CN112481184A - 一株bcg_0349基因缺失重组卡介苗及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株基因缺失重组卡介苗，该菌株缺失的基因是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的BCG_0349基因，属于人兽共患病防治技术领域。本发明通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含BCG_0349基因上下游同源臂的同源交换底物转导进卡介苗基因组中进行BCG_0349基因敲除，成功构建该菌株并首次确认了缺失株能促进机体炎性细胞因子的表达和分泌，同时毒力致弱，具体体现在索状结构形成能力降低和小菌落表型，胞内存活能力降低更易于被机体所清除，本发明具有在人及动物结核病诊断、疫苗和药物开发等相关领域良好的应用潜能。

Description

一株BCG_0349基因缺失重组卡介苗及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于人兽共患病防治技术领域，涉及卡介苗，尤其是一株基因缺失重组卡介苗，本发明还涉及该菌株的构建方法及其应用。

背景技术

牛结核病是多种动物和人共患的一种慢性消耗性人兽共患病，给世界养牛业和公共健康带来了巨大的经济损失。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)是导致牛结核病的主要病原菌，它与人结核病的主要致病菌结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)在基因水平上有99.95％的同源，因此感染谱相互交叉，两者几乎可以感染所有的脊椎动物，包括人。正因如此，目前用于预防人结核病的唯一官方疫苗就是牛分枝杆菌的体外传代致弱菌株-牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis BacilleCalmette-Guerin，M.bovis BCG)。1921年法国开始将BCG作为人结核病的预防性疫苗，此后逐渐延伸到全球。迄今为止仍是用来预防人结核病的唯一获得许可使用疫苗，部分国家也用来预防动物结核病。然而，虽然卡介苗拯救了数以万计的生命，但对许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生。为解决这一问题，越来越多的学者致力于开发更为安全有效的结核病疫苗，但至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。

分枝杆菌含有大量功能各异的表面蛋白和分泌蛋白，其中一部分蛋白质锚定在细菌的细胞壁和细胞膜上或者直接分泌出胞外，直接暴露于病原菌的生长环境当中(如巨噬细胞吞噬体或组织肉芽肿中)，参与病原与宿主的互作，调控病原菌的胞内存活和宿主的免疫反应。例如结核分枝杆菌表面蛋白Mce3E通过抑制宿主ERK1/2信号通路的激活来下调TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的产生来提高胞内菌的存活^[1]；PPE家族蛋白PPE18通过抑制NF-κB/Rel介导的信号通路抑制由LPS刺激巨噬细胞所产生的IL-12和TNF-α因子，促进机体免疫反应向Th2方向极化^[2]；PtpA蛋白则能够利用宿主细胞的泛素化系统来干扰宿主天然免疫的激活，进而提高感染过程中细菌的胞内存活能力^[3]。可见，结核分枝杆菌表面蛋白作为效应分子在与宿主的互作中发挥着重要的作用，可以通过干扰宿主的免疫反应避免细菌被宿主清除，进而促进结核分枝杆菌建立感染。

索状因子是卡介苗细胞壁糖脂中的一种潜在炎性调节因子，影响着细菌的排列形态。已经被证实的是，索状因子能够影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿，在结核感染中起着重要的作用^[4]。索状结构是致病性分枝杆菌的特有表型，根据有无索状结构，分枝杆菌可表现为粗糙型或光滑型，两者的毒力存在差异。如脓肿分枝杆菌的光滑型被认为不具备侵袭能力，而粗糙型则具有更强的侵袭能力^[5]。索状因子的形成涉及多种细菌表面蛋白的共同参与，如脂肪酸辅酶A合成酶FadD26缺失可导致结核分枝杆菌突变株表现出索状因子消失，并在小鼠模型中减毒^[6]。因此，分枝杆菌的索状结构形态是细菌毒力的重要指征之一。

