CN112646765B - 一种降低菌株胆固醇能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降低菌株胆固醇能力的方法，属于微生物领域。本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法包括如下步骤：将菌株加入到培养基中，并加入胆固醇和\或牛胆汁进行培养。因为乳酸脱氢酶是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，如果阻断这一转化途径，培养基的pH值会发生变化，本发明基于这一假设通过敲除ldh关键酶基因，再结合敲除bsh基因的菌株进行一系列实验验证，从而得出培养基中的pH值会对菌株的降胆固醇能力产生一定的影响。所以本发明通过对比野生型菌株L.plantarum AR113和敲除菌株的生长特性、培养基pH值及其降胆固醇能力的差异，来佐证BSH和培养基pH值对益生菌L.plantarum AR113降解胆固醇的影响。

Description

一种降低菌株胆固醇能力的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种降低菌株胆固醇能力的方法。

背景技术

植物乳杆菌体外降胆固醇的能力受到多种因素的影响，并且不同菌株间表现出差异性。近年来，在体外高效降解胆固醇的益生菌菌株的研究中，主要作用是源于其产生多量或高活性的BSH，即BSH在体外降胆固醇方面发挥重要作用，如乳酸乳球菌亚种KS4和P1、嗜热链球菌Tx、植物乳杆菌FB003、植物乳杆菌H13和植物乳杆菌Lp91等。

乳酸脱氢酶(LDH)是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，如果阻断这一转化途径，培养基的pH值会发生变化，基于这一假设，还没有实验对这一假设进行验证。胆固醇摄入量过高，会引起冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病，严重威胁人体的健康，增加病亡率。研究表明益生菌对人体健康的有益作用之一是降低胆固醇。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种降低菌株胆固醇能力的方法。

本发明提供了一种降低菌株胆固醇能力的方法，具有这样的特征，包括如下步骤：将菌株加入到培养基中，并加入胆固醇和\或牛胆汁进行培养。

在本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法中，还具有这样的特征：其中，菌株为敲除ldh基因的菌株。

在本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法中，还具有这样的特征：其中，敲除ldh基因的菌株的制备方法包括：步骤1，制备菌株感受态细胞；步骤2，将质粒导入菌株感受态细胞中，得含质粒的菌株感受态细胞；以及步骤3，构建ldh敲除质粒并电转入含质粒的菌株感受态细胞中，涂布、培养24-48h，得敲除ldh基因的菌株。

在本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法中，还具有这样的特征：其中，涂布在红霉素和氯霉素双抗性的平板上进行。

在本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法中，其特征在于：其中，培养基为MRS培养基、含有胆固醇的MRS培养基、含有牛胆汁的MRS培养基或含有胆固醇和牛胆汁的MRS培养基中的任意一种。

在本发明提供的降低菌株胆固醇能力的方法中，其特征在于：其中，菌株为植物乳杆菌AR113。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的降低菌株胆固醇能力的方法，因为包括如下步骤：将菌株加入到培养基中，并加入胆固醇和\或牛胆汁进行培养。因为乳酸脱氢酶是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，如果阻断这一转化途径，培养基的pH值会发生变化，基于这一假设通过敲除ldh关键酶基因，再结合敲除bsh基因的菌株进行一系列实验验证，从而得出培养基中的pH值会对菌株的降胆固醇能力产生一定的影响。所以本发明通过对比野生型菌株L.plantarum AR113和敲除菌株的生长特性、培养基pH值及其降胆固醇能力的差异，来佐证BSH和培养基pH值对益生菌L.plantarum AR113降解胆固醇的影响。

附图说明

图1是本发明的实施例1中ldh基因敲除的验证；

图2是本发明的实施例3中菌株在4种培养基中的生长曲线；

图3是本发明的实施例4中菌株在4种培养基中的pH值；以及

图4是本发明的实施例5中菌株培养24h在MC培养基及MCB培养基中胆固醇去除率。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。

下述实施例中的菌株来源如下：

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR113菌株已于2017年03月22日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其编号为CGMCCNo.13909。

下述实施例中四种培养基的配方如下：

MRS培养基：蛋白胨10.0g、磷酸氢二钾2.0g、牛肉浸出粉10.0g、酵母膏5.0g、硫酸锰0.25g、无水乙酸钠5.0g、葡萄糖20.0g、硫酸镁0.58g、Tween-801.0mL，加去离子水定容1000mL。固体培养基需要在此基础上加20g的细菌琼脂粉。115℃，灭菌20min。

MC培养基：精确称取胆固醇0.5g，用少量无水乙醇溶解并定容50mL，终浓度为10mg/mL。用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤除菌，按照1％(v/v)的量加入到已灭菌的MRS液体培养基中，使MRS液体培养基中胆固醇终浓度为0.1mg/ml。

