JP2023133181A - 組換え大腸菌および高純度ウルソデオキシコール酸の調製方法 - Google Patents
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- C12Y101/01201—7-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.201)
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Abstract
【課題】本発明は、生物工学技術分野に属し、特に、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および高純度ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製方法の提供。【解決手段】本発明は、新規の二重酵素共発現遺伝子操作細菌、すなわち組換え大腸菌を構築する。細菌は、７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β－ＨＳＤＨ）とグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）とを同時に発現する。細菌は、高純度ＵＤＣＡの調製に適用可能である。７β－ＨＳＤＨとＧＤＨとを併用して発現および適用することにより、標的調製物の収量が増加する。高純度ＵＤＣＡの調製方法は、簡便であり、調製プロセスにおける不純物の発生が少なく、環境保護要件を満たす環境に優しいプロセスであり、重要な産業応用価値を有する。【選択図】なし
Description
本発明は、生物工学技術分野に属し、特に、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および高純度ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製方法に関する。
伝統的な漢方薬の有効成分として、ＵＤＣＡ（３α，７β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸）は、非常に広い臨床応用が認められており、優れた薬学的価値を有している。ＵＤＣＡは、胆石症、肝移植促進、胆汁逆流性胃炎、アルコール性肝臓疾患、胆汁性肝硬変、および薬剤性肝炎の治療において優れた治療効果を発揮し、よって市場における高い需要がある。
現在、ＵＤＣＡは主に天然由来と合成とにより調製されている。天然の供給源は、動物愛護法で保護されている生きたクマの胆嚢や胆汁から抽出したもので、抽出源が限られているため、天然のクマの胆嚢の供給源は徐々に減少している。合成法では、入手が容易な牛やガチョウの胆汁から抽出したケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を用いてＵＤＣＡを化学合成し、酸化還元法を用いて７－ＯＨを構造変化させる方法がとられている。しかし、複雑な反応プロセス、低い選択性、厳しい反応条件、高いエネルギー消費、深刻な汚染など、一連の問題がある。特に、保護および脱保護の際に毒性および危険性を有する試薬が必要であり、よって化学的方法の工業的応用は大きく制限される。現在、化学的方法を用いて調製されたＵＤＣＡは約３０％の市場シェアを占め、純度も約８０％と比較的低く、市場におけるＵＤＣＡの用途や品質に対する要求を満たすには程遠い。
化学的なエピマー化と比較して、ＵＤＣＡの生物学的合成は効率的であり、比較的環境に優しい。微生物による変換または生物学的酵素触媒は、主に、７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α－ＨＳＤＨ）および７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β－ＨＳＤＨ）の展開を伴い、ＣＤＣＡからＵＤＣＡへの生物学的変換を実施するためには、７α－ＨＳＤＨと７β－ＨＳＤＨとを生成するクロストリジウム・リモサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、クロストリジウム・アブソナム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、およびキサントモナス・マルトフィリア（ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）が、使用されている。しかし、高濃度のＣＤＣＡは細胞バイオマスの蓄積を阻害するため、生成物のリサイクルや精製が困難になる。また、これまでの研究では、培養時間の経過とともに中間体の収量が増加し、ＵＤＣＡが減少するため、工業的な調製を実施することは不可能であることが示されている。近年、７α－ＨＳＤＨと７β－ＨＳＤＨとを併用して、ＣＤＣＡを基質とするＵＤＣＡを２工程法で調製する研究が注目されている。現在、研究されている総合的な変換率は９０％を超えている。しかし、反応量はミリリットルレベルであり、工業化には程遠いのが現状である。主な制限的なボトルネックは、以下の通りである。
１）ＣＤＣＡを基質とする２工程法の主要な酵素７β－ＨＳＤＨは極めて不安定である。酵素の活性は十分であるが、触媒反応系ではすぐに不活性になる。
２）２工程法における反応系は、基質量が過度に少なく（体積比１％）、前記系が不安定である。
３）２工程法における２つの主要な酵素は、工業的応用において大規模な供給源の問題に直面する。
４）酵素タンパク質の分離・精製にかかるコストが高すぎる。
１）ＣＤＣＡを基質とする２工程法の主要な酵素７β－ＨＳＤＨは極めて不安定である。酵素の活性は十分であるが、触媒反応系ではすぐに不活性になる。
２）２工程法における反応系は、基質量が過度に少なく（体積比１％）、前記系が不安定である。
３）２工程法における２つの主要な酵素は、工業的応用において大規模な供給源の問題に直面する。
４）酵素タンパク質の分離・精製にかかるコストが高すぎる。
（概要）
本発明は、従来技術の問題点を解決するために、高純度ＵＤＣＡの調製方法を提供し、複数の酵素を共発現する操作された細菌を構築し、ＵＤＣＡの効率的な調製を実施する。本発明は、ＵＤＣＡを低コストで調製できる組換え操作された細菌を提供する。また、本発明は、菌株の構築および応用に関する技術的課題を解決することを目的とする。