BCG_0349是一个功能未知的基因，位于结核分枝杆菌基因组的RD8(Region ofdifference)区；在卡介苗中，除BCG-Frappier株和BCG-Connaught株缺失该基因外，包括BCG Pasteur株在内的大部分BCG中均存在有该基因。BCG_0349基因所编码的蛋白为假想蛋白，属于Yku D蛋白超家族，并具有L,D-肽聚糖转肽酶活性的结构域，与结核分枝杆菌的耐药性相关。一方面，生物信息学分析结果显示，BCG_0349蛋白为分泌蛋白，具有两个T细胞抗原表位。在不同的临床分离株中，BCG_0349蛋白的T细胞表位中具有较高水平的氨基酸多态性，提示该蛋白可能在病原菌的免疫逃逸过程中发挥作用^[7]。另一方面，质谱结果显示，结核分枝杆菌H37Rv的培养滤液、膜蛋白部分和全细胞裂解液中均含有该蛋白。

本发明前期研究发现，BCG_0349蛋白可以下调宿主IFN-γ和TNF-α等Th1型细胞因子分泌水平，具有负向调控宿主天然免疫反应的潜在功能，具有开发为抗结核疫苗、药物、诊断试剂等方面的重要潜能。

参考文献：

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[2]Nair S,Pandey A D,Mukhopadhyay S.The PPE18 protein ofMycobacterium tuberculosis inhibits NF-kappaB/rel-mediated proinflammatorycytokine production by upregulating and phosphorylating suppressor ofcytokine signaling 3 protein[J].J Immunol,2011,186(9):5413-24.

[3]Wang J,Li B X,Ge P P,et al.Mycobacterium tuberculosis suppressesinnate immunity by coopting the host ubiquitin system[J].Nat Immunol,2015,16(3):237-45.

[4]Kenji T,Yasunobu M,Sho Y,et al.Characterization of the Receptorsfor Mycobacterial Cord Factor in Guinea Pig[J].Plos One,2014,9(2):e88747.

[5]Clary G,Sasindran S J,Nesbitt N,et al.Mycobacterium abscessusSmooth and Rough Morphotypes Form Antimicrobial-Tolerant Biofilm Phenotypesbut Are Killed by Acetic Acid[J].Antimicrob Agents Chemother,2018,62(3).

[6]T-Cell Responses and In Vivo Cytotoxicity in the Target Organ andthe Regional Lymphoid Tissue During Airborne Infection with the VirulentMycobacterium tuberculosis MT103 and its Lipid Mutant fadD26[J].ScandinavianJournal of Immunology,2010.

[7]Jiang Y,Dou X,Zhang W,et al.Genetic diversity of antigens Rv2945cand Rv0309 in Mycobacterium tuberculosis strains may reflect ongoing immuneevasion[J].FEMS Microbiol Lett,2013,347(1):77-82.

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株重要的基因缺失重组卡介苗菌株，该菌株缺失了BCG_0349基因。相对于野生型卡介苗，该重组卡介苗表现出毒力致弱、能更有效激活宿主的抗结核反应等特性，具体表现在菌落变小、索状结构减少，胞内存活能力降低，有效促进宿主炎性细胞因子的表达和分泌。该菌株具有在人及动物结核病诊断、疫苗和药物开发等相关领域的应用潜能。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室构建了牛分枝杆菌卡介苗基因缺失株，命名为Mycobacteriumbovis BCGΔBCG_0349(在本发明中简称为BCGΔBCG_0349)，该缺失株缺失了BCG_0349基因，该基因编码一种保守的假想蛋白。与野生型BCG相比，缺失株BCGΔBCG_0349生长速率无显著差异，形态学上表现出菌落直径变小以及索状结构明显消失等特性；细胞水平上能够促进细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，胞内存活能力显著降低。动物水平上，BCGΔBCG_0349缺失株能够有效促进C57BL/6小鼠血液及脾脏中TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表达，促进机体免疫反应向Th1型免疫反应极化。

BCGΔBCG_0349所缺失的基因为BCG_0349，缺失株所显示出的性状即被BCG_0349基因所调控，因此推测该基因所编码的蛋白，对宿主的免疫反应水平及细菌的毒力具有调控作用。以上结果提示：BCGΔBCG_0349菌株存在有毒力致弱，且提升机体抵御结核分枝杆菌的能力，具有开发为人及动物结核病疫苗、诊断试剂或新药靶标等的潜在价值。因此，该缺失株的成功构建及其所涉及基因BCG_0349相关功能的研究将对开发更为安全有效的疫苗、诊断试剂和药物具有重要的参考价值。