MB培养基：MRS培养基中，加入0.1％(w/v)牛胆粉。

MCB培养基：MC培养基中，加入0.1％(w/v)牛胆粉。

下述实施例中载体pLH0的序列如下：

GTCGACCCTTCAATAGAGTTCTTAACGTTAATCCGAAAAAAACTAACGTTAATATTAAAAAATAAGATCCGCTTGTGAATTATGTATAATTTGATTAGACTAAAGAATAGGAGAAAGTATGATGATATTTAAAAAACTTTCTCGTTAAGATAGGTTGTTGGTGAGCATGTTATATACGGATGTATCGGTTTCCTTAATGCAAAATTTTGTTGCTATCTTATTAATTTTTCTATTATATAGATATATTCAAAGAAAGATAACATTTAAACGGATCATATTAGATATTTTAATAGCGATTATTTTTTCAATATTATATCTGTTTATTTCAGATGCGTCATTACTTGTAATGGTATTAATGCGATTAGGGTGGCATTTTCATCAACAAAAAGAAAATAAGATAAAAACGACTGATACAGCTAATTTAATTCTAATTATCGTGATCCAGTTATTGTTAGTTGCGGTTGGGACTATTATTAGTCAGTTTACCATATCGATTATCAAAAGTGATTTCAGCCAAAATATATTGAACAATAGTGCAACAGATATAACTTTATTAGGTATTTTCTTTGCTGTTTTATTTGACGGCTTGTTCTTTATATTATTGAAGAATAAGCGGACTGAATTACAACATTTAAATCAAGAAATCATTGAATTTTCGTTAGAAAAACAATATTTTATATTTATATTTATTTTATTTATAGTAATAGAAATTATTTTAGCAGTTGGGAATCTTCAAGGAGTAACAGCCACGATATTATTAACCATTATCATTATTTTTTGTGTCCTTATCGGGATGACTTTTTGGCAAGTGATGCTTTTTTTGAAGGCTTATTCGATTCGCCAAGAAGCCAATGACCAATTGGTCCGGAATCAACAACTTCAAGATTATCTAGTCAATATCGAACAGCAGTACACCGAATTACGGCGATTTAAGCATGATTATCAAAACATCTTATTATCGTTGGAGAGTTTTGCCGAAAAGGGCGATCAGCAACAGTTTAAGGCGTATTACCAAGAATTATTAGCACAACGGCCAATTCAAAGTGAAATCCAAGGGGCAGTCATTGCACAACTCGACTACTTGAAAAATGATCCTATTCGAGGATTAGTCATTCAAAAGTTTTTGGCAGCCAAACAGGCTGGTGTTACTTTAAAATTCGAAATGACCGAACCAATCGAATTAGCAACCGCTAATCTATTAACGGTTATTCGGATTATCGGTATTTTATTAGACAATGCGATTGAACAAGCCGTTCAAGAAACCGATCAATTGGTGAGTTGTGCTTTCTTACAATCTGATGGTTTAATCGAAATTACGATTGAAAATACGGCCAGTCAAGTTAAGAATCTCCAAGCATTTTCAGAGTTAGGCTATTCAACGAAAGGCGCTGGTCGGGGGACTGGTTTAGCTAATGTGCAGGATTTGATTGCCAAACAAACCAATTTATTCTTAGAAACACAGATTGAAAATAGAAAGTTACGACAGACATTGATGATTACGGAGGAAACTTAATTTGTATCCCGTTTATTTATTAGAGGATGATTTACAGCAACAAGCGATTTATCAGCAAATTATCGCGAATACGATTATGATTAACGAATTTGCAATGACTTTAACATGCGCTGCCAGTGATACTGAGACATTGTTGGCGGCAATTAAGGATCAGCAACGAGGTTTATTCTTTTTGGATATGGAAATTGAGGATAACCGCCAAGCCGGTTTAGAAGTGGCAACTAAGATTCGGCAGATGATGCCGTTTGCGCAAATTGTCTTCATTACAACCCACGAGGAACTGACATTATTAACGTTAGAACGAAAAATAGCGCCTTTAGATTACATTCTCAAGGACCAAACAATGGCTGAAATCAAAAGGCAATTGATTGATGATCTATTGTTAGCTGAGAAGCAAAACGAGGCGGCAGCGTATCACCGAGAAAATTTATTTAGTTATAAAATAGGTCCTCGCTTTTTCTCATTACCATTAAAGGAAGTTGTTTATTTATATACTGAAAAAGAAAATCCGGGTCATATTAATTTGTTAGCCGTTACCAGAAAGGTTACTTTTCCAGGAAATTTAAATGCGCTGGAAGCCCAATATCCAATGCTCTTTCGGTGTGATAAAAGTTACTTAGTTAACCTATCTAATATTGCCAATTATGACAGTAAAACACGGAGTTTAAAATTTGTAGATGGCAGTGAGGCAAAAGTCTCGTTCCGGAAATCACGGGAACTAGTGGCCAAATTAAAACAAATGATGTAGCGCCTGCAGGCACGCCAAATGATCCCAGTAAAAAGCCACCCGCATGGCGGGTGGCTTTTTATTAGCCCTAGAAGGGCTTCCCACACGCATTTCAGCGCCTTAGTGCCTTAGTTTGTGAATCATAGGTGGTATAGTCCCGAAATACCCGTCTAAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACAGTCGGTTTTCTAATGTCACTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGGTTTTTATATTACAGCTCCAGATCTACCGGTGGGCCCATATTAACGTTTAACCGATAAAGTTGAACGTTAATATTTTTTTTGCGCAGAAATGGTAAATTGAAGCATAATAGTCTTGTAAGGTATTTAGCTGGCTGGCGTAAAGTATGCTTTATAAAATAATATATAGGAGTATGATTCCCATGATACCAGCACAGGCAGGTTTAAACGAGCATTGGCAGCAACGTAACGACTCACGTGACTGGGTACTTGACGCAGATAACTATTGCTACGATGGTGACGAGTTCGACAAAGCACAGTTGTTTCAAGATTACATTGATAACAATGACTTTGAGCAGTGGGCGACTGATATGCAGGCCGATATGTTAAGTGCCATTTGTATCGTCACTTTCGGTTCGACTGACGTAAGTGTGTTGTATCCAGATCAAGGTGAGGAACCTAATTGGCAATGGTTGATTGATGTGTTTGGTCAGTCCCGTCTATGGGACGAGCTACTGGTACACATCGACACGGACACGATGATGACACGTCTGGGCTATCACTGGGTATCAGAGGGGGAAGAAGCATGAGTAATGAGCTAGTTACGATGGTTAATAACAATATTGAGGATATGAAGAATAATGAAGGCTTGTCATTACCACCTGATTATTCAGTAGGGAATGCATTAAACAGTGCTTACTTGATTTTGAGTGATACGTCTAAGGGCCAACCATTACTTGATAAGTGTGACCAAGGATCAGTTATCAAGGCGTTAATGAACATGGCAATTCAAGGATTGAGCCCAGCTAAAAACCAATGCTATTTCATTCCTTATGGTAACCAGTTAGTCATGCAGCGTTCCTATTTTGGCTCAATTAGCGTTGTAAAGCGTCTTTCAAACGTTAAGGATATTCAGGCACAGGTTGTCCACAAAGACGACACGTTCAAGATTGGTGGTAAAGATGGAGTGTTGGTGGTTAAAGAGTTCGAGCCAAGCTTTGAGAACCTAGATAAGCCAATTATCGGGGCCTTTGCATGGATCGAAGACATCAACGGGAACCGGACATACACGGTTATGACAAAAAAGGACATCGACATCAGTTGGAGCCACGCTAAGACGAAGAAGGTTCAAAACGAGTTCCCAGAAGAGATGGCTAAACGGACTGTAATTAATCGAGCTGCTAAGTTCTATATTAATTCAAGCTCAGACAACGATTTATTTGTAAAAGCAGTTAACGAAACCACTAGCAACGAATATGAGAATGACGAAAGAAAAGACGTAACACCGGCTAAGCGGTCACTAGTAGCTGACGTAGCAGAGAATAAAGCCGAGAAGGTAGAATCTGCCGAACCAGCTAAAGAACCCGTTAGAACGGCTGTAAAGGAGGCATCAAGCAATGATCAAGAACCTGTCAAAGGCGAAGTCGACCAGCAAAACCTCTTCGACAACCTCGGAGACTTTGACGCCAGCTAACTATTACGATCGCTGGACAGATCAATCATTTATGTCAGCAACATGGTTCAAGAAGTTTTTAGCCTGTGAAGCAGAAGCGTTAGCCGAGCTTACTGGTAAATGGCAACCTGTTCGTGACGCTAAGGCCTTAGTAGTTGGCAATTGGCTTCATAGTTATTTTGAAAGCAAGCAAGCACACGAAAAGTTTAAAGATGAGCATCCAGAATCAATTTCAAAACGCGGCCCTACTAAAGGGCAACTAAAGAGTGATTTTAAGGTCGCTAATGCTATGATTCAGTCGCTTACTAATGATCATGACTTCAATTTACTATATCAAGGCGATAAGGAAGTAATTGTTACTGGTGAAATCGGTGGTTATCCCTGGAAGGGCAAGATTGATTGCCTCAACTTGAAACAAGGCTACTTCGTTGATCTAAAGACGACCGCTGACATATACAAGGTGTATTGGAATCCAGAAACTCGTGAGAAAGAATCGTTTGTATATGCGTATAACTACCCACTTCAGATGGCAGTCTATCAAGAGTTGATTAAGCAGCAATTTGGTGTGACGTGTAAGCCGTACATCGTGGCAGTAAGCAAACAGGATCCACCAGACAAGCAGGCTATTGATTTACCGGAGTACCGACTTACTAATGCTATGAACCAGGTATTGGAATCTCAACAGCATCTTCAAGATATCATTAAAGGCGAAGCAGATCCTATCCAATGCGGACATTGTGCTTATTGTCGTAGTACCAAAAAGTTAGAGAGCGTCGTTAGTGCAGACGACTTACTCATAGATTGATCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAGGCGCCAAGCTTCAAATTACAGCACGTGTTGCTTTGATTGATAGCCAAAAAGCAGCAGTTGATAAAGCAATTACTGATATTGCTGAAAAATTGTAATTTATAAATAAAAATCACCTTTTAGAGGTGGTTTTTTTATTTATAAATTATTCGTTTGATTTCGCTTTCGATAGAACAATCAAAGCGAGAATAAGGAAGATAAATCCCA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下述实施例中pHSP01载体的序列如下：

ATTAGTTGCCGACTACGCGGGCTGATACCTGCTAAAATTGTTTGAAAGTCGGGCGTTTGCTCAACAATCGTTTCAATATCCATTCTGTCGTTTCCTCCCGGGCTAGTTATATTGATTCATAACTGCCGTAAAATCATCATTTGCTAACCAAGCTTCGACCGCCGCTAGCGCCGTAATCTTAGCATCGTCAAACTTCGCCACTTCGGCTGGCGTAAATTTCCCCAACACGTAATCAACAACACTCATCTTCTGAGGATGGTCAATACCAACTTTAACGCGCTTGAAGTGCTGATCACCAACATGACTAATAATGCTCTTGATGCCATTATGACCACCCGCCGATCCCTTTTGTTTGAGGCGTACTTTTCCTAGTGGTAAATCTAAATCATCATGTATAACGAGCAAATCAGCAGGATCAACATTGTAATAGCTCATCAACGGTCCCACCGCTCGTCCAGAATCATTCATATAAGTGGCGGGTTTCACCAGTAAAATCTTCTCACCGTCTTGAAAAGCCGTTGCCACCTGTGCTTCAAATTTACTCGTTTGAAACGTAACGTTTAGTTTGCTAGCTAATTCGTCCACAATCATAAAACCAACATTATGACGTGTCTGGGCATATTGCCGCCCAATGTTGCCTAACCCAACGATCATTTTCATAATTTTATCTTCTCCTATTACTTTGCATACCAAAACAGGCCGAACCGGTAATCGACCCGATTCGGCAACTCTGAGTAACGATACCACCTAAGTCGTATTGGCACCACTACTCACACCGTGACCGACGCGCCCGCCAGTCAAGTGTTCAAAAGTTAGCGTTTATTAAGTGCGATAAGTATACCACAAAGGGCTTATTGACGCCCGCCAAAGGGTTTTGCGGACATTGTTAATAATTGTATTAAAAGCATGCTCAATCTAACACTTATTTTGCACAAACATGGTATACTTTAACCGTAAAAACTAAATTTTCACTACGAGAGGATGACTTATTTTGTCAAGCAATAAATAATCATTTCATACGATTAAATGTATGATGAACGCTCGTCTATAGCAGACGGGCGTTTTTTTGTTTGCTTGAGGTACCTTAGCGATTCATTAAAGCGCAACACGCACTAAAGGCTATTTTTAAAACTTTCTTATCACGATTACCGGCCTTGAAGTTTGCACTCATCTCACTTCTGTTATAAGGTGAGAATATTACGAATATATGGAGGACCAACTTAATTATGAAACATAAACGTGGACTTATGATTGGGGGCAGTATCCTCGGTCTCCTCGTCATCGGATATGTTGCCACGAGCTTAATCTGGCAACATCAACAAACGTTCCTCAGTAATACGTCGGTCGCTGGTGTTGACGTCAGTGGTAAAACCGCCGCTCAAGCAGCACCGAAAGTTAATCGCGCTTTAGAACATCGCACTTATCGAATTATTGAAAACGGCCAAACAAAGTACTCATTTACCAGCAAATCAGCCGGTATTACAATCAATACTAAAAAAGATTTAACCAAATTAGTGACCAAACAAAACTACTGGCGTTGGCCCCTTGCACTATTGCAATCGGCTCAGGCTGATGATAGCTCAGCGGTTGGACAACTAACCATCAATCACACTGATTTGAAAACCCTACTACAAAAAATCACCACGACTGCCAATCAAACCAAACGAACAAAAACTGAAAACGCCAAGTTAGTTTATCAACATAACCAAGTTGAGATTAAGAAAGAAGTTCAAGGAACCGAATTAGATCAAGCTAAACTTAAGACGGTCGTCACCAAAGCAATTAGTAATGGTGACAGTCATATCACCCTTAAAGACGCCTACGTCACTCCGACCGTTACCAGCACGAGTGCTAGTTTAAAGACGGCCAAAGCAAAATCAGCGAAATACGCTACCGAAAAGGCCACCTATAATATCAACGGTCATAAATTCACGATTCCTCACGACCTAATTCTCAGTTGGATTAAAGTCGATAAGCAAGGCAAAGTAAGTTTAGACCAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTAGCGACATCGCGAACTGGATCTAGAATATATCATAGTATGTCCATTCTGTCAACAACTATAGCGCTGTCGACGTATGGACAGTTTTCCCTTTGATATGTAACGGTGAACAGTTGTTCTACTTTTGTTTGTTAGTCTTGATGCTTCACTGATAGATACAAGAGCCATAAGAACCTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATACTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGTTGCGGCCGCAATCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACGTTTCCACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATG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<实施例1>