本発明は、従来技術の問題点を解決するために、高純度ＵＤＣＡの調製方法を提供し、複数の酵素を共発現する操作された細菌を構築し、ＵＤＣＡの効率的な調製を実施する。本発明は、ＵＤＣＡを低コストで調製できる組換え操作された細菌を提供する。また、本発明は、菌株の構築および応用に関する技術的課題を解決することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明では以下の技術的解決法が採用される。
本発明の第１の目的は、低コストでＵＤＣＡを調製することができる組換え大腸菌を提供することである。前記組換え大腸菌は、７β－ＨＳＤＨおよびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である２つの酵素、をそれぞれ同時に発現し得る。前記組換え大腸菌は、２０２１年１２月２７日にＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。その寄託番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２１１６４４である。
好ましくは、前記７β－ＨＳＤＨはクロストリジウム・アブソナム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ）に由来し、そのＧｅｎＢａｎｋログインナンバーはＪＮ１９１３４５．１である。
好ましくは、前記ＧＤＨは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来し、そのＧｅｎＢａｎｋログインナンバーはＮＣ－０００９６４である。
好ましくは、前記７β－ＨＳＤＨおよび前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化が行われ、前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列、および前記ＧＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるように、コードされる。
好ましくは、組換え細菌の場合、前記７β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子と前記ＧＤＨをコードする遺伝子をともにプラスミドに連結して二遺伝子共発現組換えプラスミドを構築し、前記組換えプラスミドを、対応する菌株に形質転換して、組換え操作された細菌が得られる。
好ましくは、前記組換え大腸菌は、具体的には、以下の方法：
（１）前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子および前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化を行い、全遺伝子合成を行うステップ；
（２）合成された前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子をベクターｐＥＴＤｕｅｔ１に連結し、組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（３）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する大腸菌ＤＨ５α－ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（４）前記大腸菌ＤＨ５α－ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを抗生物質固体プレートに塗布し、スクリーニングを行って陽性形質転換体を得るステップ（ステップ３およびステップ４の目的は、プラスミドに担持されている耐性遺伝子を用いてスクリーニングを行い、連結に成功した組換えプラスミドを得ることである）；
（５）合成された前記ＧＤＨの遺伝子をベクターｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨに連結し、組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（６）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；および
（７）前記大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを抗生物質固体プレートに塗布し、スクリーニングを行って陽性形質転換体を得、前記組換え大腸菌を得るステップ、により構築される。
（１）前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子および前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化を行い、全遺伝子合成を行うステップ；
（２）合成された前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子をベクターｐＥＴＤｕｅｔ１に連結し、組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（３）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する大腸菌ＤＨ５α－ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（４）前記大腸菌ＤＨ５α－ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを抗生物質固体プレートに塗布し、スクリーニングを行って陽性形質転換体を得るステップ（ステップ３およびステップ４の目的は、プラスミドに担持されている耐性遺伝子を用いてスクリーニングを行い、連結に成功した組換えプラスミドを得ることである）；
（５）合成された前記ＧＤＨの遺伝子をベクターｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨに連結し、組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（６）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；および