本发明的具体技术方案如下所述：

申请人所用的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株【美国模式培养物保藏所(ATCC)：35734】为美国俄勒冈州立大学Luiz Bermudez教授馈赠。申请人以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株为野生菌株，利用具有温敏特性的噬菌体，将带有同源臂的同源交换底物转导到牛分枝杆菌卡介苗中，利用潮霉素对突变菌株进行抗性筛选，从而成功构建基因缺失株。申请人将该缺失株分类命名为Mycobacterium bovis BCGΔBCG_0349，并于2020年9月14日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020492。

更详尽的构建方法如下：

(1)设计引物，构建包含BCG_0349基因上下游同源臂的同源交换底物；

(2)将步骤(1)构建的同源交换底物与phAE159质粒连接，电转入耻垢分枝杆菌MC²155产生包含同源交换底物的温敏型噬菌体；

(3)用步骤(2)的温敏型噬菌体感染野生型卡介苗，利用潮霉素抗性筛选阳性克隆；

(4)鉴定阳性克隆，获得敲除了BCG_0349基因的重组卡介苗。

所述引物的序列如下：

上游同源臂正向引物：TTTTTTTTCCATAAATTGGTGTTTCGCTCGCTTTTGTCG

上游同源臂反向引物：TTTTTTTTCCATTTCTTGGACAGCAAAGCTAGGAGTCGG

下游同源臂正向引物：TTTTTTTTCCATAGATTGGTGCAGATCATCCGTTGGCTG

下游同源臂反向引物：TTTTTTTTCCATCTTTTGGAGCTCGGGTAACAGAACTGC。

同时，申请人以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株全基因组为模板克隆BCG_0349基因，并构建重组转化质粒，电转进入缺失株BCGΔBCG_0349的感受态细胞，利用潮霉素和卡那霉素进行抗性筛选，成功构建回补菌株，命名为Mycobacterium bovis BCGΔBCG_0349+BCG_0349(在本发明中简称为BCGΔBCG_0349+BCG_0349或回补株)。

将本发明获得的缺失株(BCGΔBCG_0349)、回补株(BCGΔBCG_0349+BCG_0349)与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H9培养基中进行生长特性的测定，结果显示，缺失株、野生株以及回补株之间生长速率无显著差异。将缺失株、回补株、野生株分别接种于7H11培养基中进行菌落形态的测定，结果显示缺失株菌落形态显著变小且索状结构明显消失。为验证BCGΔBCG_0349缺失株的特性及功能，本发明在细胞水平(巨噬细胞模型)和动物水平(C57BL/6小鼠模型)上进行了验证，确定了BCGΔBCG_0349具有促进细胞和小鼠炎性细胞因子产生的功能。

本发明构建的缺失株涉及基因为BCG_0349，该基因编码保守型假想蛋白，尚未检索到相关文献或数据库报道该基因功能。

本发明具有以下优点：

1、本发明的基因缺失重组卡介苗是发明人利用牛分枝杆菌卡介苗首次构建的BCG_0349全基因敲除菌株。

2、本发明的基因缺失重组卡介苗已被发明人证实在体外和体内感染中，相对于野生型BCG和回补菌株呈现显著促进炎性细胞因子分泌和低胞内存活的能力。

3、本发明的基因缺失重组卡介苗已被发明人证实相较于牛分枝杆菌卡介苗野生菌株呈现显著的形态变小且索状结构明显消失的表型。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。