在AR113-Δbsh13的基础上对ldh基因的敲除实验

实验方法：质粒pLCP11-0467和pLCP11-1778分别电转到植物乳杆菌AR113-Δbsh13(gba)感受态细胞中，MRS+Cm(氯霉素)+Em(红霉素)平板，37℃厌氧培养48～60h，长出转化子后，进行菌落PCR验证，并将PCR产物通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分析，绘制图像。

其中，pLCP11-1778质粒构建的构建方法如下：1778up(F:CTTTTTCTAAACTAGGGCCCGCGAAGGGTGCTAAGAGCCAGATT；R:ATTTTCAGTGATAATCGAGATACAAAAATTCCTCCTATAT)、1778down(F:ATATAGGAGGAATTTTTGTATCTCGATTATCACTGAAAATGG；R:ACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCATCATTTTTGACCTTGACG)以植物乳杆菌AR113基因组为模板，1778gRNA(F：CGTCAAGGTCAAAAATGATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTR：GGACATACTATGATATATTCTAGAGTTCCTACTGTTAAAGCACGGTTTTAGAGCTAG)以质粒pHSP01为模板，然后使用FX KOD酶将三者进行Overlap PCR，割胶回收获得1778up-down-gRNA片段，再与经ApaI和XbaI酶切回收的pHSP01载体(本实验室保藏)进行无缝克隆，连接产物转化(方法：将质粒转入感受态中，冰上静置30min，然后置于42℃恒温水浴锅热击90s，冰上静置2min，加入900μL LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，NaCl 10.0g，121℃灭菌15min)至E.coli Top10感受态细胞中，摇床培养1h后，涂布于含卡那霉素抗性的平板中。长出的单菌落用引物pLCP11-yz(F:ATCATTTCGTTTTTCTTTTGCGCT；R:GTAGAACAACTGTTCACCGT)进行验证，获得的正确质粒命名命名为pLCP11-1778。质粒pLCP11-0467与质粒pLCP11-1778的制备方法相同，在此不再赘述。

实验结果如图1所示。图1(a)为AR113-Δbsh13-Δldhl。图1(b)为AR113-Δbsh13-Δldhd。

根据图1(a)可知，标号1-6是AR113-Δbsh13-Δldhl的6个单菌落，用引物Delete-0467-YZ(F:GTGACTCTGGTGAACTTGTC:R:AACCACTGGTGATTGGTG)验证。根据图1(b)可知，标号1-12是AR113-Δbsh13-Δldhd的12个单菌落，用引物Delete-1778-YZ(F:GACGAATTGAATGGAGAG；R：ATACAATCTCGCATAGGG)验证。AR113_0467和AR113_1778菌落PCR验证获得预期条带在大约2300bp，野生型(阳性对照)条带约为3000bp。结果表明ldh基因单敲除菌株L.plantarum AR113-Δbsh13-Δldhl(简称Δbsh13-Δldhl)和L.plant arumAR113-Δbsh13-Δldhd(简称Δbsh13-Δldhd)成功获得。对敲除带进行测序，比对结果与预期完全吻合。

<实施例2>

敲除ldh基因的菌株的制备方法

步骤1，AR113感受态的制备：

具体步骤：将植物乳杆菌AR113划线于MRS固体平板后于厌氧培养至长出1～2mm大小的单菌落。挑取单菌落接于5mLMRS液体培养基中，37℃静止培养12～16h。按3％接种量转接至100mL SGMRS(MRS+0.3M蔗糖+1％甘氨酸。115℃灭菌20min)液体，37℃静置培养至OD₆₀₀为0.3～0.5，在4℃、4500rpm/min的条件下离心10min，弃上清，用预冷的SM(952mM蔗糖+5mMMgCl2。115℃灭菌20min)缓冲液洗涤两次，在4℃、5500rpm/min的条件下离心8min。用适量预冷的SM缓冲液重悬，每100μL进行分装至1.5mLEP管中，-80℃保存备用；

步骤2，AR113(pLH01)感受态的制备：

具体步骤：当OD₆₀₀达到0.3左右时，加入终浓度为100ng/mL的诱导肽(氨基酸序列为MAGNSSNFIHKIKQIFTHR)以诱导RecE/T的表达，将质粒pLH01电转到AR113感受态细胞中，划线于MRS固体平板后于厌氧培养至长出1～2mm大小的单菌落。挑取单菌落接于5mLMRS液体培养基中，37℃静止培养12～16h。按3％接种量转接至100mL SGMRS(MRS+0.3M蔗糖+1％甘氨酸。115℃灭菌20min)液体，37℃静置培养至OD₆₀₀为0.3～0.5，在4℃、4500rpm/min的条件下离心10min，弃上清，用预冷的SM(952mM蔗糖+5mM MgCl2。115℃灭菌20min)缓冲液洗涤两次，在4℃、5500rpm/min的条件下离心8min。用适量预冷的SM缓冲液重悬，每100μL进行分装至1.5mL EP管中，-80℃保存备用，得AR113(pLH01)感受态细胞；

步骤3，将构建成功的ldh敲除质粒电转入AR113(pLH01)感受态细胞中：将0.1～1.0μg ldh质粒转入感受态中，冰上静置10min，转入预冷的电转杯中，以2.5kV，400Ω，25μF的条件进行电转，立即加入900μL复苏液SMRS(MRS+0.5M蔗糖+0.1MMgCl2。115℃灭菌20min)，于37℃静置复苏3h，涂布于红霉素和氯霉素双抗性的平板上，37℃厌氧培养24～48h，得到敲除ldh基因的菌株。

<实施例3>

胆固醇对敲除菌株自身生长特性的影响实验

实验方法：对野生型菌株AR113和12株敲除菌株在MRS、MC、MB和MCB液体培养基中进行培养，并测定生长曲线。

实验结果如图2所示。图2(a)为敲除菌株在MRS培养基中的生长曲线。图2(b)为敲除菌株在MC培养基中的生长曲线。图2(c)为敲除菌株在MB培养基中的生长曲线。图2(d)为敲除菌株在MCB培养基中的生长曲线。

根据图2(a)可知，在MRS培养基中，除了菌株Δldh外，其余菌株的生长趋势相似，生长速率相近，15h进入稳定期，总生物量达1.6左右。根据图2(b)可知，在仅添加胆固醇的MC培养基中，Δldhl、Δldhd和Δldh的生长速率变小，到20h才趋于稳定，总生物量减少至1.0左右，其余菌株在15h进入稳定期，生长趋势相似，总生物量达1.6左右。根据图2(c)可知，在仅添加牛胆汁的MB培养基中，各菌株的生长速率与生长趋势略有差异，总生物量最高达1.4左右，其中Δldhl、Δldhd和Δldh的生长缓慢，菌株Δldh的总生物量最低，仅为0.92。根据图2(d)可知，在添加胆固醇和牛胆汁的MCB培养基中，大部分菌株的生长受到了抑制，菌株的总生物量从1.6降低至1.4，最低仅为0.8，其中菌株Δldh、Δldhl和Δldhd在25h左右才进入稳定期，生长最缓慢。综上，表明胆固醇和牛胆汁的添加会抑制菌株的生长，当二者共同作用时抑制效果更明显。

