反应体系进行如下PCR反应程序：

94℃预热5min；然后94℃ 50s, 48℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

（4）取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1%)电泳。电泳结果显示，在750bp到1000bp之间有一条清晰的条带。回收该条带并与pUC_m-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。测序结果如SEQ ID NO:1所示，其长度为807个核苷酸，其中ATG为起始密码子,TAG为终止密码子。利用DNAStar软件将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列翻译成氨基酸序列得到如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(即本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列）。将本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因和氨基酸序列分别与已报道的顺式环氧琥珀酸水解酶序列进行比对，发现它们与本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因和氨基酸序列相似性都不超过50%，由此说明，本发明所获得的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因是一个新的基因。

实施例4：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据SEQ ID NO:1所示的序列设计含有限制性内切酶NdeⅠ识别位点的正向引物3和含有限制性内切酶EcoRⅠ识别位点的反向引物4，引物3和引物4的序列分别为：

引物3:5'-CATATGTCTATCAGCCCACTCCCG (SEQ ID NO:7)；

引物4:5'- GAATCCCTACGGCCTGGTTTCCTT (SEQ ID NO:8)。

以黑曲霉WH-2的基因组为模板，引物3和引物4为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为: 实施例3步骤1所得的模板2µL，Taq DNA聚合酶(5Μ/μL)1μL，10×PCR buffer 5µL，引物3(10μmol/µL)1µL，引物4(10μmol/µL)1µL，dNTP(100mmol/L)1μL，H₂O 39µL，总体积50µL。

上述50μLPCR反应体系进行如下PCR反应程序：

94℃预热5min；然后94℃ 50s, 48℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR产物并与pUC_m-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对，结果显示：含有限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ识别位点的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因成功插入pUC_m-T载体。然后用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分别对含有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的pUC_m-T载体和pET-22b(+)表达载体进行双酶切，用T₄ DNA连接酶将酶切下来的顺式环氧琥珀酸水解酶基因与酶切后的pET-22b(+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取菌落进行测序。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶基因进行比对，序列完全匹配，说明成功构建了含有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的pET-22b(+)重组载体和含有pET-22b(+)重组载体的基因工程菌。

如图1所示，此基因工程菌经过IPTG诱导和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，约在30kDa之间有明显条带（泳道1），该条带显示的蛋白大小与根据该顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列计算所得的蛋白大小相符；以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21(DE3)为对照,无对应蛋白条带（泳道2），说明经IPTG诱导后，顺式环氧琥珀酸水解酶基因所编码的重组蛋白能高效表达。

实施例5：利用本发明所述的基因工程菌制备L(+)酒石酸

实施例4中所述的基因工程菌在LB培养基中37℃振荡培养12h后，再转接入1L LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养约2h后，加入0.1 M IPTG，37℃、200rpm继续振荡培养8 h。LB培养基的配方为：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，pH7.0。然后向上述培养液中加入10g顺式环氧琥珀酸二钠，继续37℃、200rpm振荡12h后，加入过量的CaCl₂水溶液，有沉淀生成。对沉淀的产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到14.1g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到6.6g固体产物。经Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测、核磁共振用Bruker AvanceDMX500核磁共振仪氢谱和碳谱检测和Bruker Esquire 3000^plus质谱仪检测，确定该固体产物为酒石酸。经WZZ-2B旋光仪检测，该固体产物的比旋光度为[α]

=+12.1°，证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度为99.9%。

本实施例中的顺式环氧琥珀酸二钠可以替换为顺式环氧琥珀酸或其与各种阳离子形成的盐，阳离子包括且不仅限于铵离子、钾离子、镁离子和钙离子等。

实施例6：利用κ- 卡拉胶包埋本发明所述的基因工程菌制备L(+)-酒石酸

将实施例5的培养液离心并收集基因工程菌细胞，取10g该基因工程菌细胞加入到100mL 40g/Lκ- 卡拉胶溶液中，于42℃混合均匀后，4℃冷却，凝固后用0.3 M氯化钾溶液于4℃浸泡10h，将凝胶切成小块，于4℃保存。取上述固定化细胞30g 放入30mL 1.0M 顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，37℃反应24h 后，过滤回收固定化细胞。过滤液中加入CaCl2 水溶液，经充分搅拌后过滤，洗涤沉淀，加硫酸酸解沉淀、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干得到L(+)-酒石酸3.9g。

将回收的固定化细胞再放入30ml 1.0M 顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，37℃反应24h后，过滤回收固定化细胞。过滤液中加入CaCl2 水溶液，经充分搅拌后过滤，洗涤沉淀，加硫酸酸解沉淀、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干得到L(+)-酒石酸4.0g。

该固定化细胞可以反复使用。

本实施例中的顺式环氧琥珀酸二钠可以替换为顺式环氧琥珀酸或其与各种阳离子形成的盐，阳离子包括且不仅限于铵离子、钾离子、镁离子和钙离子等。

尽管已参照本发明的确定优选实例表示和描述了本发明，但本领域内的普通技术人员将理解的是，可在不背离由所附权利要求书限定的本发明宗旨和范围的前提下对本发明进行各种形式和细节上的修改。

