JP7159322B2 - 生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用 - Google Patents
生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、バイオテクノロジーの分野に属し、遺伝子工学的方法により生体酵素を修飾した後、タウロケノデオキシコール酸の生体内変換を効率的に触媒する方法に関し、具体的には、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法、および生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の応用に関する。
第1の態様では、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法を提供し、遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、ここで、前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択される。
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の有益な効果は、以下のとおりである:
(1)本出願が提供した生体内変換方法を使用すると、変換される基質の濃度を高め、基質の濃度を250g/Lに達させることができ、反応時間は短く、かつ基質への変換率は98%以上に達し、得られた製品の純度は99%以上である;
(2)上記の特定発現した大腸菌を生物工学菌として使用すると、生体内変換プロセス中、反応中間体であるタウリン7-ケトリトコール酸は高効率でタウロウルソデオキシコール酸に変換され、最終製品にはほとんど副産物が含まれない;
(3)7α-ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび7β-ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼを使用すると、反応系でNAD+を循環再生させ、補酵素NAD+の使用量を大幅に減らし、酵素触媒反応のコストを削減し、工業規模の拡大に資する;
(4)ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素は、柔軟なポリペプチド配列によって結合されて融合タンパク質多量体として構築され、基質と補酵素への結合距離をより近づけ、変換反応を促進し、工業生産において発酵の回数を減らし、プロセスを簡素化し、時間コストと原料コストを節約する;
(5)本出願では、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび7β-ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼの全細胞をタウロケノデオキシコール酸の変換に使用でき、細胞の破砕、細胞液の清澄化、酵素のアフィニティ精製などの高費用のかかる工業ステップを回避し、コストを大幅に節約し、かつプロセスは簡単で制御可能である。
「第一」、「第二」などの用語は説明上の便宜を図るためのものに過ぎず、相対的な重要度を指示や示唆するもの、或いは技術的特徴を指示する数を実質的に含むものとして理解できない。別途、明確かつ具体的に限定されていない限り、「複数」は二つ以上を意味する。
第1の態様では、本出願のいくつかの実施例は、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法を提供し、遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、ここで、前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択される。
(1)本出願が提供した生体内変換方法を使用すると、変換される基質の濃度を高め、基質の濃度を250g/Lに達させることができ、反応時間は短く、かつ基質への変換率は98%以上に達し、得られた製品の純度は99%以上である;
(2)上記の特定発現した大腸菌を生物工学菌として使用すると、生体内変換プロセス中、反応中間体であるタウリン7-ケトリトコール酸は高効率でタウロウルソデオキシコール酸に変換され、最終製品にはほとんど副産物が含まれない;
(3)7α-ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび7β-ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼを使用すると、反応系でNAD+を循環再生させ、補酵素NAD+の使用量を大幅に減らし、酵素触媒反応のコストを削減し、工業規模の拡大に資する;
(4)ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素は、柔軟なポリペプチド配列によって結合されて融合タンパク質多量体として構築され、基質と補酵素への結合距離をより近づけ、変換反応を促進し、工業生産において発酵の回数を減らし、プロセスを簡素化し、時間コストと原料コストを節約する;
(5)本出願では、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび7β-ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼの全細胞をタウロケノデオキシコール酸の変換に使用でき、細胞の破砕、細胞液の清澄化、酵素のアフィニティ精製などの高費用のかかる工業ステップを回避し、コストを大幅に節約し、かつプロセスは簡単で制御可能である。
本出願の実施例において、前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:2であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:4であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:6であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:8である。
いくつかの実施例において、前記工学菌を構築する方法は、以下を含む:
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌BL21のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る。
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHをそれぞれ取得し、または
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)をそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHをそれぞれ取得する。
いくつかの実施例において、前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、SEQ ID NO:10であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、SEQ ID NO:12である。
本出願の実施例において、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:タウロケノデオキシコール酸を基質とし、3mLの反応系に2.97mLの100mM pH8.0のリン酸緩衝液、最終濃度0.5mMのタウロケノデオキシコール酸、10μLの希釈酵素溶液、最終濃度0.5mMのNADP+を添加し、pH8.0と25℃で1min反応させ、340nmでの吸光値の増加を測定する。
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD+を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させる。
(1)遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7α-HSDH、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子LDH、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7β-HSDH、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子GDHと表記される。
(2)工学菌の構築
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌BL21のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る。
(3)工学菌の培養
工学菌の小規模発酵発現:工学菌の菌液をアンピシリン耐性のLBプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む5mLのLB培地に接種し、37℃、220rpmで培養し、OD値が0.8-1.2の場合、1mM IPTGを添加して2h誘導し、SDS-PAGEで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、20μLの菌種を200mLのアンピシリン耐性LB培地に接種して一晩培養し、OD値が2.5-4.0の場合、2mLの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、OD値が1の場合、IPTGを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集する。
工学菌の大規模発酵発現:工学菌を選別してアンピシリン耐性LB培地の1Lの三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩培養し、OD600値が2.5-4.0の場合、培養液20mLをそれぞれ、1Lのアンピシリン耐性培地10本が入った3Lの三角フラスコに接種し、37℃、140rpmで一晩培養し、そして、10Lの種液を、200Lの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、37℃で、通気撹拌しながら8時間培養し、8時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度0.1mMのIPTG溶液を添加して誘導し、10-12h誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して4℃で保存し、少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。