附图说明

图1：为空载质粒p0004s图谱。

图2：为空载质粒phAE159图谱。

图3：本发明所采用的穿梭质粒pMV261的质粒图谱。

图4：缺失株的PCR鉴定结果。

图5：缺失株和回补株的Western Blot鉴定结果。

图6：野生株、缺失株和回补株在7H9培养基中的生长曲线。

图7：A图为野生株、缺失株和回补株的菌落形态，B图为三种菌落直径统计图。图中，***表示P<0.001。

图8：细胞水平上野生株、缺失株和回补株调控巨噬细胞中炎性细胞因子分泌的qRT-PCR检测结果。图中，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图9：细胞水平上野生株、缺失株和回补株调控巨噬细胞中炎性细胞因子分泌的ELISA检测结果。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图10：动物水平上野生株、缺失株和回补株调控脾脏中炎性细胞因子分泌的qRT-PCR检测结果。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图11：动物水平上野生株、缺失株和回补株调控脾脏中炎性细胞因子分泌的ELISA检测结果。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图12：野生株、缺失株和回补株的胞内存活能力体外水平检测结果。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图13：野生株、缺失株和回补株的胞内存活能力体内水平检测结果。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明的BCG缺失株敲除基因BCG_0349的核苷酸序列，序列全长为657bp。(NC_008769.1:408858-409514Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCGstr.Pasteur 1173P2,complete genome)

SEQ ID NO:2是扩增BCG_0349上游同源臂的正向引物BCG_0349-LF的序列，用于构建缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:3是扩增BCG_0349上游同源臂的反向引物BCG_0349-LR的序列，用于构建缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:4是扩增BCG_0349下游同源臂的正向引物BCG_0349-RF的序列，用于构建缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:5是扩增BCG_0349下游同源臂的反向引物BCG_0349-RR的序列，用于构建缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:6是缺失株鉴定引物正向引物BCG_0349-out-F的序列，用于鉴定缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:7是缺失株鉴定引物反向引物BCG_0349-out-R的序列，用于鉴定缺失株BCGΔBCG_0349。

SEQ ID NO:8是扩增BCG_0349基因片段的正向引物BCG_0349F的序列，用于构建pMV261-BCG_0349。

SEQ ID NO:9是扩增BCG_0349基因片段的反向引物BCG_0349R的序列，用于构建pMV261-BCG_0349。

实施例1：BCGΔBCG_0349基因缺失株和回补菌株的构建

1.1同源交换底物的构建

参考GenBank中Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG str.Pasteur1173P2卡介苗巴斯德株的全基因组序列，利用卡介苗巴斯德株全基因组为模板，利用如下设计的引物(序列表SEQ ID NO：2-5)得到BCG_0349基因的上下游同源臂。利用高保真DNA聚合酶分别PCR扩增左右同源臂。

扩增BCG_0349上下游同源臂引物序列如下所示：

a、上游同源臂正向引物(SEQ ID NO:2)BCG_0349-LF：

TTTTTTTTCCATAAATTGGTGTTTCGCTCGCTTTTGTCG下划线所示为Van91I的酶切位点。

b、上游同源臂反向引物(SEQ ID NO:3)BCG_0349-LR：

TTTTTTTTCCATTTCTTGGACAGCAAAGCTAGGAGTCGG下划线所示为Van91I的酶切位点。

c、下游同源臂正向引物(SEQ ID NO:4)BCG_0349-RF：

TTTTTTTTCCATAGATTGGTGCAGATCATCCGTTGGCTG下划线所示为Van91I的酶切位点。

d、下游同源臂反向引物(SEQ ID NO:5)BCG_0349-RR：

TTTTTTTTCCATCTTTTGGAGCTCGGGTAACAGAACTGC下划线所示为Van91I的酶切位点。

PCR反应体系如下：

模板DNA 2μL，2×planta^TM Master Mix 25μL，引物各2μL，超纯水19μL。

PCR扩增条件如下：

98℃预变性5min；98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，进行30个循环反应；72℃彻底延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，鉴定正确后用DNA纯化试剂盒(Cycle-Pure Kit)纯化。

将上下游同源臂以及p0004s质粒(p0004s质粒酶切后回收两条片段，大小分别为3672bp和1614bp)，经Van91I酶切后回收纯化用T4连接酶，4℃，连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用LB固体培养基(Hyg^150μg/mL)筛选阳性克隆，提取重组质粒后测序，将测序正确的质粒于-20℃保存备用，命名为p0004s-BCG_0349。

1.2构建包含同源交换底物的温敏型噬菌体

1.2.1噬菌体包装质粒构建

p0004s-BCG_0349重组质粒和phAE159质粒均经Pac I酶切，p0004s重组质粒酶切产物用凝胶回收试剂盒回收后备用；phAE159质粒酶切产物直接用热敏碱性磷酸酶去磷酸化后备用。上述酶切产物用T4 DNA连接酶4℃连接过夜。