<实施例4>

胆固醇对敲除菌株生长中pH值的影响实验

实验方法：对野生型菌株AR113和12株敲除菌株在MRS、MC、MB和MCB液体培养基中分别培养0h、5h、15h和24h，并对4种培养基的pH值进行测定，绘制图像。

实验结果如图3所示。图3(a)为敲除菌株在MRS培养基中的pH值。图3(b)为敲除菌株在MC培养基中的pH值。图3(c)为敲除菌株在MB培养基中的pH值。图3(d)为敲除菌株在MCB培养基中的pH值。

根据图3(a)可知,在MRS培养基中，除了菌株Δldh和Δbsh13-Δldhd外，其他菌株的pH值在培养24h时均降至4.0，菌株之间无显著变化。根据图3(b)可知,在MC培养基中，菌株Δldh的pH值在24h时提高至6.11，Δldhl也达到4.28，其余菌株也略有提高。。根据图3(c)可知,在MB培养基中，菌株Δldh的pH值在24h时显著提高至6.13，Δldhd和Δldhl在24h也分别达到4.49和4.20，其余菌株pH值的波动不明显。根据图3(d)可知，在MCB培养基中，菌株Δldh的pH值在24h时提高至6.15，Δldhd和Δldhl在24h也分别达到4.74和4.34。总体来看，与MRS培养基相比，添加胆固醇和牛胆汁对大多数菌株的培养基pH值没有显著影响，双敲除l型和d型的ldh基因的菌株Δldh在4种培养基中培养24h时培养基pH值还高于初始培养基的pH值6.04，菌株的pH值呈现显著增加的趋势。根据图3可知，菌株Δldh在4种培养基中培养24h时培养基pH值还高于初始培养基的pH值6.04，说明双敲除l型和d型的ldh基因的作用显著，在菌株Δldh生长过程中能够有效地抑制丙酮酸转化为乳酸的过程。

<实施例5>

胆固醇对敲除菌株降胆固醇能力的影响实验

实验方法：用改良的OPA法测定野生型菌株AR113和敲除菌株在MC、MCB培养基中的胆固醇去除率。

实验结果如图4所示。图4(a)为敲除菌株在MC培养基中培养24h的胆固醇去除率。图4(b)为敲除菌株在MCB培养基中培养24h的胆固醇去除率。

根据图4(a)可知，在MC培养基中，除了菌株Δbsh1和Δbsh2外，其余菌株都与AR113相比都具有显著性差异(p<0.05)。Δbsh13的胆固醇去除率降至约10％，与Δbsh3、Δbsh134、Δldh以及Δbsh13-Δldhd四株菌有显著性差异，而Δbsh3、Δldh和Δldh之间无显著性差异，表明基因bsh13对菌株降胆固醇贡献较大。根据图4(b)可知，添加牛胆汁后，与AR113相比，所有菌株的胆固醇去除率都显著降低了，Δbsh1、Δbsh2、Δbsh3、Δbsh132、Δbsh134、Δldhl、Δldhd、Δbsh13-Δldhl和Δbsh13-Δldhd之间无显著差异性，但Δbsh13，Δldh的作用效果较为明显，胆固醇去除率仅为6％和5％，但是二者差异不太明显，说明bsh13和ldh在降胆固醇机制中发挥重要作用，作用效果相似。相比于Δldhl、Δldhd的降胆固醇能力，Δldh的胆固醇去除率显著性降低，表明敲除ldh基因对菌株降胆固醇能力有明显的抑制，进而表明pH值对胆固醇去除的作用影响较大。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的降低菌株胆固醇能力的方法，因为包括如下步骤：将菌株加入到培养基中，并加入胆固醇和\或牛胆汁进行培养。因为乳酸脱氢酶是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，如果阻断这一转化途径，培养基的pH值会发生变化，基于这一假设通过敲除ldh关键酶基因，再结合敲除bsh基因的菌株进行一系列实验验证，从而得出培养基中的pH值会对菌株的降胆固醇能力产生一定的影响。所以本实施例通过对比野生型菌株L.plantarum AR113和敲除菌株的生长特性、培养基pH值及其降胆固醇能力的差异，来佐证BSH和培养基pH值对益生菌L.plantarumAR113降解胆固醇的影响。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海理工大学

<120> 一种降低菌株胆固醇能力的方法

<130> SHLG20102P

<141> 2020-12-24

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctttttctaa actagggccc gcgaagggtg ctaagagcca gattattttc agtgataatc 60

gagatacaaa aattcctcct atat 84

<210> 2

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atataggagg aatttttgta tctcgattat cactgaaaat ggaccgagtc ggtgcttttt 60

ttcatcattt ttgaccttga cg 82

<210> 3

<211> 98

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgucaagguc aaaaaugaug aaaaaaagca ccgacucggu rggacauacu augauauauu 60

cuagaguucc uacuguuaaa gcacgguuuu agagcuag 98

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atcatttcgt ttttcttttg cgctgtagaa caactgttca ccgt 44

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gtgactctgg tgaacttgtc aaccactggt gattggtg 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gacgaattga atggagagat acaatctcgc ataggg 36

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ile His Lys Ile Lys Gln Ile Phe

1 5 10 15

Thr His Arg

<210> 8

<211> 9186

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtcgaccctt caatagagtt cttaacgtta atccgaaaaa aactaacgtt aatattaaaa 60

aataagatcc gcttgtgaat tatgtataat ttgattagac taaagaatag gagaaagtat 120

gatgatattt aaaaaacttt ctcgttaaga taggttgttg gtgagcatgt tatatacgga 180

tgtatcggtt tccttaatgc aaaattttgt tgctatctta ttaatttttc tattatatag 240

atatattcaa agaaagataa catttaaacg gatcatatta gatattttaa tagcgattat 300

tttttcaata ttatatctgt ttatttcaga tgcgtcatta cttgtaatgg tattaatgcg 360

attagggtgg cattttcatc aacaaaaaga aaataagata aaaacgactg atacagctaa 420

tttaattcta attatcgtga tccagttatt gttagttgcg gttgggacta ttattagtca 480

gtttaccata tcgattatca aaagtgattt cagccaaaat atattgaaca atagtgcaac 540

agatataact ttattaggta ttttctttgc tgttttattt gacggcttgt tctttatatt 600

attgaagaat aagcggactg aattacaaca tttaaatcaa gaaatcattg aattttcgtt 660

agaaaaacaa tattttatat ttatatttat tttatttata gtaatagaaa ttattttagc 720

agttgggaat cttcaaggag taacagccac gatattatta accattatca ttattttttg 780

tgtccttatc gggatgactt tttggcaagt gatgcttttt ttgaaggctt attcgattcg 840

ccaagaagcc aatgaccaat tggtccggaa tcaacaactt caagattatc tagtcaatat 900

cgaacagcag tacaccgaat tacggcgatt taagcatgat tatcaaaaca tcttattatc 960

gttggagagt tttgccgaaa agggcgatca gcaacagttt aaggcgtatt accaagaatt 1020

attagcacaa cggccaattc aaagtgaaat ccaaggggca gtcattgcac aactcgacta 1080

cttgaaaaat gatcctattc gaggattagt cattcaaaag tttttggcag ccaaacaggc 1140

tggtgttact ttaaaattcg aaatgaccga accaatcgaa ttagcaaccg ctaatctatt 1200

aacggttatt cggattatcg gtattttatt agacaatgcg attgaacaag ccgttcaaga 1260

aaccgatcaa ttggtgagtt gtgctttctt acaatctgat ggtttaatcg aaattacgat 1320

tgaaaatacg gccagtcaag ttaagaatct ccaagcattt tcagagttag gctattcaac 1380

gaaaggcgct ggtcggggga ctggtttagc taatgtgcag gatttgattg ccaaacaaac 1440

caatttattc ttagaaacac agattgaaaa tagaaagtta cgacagacat tgatgattac 1500

ggaggaaact taatttgtat cccgtttatt tattagagga tgatttacag caacaagcga 1560

tttatcagca aattatcgcg aatacgatta tgattaacga atttgcaatg actttaacat 1620

gcgctgccag tgatactgag acattgttgg cggcaattaa ggatcagcaa cgaggtttat 1680

tctttttgga tatggaaatt gaggataacc gccaagccgg tttagaagtg gcaactaaga 1740

ttcggcagat gatgccgttt gcgcaaattg tcttcattac aacccacgag gaactgacat 1800

tattaacgtt agaacgaaaa atagcgcctt tagattacat tctcaaggac caaacaatgg 1860

ctgaaatcaa aaggcaattg attgatgatc tattgttagc tgagaagcaa aacgaggcgg 1920

cagcgtatca ccgagaaaat ttatttagtt ataaaatagg tcctcgcttt ttctcattac 1980

cattaaagga agttgtttat ttatatactg aaaaagaaaa tccgggtcat attaatttgt 2040

tagccgttac cagaaaggtt acttttccag gaaatttaaa tgcgctggaa gcccaatatc 2100

caatgctctt tcggtgtgat aaaagttact tagttaacct atctaatatt gccaattatg 2160

acagtaaaac acggagttta aaatttgtag atggcagtga ggcaaaagtc tcgttccgga 2220

aatcacggga actagtggcc aaattaaaac aaatgatgta gcgcctgcag gcacgccaaa 2280

tgatcccagt aaaaagccac ccgcatggcg ggtggctttt tattagccct agaagggctt 2340

cccacacgca tttcagcgcc ttagtgcctt agtttgtgaa tcataggtgg tatagtcccg 2400

aaatacccgt ctaaggaatt gtcagatagg cctaatgact ggcttttata atatgagata 2460

atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaatgtcac taacctgccc cgttagttga 2520

