KR101873362B1 - 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주을 이용한 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS, Omp19, PrpA 및 SOD 항원의 분비를 증가시키도록 개발된 벡터로 약독화 살모넬라균을 형질전환시키고 상기 형질전환된 살모넬라 변이주의 혼합물을 접종시킨 마우스에서 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 유도 및 도전 감염시 방어 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 변이주는 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing or treating brucellosis comprising attenuated Salmonella mutant expressing pan-Brucella immunogen}
본 발명은 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
브루셀라증(Brucellosis)은 포유동물 특히 소를 포함한 반추동물, 개, 돼지, 산양, 면양, 말 등에서 유산 및 불임을 일으키고, 사람에서는 몰타열(Malta fever, Melitensis fever)을 포함한 열병(파상열), 관절염 및 오한을 유발하는 인수 공통 전염병이다. 브루셀라증은 원인균으로 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis) 및 브루셀라 캐니스(Brucella canis) 등의 브루셀라균이 감염되어 유발되는 것으로 보고되어 있다. 이 중 브루셀라 아보투스는 소에서 발견되는 병원균으로 양축 농가에 큰 피해를 주어 국가 경제적으로 큰 문제가 되고 있다.
우리 나라는 1955년까지 브루셀라증의 비감염 지역이었으나 1956년에 미국에서 도입한 젖소군에서 처음 브루셀라증의 발병이 보고된 이후 1958년에 국립종축장의 돼지에서, 1960년에는 제주 목장에 도입된 소에서 집단 발병한 것으로 보고되었으며 이외에도 지속적인 발병 사례가 발표되고 있다.
브루셀라증을 극복하기 위하여 세계 여러 나라에서는 젖소를 대상으로 예방 백신을 접종하거나 이를 진단하여 양성을 보이는 소를 살처분하는 2가지 방식의 정책을 시행하여 왔다. 우리 나라의 경우는 아직 브루셀라증의 발병율이 낮기 때문에 지금까지는 예방 백신을 접종하기보다는 이를 검진하여 양성인 소를 도태시키는 방식으로 브루셀라증을 근절하고자 하였다. 그러함에도 불구하고 그 발병 두수가 증가함은 물론 그의 집단 발병으로 낙농업을 포기하는 농가가 증가하고 있는 실정이다. 따라서 국가 방역 정책이 예방 접종으로 변경된다면 브루셀라증 진단약을 생산하고 그 검진 사업에 소용되는 예산의 일부로서도 전 젖소에 대하여 충분히 예방 접종을 수행할 수 있는 경제적인 이점도 기대할 수 있다.
브루셀라균은 숙주가 된 대식세포 안에서 세포 내로 침입을 하고 증식하는 병원균이다. 체액성과 세포매개 면역성 모두 브루셀라증을 예방하기 위해 필요하지만 특히 세포매개 면역반응이 숙주개체로부터 브루셀라를 제거하기 위해 필요하다. 숙주가 브루셀라 감염에 반응하여 IFN-γ에 의해 매개된 T 세포 타입 1(Th1)의 면역 반응을 활성화시킨다. 현재까지 브루셀라증을 예방하기 위해 상업적으로 사용할 수 있는 백신들은 생백신과 약독화된 브루셀라 백신 균주이다. 이러한 백신들은 병원성 균주로 되돌아가는 성질이 있고, 브루셀라 진단에 방해가 되는 등의 문제점이 있다. 이러한 제한 때문에 안전하게 사용하기 위해서는 더욱 효과적인 백신 개발이 신속하게 이루어질 필요가 있다. 현재 유전공학 기술로 재조합된 약독화 백신, 분자 표지 균주, DNA 백신 및 서브유닛 백신 등을 구축하고 있으나, 아직까지 효과적인 백신은 없는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제0263942호에는 '브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 균주 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1151004호에는 '소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화된 살모넬라 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 백신으로 인한 면역 반응의 증강뿐만 아니라 브루셀라증과 살모넬라증을 동시에 예방하기 위해 브루셀라 아보투스 유래의 4종의 항원(BLS, Omp19, PrpA 및 SOD)을 각각 Bla 신호 서열을 포함하는 생균 백신용 재조합 벡터에 클로닝하여 비병원성 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키고 상기 형질전환된 살모넬라 혼합물을 접종시킨 마우스에서 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 유도 및 도전 감염시 방어 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 각각 발현하고, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 코딩하는 유전자를 각각 증폭시키는 단계를 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 약독화 살모넬라 변이주는 살모넬라 야외균주와 유사한 외각성분 및 외각구조를 가지면서 브루셀라 아보투스 유래 항원들을 세포 외부에 발현시켜 상기 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 유도 및 도전 감염시 방어 효과가 우수하여 본 발명의 변이주는 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 브루셀라증과 살모넬라증을 동시에 예방 및 치료할 수 있는 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 정제하여 사용된 브루셀라 LPS를 실버 염색으로 확인한 결과이다.