（７）前記大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを抗生物質固体プレートに塗布し、スクリーニングを行って陽性形質転換体を得、前記組換え大腸菌を得るステップ、により構築される。
好ましくは、前記組換え大腸菌は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として構築される。
本発明の第２の目的は、ＵＤＣＡの調製方法を提供することである。当該方法において、調製は、本発明の任意の前記組換え大腸菌を用いることにより行われる。
好ましくは、ＵＤＣＡの前記調製方法は、完全細胞変換調製（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を行うことである。
好ましくは、完全細胞変換調製の系は、湿重量が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの細胞と、濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの７－オキソ－リトコール酸と、濃度が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌのグルコースとを含み、ｐＨは７．０～９．０であり、反応は１℃～３０℃で１時間～４８時間行われる。
（有益な効果）
本発明は、高純度ＵＤＣＡの調製方法を開示する。本発明は、新規の二重酵素共発現遺伝子操作細菌を構築する。当該細菌は、高純度ＵＤＣＡの調製に適用可能である。７β－ＨＳＤＨとＧＤＨとを併用して発現および適用することにより、標的調製物の収量が増加する。本発明の方法は、簡便であり、プロセスにおける不純物の発生が少なく、環境保護要件を満たす環境に優しいプロセスであり、重要な産業応用価値を有する。
本発明は、高純度ＵＤＣＡの調製方法を開示する。本発明は、新規の二重酵素共発現遺伝子操作細菌を構築する。当該細菌は、高純度ＵＤＣＡの調製に適用可能である。７β－ＨＳＤＨとＧＤＨとを併用して発現および適用することにより、標的調製物の収量が増加する。本発明の方法は、簡便であり、プロセスにおける不純物の発生が少なく、環境保護要件を満たす環境に優しいプロセスであり、重要な産業応用価値を有する。
（実施形態の説明）
以下、本発明を詳細に説明する。その説明にあたり、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される用語は、通常の意味および辞書的意味に限定して解釈されるべきではなく、発明者が最適な解釈をするために用語を適切に定義できるという原則に基づいて、本発明の技術的側面に対応する意味および概念に従って解釈されることが理解されるべきである。したがって、本明細書に示した説明は、説明のための好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の同等の方法または改良がそこから得ることができることを理解されたい。
以下、本発明を詳細に説明する。その説明にあたり、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される用語は、通常の意味および辞書的意味に限定して解釈されるべきではなく、発明者が最適な解釈をするために用語を適切に定義できるという原則に基づいて、本発明の技術的側面に対応する意味および概念に従って解釈されることが理解されるべきである。したがって、本明細書に示した説明は、説明のための好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の同等の方法または改良がそこから得ることができることを理解されたい。
以下の実施形態は、本発明の実施形態の例として列挙されているに過ぎず、本発明を限定するものではなく、本発明の要旨および着想を逸脱しない範囲での変更が本発明の保護範囲に属することは、当業者には理解される。なお、以下の実施形態で使用する試薬および器具は、特に規定がなければ、すべて市販品である。
本発明における遺伝子操作された細菌の機能的核心は、７β－ＨＳＤＨとＧＤＨという２つの酵素を同時に発現させることができることである。操作された細菌の原理は、遺伝子操作された細菌の完全細胞において、ＮＡＤＰを補酵素とするＧＤＨを用いてグルコースを脱水素し、グルコン酸およびＮＡＤＰＨを生成することである。前記７β－ＨＳＤＨは、グルコースを脱水素するプロセスで生成したＮＡＤＰＨを用いて７－オキソ－リトコール酸をＵＤＣＡにすると同時に、補酵素ＮＡＤＰの再生を行う。
１．本発明で使用する菌株とプラスミド
７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨの遺伝子について、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．が大腸菌のコドンバイアスに従って遺伝子配列のコドン最適化および全遺伝子合成を行う。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入する。プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｙｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入する。
７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨの遺伝子について、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．が大腸菌のコドンバイアスに従って遺伝子配列のコドン最適化および全遺伝子合成を行う。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入する。プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｙｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入する。