1.2.2噬菌体包装

将上述p0004s-BCG_0349重组质粒和phAE159质粒的连接产物使用包装试剂盒(Max Plax Lambda Packaging Extracts)进行包装，步骤如下：

1)大肠杆菌HB101宿主细胞的制备：挑取大肠杆菌HB101单菌落接种于5mL LB液体培养基(添加10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖)，37℃，180r/min培养过夜。第二天1:50～1:100转接至25mL新鲜的LB液体培养基(添加10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖)中，培养至OD600 0.8～1.0。然后4℃，4,000r/min离心5～10min收集细胞。依次用等体积、1/2体积预冷的10mMMgSO₄洗涤，最终重悬在12.5mL 10m M MgSO₄中，4℃保存备用。

2)连接产物的包装：将包装试剂在冰上化冻，加入5μL p0004s-BCG_0349重组质粒和phAE159质粒的连接产物，轻轻混匀后于室温放置1.5h。加入400μL MP Buffer，室温静置30min。加入1mL新鲜制备的大肠杆菌HB101宿主细胞，混匀后置于37℃温箱孵育1h。4,000r/min离心收集细胞，用1mL新鲜的LB液体培养基重悬。取100～200μL菌液均匀涂布于LB固体培养基(Hyg^150μg/mL)上，平板置于37℃温箱培养过夜。

利用LB固体培养基(Hyg^150μg/mL)筛选阳性克隆子，提取质粒测序，鉴定正确后保存备用，命名为phAE159-BCG_0349。

1.2.3高滴度噬菌体裂解液的制备

将phAE159-BCG_0349重组质粒电转入耻垢分枝杆菌MC²155(电击程序：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF)，电击后迅速加入1mL 7H9培养基(不含Tween-80)，混匀后转移至15mL离心管中，于37℃温箱复苏4h。取800μL复苏后的菌液置于5mL离心管中，加入3mL50℃温热的Top Agar，混匀后迅速倾倒在7H11平板上，迅速晃动平板使液体均匀平整的铺满整个平板。待凝固后将平板置于30℃温箱培养2～3天，观察噬菌斑的形成。

挑取单个噬菌斑至已加有200μL MP Buffer的1.5mL离心管中，4℃静置过夜。过夜后从中取出50μL并加到300μL新鲜培养的MC²155中，混匀后加入3mL 50℃温热的Top Agar并铺板，平板倒置30℃温箱培养2～3天。向长满噬菌斑的平板中加入5mL MP Buffer，4℃放置过夜。利用无菌注射器吸取平板中的液体(噬菌体裂解液)，0.22μm滤器过滤至1.5mL离心管中。噬菌体裂解液滴度的测定，4℃保存备用。

1.3高滴度噬菌体裂解液感染待敲除菌株及阳性克隆筛选

待敲除菌株培养至OD600 0.7～0.8，即菌达到10⁹CFU/mL左右时，高滴度噬菌体裂解液可以达到10¹⁰PFU/mL。选择高滴度噬菌体裂解液原液和稀释10倍的噬菌体裂解液感染待敲除菌株。离心收集10mL培养的待敲除菌株，用MP buffer洗涤2次，最终用1ml MPbuffer重悬，将噬菌体裂解液与1ml MP buffer重悬的菌株混匀置37℃孵育过夜后，离心弃上清，然后加入10ml 7H9培养基，置于37℃培养箱复苏24小时，离心后涂平板(7H11+Hyg^{75ug /ml})，37℃培养3周左右。

1.4敲除株阳性克隆鉴定及回补株构建

1.4.1敲除株阳性克隆鉴定

从潮霉素抗性平板上挑取2～3个单克隆至装有8mL 7H9培养基(Hyg^75μg/mL)的细菌瓶中，37℃温箱静置培养约2周后提取基因组进行PCR鉴定。引物序列如下：

a、正向引物(SEQ ID NO：6)BCG_0349-out-F：CAACCTGACAGCGTAGGTCA

b、反向引物(SEQ ID NO：7)BCG_0349-out-R：TGCATGCGCTTGGTGTAGAT

基因缺失株的PCR鉴定体系如下：

模板DNA 2μL，2×Taq Master Mix 25μL，引物各2μL，超纯水19μL。

PCR扩增条件如下：

98℃预变性5min；98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，进行30个循环反应；72℃彻底延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