(4)基質の変換
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD+を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させる。
(5)生成物の調製
ステップ(4)で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、2-10倍の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール-水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する。
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHをそれぞれ取得し、または
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)をそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHをそれぞれ取得する。
(1)遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7α-HSDH、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子LDH、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7β-HSDH、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子GDHと表記される。
(2)単一遺伝子発現ベクターの構築
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHを取得する。
(3)二重遺伝子発現ベクターの構築
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHを取得する。
(4)単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)を取得する。
(5)単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHを取得する。
(6)単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHを取得する。
(7)工学菌の構築
ステップ(2)-ステップ(6)で構築されたすべての発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)のコンピテント細胞に変換し、工学菌を得る。
(8)工学菌の小規模発酵発現
工学菌の菌液をアンピシリン耐性のLBプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む5mLのLB培地に接種し、37℃、220rpmで培養し、OD値が0.8-1.2の場合、1mM IPTGを添加して2h誘導し、SDS-PAGEで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、20μLの菌種を200mLのアンピシリン耐性LB培地に接種して一晩培養し、OD値が2.5-4.0の場合、2mLの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、OD値が1の場合、IPTGを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集する。
(9)工学菌の大規模発酵発現
工学菌を選別してアンピシリン耐性LB培地の1Lの三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩培養し、OD600値が2.5-4.0の場合、培養液20mLをそれぞれ、1Lのアンピシリン耐性培地10本が入った3Lの三角フラスコに接種し、37℃、140rpmで一晩培養し、そして、10Lの種液を、200Lの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、37℃で、通気撹拌しながら8時間培養し、8時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度0.1mMのIPTG溶液を添加して誘導し、10-12h誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して4℃で保存し、少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。
(10)酵素活性の測定
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:タウロケノデオキシコール酸を基質とし、3mLの反応系に2.97mLの100mM pH8.0のリン酸緩衝液、最終濃度0.5mMのタウロケノデオキシコール酸、10μLの希釈酵素溶液、最終濃度0.5mMのNADP+を添加し、pH8.0と25℃で1min反応させ、340nmでの吸光値の増加を測定する。
(11)タウロケノデオキシコール酸のタウロウルソデオキシコール酸への変換
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD+を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させる。
(12)タウロウルソデオキシコール酸の調製
ステップ(11)で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、2-10倍の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール-水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する。
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の応用の有益な効果は、以下のとおりである:生体内変換法によって調製されたタウロウルソデオキシコール酸の変換液において、アルカリ溶解してウルソデオキシコール酸を調製し、化学法でウルソデオキシコール酸を合成する場合に大量の有機溶剤を使用することを回避し、かつこの方法では、反応時間が短く、反応が穏やかで制御可能で、操作が簡単である。
上記の酵素はすべて、液体酵素または固定化酵素であってもよく、全細胞、未精製酵素または精製酵素であってもよい。
以下、具体的な実施例と組み合わせて説明する。
単一遺伝子発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpETDuet-1-7α-HSDHの調製
Campylobacter hyointestinalisに由来する7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子(DNA配列:SEQ ID NO:1、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:2)については、プライマー対(SEQ ID NO:13)5´-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:14)5´-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´を使用してPCRで増幅し、BamH IおよびEcoR Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。BamH IおよびEcoR IでpETDuet-1ベクターを切断する。リガーゼを使用して7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーティングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpETDuet-1-LDHの調製
Humanに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(DNA配列:SEQ ID NO:3、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:4)については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpETDuet-1-7β-HSDHの調製
Collinsella aerofaciens ATCC 25986に由来する7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異体(A78C、V116C)(DNA配列:SEQ ID NO:5、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:6)については、プライマー対(SEQ ID NO:17)5´-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:18)5´-CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´を使用してPCRで増幅し、BamH IおよびEcoR Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。BamH IおよびEcoR IでpETDuet-1ベクターを切断する。リガーゼを使用して7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpETDuet-1-GDHの調製
Bacillus subtilis (strain 168)に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子(DNA配列:SEQ ID NO:7、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:8)については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
双遺伝子共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプ ラスミドpETDuet-1-7α-HSDH/LDHの調製