２．前記７β－ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する大腸菌は、以下の方法：
（１）前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子および前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化を行い、全遺伝子合成を行い、そして７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるように、コードされるステップ；
（２）合成された２つの遺伝子をそれぞれベクターｐＥＴＤｕｅｔ１に順次連結し、前記７β-ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（３）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する、操作された細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；および
（４）前記操作された細菌を培養するステップ、すなわち、前記操作された細菌をＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に接種して培養を行い、前記７β－ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する大腸菌を得るステップ、を用いて構築される。
（１）前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子および前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化を行い、全遺伝子合成を行い、そして７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるように、コードされるステップ；
（２）合成された２つの遺伝子をそれぞれベクターｐＥＴＤｕｅｔ１に順次連結し、前記７β-ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；
（３）前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する、操作された細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ；および
（４）前記操作された細菌を培養するステップ、すなわち、前記操作された細菌をＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に接種して培養を行い、前記７β－ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する大腸菌を得るステップ、を用いて構築される。
３．前記操作された細菌の培養は、以下のステップ：
（１）前記操作された細菌を、活性化のためにＬＢ固体プレート培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、および寒天１５．０ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で１６時間～２０時間培養し、前記ＬＢ固体プレート培地からシングルコロニーを採取し、前記シングルコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を含むＬＢ液体培地を入れたエルレンマイヤーフラスコに接種し、２００ｒｐｍ／分、３７℃で１６時間～２０時間の振とう培養するステップ；
（２）ステップ(１)における培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を１：１００の割合で含むＴＢ液体培地（トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム９．４ｇ／Ｌ、およびリン酸一カリウム２．２ｇ／Ｌ）に接種し、４時間から６時間、２００ｒｐｍ／分、３７℃の条件で振とう培養し、０．４ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で１０時間～１６時間培養を継続し、７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨを共発現する大腸菌である操作された細菌を得るステップ；および
（３）誘導発現の終了後、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収するステップ、を含む。
（１）前記操作された細菌を、活性化のためにＬＢ固体プレート培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、および寒天１５．０ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で１６時間～２０時間培養し、前記ＬＢ固体プレート培地からシングルコロニーを採取し、前記シングルコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を含むＬＢ液体培地を入れたエルレンマイヤーフラスコに接種し、２００ｒｐｍ／分、３７℃で１６時間～２０時間の振とう培養するステップ；
（２）ステップ(１)における培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を１：１００の割合で含むＴＢ液体培地（トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム９．４ｇ／Ｌ、およびリン酸一カリウム２．２ｇ／Ｌ）に接種し、４時間から６時間、２００ｒｐｍ／分、３７℃の条件で振とう培養し、０．４ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で１０時間～１６時間培養を継続し、７β－ＨＳＤＨおよびＧＤＨを共発現する大腸菌である操作された細菌を得るステップ；および
（３）誘導発現の終了後、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収するステップ、を含む。
４.完全細胞変換によるＵＤＣＡの調製
