CN107641622A - 可水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸的腈水解酶 - Google Patents
可水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸的腈水解酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了来源于泛菌属(Pantoea sp.AS‑PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和荠蓝(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用该腈水解酶作为生物催化剂制备对氨甲基苯甲酸中间体对氰基苯甲酸。以相应腈水解酶的静息细胞可催化100g/L的底物，转化率大于99％，本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点，有较大的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因及其蛋白产物，具体涉及来源于泛菌属(Pantoea sp.AS-PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和荠蓝(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用其生物催化制备对氰基苯甲酸，属于应用微生物与酶工程领域。
背景技术
对氨甲基苯甲酸为一种止血剂，适用于肺、肝、胰、前列腺、甲状腺、肾上腺等手术时的异常出血，妇产科和产后出血及肺结核咯血、痰中带血、血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。工业上主要采用对氰基苯甲酸催化氢化法制备对氨甲基苯甲酸。
文献报道的对氰基苯甲酸的生产方法主要有三种：以对氨基苯甲酸为原料的Sandmeyer法、以对甲酰基苯甲酸为原料的氨氧化法与钯催化氰基化法(华西药学杂志，2015，30(5)，528～530)，但是，这些方法普遍存在反应条件苛刻、氰化试剂存在剧毒、环境污染大、价格昂贵等问题。
生物催化法相对于化学法具有反应条件温和、环境友好、无重金属污染等优势。1994年，Turner等报道了使用固定化的红球菌(Rhodococcus sp.)催化对苯二甲腈选择性水解制备对氰基苯甲酸的方法，但是底物浓度只有25mmol/L，产物的收率为62％(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1994,1679～1687)；Meth-Cohn等利用红球菌AJ270(Rhodococcus sp.AJ270)可以实现60mmol/L底物的转化，收率为81％(J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 1997,3197～3204)。
但是，目前已报道的生物催化合成对氰基苯甲酸的方法中，普遍存在底物浓度低、反应时间长、酶催化效率低等问题。
发明内容
针对已报道制备方法中底物浓度低、反应时间长、酶催化效率低等问题，本发明采用基因挖矿的手段，得到的腈水解酶能高效催化对苯二甲腈选择性水解制备对氰基苯甲酸。该过程具有反应条件温和、反应速度快、无污染和工艺路线简单等显著特点。其化学反应式如下：
本发明所述的腈水解酶N1的基因编码333个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.1；N2的基因编码339个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.2；N3的基因编码369个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.3；N4的基因编码334个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.4；N5的基因编码343个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.5；N6的基因编码346个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.6。
本发明的具体步骤如下：
本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对泛菌属(Pantoea sp.AS-PWVM4)的基因NIT1(WP_021186296.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的基因NIT2(NP_190016)、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的基因NIT3(ABD98457.1)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的基因NIT4(U9VXK5)、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的基因NIT5(XP_013627177.1)和荠蓝(Camelinasativa)的基因NIT6(XP_010514769.1)分别进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上相应的酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转入受体菌，即得到所述的产腈水解酶的基因工程菌N1、N2、N3、N4、N5、N6；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了腈水解酶的高效异源表达。
本发明中所述产腈水解酶的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
在本发明中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的腈水解酶即可。
本发明的腈水解酶可以是上述腈水解酶基因工程重组菌的培养物，也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液、或者对提取物腈水解酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。
本发明涉及生物转化合成对氰基苯甲酸的方法，所述方法为：
将所述产腈水解酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，加入pH值为6.0～10.0的缓冲液，底物10～200g/L，20～50℃，200rpm下转化2～24小时，反应完全后经处理得到对氰基苯甲酸，收率大于90％。
反应中适用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可以是水中加入一种或几种适当磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐等。
本发明所述的pH值优选能够保持在腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH值为6.0～10.0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选20～40℃。
本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物为10～200g/L，考虑到反应效果，底物浓度优选大于等于100g/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加底物。
附图说明
图1产物对氰基苯甲酸的核磁氢谱
图2产物对氰基苯甲酸的核磁碳谱
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：高表达基因工程菌的获得
全基因合成由上海旭冠公司完成。
根据泛菌属(Pantoea sp.AS-PWVM4)的基因NIT1(WP_021186296.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的基因NIT2(NP_190016)、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis72W)的基因NIT3(ABD98457.1)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的基因NIT4(U9VXK5)、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的基因NIT5(XP_013627177.1)和荠蓝(Camelina sativa)的基因NIT6(XP_010514769.1)分别进行密码子优化后，以期使基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达，序列见附表。并在基因两端加上相应的酶切位点，构建到相应载体中，得到基因工程菌N1、N2、N3、N4、N5、N6。
将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami中，以构建重组腈水解酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
实施例2基因工程菌的培养和静息细胞的制备
挑取平板上单菌落接种至5ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15h左右作为种子液，按照1％的接种量接种至含600ml的发酵培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导10h以上，以8000rpm离心培养液收集菌体。
实施例3利用N1的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N1的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全(液相色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 5μm,4.6×150mm，流动相：水(0.5％三氟乙酸)/甲醇＝75:25，检测波长：230nm，流速：1.0mL/min)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸10.28g，收率90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.10(d,J＝8.3Hz,2H),7.99(d,J＝8.3Hz,2H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ166.52,135.33,133.13,130.38,118.65,115.53。
实施例4利用N2的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N2的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸10.05g，收率88％。
实施例5利用N3的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N3的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸10.61g，收率95％。
实施例6利用N4的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N4的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸9.61g，收率84％。