도 2는 약독화 살모넬라 균주 JOL912와 JOL912에서 유래한 O-항원 결실 균주 JOL1800에서 각각 발현된 브루셀라 항원(A:BLS, B:PrpA, C:Omp19, D:SOD)을 배양 상층액에서 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과이다.
도 3의 (I)는 초음파 분쇄된 (sonicated) 브루셀라 균주를 코팅 항원으로 사용한 ELISA를 통한 면역 실험동물의 혈청과 장세척액에서 검출된 IgG(A)와 IgA(B) 수준을 측정한 결과이며, (II)는 재조합 브루셀라 항원 중 BLS 정제 단백질을 코팅 항원으로 사용한 ELISA를 통한 면역 실험동물의 혈청과 장세척액에서 검출된 IgG(A)와 IgA(B) 수준을 측정한 결과이다.
도 4의 (I)는 브루셀라 항원으로 재자극한 마우스 비장세포에서 RT-PCR을 이용하여 IL-4와 IL-12 사이토카인의 농도를 확인한 결과이며,(II)는 브루셀라 항원(BS) 또는 살모넬라 외막 단백질(SS)로 자극한 비장세포에서 분비하는 IFN-γ 사이토카인의 농도를 ELISPOT 분석으로 확인한 결과이다. 자극하지 않은 비장세포(US)의 수치와 비교하여 통계학적 유의함이 결정되었다.
도 5는 ELISPOT 분석으로 IFN-γ 점(dot)을 확인한 결과이다.
도 6은 도전감염 실험동물의 비장에서 각 그룹별로 검출된 도전감염 균주 사진이다.
도 7은 도전감염 후 비장에서 검출된 도전감염 균주의 수에 따른 보호 인덱스(protective Index) 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 각각 발현하고, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 제공한다.
브루셀라증은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus, 소), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis, 양,염소), 브루셀라 수이스(Brucella suis, 돼지), 브루셀라 캐니스(Brucella canis, 개) 및 브루셀라 오비스(Brucella ovis, 양) 등의 브루셀라균이 감염되어 유발되는 것으로 보고되어 있고, 모두 인체에 감염하여 심각한 질병을 초래하며, 국내에서 문제가 되고 있는 원인체는 브루셀라 아보투스에 의한 감염이 주를 이루고 있다.
본 발명자는 브루셀라의 병인기전과 관련된 각 항원단백질의 선별로 각 병인기전에 따른 방어효과를 기대하며 브루셀라 아보투스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 캐니스를 포함하는 브루셀라균에서 공통으로 발현되는 항원을 선정하였다.
본 발명자는 상기 항원으로 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase)을 선정하였으며, 상기 항원들은 다른 브루셀라균(브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 캐니스)과 99~100% 상동성을 가지고 있다.
본 발명의 BLS는 루마진 신타아제(lumazine synthase, LS; 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase) 효소를 촉매화시켜 리보플라빈(riboflavin)의 합성에 관여한다. 과도한 리보플라빈의 합성은 세포내에서 브루셀라균이 산화(oxidative) 혹은 질산화(nitrosative) 스트레스에 취약하게 만들어 세포내 생존을 저해하므로 BLS는 브루셀라균의 세포내 생존에 필수적인 요소이다. 또한 BLS는 N 말단에 외부 항원을 결합하여 펩타이드 혹은 단백질의 운반체로 광범위하게 이용되는 특성으로 인하여 면역시스템에 효율적으로 항원을 제시할 뿐만 아니라 TLR4(Toll-Like Receptor 4)에 인식되어 수지상 세포의 성숙과 CD8+ 연관 면역 반응을 포함하고 있는 선천성 후천성 면역반응을 조절하며 T-helper(Th)1 과 Th2 반응을 동시에 일으킨다.