完全細胞変換調製の系は、湿重量が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの細胞と、濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの７－オキソ－リトコール酸と、濃度が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌのグルコースとを含み、ｐＨは７．０～９．０であり、反応は１℃～３０℃で１時間～４８時間行われる。変換の終了後、液体クロマトグラフィーを用いてＵＤＣＡの収量とコンフォメーションとを測定する。
完全細胞変換調製の系は、湿重量が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの細胞と、濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの７－オキソ－リトコール酸と、濃度が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌのグルコースとを含み、ｐＨは７．０～９．０であり、反応は１℃～３０℃で１時間～４８時間行われる。変換の終了後、液体クロマトグラフィーを用いてＵＤＣＡの収量とコンフォメーションとを測定する。
５．サンプルの検出および分析
クロマトグラフィー条件は、ＲＩＤ検出器を使用すること、移動相がアセトニトリル（５０）－水（０．０１２５％リン酸）（５０）、流速が１ｍＬ／分、カラム温度が３５℃、かつ、サンプルサイズが１０μＬ、である。
クロマトグラフィー条件は、ＲＩＤ検出器を使用すること、移動相がアセトニトリル（５０）－水（０．０１２５％リン酸）（５０）、流速が１ｍＬ／分、カラム温度が３５℃、かつ、サンプルサイズが１０μＬ、である。
本発明によって解決される技術的問題、技術的解決法、および有益な効果をより明確に理解するために、本発明は、実施形態と関連して以下に詳細に説明される。なお、本明細書に記載された特定の実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を限定することを意図するものではないことに留意されたい。
実施例１
操作された細菌の構築
１．プラスミドＰＵＣ５７－７β－ＨＳＤＨを含む大腸菌と、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１を含む大腸菌との培養物を増殖させた。サンプルを１０μl採取し、ＬＢ（Ａｍｐ＋）培地５ｍＬに添加した。培養は３７℃のシェーカーで１２時間から１６時間行い、シェーカーの回転数は２００ｒｐｍ／分であった。
１．プラスミドＰＵＣ５７－７β－ＨＳＤＨを含む大腸菌と、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１を含む大腸菌との培養物を増殖させた。サンプルを１０μl採取し、ＬＢ（Ａｍｐ＋）培地５ｍＬに添加した。培養は３７℃のシェーカーで１２時間から１６時間行い、シェーカーの回転数は２００ｒｐｍ／分であった。
２．培養したプラスミド大腸菌は、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したカラムプラスミドミニプレップキット（ｃｏｌｕｍｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐｓ ｋｉｔ）を用いて抽出した。操作は、キットの操作説明書に従って行った。
３．プラスミドＰＵＣ５７－７β－ＨＳＤＨとベクターｐＥＴＤｕｅｔ１とをそれぞれＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）し、抽出した。消化系を下記表１に示す：
消化は３７℃で３時間～６時間行った。Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ，Ｌｔｄ．から購入したカラムＤＮＡゲル抽出キットを用いて、標的セグメントと線形ベクターとをリサイクルし、精製した。
４．リサイクルされた標的遺伝子セグメント７β－ＨＳＤＨと線形ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１とを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その系を下記表２に示す：
連結は２２℃で３０分～６０分行った。
５．連結系により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルの形質転換を行う。
スーパークリーンベンチ（ｓｕｐｅｒ－ｃｌｅａｎ ｂｅｎｃｈ）上で、１０μＬの系を、標準液に従って調製した化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５αに、移入した。混合物を軽く均一に混合し、氷上に３０分間静置した。
スーパークリーンベンチ（ｓｕｐｅｒ－ｃｌｅａｎ ｂｅｎｃｈ）上で、１０μＬの系を、標準液に従って調製した化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５αに、移入した。混合物を軽く均一に混合し、氷上に３０分間静置した。
４２℃、６０秒のヒートショックを行い、前記混合物を氷上に２分間静置した。前記スーパークリーンベンチ上で滅菌済みＬＢ培地を７００μＬ添加した。
前記混合物を３７℃、２００ｒｐｍのシェーカーに入れ、４０分～６０分間活性化し、ＬＢ（Ａｍｐ＋）固体プレート培地に塗布した。
塗布したプレートを３７℃のインキュベーター中に置いた。倒置培養（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を１２時間～１６時間行った。
６．陽性クローンのコロニーＰＣＲ検出
７β－ＨＳＤＨを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれＤｕｅｔＵＰ２とＴ７ｔである。
７β－ＨＳＤＨを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれＤｕｅｔＵＰ２とＴ７ｔである。
ＰＣＲ反応系を、以下の表３に示す。
滅菌した接種リングを用いてスーパークリーンベンチ上で優占のコロニーを採取し、鋳型として使用するためにＰＣＲチューブ中で浸漬した。