序列表

<110> 浙江科技学院

<120> 一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

atgtctatca gcccactccc gaaggcacta ttctttgacg tctttggcac cgtcgtggag 60

tggcgctcct gcgttaccca ggccctgatg aaagcggctg agaatgctct gctcgatcct 120

gggaagcagc tcccagcgga cgtccgcgca cgggtacagg ctacgacctc tgaggactgg 180

caggccattg cggaagaatg gcgcgcgtcc tatggccggt ttacgaagaa ctttgactca 240

acatcgacgt tcgtatcggt ggatgaacat cattacagct ctattaagca gctgctccac 300

cagagaggtc tccacgacat actctctgat gaagagcgat gggaccttgc actctgttgg 360

catcggctcg agccttggtc ggactcggtc gaaggcttag agctgttgaa ccgccggttc 420

cagacttgca ctctgtcgaa cggcaatgtg tctcttctag aagatctttt gaaatatggg 480

tcattgccat tcatgaacgt ggccagcgct gagcacttcg gagcctataa gcccgccctt 540

cgagcgtacc atggagcagc cgagcggttc ggcttggatc ccagtgagtg tggtatggta 600

gcagcgcatt tgtacgatct caaagcggca aagaaagctg gctttatgac aatctacgtc 660

gaacggcccc aggaggagag cttcaccgct gaacagattg ccgaagccaa acaggagggt 720

tttgtcgacc tgtggctcga gcatggctac agcggtctaa ttggggtggc tgagcgactt 780

ggtattctga aagaaaccag gccgtag 807

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

Met Ser Ile Ser Pro Leu Pro Lys Ala Leu Phe Phe Asp Val Phe Gly

1 5 10 15

Thr Val Val Glu Trp Arg Ser Cys Val Thr Gln Ala Leu Met Lys Ala

20 25 30

Ala Glu Asn Ala Leu Leu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Pro Ala Asp Val

35 40 45

Arg Ala Arg Val Gln Ala Thr Thr Ser Glu Asp Trp Gln Ala Ile Ala

50 55 60

Glu Glu Trp Arg Ala Ser Tyr Gly Arg Phe Thr Lys Asn Phe Asp Ser

65 70 75 80

Thr Ser Thr Phe Val Ser Val Asp Glu His His Tyr Ser Ser Ile Lys

85 90 95

Gln Leu Leu His Gln Arg Gly Leu His Asp Ile Leu Ser Asp Glu Glu

100 105 110

Arg Trp Asp Leu Ala Leu Cys Trp His Arg Leu Glu Pro Trp Ser Asp

115 120 125

Ser Val Glu Gly Leu Glu Leu Leu Asn Arg Arg Phe Gln Thr Cys Thr

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Val Ser Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Tyr Gly

145 150 155 160

Ser Leu Pro Phe Met Asn Val Ala Ser Ala Glu His Phe Gly Ala Tyr

165 170 175

Lys Pro Ala Leu Arg Ala Tyr His Gly Ala Ala Glu Arg Phe Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Ser Glu Cys Gly Met Val Ala Ala His Leu Tyr Asp Leu Lys

195 200 205

Ala Ala Lys Lys Ala Gly Phe Met Thr Ile Tyr Val Glu Arg Pro Gln

210 215 220

Glu Glu Ser Phe Thr Ala Glu Gln Ile Ala Glu Ala Lys Gln Glu Gly

225 230 235 240

Phe Val Asp Leu Trp Leu Glu His Gly Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Val

245 250 255

Ala Glu Arg Leu Gly Ile Leu Lys Glu Thr Arg Pro

260 265

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

Met Ser Ile Ser Pro Leu Pro Lys Ala Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 4

Arg Leu Gly Ile Leu Lys Glu Thr Arg Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成( synthetic sequence)

<400> 5

atgwsnatng wsccnytncc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成( synthetic sequence)

<400> 6

yyanggncmn gtytcyttna 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成( synthetic sequence)

<400> 7

catatgtcta tcagcccact cccg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成( synthetic sequence)

<400> 8

gaatccctac ggcctggttt cctt 24

Claims (7)

1.一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用，该多肽的氨基酸序列为：SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

2.编码黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因在调控微生物生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用，该基因的核苷酸序列为：SEQ ID No.1 所示的核苷酸。

3.一种包含黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的编码基因的重组表达载体，该编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID No.1 所示的核苷酸。

4.一种表达黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的重组微生物菌株，该黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的氨基酸序列为：SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

5.一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于利用黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽与顺式环氧琥珀酸或其盐反应，所述多肽的氨基酸序列为：SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

6.一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于利用权利要求4所述的重组微生物菌株与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。

7.如权利要求6所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于具体为：

1）在合适的培养基中培养重组微生物菌株；

2）将步骤1）中得到的重组微生物菌株的细胞、细胞抽提物或无细胞抽提物或由所述重组微生物菌株纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶固定在固体支持物上或包埋在固定载体中；

3）将步骤1）中得到的重组微生物菌株或步骤2）中得到的制备物与顺式环氧琥珀酸或其盐在适于水解的条件下反应以生产L(+)-酒石酸或其盐；和

4）任选地重复利用上述固定或包埋的酶和/ 或细胞。

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