agaaggtttt tatattacag ctccagatct accggtgggc ccatattaac gtttaaccga 2580

taaagttgaa cgttaatatt ttttttgcgc agaaatggta aattgaagca taatagtctt 2640

gtaaggtatt tagctggctg gcgtaaagta tgctttataa aataatatat aggagtatga 2700

ttcccatgat accagcacag gcaggtttaa acgagcattg gcagcaacgt aacgactcac 2760

gtgactgggt acttgacgca gataactatt gctacgatgg tgacgagttc gacaaagcac 2820

agttgtttca agattacatt gataacaatg actttgagca gtgggcgact gatatgcagg 2880

ccgatatgtt aagtgccatt tgtatcgtca ctttcggttc gactgacgta agtgtgttgt 2940

atccagatca aggtgaggaa cctaattggc aatggttgat tgatgtgttt ggtcagtccc 3000

gtctatggga cgagctactg gtacacatcg acacggacac gatgatgaca cgtctgggct 3060

atcactgggt atcagagggg gaagaagcat gagtaatgag ctagttacga tggttaataa 3120

caatattgag gatatgaaga ataatgaagg cttgtcatta ccacctgatt attcagtagg 3180

gaatgcatta aacagtgctt acttgatttt gagtgatacg tctaagggcc aaccattact 3240

tgataagtgt gaccaaggat cagttatcaa ggcgttaatg aacatggcaa ttcaaggatt 3300

gagcccagct aaaaaccaat gctatttcat tccttatggt aaccagttag tcatgcagcg 3360

ttcctatttt ggctcaatta gcgttgtaaa gcgtctttca aacgttaagg atattcaggc 3420

acaggttgtc cacaaagacg acacgttcaa gattggtggt aaagatggag tgttggtggt 3480

taaagagttc gagccaagct ttgagaacct agataagcca attatcgggg cctttgcatg 3540

gatcgaagac atcaacggga accggacata cacggttatg acaaaaaagg acatcgacat 3600

cagttggagc cacgctaaga cgaagaaggt tcaaaacgag ttcccagaag agatggctaa 3660

acggactgta attaatcgag ctgctaagtt ctatattaat tcaagctcag acaacgattt 3720

atttgtaaaa gcagttaacg aaaccactag caacgaatat gagaatgacg aaagaaaaga 3780

cgtaacaccg gctaagcggt cactagtagc tgacgtagca gagaataaag ccgagaaggt 3840

agaatctgcc gaaccagcta aagaacccgt tagaacggct gtaaaggagg catcaagcaa 3900

tgatcaagaa cctgtcaaag gcgaagtcga ccagcaaaac ctcttcgaca acctcggaga 3960

ctttgacgcc agctaactat tacgatcgct ggacagatca atcatttatg tcagcaacat 4020

ggttcaagaa gtttttagcc tgtgaagcag aagcgttagc cgagcttact ggtaaatggc 4080

aacctgttcg tgacgctaag gccttagtag ttggcaattg gcttcatagt tattttgaaa 4140

gcaagcaagc acacgaaaag tttaaagatg agcatccaga atcaatttca aaacgcggcc 4200

ctactaaagg gcaactaaag agtgatttta aggtcgctaa tgctatgatt cagtcgctta 4260

ctaatgatca tgacttcaat ttactatatc aaggcgataa ggaagtaatt gttactggtg 4320

aaatcggtgg ttatccctgg aagggcaaga ttgattgcct caacttgaaa caaggctact 4380

tcgttgatct aaagacgacc gctgacatat acaaggtgta ttggaatcca gaaactcgtg 4440

agaaagaatc gtttgtatat gcgtataact acccacttca gatggcagtc tatcaagagt 4500

tgattaagca gcaatttggt gtgacgtgta agccgtacat cgtggcagta agcaaacagg 4560

atccaccaga caagcaggct attgatttac cggagtaccg acttactaat gctatgaacc 4620

aggtattgga atctcaacag catcttcaag atatcattaa aggcgaagca gatcctatcc 4680

aatgcggaca ttgtgcttat tgtcgtagta ccaaaaagtt agagagcgtc gttagtgcag 4740

acgacttact catagattga tctagactcg aggaattcgg taccccgggt tcgaaggcgc 4800

caagcttcaa attacagcac gtgttgcttt gattgatagc caaaaagcag cagttgataa 4860

agcaattact gatattgctg aaaaattgta atttataaat aaaaatcacc ttttagaggt 4920

ggttttttta tttataaatt attcgtttga tttcgctttc gatagaacaa tcaaagcgag 4980

aataaggaag ataaatccca taagggcggg agcagaatgt ccgagactaa ttcatgagat 5040

cgatttttta ttaaaacgtc tcaaaatcgt ttctgagacg ttttagcgtt tatttcgttt 5100

agttatcggc ataatcgtta aaacaggcgt tatcgtagcg taaaagccct tgagcgtagc 5160

gtgctttgca gcgaagatgt tgtctgttag attatgaaag ccgatgactg aatgaaataa 5220

taagcgcagc gtccttctat ttcggttgga ggaggctcaa gggagtttga gggaatgaaa 5280

ttccctcatg ggtttgattt taaaaattgc ttgcaatttt gccgagcggt agcgctggaa 5340

aaatttttga aaaaaatttg gaatttggaa aaaaatgggg ggaaaggaag cgaattttgc 5400

ttccgtacta cgacccccca ttaagtgccg agtgccaatt tttgtgccaa aaacgctcta 5460

tcccaactgg ctcaagggtt tgaggggttt ttcaatcgcc aacgaatcgc caacgttttc 5520

gccaacgttt tttataaatc tatatttaag tagctttatt gttgttttta tgattacaaa 5580

gtgatacact aattttataa aattatttga ttggagtttt ttaaatggtg atttcagaat 5640

cgaaaaaaag agttatgatt tctctgacaa aagagcaaga taaaaaatta acagatatgg 5700

cgaaacaaaa aggtttttca aaatctgcgg ttgcggcgtt agctatagaa gaatatgcaa 5760

gaaaggaatc agaataaaaa aaataagcga aagctcgcgt ttttagaagg atacgagttt 5820

tcgctacttg tttttgataa ggtaatatat catggctatt aaatactaaa gctagaaatt 5880

ttggattttt attatatcct gactcaattc ctaatgattg gaaagaaaaa ttagagagtt 5940

tgggcgtatc tatggctgtc agtcctttac acgatatgga cgaaaaaaaa gataaagata 6000

catggaatag tagtgatgtt atacgaaatg gaaagcacta taaaaaacca cactatcacg 6060

ttatatatat tgcacgaaat cctgtaacaa tagaaagcgt taggaacaag attaagcgaa 6120

aattggggaa tagttcagtt gctcatgttg agatacttga ttatatcaaa ggttcatatg 6180

aatatttgac tcatgaatca aaggacgcta ttgctaagaa taaacatata tacgacaaaa 6240

aagatatttt gaacattaat gattttgata ttgaccgcta tataacactt gatgaaagcc 6300

aaaaaagaga attgaagaat ttacttttag atatagtgga tgactataat ttggtaaata 6360

caaaagattt aatggctttt attcgcctta ggggagcgga gtttggaatt ttaaatacga 6420

atgatgtaaa agatattgtt tcaacaaact ctagcgcctt tagattatgg tttgagggca 6480

attatcagtg tggatataga gcaagttatg caaaggttct tgatgctgaa acgggggaaa 6540

taaaatgaca aacaaagaaa aagagttatt tgctgaaaat gaggaattaa aaaaagaaat 6600

taaggactta aaagagcgta ttgaaagata cagagaaatg gaagttgaat taagtacaac 6660

aatagattta ttgagaggag ggattattga ataaataaaa gcccccctga cgaaagtcgc 6720

actgattggt gtatcatttc gtttttcttt tgcggacctg cagatgcgat atcatgcgca 6780

tgcaagctta tcgatgataa gctgtcaaac atgagaatta caacttatat cgtatggggc 6840

tgacttcagg tgctacattt gaagagataa attgcactga aatctagaaa tattttatct 6900

gattaataag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct tgctctgaaa 6960

acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga 7020

accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt 7080

aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt 7140

ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 7200

cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg 7260

gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt 7320

aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa acgcctggta 7380

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt cgtgatgctt 7440

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgg ctttgccgcg gccctctcac ttccctgtta 7500