ＰＣＲ増幅条件は以下の通りである：９４℃３分、（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３２サイクル、７２℃１０分、および４℃で保存。
７．電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した。標的セグメントを担持する陽性コロニーＤＨ５ａ－ｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを選択した。
前記陽性コロニーをスーパークリーンベンチ上で採取した。ＬＢ（Ａｍｐ＋）液体培地５ｍＬを添加した。混合物をシェーカーにて、３７℃、２００ｒｐｍで振とうした。培養を１２時間～１６時間行った。
８．プラスミドＰＵＣ５７－ＧＤＨを含む大腸菌の培養物を同時に増殖させた。１０μＬのサンプルを採取した。ＬＢ（Ａｍｐ＋）培地５ｍＬを加えた。この混合物を、シェーカー中で３７℃にて１２時間～１６時間培養した。シェーカーの速度は２００ｒｐｍ／分であった。
培養された陽性菌プラスミドおよびプラスミドＰＵＣ５７－ＧＤＨを、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のカラムプラスミドミニプレップキットを用いて抽出し、プラスミドＰＵＣ５７－ＧＤＨおよびベクターｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨは、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化を用いて抽出した。消化系は前記３．の項目と同様であった。標的遺伝子セグメントおよび線形ベクターに対して、ゲルリサイクリングを行った。
９．リサイクルされたＧＤＨ標的遺伝子および線形ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを、連結した。連結系は、前記４．の項目と同様であった。
１０．前記連結系を、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。操作は前記５．の項目と同様であった。
１１．陽性クローンのコロニーＰＣＲ検出：フォワードプライマーおよびリバースプライマーであるｐＥＴ ＵｐｓｔｒｅａｍおよびＤｕｅｔＤＯＷＮ１を用いて、ＧＤＨを増幅した。電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した。スクリーニングを通して、標的セグメントを担持する陽性コロニーｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨが、得られた。ＰＣＲ反応系の条件およびサイクルの条件は、前記６．の項目と同様であった。
１２．陽性クローン細菌を採取した。ＬＢ（Ａｍｐ＋）液体培地５ｍＬを添加した。混合物をシェーカーにて、３７℃、２００ｒｐｍで振とうした。培養を１２時間～１６時間行った、プラスミドを抽出した。消化と検証を行い、ベクターが正しく構築されたことを確認した。ベクターのプロファイルを、図１に示す。
１３．組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現株に移入し、操作された細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得た。
１４．操作された細菌の培養
前記遺伝子操作された細菌を、活性化のためにＬＢ固体プレート培地に接種した。活性化および培養は、３７℃で１６時間～２０時間行った。ＬＢ固体プレート培地からシングルコロニーを採取し、アンピシリン（Ａｍｐ＋）１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地を入れたエルレンマイヤーフラスコに接種し、２００ｒｐｍ／分、３７℃で１６時間～２０時間の振とう培養を行った。
前記遺伝子操作された細菌を、活性化のためにＬＢ固体プレート培地に接種した。活性化および培養は、３７℃で１６時間～２０時間行った。ＬＢ固体プレート培地からシングルコロニーを採取し、アンピシリン（Ａｍｐ＋）１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地を入れたエルレンマイヤーフラスコに接種し、２００ｒｐｍ／分、３７℃で１６時間～２０時間の振とう培養を行った。
この培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を１：１００の割合で含むＴＢ液体培地に移した。振盪培養を、２００ｒｐｍ／分、３７℃で４時間～６時間行った。０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加した。培養を２５℃で１０時間から１６時間継続した。得られた調製物を、今後の使用のために、操作された細菌として保存した。
前記ＬＢ固体培地は、以下の成分：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１０ｇ／Ｌ、および寒天１５．０ｇ／Ｌ、を含む。
前記ＬＢ液体培地は、以下の成分：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１０ｇ／Ｌ、を含む。
前記ＴＢ液体培地は、以下の成分：トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）９．４ｇ／Ｌ、およびリン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）２．２ｇ／Ｌ、を含む。
実施例２
実施例１の誘導発現法に従い、誘導発現が終了した後、菌体を回収した。１００ｍＬの反応系において、細胞の湿重量は３ｇ／Ｌ、グルコースは４ｇ／Ｌ、７－オキソ－リトコール酸は７ｇ／Ｌ、ｐＨ＝８．０、温度１０℃であった。形質転換は１０時間行い、その間、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０±０．２にコントロールした。
図２は、ＵＤＣＡ用に遺伝子操作された細菌の触媒下、７－オキソ－リトコール酸を用いてＵＤＣＡを調製する反応の液相検出結果のプロファイルである。液体クロマトグラフィー検出率９９％超で７－オキソ－リトコール酸を変換してＵＤＣＡを調製した。