Humanに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva Iで上記の正しく配列決定されたpETDuet-1-7α-HSDHプラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpETDuet-1-7β-HSDH/GDHの調製
Bacillus subtilis (strain 168)に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva Iで上記の正しく配列決定されたpETDuet-1-7β-HSDHプラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子発現融合タンパク質ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子組換えプラスミドpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)の調製
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子(DNA配列:SEQ ID NO:9、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:10)については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:14)5´-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´を使用してPCRで増幅し、BamH IおよびEcoR Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。BamH IおよびEcoR IでpETDuet-1ベクターを切断する。リガーゼを使用して7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子組換えプラスミドpETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)の調製
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子(DNA配列:SEQ ID NO:11、コードされたタンパク質配列:SEQ ID NO:12)については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:18)5´-CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´を使用してPCRで増幅し、BamH IおよびEcoR Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。BamH IおよびEcoR IでpETDuet-1ベクターを切断する。リガーゼを使用して7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDHの調製
Humanに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドpETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHの調製
Bacillus subtilis (strain 168)に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)プラスミドを切断し、リガーゼを使用してグルコースデヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDHの調製
Campylobacter hyointestinalisに由来する7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:20)5´-TCCCTCGAGTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)プラスミドを切断し、リガーゼを使用して7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドpETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHの調製
Collinsella aerofaciens ATCC 25986に由来する7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異体(A78C、V116C)については、プライマー対(SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´および(SEQ ID NO:21)5´-TCCCTCGAGTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´を使用してPCRで増幅し、Nde IおよびAva Iで切断し、Dpn I酵素でテンプレートを消化する。Nde IおよびAva IでpETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)プラスミドを切断し、リガーゼを利用して7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をDH5αに変換し、アンピシリン耐性のLBプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、5mL LBに接種して一晩培養する。菌体を収集し、TIANGEN製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
組換えプラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)菌種を20μL取り、200mLのアンピシリン耐性LB培地に接種し、37℃、220rpmで、一晩培養し、OD600値は2.5-4.0である。20mLの培養液を1Lアンピシリン耐性培地に接種し、37℃、140rpmで、3時間培養し、OD600値が1の場合、0.5mM IPTGを添加して一晩の発現を誘導する。遠心分離して菌体を収集する。少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。技術的解決手段における方法により、酵素活性を測定する。
実施例2 発酵槽での組換えプラスミドを含む大腸菌の発酵発現
組換えプラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)菌種を20μL取り、200mLアンピシリン耐性LB培地に接種し、37℃、220rpmで、一晩培養し、OD600値は2.5-4.0である。20mLの培養液を1Lアンピシリン耐性培地に接種し、37℃、140rpmで、一晩培養する。10Lの種液を、200Lの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、37℃で、通気撹拌しながら8時間培養する。大腸菌高密度発酵培地には、18g/Lのリン酸水素二カリウム十二水和物、6.8g/Lのリン酸二水素カリウム、0.7g/Lの無水硫酸ナトリウム、0.48g/Lの硫酸マグネシウム、2.25g/Lのグリセリン、2.5g/Lの酵母粉末、5g/Lのペプトンが含まれている。8時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度0.1mMのIPTG溶液を添加して誘導し、10-12h誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して4℃で保存する。少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。技術的解決手段における方法により、酵素活性を測定する。
実施例3 1L反応系での単一遺伝子発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
250gのタウロケノデオキシコール酸を700mLの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.25mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ(約5gの純粋な酵素を含む)および乳酸デヒドロゲナーゼ(約2gの純粋な酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を1Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ(約5gの純粋な酵素を含む)およびグルコースデヒドロゲナーゼ(約2gの純粋な酵素を含む)の大腸菌を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は98%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例4 1L反応系での双遺伝子共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
250gのタウロケノデオキシコール酸を700mLの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.25mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ(合計約10gの酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を1Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ(合計約10gの酵素を含む)を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は98%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例5 1L反応系での単一遺伝子発現融合タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
250gのタウロケノデオキシコール酸を700mLの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.25mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ(約5gの酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を1Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ(約5gの酵素を含む)を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は99.7%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例6 1L反応系での単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