본 발명의 Omp19 단백질은 브루셀라 균의 외막 지질 단백질의 한 구성 성분으로써 브루셀라 주요 6개 종에서 모두 발현되며 주요 면역 반응 단백질로 알려져 있다.
본 발명의 PrpA 단백질은 브루셀라 아보투스의 주요 병인 인자(virulence factor)로써 대식세포의 NMMIIA(non-muscle myosin IIA)와 상호작용하며 B-세포 증식과 연관이 있는 용해 요소의 분비를 유도한다고 알려져 있으며 마우스에서 급성 감염기에 면역 반응을 지연시켜 만성화를 일으키는 주요 요소이다. 또한 B-세포 수의 증가와 특이 항체 반응을 유도하여 세포 감염을 증진시키고 있으며 급성 감염기 동안 IFN-γ, IL-10, TGFβ1 및 TNFα 사이토카인 레벨을 변화시키는 주요 요소로 알려져 있다.
본 발명의 SOD는 외부에서 생산된 수퍼옥사이드(superoxide)에서 세포를 보호하는 역할을 하며 이는 브루셀라의 대식세포내 침입시 oxidative burst로부터 브루셀라를 보호해 주요 병인 인자로써 주요 면역항원으로 인식되고 있다.
본 발명에 따른 BLS, Omp19, PrpA 및 SOD 항원의 범위는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 각각의 서열번호 1, 2, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 각각의 서열번호 1, 2, 3 및 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 브루셀라증 백신 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 각각의 BLS, Omp19, PrpA 및 SOD 항원의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
본 발명에 사용되는 살모넬라 변이주는 약독화 살모넬라 변이주로서 asd 유전자가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게는 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 변이주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 살모넬라 변이주에 있어서, lon , cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 변이주(Δlon ΔcpxR Δasd Salmonella typhimurium mutant, JOL912)는 asd 유전자가 결실된 DAP(diaminopimellic acid) 요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, cpxR을 결실시킴으로써 림프조직 침투력이 증가되어 면역원성을 높이고, lon 유전자를 결실하여 병원성이 약독화될 수 있다. 상기 균주는 항원으로 작용할 수 있는 EPS(extracellular polysaccharide)의 생산에는 아무 영향을 주지 않아 그 자체로 항원의 역할을 하여 안정성을 지니면서 충분한 체액성 점막성 세포성 면역 반응을 일으킨다고 알려져 있다.
상기 약독화 살모넬라 변이주는 Bla(β-lactamse) 신호 서열, 이에 연결된 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자; 및 asd 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 재조합 벡터는 Bla 신호 서열을 기초로 한 분비 시스템을 지닌 pJHL65(Asd+ vector, pBR ori, 6xHis) 또는 pJHL80(Asd+ vector, p15A ori, 6xHis)일 수 있다.
또한, 본 발명의 살모넬라 변이주에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 또는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 등일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 티피무리움일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 살모넬라 변이주의 혼합물은 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균으로부터 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원 중 어느 하나의 항원을 세포외막 또는 세포 밖에 발현하는 살모넬라 변이주를 2 이상 포함하고 있는 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 살모넬라 변이주 혼합물은 BLS를 발현하는 살모넬라 변이주, Omp19를 발현하는 살모넬라 변이주, PrpA를 발현하는 살모넬라 변이주 및 SOD를 발현하는 살모넬라 변이주를 모두 포함하는 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 코딩하는 유전자를 각각 증폭시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 asd 유전자를 가진 재조합 벡터에 각각 클로닝하여 4개의 클로닝된 플라스미드를 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 클로닝된 각각의 플라스미드를 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화된 살모넬라 균주에 각각 형질전환시켜 4개의 형질전환된 살모넬라 변이주를 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하여 혼합하는 단계;를 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물 제조방법을 제공한다.