前述の酵素、および酵素を共発現する遺伝子操作された細菌の形質転換および構築、菌体の培地成分および培養方法、ならびに完全細胞の生物学的変換は、本発明の好ましい例にすぎず、本発明を限定するために用いられるものではない。理論的には、他の細菌、糸状菌、放線菌、動物細胞はすべてゲノム形質変換を受ける可能性があり、複数遺伝子共発現の完全細胞の触媒に使用される。本発明の原理および趣旨の範囲内で、任意の修正および同等の置換を行うことができる。
Claims (6)
- 組換え大腸菌であって、前記組換え大腸菌が、７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β－ＨＳＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を同時に発現し、
前記７β－ＨＳＤＨおよび前記ＧＤＨが、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１によって共発現され、かつ
前記組換え大腸菌の宿主細菌が、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、組換え大腸菌。 - 前記組換え大腸菌が、以下の方法、
前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子および前記ＧＤＨの遺伝子に対してそれぞれコドン最適化を行い、全遺伝子合成を行うステップ、
合成された前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子を、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ１に最初に連結し、組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨを得、次いで、前記ＧＤＨの遺伝子を前記プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－７β－ＨＳＤＨに連結し、前記７β－ＨＳＤＨと前記ＧＤＨとを共発現する組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ、
前記ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに移入し、前記組換えプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを得るステップ、および、
前記大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを培養し、前記組換え大腸菌を得るステップ、により構築される、請求項１に記載の組換え大腸菌。 - ステップ（１）において、前記７β－ＨＳＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列および前記ＧＤＨの遺伝子のヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるように、コードされ、コドン最適化が行われ、
ステップ（４）において、大腸菌の前記培養が、以下のステップ、
前記大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ１－ＧＤＨ－７β－ＨＳＤＨを、活性化および培養のためにＬＢ固体プレート培地に接種し、前記ＬＢ固体プレート培地からシングルコロニーを採取し、前記シングルコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を含むＬＢ液体培地を入れたエルレンマイヤーフラスコ、に接種し、振とう培養するステップ、
ステップ（１）における培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ＋）を含むＴＢ液体培地に移し、ある一定時間振とう培養し、０．４ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養を継続するステップ；および
誘導発現終了後、遠心分離して細胞を回収し、操作された細菌として前記組換え大腸菌を得るステップ、を含む、請求項２に記載の組換え大腸菌。 - 前記ＬＢ固体プレート培地が、以下の成分：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、および寒天１５．０ｇ／Ｌ、を含み、
前記ＬＢ液体培地が、以下の成分：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、および塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、を含み、かつ、
前記ＴＢ液体培地が、以下の成分：トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム９．４ｇ／Ｌ、およびリン酸一カリウム２．２ｇ／Ｌ、を含む、請求項３に記載の組換え大腸菌。 - 調製が、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え大腸菌を用いて実施される、高純度ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製方法。
- 前記調製方法が、完全細胞変換調製を行うことであり、前記完全細胞変換調製の系が、湿重量が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの細胞と、濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌの７－オキソ－リトコール酸と、濃度が１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌのグルコースとを含み、前記系のｐＨが７．０～９．０であり、反応が、１℃～３０℃、１時間～４８時間の条件で行われる、請求項５に記載の高純度ＵＤＣＡの調製方法。
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