实施例6利用N5的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N5的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸10.05g，收率88％。
实施例7利用N6的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N6的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(10.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸10.39g，收率8690％。
实施例8利用N1的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N1的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(20.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应24小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸20.78g，收率90％。
实施例9利用N1的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N1的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(1.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应2小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸1.01g，收率88％。
实施例10利用N3的静息细胞催化对苯二甲腈单次水解
取2.0g N3的静息细胞重悬于90mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入含10mL二甲亚砜的对苯二甲腈(20.0g)悬浊液，然后于30℃、200rpm的摇床反应24小时，HPLC检测显示反应完全，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH 2，抽滤，经乙醇重结晶得到对氰基苯甲酸21.22g，收率92％。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 可水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸的腈水解酶
<130> 2017.10.26
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 333
<212> PRT
<213> 泛菌属(Pantoea sp. AS-PWVM4)
<400> 1
Met Ala Gly Ser Arg Ile Ile Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ile Ala Pro
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Asp Leu His Glu Ala Ser Lys Thr Leu Ala Arg Val Leu Glu Ala Ile
20 25 30
Asp Lys Ala Ala Glu Gln Gly Ala Glu Ile Ile Val Phe Pro Glu Thr
35 40 45
Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe Ile Thr Pro Ala Met Thr
50 55 60
Ala Gly Ala Ala His Leu Lys Leu Tyr Asp Gln Ala Val Val Val Pro
65 70 75 80
Gly Pro Ile Thr His Ala Val Gly Glu Arg Ala Arg Leu Arg Lys Met
85 90 95
Val Val Val Leu Gly Val Asn Glu Arg Asp His Gly Thr Leu Tyr Asn
100 105 110
Thr Gln Leu Val Phe Asp Ala Ser Gly Glu Leu Val Leu Lys Arg Arg
115 120 125
Lys Ile Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met Ile Trp Gly Gln Gly Asp
130 135 140
Gly Ala Gly Leu Lys Val Val Asp Thr Ala Val Gly Arg Val Gly Ala
145 150 155 160
Leu Ala Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Tyr Ser Leu Met
165 170 175
Thr Gln His Glu Glu Ile His Cys Ser Gln Phe Pro Gly Ser Leu Val
180 185 190
Gly Pro Ile Phe Ala Glu Gln Met Asp Val Thr Ile Arg His His Ala
195 200 205
Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Ile Asn Ala Thr Gly Trp Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Gln Ile Asn Glu Leu Thr Ala Asp Pro Ala Leu Gln Lys Gly Leu
225 230 235 240
Arg Gly Gly Cys Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Glu Gly Arg His Leu
245 250 255
Val Pro Pro Leu Thr Glu Gly Glu Gly Ile Leu Ile Ala Asp Leu Asp
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Met Ala Leu Ile Thr Lys Arg Lys Arg Met Met Asp Ser Val Gly His
275 280 285
Tyr Ala Arg Pro Glu Leu Leu Ser Leu Arg Leu Asp Ala Thr Pro Ala
290 295 300
Arg Tyr Val Val Ala Arg Asp Asp Glu Ser Glu Thr Gly Gly Glu Arg
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Asp Ala Glu Arg Ser Val Tyr Ser Pro Ala Ala Asp His
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<210> 2
<211> 339
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliand)
<400> 2
Met Ser Thr Ser Glu Asn Thr Pro Phe Asn Gly Val Ala Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ile Val Arg Ala Thr Ile Val Gln Ala Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr
20 25 30
Pro Ala Thr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Phe Ile Val Glu Ala Ala Ser
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Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Leu Gly Val Gly Val His Asn Glu Glu
65 70 75 80
Gly Arg Asp Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ser Ala Ile Lys Val Pro
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Gly Pro Glu Val Glu Lys Leu Ala Glu Leu Ala Gly Lys Asn Asn Val
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Thr Ala Leu Phe Phe Ser Pro Gln Gly Gln Phe Leu Gly Lys His Arg
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Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Leu Arg Lys Asp Phe Pro Asp His
225 230 235 240
Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp Tyr Asp Asp Lys Glu Pro Asp Ser
245 250 255
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260 265 270
Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp Leu
275 280 285
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His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu His Leu Thr Val Asn Glu His Pro
305 310 315 320
Lys Lys Pro Val Thr Phe Ile Ser Lys Val Glu Lys Ala Glu Asp Asp
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Ser Asn Lys
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<212> PRT
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)
<400> 3
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
260 265 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
275 280 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
290 295 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305 310 315 320
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Lys