상기 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자는 세포벽 합성에 있어서 펩티도글리칸의 크로스 연결에 관여하는 DAP(diaminopimellic acid) 합성의 개시지점에 관련된 효소로, DAP가 결핍된 배지에서 asd 유전자 결핍주에 asd 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있어, 이는 유용한 플라스미드의 선택표지이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 제공한다.
상기 약독화 살모넬라 변이주 및 이의 혼합물은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라균에 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 사람 또는 동물에 처리하여 브루셀라증 및 살모넬라증을 동시에 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 살모넬라 변이주 혼합물은 변이주 생균 또는 사균의 형태로 준비될 수 있고, 바람직하게는 변이주 생균의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 유효성분으로서 브루셀라 유래 LPS(lipopolysaccharide)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 브루셀라 표면 항원에 대한 항체 생성을 극대화시켜 면역 증강 및 브루셀라균에 대한 방어 효과를 위하여 정제되어진 브루셀라 LPS를 함께 투여하였다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 복강 내 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 복강 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 사람이나 동물의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 백신 조성물은 사람이나 포유동물에 접종할 수 있으며, 포유동물은 소, 사슴, 산양, 염소, 개, 돼지 등일 수 있으며, 바람직하게는 소에 접종할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), Omp19(outer membrane protein 19), PrpA(Proline racemase subunit A) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원을 발현 및 분비하는 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 살모넬라 변이주의 혼합물이 브루셀라 및 살모넬라에 대한 보호 효과뿐만 아니라, 동물의 세포성 및 체액성 면역반응을 효과적으로 유도하므로 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 가축의 브루셀라증 및 살모넬라증 동시 예방 및 면역증강에 기여할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 살모넬라 변이주 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. rfaL 유전자 녹아웃( knockout ) 살모넬라 티피무리움 균주의 제작
람다 레드(lambda RED) 플라스미드인 pKD46 플라스미드를 분리하여 살모넬라 티피무리움(JOL912; 표 1 참고)에 형질전환 후 32℃ 이하(28~30℃)에서 배양 후 PCR을 통해 성공적으로 플라스미드가 도입되었는지 확인하였다. pKD3 플라스미드를 주형으로 하여 rfaL 유전자와 pKD3 플라스미드의 일부분을 포함하는 프라이머 세트(waa.rfaP1, tgtctcatcccaaacctattgtggagaaaagatgctaaccgtgtaggctagagctgcttc, 서열번호 5; waa.rfaP2, atgatggaaaacgcgctgataccgtaataagtatcagcgcatgggaattagccatggtcc, 서열번호 6)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 추출하여 pKD46이 도입된 살모넬라 티피무리움 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질전환시켰다. 아라비노스(Arabinose)를 첨가한 배지에 도말하여 37℃에서 배양하면 pKD46 플라스미드 내의 감마(gama), 베타(beta), 엑소(exo) 유전자가 발현되어 pKD3 PCR 산물이 살모넬라 티피무리움의 rfa 유전자와 치환되었다. PCR로 다시 특정 유전자가 결실(deletion)되었는지 확인하였다. 항생제 저항 유전자를 제거하기 위해 유전자 결실이 확인된 콜로니의 균으로 컴피턴트 세포를 만들어 pCP20 플라스미드를 형질전환하였다. 37℃에서 배양해 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성이 없는 균을 선택하였다. LPS를 분리하여 야생 살모넬라 티피무리움과 비교를 위한 SDS-PAGE를 진행하여 확인하였다. 상기 살모넬라 균주를 JOL1800로 명명하였다(표 1 참고).
Figure 112016127239544-pat00001
2 브루셀라 LPS의 정제
브루셀라 LPS는 페놀을 이용한 LPS 추출 키트(iNtRON biotechnology, 한국)를 이용하여 분리되었다. 2-5㎖의 브루셀라 아보투스 S544 세균 배양액을 13,000rpm 의 속도의 원심분리를 이용하여 세균 펠렛(pellet)을 분리 후 세포벽을 용해하기 위하여 1㎖의 용균 버퍼(lysis buffer)를 이용하였다. 용해된 세균 용액에 200㎕의 클로로폼을 더한 후 5분간 실외온도에 보관 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상층액만 분리하여 새로운 1.5㎖ 튜브에 보관하였다. 800㎕의 정제 버퍼(purification buffer)를 더하여 -20도에 10분간 보관후 13,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 LPS 펠렛을 확인하였다. 정제된 LPS는 실버 스테이닝 키트(Silver Stain Plus, Bio-Rad, US)를 이용하여 분리 여부를 확인하였고 단백질과 핵산의 오염을 방지하기 위하여 프로테이나아제 K(proteinase K)를 더하여 추출을 진행하였다(도 1).