250gのタウロケノデオキシコール酸を700mLの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.20mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼ(合計約7gの酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を1Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼ(合計約7gの酵素を含む)を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は98.5%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例7 1L反応系での単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
250gのタウロケノデオキシコール酸を700mLの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.50mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼと7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ(合計約7gの酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を1Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼと7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ(合計約7gの酵素を含む)を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は99.5%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例8 100L反応系での単一遺伝子発現融合タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
25Kgのタウロケノデオキシコール酸を70Lの100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.25mMのNAD+を添加し、60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ(約500gの酵素を含む)を添加し、100mMグリシン緩衝液を100Lまで追加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。100g/Lのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ(約500gの酵素を含む)を添加し、5M NaOHでpHを7.5に調整する。25℃で、6-18h反応させる。基質変換率は99.5%以上であり、完成品の含有量は96.8%以上であり、収量は85%を超える。
実施例3-8における7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの使用量、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの使用量、NAD+の添加量および基質変換率は、以下の表1に示す。
上記の変換した反応液を、ペースト状に回転蒸発し、10倍の体積の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去する。上澄みを真空乾燥して、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得る。反応後のタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分離用HPLCによってC18シリカゲルパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注ぎ(カラムサイズ 15*255mm)、その後、30%メタノール-水溶液で調製した移動相Aをステンレスカラムに注入して溶出させ、溶出速度を240mL/hとし、溶出時間を175分間とし、溶出液1を収集し、続いて、移動相の勾配を50分間以内に直線的に50%移動相B(80%メタノール-水溶液)に増加して溶出させ、50%移動相Bで75分間溶出させ、溶出液2を収集し、そして、溶出勾配を40分間以内に直線的に100%移動相Bに増加し、100%移動相Bで70分間溶出させ、溶出液3を収集し、そして、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸胆酸の純度を測定し、質量部として、そこで、溶出液1におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は5.77%であり、回収量は8.2%であり、溶出液2におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は99.3%であり、回収量は81.5%であり、溶出液3におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は14.9%であり、回収量は10.3%である。実施例9で調製されたタウロウルソデオキシコール酸のHPLCチャートは図3に示す。
実施例10 ウルソデオキシコール酸の調製
上記の変換した反応液に水酸化ナトリウムを添加し、pHを10に調整し、温度を100℃に上げ、24h反応させ、温度を10℃に下げ、塩酸を添加してpHを4に調整し、ウルソデオキシコール酸を析出する。つまり、ウルソデオキシコール酸の粗生成物を得る。
Claims (18)
- 遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌に由来する酵素により基質を変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、
前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択され、
前記基質の濃度は20g/Lより大きく、250g/L以下であり、
前記基質の変換方法は、
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD + を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、最終体積において前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体の再懸濁液を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を該最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、
そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、最終体積において前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体の再懸濁液を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させることを、含むことを特徴とする生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌に由来する酵素により基質を変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、
前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択され、
前記基質の濃度は20g/Lより大きく、250g/L以下であり、
前記基質の変換方法は、
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD + を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、最終体積において前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体の精製または部分的に精製された細胞溶解液を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を該最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、
そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、最終体積において前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体の精製または部分的に精製された細胞溶解液を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させることを、含むことを特徴とする生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの発現酵素は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ単一発現酵素、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択され、