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<213> 瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)
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Val Leu His Ser Cys Glu Gly Thr Leu Glu Lys Val Leu Lys Ala Ile
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Asp Asp Ala Ala Val Glu Gly Ala Glu Leu Ile Val Phe Pro Glu Thr
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Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe Val Leu Pro Pro Val Leu
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Val Val Val Leu Gly Val Asn Glu Arg Asp Lys Gly Ser Leu Tyr Asn
100 105 110
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115 120 125
Lys Val Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met Val Trp Gly Gln Gly Asp
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Gly Ser Gly Phe Lys Val Cys Asp Thr Ala Val Gly Arg Val Gly Ala
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Leu Ala Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Tyr Ser Leu Met
165 170 175
Ala Glu His Glu Gln Ile His Cys Ala Gln Phe Pro Gly Ser Met Val
180 185 190
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195 200 205
Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Val Asn Ala Thr Gly Trp Leu Thr Pro
210 215 220
Asp Gln Val Ser Glu Ile Ala Pro Ser Glu Gly Leu Glu Lys Val Leu
225 230 235 240
Arg Gly Gly Cys Tyr Thr Thr Ile Ile Ser Pro Glu Gly Val Pro Leu
245 250 255
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<210> 5
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<212> PRT
<213> 甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var. oleracea)
<400> 5
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Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Met His Ile Ala Met Glu Gly Gly Cys
210 215 220
Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Gln Arg Lys Asp Phe Pro Ala
225 230 235 240
His Val Asp His Leu Phe Thr Asp Trp Tyr Asp Asp Gln His Asp Glu
245 250 255
Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Leu Gly Lys
260 265 270
Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp
275 280 285
Leu Asp Leu Gly Asp Ile Ala Arg Ala Lys Leu Tyr Phe Asp Val Val
290 295 300
Gly His Tyr Ser Lys Pro Asp Val Phe Asn Leu Thr Val Asn Glu His
305 310 315 320
Pro Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Ser Lys Thr Val Lys Ala Glu Asp
325 330 335
Gly Ser Glu Ser Lys Glu Lys
340
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> 荠蓝(Camelina sativa)
<400> 6
Met Ser Ser Ala Lys Glu Met Leu Thr Val Lys Asn Thr Thr Pro Val
1 5 10 15
Asp Gly Val Ala Pro Ser Ser Ile Val Arg Val Thr Ile Val Gln Ala
20 25 30
Ser Thr Val Tyr Asn Asn Thr Pro Ala Thr Leu Asp Lys Ala Glu Lys
35 40 45
Tyr Ile Ala Glu Ala Ala Ser Lys Gly Ala Glu Leu Val Leu Phe Pro
50 55 60
Glu Ala Phe Ile Gly Gly Tyr Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Leu Ala
65 70 75 80
Ala Gly Val His Asn Glu Glu Gly Arg Asp Glu Phe Arg Lys Tyr His
85 90 95
Ala Ser Ala Ile Lys Val Pro Gly Pro Glu Leu Asp Arg Leu Ala Glu
100 105 110
Leu Ala Gly Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Val Val Gly Ala Ile Glu Lys
115 120 125
Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Ala Leu Phe Phe Ser Pro Gln Gly
130 135 140
Arg Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Leu Met Pro Thr Thr Met Glu Arg
145 150 155 160
Cys Ile Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr
165 170 175
Pro Ile Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro
180 185 190
Leu Tyr Arg Thr Ala Leu Tyr Ala Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala
195 200 205
Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Met His Ile
210 215 220
Ala Leu Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Leu
225 230 235 240
Arg Lys Asp Phe Pro Asp His Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Met Asp
245 250 255
Asp Asn Lys Glu Gln Asp Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile
260 265 270
Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu
275 280 285
Gly Leu Ile Thr Ala Asp Leu Asp Leu Gly Asp Ile Ala Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Tyr Phe Asp Ala Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu His
305 310 315 320
Leu Thr Val Asn Glu His Pro Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Thr Lys
325 330 335
Val Glu Lys Ala Glu Asp Asp Ser Asn Asn
340 345
Claims (5)
1.腈水解酶，可作为生物催化剂选择性水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸。
2.如权利要求1所述的腈水解酶，其序列包含了与来源于泛菌属(Pantoea sp.AS-PWVM4)的基因NIT1(WP_021186296.1)或拟南芥(Arabidopsis thaliand)的基因NIT2(NP_190016)或敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的基因NIT3(ABD98457.1)或瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的基因NIT4(U9VXK5)或甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleraceavar.oleracea)的基因NIT5(XP_013627177.1)或荠蓝(Camelina sativa)的基因NIT6(XP_010514769.1)具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述基因具有腈水解酶的活性。
3.如权利要求2所述的基因NIT1、NIT2、NIT3、NIT4、NIT5、NIT6，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
4.如权利要求2所述的腈水解酶，其可以是重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。
5.如权利要求4所述加工的制品是由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的腈水解酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
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