因本发明采用同源臂交换的方式，目的基因被潮霉素抗性盒子替换，当使用外部引物鉴定时敲除株的基因片段(5-8Kb)要比野生株(2-3kb)大得多，可以将两者区分开来。通过上述鉴定结果(图4)，本实验成功获得了BCGΔBCG_0349基因缺失株。

1.4.2基因缺失株BCGΔBCG_0349的回补株构建

以BCG巴斯德株全基因组为模板，利用如下设计的引物(序列表SEQ ID NO：8-9)克隆BCG_0349基因，得到BCG_0349基因的全序列，序列长度为657bp。

扩增BCG_0349基因的引物序列如下所示：

a、正向引物(SEQ ID NO：8)BCG_0349F：

GGGGATCCATGAGCCGACTCCTAGCTTTGCT下划线所示为BamHⅠ的酶切位点。

b、反向引物(SEQ ID NO：9)BCG_0349R：

CGAAGCTTCTTGGCGATCGCGATCACCG。下划线所示为HindⅢ的酶切位点。

PCR反应体系如下：

模板DNA 2μL，2×planta^TM Master Mix 25μL，引物各2μL，超纯水19μL。

PCR扩增条件如下：

98℃预变性5min；98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，进行30个循环反应；72℃彻底延伸10min。

回收PCR扩增产物，用BamHⅠ和HindⅢ酶切，同时将pMV261质粒用相同的酶进行双酶切。将酶切后的BCG_0349基因和pMV261质粒用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pMV261-BCG_0349。将该重组质粒pMV261-BCG_0349转化BCGΔBCG_0349后，利用潮霉素抗性和卡那抗性7H11固体培养基筛选得到阳性克隆。采用菌液PCR鉴定正确后进行Westernblot检测。

1.4.3Western blot鉴定缺失株和回补菌株

将上述构建的缺失株、回补菌株以及野生株培养至对数生长期，4℃，l0000rpm/min离心5min后用PBS洗涤菌体3次，重悬菌体后超声破碎细胞进行SDS-PAGE电泳，将胶转移到PVDF膜上，膜洗涤后，将膜放入用TBST稀释的5％BSA中，室温封闭3h；充分洗涤后将PVDF膜放入1000倍稀释的BCG_0349多克隆抗体中，4℃孵育过夜；充分洗涤后将PVDF膜放入10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG中，室温1h；TBST洗涤三次后将混合好的ECL发光液均匀滴加在膜上，应用Kodak Image Station化学发光检测仪检测信号。结果显示：缺失株不能与BCG_0349抗体发生反应，未检测到特异性反应条带，(图5，泳道2)。野生株和回补株均能与BCG_0349抗体抗体发生反应，检测到分子量约为22kDa特异性反应条带(图5，泳道1,3)，因此缺失株和回补株构建成功。

实施例2：BCGΔBCG_0349缺失株的体外生长特性

2.1 BCGΔBCG_0349缺失株生长曲线测定

取牛分枝杆菌卡介苗野生株、回补株和缺失株BCGΔBCG_0349以1:100(体积比)的比例接种7H9液体培养基中，静置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养60天，每3天取适当菌液测量OD₆₀₀值，如图6所示，在体外培养条件下三种菌株生长速率无显著统计学差异。表明BCG_0349基因不影响细菌的生长速度。

2.2缺失株BCGΔBCG_0349的形态学观察

将培养至对数末期的牛分枝杆菌卡介苗野生株、回补株和缺失株分别稀释适当倍数，涂布于7H11固体培养基上，于37℃、5％CO₂培养箱中培养30天后观察卡介苗菌落形态，如图7B所示BCGΔBCG_0349突变菌株菌落显著小于野生菌株(P<0.001)，相对于野生株菌落而言，突变菌株索状结构明显消失(图7A)。表明BCGΔBCG_0349缺失株相对于野生株具有较低毒力，其缺失基因BCG_0349具有增强细菌毒力的功能。