前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの発現酵素は、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ単一発現酵素、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素とグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択されることを特徴とする請求項1または2に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 7α-ステロイドデヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:1であり、乳酸デヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:3であり、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:5であり、およびグルコースデヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:7であることを特徴とする請求項1または2に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子のA78およびV116の部位を変異させることを特徴とする請求項4に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:2であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:4であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:6であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はSEQ ID NO:8であることを特徴とする請求項4または5に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 前記工学菌を構築する方法は、
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌BL21のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得ること、を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 7α-ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は7α-HSDHと表記され、乳酸デヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はLDHと表記され、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は7β-HSDHと表記され、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はGDHと表記され、前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである:
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHをそれぞれ取得し、または
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)をそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHをそれぞれ取得することを特徴とする請求項7に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 前記7α-HSDHは、Campylobacter hyointestinalis(UniProt:CDQ67_02445)に由来し、前記LDHは、Human(UniProt:P00338)に由来し、前記7β-HSDHは、Collinsella aerofaciens ATCC 25986(UniProt:A4ECA9)に由来し、および、前記GDHは、Bacillus subtilis (strain 168) (UniProt:P12310)に由来することを特徴とする請求項8に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のDNA配列は、SEQ ID NO:9であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のDNA配列は、SEQ ID NO:11であることを特徴とする請求項8に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、SEQ ID NO:10であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、SEQ ID NO:12であることを特徴とする請求項8に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 前記タウロウルソデオキシコール酸の調製方法は、
変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、2-10倍の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール-水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定することを、含むことを特徴とする請求項1または2に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法であって、
遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌に由来する酵素により基質を変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、
前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択され、
前記基質の濃度は20g/Lより大きく、250g/L以下であり、
前記タウロウルソデオキシコール酸の調製方法は、
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7α-HSDH、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子LDH、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7β-HSDH、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子GDHと表記される遺伝子コドンの最適化ステップ(1)と、
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌BL21のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る工学菌の構築ステップ(2)と、
工学菌の小規模発酵発現:工学菌の菌液をアンピシリン耐性のLBプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む5mLのLB培地に接種し、37℃、220rpmで培養し、OD値が0.8-1.2の場合、1mM IPTGを添加して2h誘導し、SDS-PAGEで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、20μLの菌種を200mLのアンピシリン耐性LB培地に接種して一晩培養し、OD値が2.5-4.0の場合、2mLの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、OD値が1の場合、IPTGを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集し、
工学菌の大規模発酵発現:工学菌を選別してアンピシリン耐性LB培地の1Lの三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩培養し、OD600値が2.5-4.0の場合、培養液20mLをそれぞれ、1Lのアンピシリン耐性培地10本が入った3Lの三角フラスコに接種し、37℃、140rpmで一晩培養し、そして、10Lの種液を、200Lの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、37℃で、通気撹拌しながら8時間培養し、8時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度0.1mMのIPTG溶液を添加して誘導し、10-12h誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して4℃で保存し、少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る工学菌の培養ステップ(3)と、
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD+を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、最終体積において前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を該最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、最終体積において前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させる基質の変換ステップ(4)と、
ステップ(4)で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、2-10倍の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール-水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する生成物の調製ステップ(5)と、
を含むことを特徴とする生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである:
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHをそれぞれ取得し、または
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのpETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)をそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHをそれぞれ取得し、または