3. 재조합 플라스미드의 제작
선별되어진 PrpA, Omp19, SODc 3개의 항원 유전자는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/1101)의 Bab S544 게놈 유전자 지도에서 각각 CP000887(1737003-1738001), CP000887(1878467..1878997), KF362132.1(1-522)의 시퀀스를 바탕으로 5'부분에 EcoRI 제한효소 시퀀스와 3'부분에 HindⅢ 제한 효소 시퀀스를 더한 프라이머를 이용하여 브루셀라 아보투스 S544 균주에서 PCR에 의해 증폭되었다(표 2). BLS 유전자는 제한효소자리가 시퀀스 안에 존재하여 제한 효소 자리 시퀀스를 더하여 합성되었다(표 2). 합성된 유전자는 시판되는 단백질 발현용 플라스미드인 pET28a에 클로닝되어 각각 pET28a-Bls, pET28a-PrpA pET28a-Sodc pET28a-Omp19으로 제조되었고 각각의 제조된 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)pLysS로 형질전환 후 각각의 항원 단백질을 정제하였다. 또한 각각의 항원 유전자는 각각 pJHL65에 삽입되어 pJHL65-Bls pJHL65-PrpA, pJHL65-Sodc, pJHL65-Omp19가 제조되었고 이 플라스미드는 rfaL 유전자 녹아웃 살모넬라 티피무리움 균주 JOL1800에 형질전환시켜 백신 균주로 준비되었다.
본 발명에 사용된 프라이머
프라이머 서열(5'->3') 서열번호 PCR 산물 크기(bp)
BLS_F GAATTCaaccaaagctgtccgaacaa 7 486
BLS_R AAGCTTtcagacaagcgcggcgatgc 8
PrpA EcoRI_F GAATTCgcaagacattccttcttctgcg 9 1011
PrpA HindIII_R AAGCTTttatgccatgctgaacccatgagca 10
Omp19 EcoRI_F GAATTCggaatttcaaaagcaagtctgctc 11 543
Omp19 HindIII_R AAGCTTtcagcgcgacagcgtcacggc 12
SOD EcoRI_F CCGCGAATTCaagtccttatttattgcatcg 13 519
SOD HindIII_R CCGCAAGCTTttattcgatcacgccgcagg 14
4. 웨스턴 블롯을 이용한 후보 항원의 백신 세포에서의 발현 확인
제작된 백신 균주가 해당 Bls, Omp19, PrpA, Sodc 항원을 발현하는지 확인하기 위하여 각 백신 후보 균주를 200㎖ LB 액체 배지에 하룻밤 배양하여 샘플을 준비하였다. 이렇게 준비된 샘플은 4,000rpm으로 원심분리 후 상층액은 새 플라스크로 옮겨주었다. 분리된 상층액은 20% TCA(trichloroacetic acid)를 이용하여 분비된 단백질을 분리정제하였고 4,000rpm에서 원심분리하여 남은 펠렛은 SDS-샘플 완충액과 혼합한 후 15분간 끊인 뒤 사용하였다. SDS-PAGE 후 PVDF 멤브레인으로 옮겨 블로킹 완충액(3% BSA in PBST)로 3시간 블로킹하였다. 1차 마우스 IgG1 항-His 항체(Penta-HisTM, LifeTechnologies, 미국)를 1:5,000으로 희석하여 하룻밤 반응을 하였다. 다음날 1:5,000으로 희석된 2차 항체(goat anti-mouse IgG1-HRP)(Sigma-Aldrich, 미국)로 1시간 반응 후 발색하여 각 항원의 크기를 확인하여 발현을 확인하였다. WEST-oneTM Western Blotting System(IntronBiotechnology, 한국)으로 발색하여 발현을 확인하였다.