agtatcttcc tggcatcttc caggaaatct ccgccccgtt cgtaagccat ttccgctcgc 7560

cgcagtcgaa cgaccgagcg tagcgagtca gtgagcgagg aagcggaata tatcctgtat 7620

cacatattct gctgacgcac cggtgcagcc ttttttctcc tgccacatga agcacttcac 7680

tgacaccctc atcagtgcca acatagtaag ccagtataca ctccgctagc gctgatgtcc 7740

ggcggtgctt ttgccgttac gcaccacccc gtcagtagct gaacaggagg gacagcgtgt 7800

tgctttgatt gatagccaaa aagcagcagt tgataaagca attactgata ttgctgaaaa 7860

attgtaattt ataaataaaa atcacctttt agaggtggtt tttttattta taaattattc 7920

gtttgatttc gctttcgata gaacaatcaa agcgagaata aggaagataa atcccataag 7980

ggcgggagca gaatgtccga gactaatgta aatttgtcca ccaattaaag gaccgataac 8040

gcgctcgagc ctgatagaaa cagaagccac tggagcacgt ttaaacaatt taaatctacc 8100

gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gacaatgtct taggcgttaa ggtcgtttta 8160

gccgatggtc gcgaagttaa gtaaggtacc atgcagttta aattcggtcc tcgggatatg 8220

ataagattaa tagttttagc tattaatctt tttttatttt tatttaagaa tggcttaata 8280

aagcggttac tttggatttt tgtgagcttg gactagaaaa aaacttcaca aaatgctata 8340

ctaggtagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt gatttagaca 8400

attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact tttagtataa 8460

ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga tataaatttt 8520

accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct tttagaactg 8580

gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt tatacaattt 8640

ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat gacttcaaag 8700

agttttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg aaattgtttc 8760

ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg acttcattta 8820

ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt attacagcag 8880

gaaaattcat taataaaggt aattcaatat atttaccgct atctttacag gtacatcatt 8940

ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa ttgtcagata 9000

ggcctaatga ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtactttcg gatcctaaac 9060

gcaattgatg attggttcgg aaggcacgtt aggaatcatt accgaagtaa tcgttaaact 9120

gttgccgatt ccgctaggga cccataactt cgtataatgt atgctatacg aacggtacag 9180

accggg 9186

<210> 9

<211> 14100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

attagttgcc gactacgcgg gctgatacct gctaaaattg tttgaaagtc gggcgtttgc 60

tcaacaatcg tttcaatatc cattctgtcg tttcctcccg ggctagttat attgattcat 120

aactgccgta aaatcatcat ttgctaacca agcttcgacc gccgctagcg ccgtaatctt 180

agcatcgtca aacttcgcca cttcggctgg cgtaaatttc cccaacacgt aatcaacaac 240

actcatcttc tgaggatggt caataccaac tttaacgcgc ttgaagtgct gatcaccaac 300

atgactaata atgctcttga tgccattatg accacccgcc gatccctttt gtttgaggcg 360

tacttttcct agtggtaaat ctaaatcatc atgtataacg agcaaatcag caggatcaac 420

attgtaatag ctcatcaacg gtcccaccgc tcgtccagaa tcattcatat aagtggcggg 480

tttcaccagt aaaatcttct caccgtcttg aaaagccgtt gccacctgtg cttcaaattt 540

actcgtttga aacgtaacgt ttagtttgct agctaattcg tccacaatca taaaaccaac 600

attatgacgt gtctgggcat attgccgccc aatgttgcct aacccaacga tcattttcat 660

aattttatct tctcctatta ctttgcatac caaaacaggc cgaaccggta atcgacccga 720

ttcggcaact ctgagtaacg ataccaccta agtcgtattg gcaccactac tcacaccgtg 780

accgacgcgc ccgccagtca agtgttcaaa agttagcgtt tattaagtgc gataagtata 840

ccacaaaggg cttattgacg cccgccaaag ggttttgcgg acattgttaa taattgtatt 900

aaaagcatgc tcaatctaac acttattttg cacaaacatg gtatacttta accgtaaaaa 960

ctaaattttc actacgagag gatgacttat tttgtcaagc aataaataat catttcatac 1020

gattaaatgt atgatgaacg ctcgtctata gcagacgggc gtttttttgt ttgcttgagg 1080

taccttagcg attcattaaa gcgcaacacg cactaaaggc tatttttaaa actttcttat 1140

cacgattacc ggccttgaag tttgcactca tctcacttct gttataaggt gagaatatta 1200

cgaatatatg gaggaccaac ttaattatga aacataaacg tggacttatg attgggggca 1260

gtatcctcgg tctcctcgtc atcggatatg ttgccacgag cttaatctgg caacatcaac 1320

aaacgttcct cagtaatacg tcggtcgctg gtgttgacgt cagtggtaaa accgccgctc 1380

aagcagcacc gaaagttaat cgcgctttag aacatcgcac ttatcgaatt attgaaaacg 1440

gccaaacaaa gtactcattt accagcaaat cagccggtat tacaatcaat actaaaaaag 1500

atttaaccaa attagtgacc aaacaaaact actggcgttg gccccttgca ctattgcaat 1560

cggctcaggc tgatgatagc tcagcggttg gacaactaac catcaatcac actgatttga 1620

aaaccctact acaaaaaatc accacgactg ccaatcaaac caaacgaaca aaaactgaaa 1680

acgccaagtt agtttatcaa cataaccaag ttgagattaa gaaagaagtt caaggaaccg 1740

aattagatca agctaaactt aagacggtcg tcaccaaagc aattagtaat ggtgacagtc 1800

atatcaccct taaagacgcc tacgtcactc cgaccgttac cagcacgagt gctagtttaa 1860

agacggccaa agcaaaatca gcgaaatacg ctaccgaaaa ggccacctat aatatcaacg 1920

gtcataaatt cacgattcct cacgacctaa ttctcagttg gattaaagtc gataagcaag 1980

gcaaagtaag tttagaccaa aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata 2040

acggactagc cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aactagcgac atcgcgaact 2100

ggatctagaa tatatcatag tatgtccatt ctgtcaacaa ctatagcgct gtcgacgtat 2160

ggacagtttt ccctttgata tgtaacggtg aacagttgtt ctacttttgt ttgttagtct 2220

tgatgcttca ctgatagata caagagccat aagaacctca gatccttccg tatttagcca 2280

gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt gcgtgagcca tgagaacgaa ccattgagat 2340

catacttact ttgcatgtca ctcaaaaatt ttgcctcaaa actggtgagc tgaatttttg 2400

cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta gtccgttacg taggtaggaa tctgatgtaa 2460

tggttgttgg tattttgtca ccattcattt ttatctggtt gttctcaagt tcggttacga 2520

gatccatttg tctatctagt tcaacttgga aaatcaacgt atcagtcggg cggcctcgct 2580

tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag tgtttaaatc tttacttatt ggtttcaaaa 2640

cccattggtt aagcctttta aactcatggt agttattttc aagcattaac atgaacttaa 2700

attcatcaag gctaatctct atatttgcct tgtgagtttt cttttgtgtt agttctttta 2760

ataaccactc ataaatcctc atagagtatt tgttttcaaa agacttaaca tgttccagat 2820

tatattttat gaattttttt aactggaaaa gataaggcaa tatctcttca ctaaaaacta 2880

attctaattt ttcgcttgag aacttggcat agtttgtcca ctggaaaatc tcaaagcctt 2940

taaccaaagg attcctgatt tccacagttc tcgtcatcag ctctctggtt gctttagcta 3000

atacaccata agcattttcc ctactgatgt tcatcatctg agcgtattgg ttataagtga 3060

acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt tttcaatcgt ggggttgagt agtgccacac 3120

agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg ttaagtcata gcgactaatc gctagttcat 3180

ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac atctcaattg gtctaggtga ttttaatcac 3240

tataccaatt gagatgggct agtcaatgat aattactagt ccttttcctt tgagttgtgg 3300

gtatctgtaa attctgctag acctttgctg gaaaacttgt aaattctgct agaccctctg 3360

taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt ttgtttatat tcaagtggtt ataatttata 3420

gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa gaatagatcc cagccctgtg tataactcac 3480

tactttagtc agttccgcag tattacaaaa ggatgtcgca aacgctgttt gctcctctac 3540

aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa gtagcaccct cgcaagctcg gttgcggccg 3600

caatcgggca aatcgctgaa tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc tgagtcgctg 3660

tctttttcgt gacattcagt tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg ggggtaaatg 3720

gcactacagg cgccttttat ggattcatgc aaggaaacta cccataatac aagaaaagcc 3780

cgtcacgggc ttctcagggc gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta tctgactttt 3840

tgctgttcag cagttcctgc cctctgattt tccagtctga ccacttcgga ttatcccgtg 3900

acaggtcatt cagactggct aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca acggggtctg 3960