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのpETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHをそれぞれ取得することを特徴とする請求項13に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - 前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:1であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:3であり、前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼDNA配列はSEQ ID NO:5であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのDNA配列はSEQ ID NO:7であることを特徴とする請求項13に記載の生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
- 生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法であって、
遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌に由来する酵素により基質を変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、
前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択され、
前記基質の濃度は20g/Lより大きく、250g/L以下であり、
前記生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の具体的なステップは、以下の(1)~(12)のとおりである:
(1)遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7α-HSDH、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子LDH、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子7β-HSDH、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子GDHと表記され、
(2)単一遺伝子発現ベクターの構築
7α-HSDH、LDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-7α-HSDH、pETDuet-1-LDH、pETDuet-1-7β-HSDH、pETDuet-1-GDHを取得し、
(3)二重遺伝子発現ベクターの構築
7α-HSDHおよびLDH、7β-HSDHおよびGDHをそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-7α-HSDH/LDH、pETDuet-1-7β-HSDH/GDHを取得し、
(4)単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)を取得し、
(5)単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDHを取得し、
(6)単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7α-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と7β-ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれpETDuet-1ベクターに構築し、pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH、pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDHを取得し、
(7)工学菌の構築
ステップ(2)-ステップ(6)で構築されたすべての発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)のコンピテント細胞に変換し、工学菌を得て、
(8)工学菌の小規模発酵発現
工学菌の菌液をアンピシリン耐性のLBプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む5mLのLB培地に接種し、37℃、220rpmで培養し、OD値が0.8-1.2の場合、1mM IPTGを添加して2h誘導し、SDS-PAGEで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、20μLの菌種を200mLのアンピシリン耐性LB培地に接種して一晩培養し、OD値が2.5-4.0の場合、2mLの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、OD値が1の場合、IPTGを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集し、
(9)工学菌の大規模発酵発現
工学菌を選別してアンピシリン耐性LB培地の1Lの三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩培養し、OD600値が2.5-4.0の場合、培養液20mLをそれぞれ、1Lのアンピシリン耐性培地10本が入った3Lの三角フラスコに接種し、37℃、140rpmで一晩培養し、そして、10Lの種液を、200Lの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、37℃で、通気撹拌しながら8時間培養し、8時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度0.1mMのIPTG溶液を添加して誘導し、10-12h誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して4℃で保存し、少量の菌体を取り、100mMリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得て、
(10)酵素活性の測定
7α-ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:タウロケノデオキシコール酸を基質とし、3mLの反応系に2.97mLの100mM pH8.0のリン酸緩衝液、最終濃度0.5mMのタウロケノデオキシコール酸、10μLの希釈酵素溶液、最終濃度0.5mMのNADP+を添加し、pH8.0と25℃で1min反応させ、340nmでの吸光値の増加を測定し、
乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:ピルビン酸ナトリウムを基質とし、3mLの反応系に2.7mLの100mMリン酸緩衝液(pH8.0)、0.2mLの100mMピルビン酸ナトリウム、50μLの希釈酵素溶液、最終濃度0.2mMのNADHを添加し、pH8.0と25℃で1min反応させ、340nmでの吸光値の減少を測定し、
7β-ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:タウロウルソデオキシコール酸を基質とし、3mLの反応系に2.97mLの100mMリン酸緩衝液(pH8.0)、最終濃度0.5mMのタウロウルソデオキシコール酸、10μLの希釈酵素溶液、最終濃度0.5mMのNADP+を添加し、pH8.0と25℃で1min反応させ、340nmでの吸光値の増加を測定し、
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである:グルコースを基質とし、3mLの反応系に2.7mLの100mMリン酸緩衝液(pH8.0)、0.2mLの1.5Mグルコース、50μLの希釈酵素溶液、最終濃度2mMのNADP+を添加し、pH8.0と25℃で2min反応させ、340nmでの吸光値の増加を測定し、
(11)タウロケノデオキシコール酸のタウロウルソデオキシコール酸への変換
タウロケノデオキシコール酸を20-100mMグリシン緩衝液に溶解し、0.01-0.8mMのNAD+を添加し、5-60g/Lのピルビン酸ナトリウムを添加し、最終体積において前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての前記7α-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、20-100mMグリシン緩衝液を該最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、そして、1.8-100g/Lのグルコースを添加し、最終体積において前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの合計が5~10g/Lとなるように、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての前記7β-ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでpHを6.5-8.5に調整し、25℃で、6-18h反応させ、
(12)タウロウルソデオキシコール酸の調製
ステップ(11)で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、2-10倍の無水エタノールまたは95%エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、0.22umの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール-水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定することを特徴とする生体変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。 - ウルソデオキシコール酸の調製における請求項1-16のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 前記調製方法は、
水酸化ナトリウムを変換したタウロウルソデオキシコール酸溶液に添加し、pHを8-11に調整し、温度を80-100℃に上げ、18-24h反応させ、温度を10-15℃に下げ、塩酸を添加してpHを3-5に調整し、ウルソデオキシコール酸を析出することであることを特徴とする請求項17に記載の使用。
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