实施例3：BCGΔBCG_0349缺失株诱导炎性因子表达能力的检测

3.1 BCGΔBCG_0349缺失株在细胞水平上调控巨噬细胞炎性细胞因子分泌能力的检测

以每孔2×10⁵个细胞接种小鼠单核巨噬细胞RAW264.7于细胞12孔板中，37℃，5％CO₂培养至贴壁；分别用缺失株、回补株及野生株以感染比10:1(MOI＝10:1)感染RAW264.7细胞。37℃，5％CO₂培养箱孵育2小时，弃去孔内液体，加入磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.4PBS)充分洗涤3遍，加入含有100μg/ml庆大霉素的培养基杀死胞外细菌，再放置37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时记为感染0h。分别于感染0、2、4、8、24、48h收集细胞培养上清用于细胞因子蛋白表达水平的检测，同时，用PBS充分洗涤细胞后提取总mRNA用于细胞因子mRNA水平的检测。如图8所示，与野生型BCG和回补菌株对比，BCGΔBCG_0349缺失株感染RAW264.7细胞8h和24h后IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平升高(P<0.001)。如图9所示，ELISA实验结果也同样证实BCGΔBCG_0349感染RAW264.7细胞8h和24h后促进感染过程中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌(P<0.001)。

3.2 BCGΔBCG_0349缺失株在动物水平上调控巨噬细胞炎性细胞因子分泌能力的检测

为了进一步验证BCGΔBCG_0349在体内实验中的表型，将缺失株、回补株和野生株以2×10⁶CFU的剂量感染小鼠，在感染后0、2、4、8、16和21天后对小鼠进行安乐死。充分研磨小鼠脾脏后进行细胞总RNA的提取，并利用qRT-PCR法对TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA表达水平进行检测。同时收集感染小鼠的血清，用ELISA法对TNF-α，IFN-γ和IL-1β的分泌水平进行检测。如图10所示，BCGΔBCG_0349缺失株感染小鼠后第4和第8天的脾脏内，细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA表达水平远远高于野生型和回补株感染的小鼠(P<0.05)；如图11所示，BCGΔBCG_0349缺失株感染小鼠后第4天的血液中，TNF-α和IFN-γ的蛋白水平也显著高于其它两组小鼠(P<0.05)，在感染后第8天，BCGΔBCG_0349缺失株感染小鼠血清中IL-1β显著高于其它两组小鼠(P<0.001),表现出与mRNA表达水平一致的检测结果。

实施例4：BCGΔBCG_0349缺失株胞内存活能力的检测

4.1 BCGΔBCG_0349缺失株胞内存活能力的体外水平检测

以每孔2×10⁵个细胞接种RAW264.7细胞于细胞12孔板中，37℃，5％CO₂培养至贴壁；分别用缺失株、回补株及野生株以感染比10:1(MOI＝10:1)感染RAW264.7细胞。37℃，5％CO₂培养箱孵育2小时，弃去孔内液体，加入磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.4PBS)充分洗涤3遍，加入含有100μg/ml庆大霉素的培养基杀死胞外细菌，再放置37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时记为感染0h。分别在感染0、2、4、8、24、48h后加入0.025％(v/v)的SDS，充分裂解细胞后进行细菌计数(CFU)。如图12所示，感染4h后BCGΔBCG_0349缺失株胞内存活能力相较野生株显著降低(P<0.001)。

4.2 BCGΔBCG_0349缺失株胞内存活能力的体内水平检测

将BCGΔBCG_0349缺失株、回补株和野生株以2×10⁶CFU的剂量分别感染小鼠，在感染后0、2、4、8、16和21天后对小鼠进行安乐死，对肺部进行载菌量的检测。如图13所示，在感染第8天，BCGΔBCG_0349缺失株感染组的肺部载菌量相较其野生株显著降低(P<0.001)。表现出与细胞水平检测结果的一致性。

综上，本发明的BCGΔBCG_0349缺失株具有诱导巨噬细胞和小鼠炎性细胞因子的表达和分泌的功能，同时降低了细菌的毒力，表现为索状结构形成能力降低，胞内存活能力降低及更易于被机体所清除。因此，BCGΔBCG_0349缺失株具有在人及动物结核病诊断、疫苗、药物开发等方面的广泛潜能。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株BCG_0349基因缺失重组卡介苗及其构建方法与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis)