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4020

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4080

agtaaacttg gtctgacagt tacgtttcca caaccaatta accaattctg attagaaaaa 4140

ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 4200

ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 4260

aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt 4320

cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 4380

tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 4440

ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 4500

gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg 4560

gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 4620

tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 4680

acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 4740

catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 4800

cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 4860

agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca 4920

agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga 4980

cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg 5040

agacacaacg tggctttccc tgcagcgaaa agccctgaca acccttgttc ctaaaaagga 5100

ataagcgttc ggtcagtaaa taatagaaat aaaaaatcag acctaagact gatgacaaaa 5160

agagaaaatt ttgataaaat agtcttagaa ttaaattaaa aagggaggcc aaatataatg 5220

aaaaatatga atgacaatga tgttatggat aagaaatact caataggctt agccatcggc 5280

acaaatagcg tcggatgggc ggtgatcact gatgattata aggttccgtc taaaaagttc 5340

aaggttctgg gaaatacaga ccgccacagt atcaaaaaaa atcttatagg ggctctttta 5400

tttgacagtg gagagacagc ggaagcgact cgtctcaaac ggacagctcg tagaaggtat 5460

acacgtcgga agaatcgtat ttgttatcta caggagattt tttcaaatga gatggcgaaa 5520

gtagatgata gtttctttca tcgacttgaa gagtcttttt tggtggaaga agacaagaag 5580

catgaacgtc atcctatttt tggaaatata gtagatgaag ttgcttatca tgagaaatat 5640

ccaactatct atcatctgcg aaaaaaattg gtagattcta ctgataaagc ggatttgcgc 5700

ttaatctatt tggccttagc gcatatgatt aagtttcgtg gtcatttttt gattgaggga 5760

gatttaaatc ctgataatag tgatgtggac aaactattta tccagttggt acaaacctac 5820

aatcaattat ttgaagaaaa ccctattaac gcaagtggag tagatgctaa agcgattctt 5880

tctgcacgat tgagtaaatc aagacgatta gaaaatctca ttgctcagct ccccggtgag 5940

aagaaaaatg gcttatttgg gaatctcatt gctttgtcat tgggtttgac ccctaatttt 6000

aaatcaaatt ttgatttggc agaagatgct aaattacagc tttcaaaaga tacttacgat 6060

gatgatttag ataatttatt ggcgcaaatt ggagatcaat atgctgattt gtttttggca 6120

gctaagaatt tatcagatgc tattttactt tcagatatcc taagagtaaa tactgaaata 6180

actaaggctc ccctatcagc ttcaatgatt aaacgctacg atgaacatca tcaagacttg 6240

actcttttaa aagctttagt tcgacaacaa cttccagaaa agtataaaga aatctttttt 6300

gatcaatcaa aaaacggata tgcaggttat attgatgggg gagctagcca agaagaattt 6360

tataaattta tcaaaccaat tttagaaaaa atggatggta ctgaggaatt attggtgaaa 6420

ctaaatcgtg aagatttgct gcgcaagcaa cggacctttg acaacggctc tattccccat 6480

caaattcact tgggtgagct gcatgctatt ttgagaagac aagaagactt ttatccattt 6540

ttaaaagaca atcgtgagaa gattgaaaaa atcttgactt ttcgaattcc ttattatgtt 6600

ggtccattgg cgcgtggcaa tagtcgtttt gcatggatga ctcggaagtc tgaagaaaca 6660

attaccccat ggaattttga agaagttgtc gataaaggtg cttcagctca atcatttatt 6720

gaacgcatga caaactttga taaaaatctt ccaaatgaaa aagtactacc aaaacatagt 6780

ttgctttatg agtattttac ggtttataac gaattgacaa aggtcaaata tgttactgaa 6840

ggaatgcgaa aaccagcatt tctttcaggt gaacagaaga aagccattgt tgatttactc 6900

ttcaaaacaa atcgaaaagt aaccgttaag caattaaaag aagattattt caaaaaaata 6960

gaatgttttg atagtgttga aatttcagga gttgaagata gatttaatgc ttcattaggt 7020

acctaccatg atttgctaaa aattattaaa gataaagatt ttttggataa tgaagaaaat 7080

gaagatatct tagaggatat tgttttaaca ttgaccttat ttgaagatag ggagatgatt 7140

gaggaaagac ttaaaacata tgctcacctc tttgatgata aggtgatgaa acagcttaaa 7200

cgtcgccgtt atactggttg gggacgtttg tctcgaaaat tgattaatgg tattagggat 7260

aagcaatctg gcaaaacaat attagatttt ttgaaatcag atggttttgc caatcgcaat 7320

tttatgcagc tgatccatga tgatagtttg acatttaaag aagacattca aaaagcacaa 7380

gtgtctggac aaggcgatag tttacatgaa catattgcaa atttagctgg tagccctgct 7440

attaaaaaag gtattttaca gactgtaaaa gttgttgatg aattggtcaa agtaatgggg 7500

cggcataagc cagaaaatat cgttattgaa atggcacgtg aaaatcagac aactcaaaag 7560

ggccagaaaa attcgcgaga gcgtatgaaa cgaatcgaag aaggtatcaa agaattagga 7620

agtcagattc ttaaagagca tcctgttgaa aatactcaat tgcaaaatga aaagctctat 7680

ctctattatc tccaaaatgg aagagacatg tatgtggacc aagaattaga tattaatcgt 7740

ttaagtgatt atgatgtcga tcacattgtt ccacaaagtt tccttaaaga cgattcaata 7800

gacaataagg tcttaacgcg ttctgataaa aatcgtggta aatcggataa cgttccaagt 7860

gaagaagtag tcaaaaagat gaaaaactat tggagacaac ttctaaacgc caagttaatc 7920

actcaacgta agtttgataa tttaacgaaa gctgaacgtg gaggtttgag tgaacttgat 7980

aaagctggtt ttatcaaacg ccaattggtt gaaactcgcc aaatcactaa gcatgtggca 8040

caaattttgg atagtcgcat gaatactaaa tacgatgaaa atgataaact tattcgagag 8100

gttaaagtga ttaccttaaa atctaaatta gtttctgact tccgaaaaga tttccaattc 8160

tataaagtac gtgagattaa caattaccat catgcccatg atgcgtatct aaatgccgtc 8220

gttggaactg ctttgattaa gaaatatcca aaacttgaat cggagtttgt ctatggtgat 8280

tataaagttt atgatgttcg taaaatgatt gctaagtctg agcaagaaat aggcaaagca 8340

accgcaaaat atttctttta ctctaatatc atgaacttct tcaaaacaga aattacactt 8400

gcaaatggag agattcgcaa acgccctcta atcgaaacta atggggaaac tggagaaatt 8460

gtctgggata aagggcgaga ttttgccaca gtgcgcaaag tattgtccat gccccaagtc 8520

aatattgtca agaaaacaga agtacagaca ggcggattct ccaaggagtc aattttacca 8580

aaaagaaatt cggacaagct tattgctcgt aaaaaagact gggatccaaa aaaatatggt 8640

ggttttgata gtccaacggt agcttattca gtcctagtgg ttgctaaggt ggaaaaaggg 8700

aaatcgaaga agttaaaatc cgttaaagag ttactaggga tcacaattat ggaaagaagt 8760

tcctttgaaa aaaatccgat tgacttttta gaagctaaag gatataagga agttaaaaaa 8820

gacttaatca ttaaactacc taaatatagt ctttttgagt tagaaaacgg tcgtaaacgg 8880

atgctggcta gtgccggaga attacaaaaa ggaaatgagc tggctctgcc aagcaaatat 8940

gtgaattttt tatatttagc tagtcattat gaaaagttga agggtagtcc agaagataac 9000

gaacaaaaac aattgtttgt ggagcagcat aagcattatt tagatgagat tattgagcaa 9060

atcagtgaat tttctaagcg tgttatttta gcagatgcca atttagataa agttcttagt 9120

gcatataaca aacatagaga caaaccaata cgtgaacaag cagaaaatat tattcattta 9180

tttacgttga cgaatcttgg agctcccgct gcttttaaat attttgatac aacaattgat 9240

cgtaaacgat atacgtctac aaaagaagtt ttagatgcca ctcttatcca tcaatccatc 9300

actggtcttt atgaaacacg cattgatttg agtcagctag gaggtgactg aagtatattt 9360