5. 후보 균주의 백신 균주로의 가능성 및 실험동물에서의 면역원성 확인
웨스트 블롯으로 발현 확인이 완료된 백신을 BALB/c 마우스에 접종하여 면역유도 반응을 분석하였다. 128마리의 마우스를 각각 16마리씩 8그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 각 그룹의 백신균주와 투여 경로는 표 3에 나타내었다. A 그룹: 대조군, B 그룹: aSrBL 백신은 O 항원이 결실되지 않은 약독화 살모넬라 균주인 JOL912에 각각 선별된 네 개의 항원이 발현되는 백신 균주 배양액에 LPS를 혼합하여 접종, C 그룹: bRSrBL 백신은 O 항원이 결실된 약독화 살모넬라 균주인 JOL1800에서 발현되는 네 개의 브루셀라 항원이 발현되는 백신 균주 배양액에 브루셀라 LPS 혼합 접종, D 그룹: B 그룹과 같은 백신 균주를 복강으로 접종, E 그룹: C 그룹과 같은 백신 균주를 복강으로 접종, F그룹: LPS 혼합 없이 브루셀라 네가지 항원 발현 JOL1800 균주를 복강으로 투여.
각 그룹에서 6마리의 마우스는 백신 접종 21일 후 비장세포를 이용한 면역반응 시험에 이용되었고, 나머지 실험동물은 백신 접종 후 30일에 병원성 야생 브루셀라 아보투스 S544로 감염시킨 마우스를 이용하여 도전감염 시험이 이루어졌다. 도전감염 15일 후 모든 실험동물은 무균적 희생 후 비장을 균질화하여 브루셀라 배양 고체 배지에 7일동안 37도에서 배양하였다. 각 그룹별로 검출된 집락의 수(x) 를 기본으로 각 그룹별 도전감염 후 아래의 계산식을 이용하여 보호 인텍스(Protection Index, PI)가 계산되었다.
y = log(x/log x)
PI = (PBS 로그 수의 y 값) - (테스트 백신 로그 수의 y 값).
Figure 112016127239544-pat00002
6. 면역화된 마우스의 체액성 면역 반응
각 항원에 대해 특이한 sIgA 항체와 IgG 항체를 측정하기 위해 ELISA를 시행하였다. 혈청 샘플과 장세척 샘플은 백신 후 4주동안 1주 간격으로 채취되었다. 혈청은 안와후 정맥을 통해 채취한 후 4,000g, 5분 동안 원심 분리하여 상등액의 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관한 후 실험에 사용하였다. 분변의 경우 분변은 무게를 잰 후 소듐 아자이드(sodium azide)가 0.1% 함유된 PBS로 100mg/㎖가 되도록 부유시킨 후 13,200rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 분리, -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 수행 방법은 접종량을 결정짓기 위한 시료 웰(sample well)에는 정제된 항원 단백질을 500ng/웰(well)의 농도로, 표준 단백질 웰(standard well)에는 염소 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG) 또는 염소 항-마우스 sIgA(goat anti-mouse sIgA)를 각각 200ng/웰의 농도로 분주한 후 4℃에서 하룻밤 동안 코팅(coating)하고, 코팅된 플레이트는 0.05% Tween 20이 함유된 PBS(PBST)로 3번 세척한 후 블로킹 완충액(3% skim milk in PBS)으로 블로킹한 다음 혈청(serum)은 PBST로 1:100으로 질세척 샘플은 1:3로 각각 희석한 다음 100㎕씩 웰에 분주한 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응하였다. 혈청의 경우 HRP-콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG(peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG) 그리고 질세척 샘플의 경우에는 HRP-콘주게이트된 염소 항-마우스 IgA(peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgA)를 1:5,000의 배율로 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. OPD(o-phenylenediamine)-기질 반응액을 웰 당 100㎕씩 분주하여 발색 후 3M H2SO4로 정지시킨 후 492nm에서 OD값을 측정하였다. 각 항원 특이적 항체의 농도는 표준 단백질 농도에 기초하여 측정하였다.