<400> 1

atgagccgac tcctagcttt gctgtgcgct gcggtatgca cgggctgcgt tgctgtggtt 60

ctcgcgccag tgagcctggc cgtcgtcaac ccgtggttcg cgaactcggt cggcaatgcc 120

actcaggtgg tttcggtggt gggaaccggc ggttcgacgg ccaagatgga tgtctaccaa 180

cgcaccgccg ccggctggca gccgctcaag accggtatca ccacccatat cggttcggcg 240

ggcatggcgc cggaagccaa gagcggatat ccggccactc cgatgggggt ttacagcctg 300

gactccgctt ttggcaccgc gccgaatccc ggtggcgggt tgccgtatac ccaagtcgga 360

cccaatcact ggtggagtgg cgacgacaat agccccacct ttaactccat gcaggtctgt 420

cagaagtccc agtgcccgtt cagcacggcc gacagcgaga acctgcaaat cccgcagtac 480

aagcattcgg tcgtgatggg cgtcaacaag gccaaggtcc caggcaaagg ctccgcgttc 540

ttctttcaca ccaccgacgg cgggcccacc gcgggttgtg tggcgatcga cgatgccacg 600

ctggtgcaga tcatccgttg gctgcggcct ggtgcggtga tcgcgatcgc caagtaa 657

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttttttcc ataaattggt gtttcgctcg cttttgtcg 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttttttcc atttcttgga cagcaaagct aggagtcgg 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttttttcc atagattggt gcagatcatc cgttggctg 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttttttttcc atcttttgga gctcgggtaa cagaactgc 39

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacctgaca gcgtaggtca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcatgcgct tggtgtagat 20

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggatccat gagccgactc ctagctttgc t 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgaagcttct tggcgatcgc gatcaccg 28

Claims (9)

1.一株基因缺失重组卡介苗，其特征在于：所述卡介苗缺失的基因是核苷酸序列如SEQID NO:1所示的BCG_0349基因。

2.如权利要求1所述的基因缺失重组卡介苗，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020492。

3.如权利要求1或2所述的基因缺失重组卡介苗的构建方法，其特征在于：通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含BCG_0349基因上下游同源臂的同源交换底物转导进卡介苗基因组中进行BCG_0349基因敲除。

4.如权利要求3所述的基因缺失重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计引物，构建包含BCG_0349基因上下游同源臂的同源交换底物；

(2)将步骤(1)构建的同源交换底物与phAE159质粒连接，电转入耻垢分枝杆菌MC²155产生包含同源交换底物的温敏型噬菌体；

(3)用步骤(2)的温敏型噬菌体感染野生型卡介苗，利用潮霉素抗性筛选阳性克隆；

(4)鉴定阳性克隆，获得敲除了BCG_0349基因的重组卡介苗。

5.如权利要求4所述的基因缺失重组卡介苗的构建方法，其特征在于，所述引物的序列如下：

上游同源臂正向引物：TTTTTTTTCCATAAATTGGTGTTTCGCTCGCTTTTGTCG

上游同源臂反向引物：TTTTTTTTCCATTTCTTGGACAGCAAAGCTAGGAGTCGG

下游同源臂正向引物：TTTTTTTTCCATAGATTGGTGCAGATCATCCGTTGGCTG

下游同源臂反向引物：TTTTTTTTCCATCTTTTGGAGCTCGGGTAACAGAACTGC。

6.如权利要求4所述的基因缺失重组卡介苗的构建方法，其特征在于：所述野生型卡介苗是牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株。

7.一株基因缺失重组卡介苗的回补菌株，其特征在于，PCR扩增野生型卡介苗的BCG_0349基因，构建重组转化质粒，电转进入权利要求1或2所述的基因缺失重组卡介苗，通过抗性筛选并鉴定获得阳性克隆。

8.权利要求1或2所述的基因缺失重组卡介苗在制备结核病诊断试剂、疫苗或防治药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述基因缺失重组卡介苗能促进机体炎性细胞因子的表达和分泌，同时毒力致弱，表现为索状结构形成能力降低和小菌落表型，胞内存活能力降低更易于被机体所清除。

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