tagatgaaga ttatttctta atctaggctc gagatctatc gataagctta agtgattagt 9420

caaagaatgg tgatgacaat tgtaaattct atttaatcac tttgactagc aaatactaac 9480

aacaagacac acacaccaaa aatcaaaaat tcactacttt tagttaaaaa ccacgtaacc 9540

acaagaacta atccaatcca tgtaatcggg ttcttcaaat atttctccaa gattttcctc 9600

ctctaatatg ctcaacttaa atgacctatt caataaatct attatgctgc taaatagttt 9660

ataggacaaa taagtatact ctaatgacct ataaaagata gaaaattaaa aaatcaagtg 9720

ttcgcttcgc tctcactgcc cctcgacgtt ttagtagcct ttccctcact tcgttcagtc 9780

caagccaact aaaagttttc gggctactct ctccttctcc ccctaataat taattaaaat 9840

cttactctgt atatttctgc taatcattcg ctaaacagca aagaaaaaac aaacacgtat 9900

catagatata aatgtaatgg catagtgcgg gttttatttt cagcctgtat catagctaaa 9960

caaatcgagt tgtgtgtccg ttttagggcg ttctgctagc ttgtttaaag tctcttgaat 10020

gaatgtatgc tctaagtcaa aagaatttgt cagcgccttt atatagcttt ctttttcttc 10080

tttttttact ttaatgatcg atagcaacaa tgatttaaca ctagcaagtt gaatgccacc 10140

atttcttcct ggtttaatct taaagaaaat ttcctgattc gccttcagta ccttcagcaa 10200

tttatctaat gtccgttcag gaatgcctag cacttctcta atctcttttt tggtcgtcac 10260

taaataaggc ttgtatacat cgcttttttc gctaatataa gccattaaat cttctttcca 10320

ttctgacaaa tgaacacgtt gacgttcgct tctttttttc ttgaatttaa accacccttg 10380

acggacaaat aaatctttac tggttaaatc acttgatacc caagctttgc aaagaatggt 10440

aatgtattcc ctattagccc cttgatagtt ttctgaatag gcacttctaa caattttgat 10500

tacttctttt tcttctaagg gttgatctaa tcgattatta aactcaaaca tattatattc 10560

gcacgtttcg attgaatagc ctgaactaaa gtaggctaaa gagagggtaa acatgacgtt 10620

attacgccct attaaaccct tttctcctga aaatttcgtt tcgtgcaata agagattaaa 10680

ccagggttca tctacttgtt ttttgccttc tgtaccgctt aaaaccgtta gacttgaacg 10740

agtaaagccc ttattatctg tttgtttgaa agaccaatct tgccattctt tgaaagaata 10800

acggtaatta ggatcaaaaa attctacatt gtccgttctt ggtatgcgag caataccaaa 10860

atgattacac gttagatcaa ctggcaaaga ctttccaaaa tattctcgga tattttgcga 10920

aattattttg gctgctttga cagatttaaa ttctgatttt gaagtcacat agactggcgt 10980

ttctaaaaca aaatatgctt gataaccttt atcagatttg ataatcatag taggcataaa 11040

acctaaatca atagcggttg ttaaaatatc gcttgctgaa atagtttctt ttgccgtgtg 11100

aatatcaaaa tcaataaaga aggtattgat ttgtcttaaa ttgttttcag aatgtccttt 11160

cgtgtatgaa cggttttcgt ctgcatacgt tccataacga taaacgttgg gtgtccaatg 11220

tgtaaatgta tcttgatttt cttgaatcgc ttcctcggaa gtcagaacaa caccacgacc 11280

gccaatcatg cttgattttg agcgatacgc aaaaatagcc cctttgcttt tacctggctt 11340

ggtagtgatt gagcgaattt tactattttt aaatttgtac tttaacaagc cgtcatgaag 11400

cacagtttct acaacaaaag ggatattcat tcagctgttc tcctttccta taaatcctat 11460

aaaataggtt gtttaattaa cttggtttgc tttttcattc aactgtttca atattgcatg 11520

ttttgaaaaa gatttttttc ctttataagt caattttttt ccactaatcg aataaattat 11580

tttgttattt tctattaact tatatatata atcttccccc tccgaagaaa aatacttatc 11640

tgattttgtt tctaagtaga tatttctctt ttctaactct ttcttaaacg tttctagtgt 11700

atagatattt gctaattttc ttatctccaa taaactattt tttatataag ttttacattc 11760

atcatgattc atacaaactc caccttctat aaatgaatac aaaaaaagca atcaaacgat 11820

ttccgattga ttgcttaaca attcttaaat tcagtagctt agatacttga aaactctctg 11880

atttccctat ataatgatag tacggttata taccgtcttc aaacaaagtt aattaaataa 11940

cttcttacga gggaagagtt catctgacta actgataagc gttggtttgg caatcttatc 12000

gggctatgca tttataaaat gtcgtcaaac attttataaa tgtgtcatgg ctcttttttc 12060

gtttctattc agttcgttgt ttcgttatat ctagtatacc gcttttaaaa aaaaataagc 12120

aacgatttcg tgcattattc acacgaagtc attgcttttt tcttcttcca tttctaaatc 12180

caatgttact tgttctgatt ctgtttctgg ctctggttct gttggctcat ttgggattaa 12240

atccactact agcgttgagt tagttaactt tgcaatttgt tctagtgttt ttatggttgg 12300

atctgatttt cctgattcta ttcgtgaata atttgatcta ctcatttcta attcttgggg 12360

taccgccagc atttcggaaa aaaaccacgc taaggatttt ttctataaaa agagccgtta 12420

tattaagaat aaaacggctc ttttatacgt aaaggacgta aattcatttg cccagtgtca 12480

tgtaatcctt caaatttgta ttctccaaga aaattgatat gttcccatcc taacggccac 12540

gcatatggca ttaaatcttc tctaaattct cctcttgctt ttaattcttc tacggctttt 12600

tccatatata cagtgttcca cacacttata gcgttaataa ttatgtttag tgcactagct 12660

ctttgtaact ggtcttggag agcacgttct ctaaattctc cacgttgtcc aaaaaatata 12720

gttctagcta atgcattgat tgcttctcct ttatttaaac ctttttgaac ccgtctcctt 12780

acggctttat tagatatgta atccagcgta aagagggttt tctcgattcg tcccatttct 12840

ccaagtgctg ttgcgagttt attttgtctt gcatatgatc cgagcttccc catgataaga 12900

gcgctaggga cctctttagc tccttggaag ctgtcagtag tatacctaat aatttatcta 12960

cattcccttt agtaacgtgt aactttccaa atttacaaaa gcgactcata gaattatttc 13020

ctcccgttaa ataatagata actattaaaa atagacaata cttgctcata agtaacggta 13080

cttaaattgt ttactttggc gtgtttcatt gcttgatgaa actgattttt agtaaacagt 13140

tgacgatatt ctcgattgac ccattttgaa acaaagtacg tatatagctt ccaatattta 13200

tctggaacat ctgtggtatg gcgggtaagt tttattaaga cactgtttac ttttggttta 13260

ggatgaaagc attccgctgg cagcttaagc aattgctgaa tcgagacttg agtgtgcaag 13320

agcaacccta gtgttcggtg aatatccaag gtacgcttgt agaatccttc ttcaacaatc 13380

agatagatgt cagacgcatg gctttcaaaa accacttttt taataatttg tgtgcttaaa 13440

tggtaaggaa tactcccaac aattttatac ctctgtttgt tagggaattg aaactgtaga 13500

atatcttggt gaattaaagt gacacgagta ttcagtttta atttttctga cgataagttg 13560

aatagatgac tgtctaattc aatagacgtt acctgtttac ttattttagc cagtttcgtc 13620

gttaaatgcc ctttacctgt tccaatttcg taaacggtat cggtttcttt taaattcaat 13680

tgttttatta tttggttgag tactttttca ctcgttaaaa agttttgaga atattttata 13740

tttttgttca tgtaatcact ccttcttaat tacaaatttt tagcatctaa tttaacttca 13800

attcctatta tacaaaattt taagatactg cactatcaac acactcttaa gtttgcttct 13860

aagtcttatt tccataactt cttttacgtt tccgccattc tttgctgttt cgatttttat 13920

gatatggtgc aagtcagcac gaacacgaac cgtcttatct cccattatat ctttttttgc 13980

actgattggt gtatcatttc gtttttcttt tgcgcttctt gataaaaggg atagtaattc 14040

attcctggtt gcaaattttg aaaaccgcta cggatcacat ctttttctaa actagggccc 14100

Claims (4)

1.一种降低菌株降胆固醇能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将菌株加入到培养基中，并加入胆固醇和牛胆汁进行培养，

其中，所述菌株为双敲除l型和d型的ldh基因的植物乳杆菌AR113，

所述植物乳杆菌AR113保藏于中国普通微生物保藏中心，编号为CGMCC No.13909。

2.根据权利要求1所述的降低菌株降胆固醇能力的方法，其特征在于：

其中，所述双敲除l型和d型的ldh基因的植物乳杆菌AR113的制备方法包括：

步骤1，制备菌株感受态细胞；

步骤2，将质粒导入所述菌株感受态细胞中，得含质粒的菌株感受态细胞；以及

步骤3，构建双敲除ldh质粒并电转入所述含质粒的菌株感受态细胞中，涂布、培养24-48h，得所述双敲除l型和d型的ldh基因的植物乳杆菌AR113。

3.根据权利要求2所述的降低菌株降胆固醇能力的方法，其特征在于：

其中，所述涂布在红霉素和氯霉素双抗性的平板上进行。

4.根据权利要求1所述的降低菌株降胆固醇能力的方法，其特征在于：

其中，所述培养基为MRS培养基。

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