7. 비장세포의 사이토카인 분석
접종 후 6주차인 마우스를 희생시켜 무균적으로 비장(spleen)을 채취한 후 분쇄하고 조직 내 세포를 꺼내 세포 스트레이너(cell stainer)로 남은 조직을 제거하였다. 원심분리하여 세포를 가라앉힌 뒤 RPMI(모든 RPMI(RPMI 1640 supplemented, Sigma)는 10% 열-불활성화 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100ug/㎖ 스트렙토마이신이 포함되어 있다)로 부유시켜 재차 세포를 원심분리로 가라앉힌 뒤 적혈구 용해 버퍼(RBC Lysis buffer)를 통해 세포를 부유시켜 적혈구(red blood cell, RBC)를 제거하였다. 이후 원심분리한 세포 침전물을 멸균 PBS로 세척하고 이와 같은 과정을 두 차례 더 거친 뒤 RPMI에 부유된 비장세포(splenocyte cell) 수를 측정하여 각 그룹에 해당하는 항원과 함께 최종 세포 수가 1×106이 되도록 96 웰 배양 플레이트에 분주 후 JOL1800 살모넬라 균주 분쇄액과 각각 성병된 브루셀라 항원 단백질로 자극 후 48시간동안 배양하였다.
배양 후 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)와 인터루킨-12(interleukin-12, IL-12) 사이토카인의 분비를 관찰하기 위하여 RNeasy plus mono kit(Qiagen사)를 사용하여 각 항원으로 반응시킨 비장세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA는 NanoDrop을 이용하여 적절한 농도값을 확인한 뒤 High capacity cDNA Reverse transcription kit을 이용하여 cDNA로 합성하여 냉동보관하고 Step One plus Real Time PCR system 기기를 사용하여 IL-4, IL-12 및 β-액틴의 증폭을 mRNA 레벨에서 관찰하였다.
8. ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot) 분석을 이용한 인터페론-γ(IFN-γ) 검출
백신 후 21일 차에 면역 실험동물에서 분리한 비장세포를 브루셀라와 살모넬라 항원으로 재자극한 후 Mouse IFN-γ ELISpotPLUS(Mabtech AB, 스웨덴)을 이용하여 백신 투여 후 비장세포에서 IFN-γ의 증가율을 확인하였다. 96 웰 플레이트에 2×105세포를 배양 후 각각 JOL1800 외막 단백질 항원과 초음파 분쇄한 브루셀라 균주 500ng으로 30시간동안 자극한 후 1차 항체로 항-INF-γ 비오틴 콘주게이트된 항체와 2차 항체로 스트렙타비딘-HRP(1:1,000) 사용하여 INF-γ 발현 세포(INF-γ spots)를 검출하였다. 각각의 세포 웰에서 INF-γ 발현 세포 수를 세어 전체 발현량을 결정하였다.
9. 유세포 분석을 이용한 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T 림프구 분석
백신을 투여한 실험동물의 비장 림프구에서 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T 림프구의 증식 여부를 확인하기 위하여 FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지 항-CD3, 비오틴-표지 항-CD4 및 APE-표지 항-CD8 항체(SouthernBiotech, 미국)와 함께 비장세포를 배양 후 MACSQuant Analyzer(Miltenyi Biotech, 독일)를 이용, 각각의 표면 항체의 발현의 차이를 기준으로 림프구 증식을 분석하였다.
실시예 1. 브루셀라 항원을 발현하는 백신의 백신 세포에서의 발현 확인
제작된 백신 균주가 해당 BLS, PrpA, Omp19, SOD 항원을 발현하는지 확인하기 위하여 웨스트 블롯을 실시하였다. BLS 항원의 발현 크기는 약 23KDa이고, PrpA 항원의 발현 크기는 약 39kDa, Omp19 항원의 발현 크기는 약 20kDa, SOD 항원의 발현 크기는 약 20kDa임을 확인하였다(도 2).
실시예 2. 체액성 면역 반응 분석 - 백신 투여 후 IgG 및 sIgA 분석
본 발명의 각 브루셀라 항원을 발현하는 살모넬라 균주의 혼합물을 투여한 실험동물군에서 IgG와 IgA의 역가를 측정하기 위해 초음파 분쇄된 브루셀라 균주를 코팅 항원 또는 재조합 브루셀라 항원 중 BLS 정제 단백질을 코팅 항원으로 사용하여 ELISA를 시행하였다. 도 3-I에 개시된 바와 같이, 초음파 분쇄된 브루셀라 균주를 코딩 항원으로 사용하여 브루셀라 항원을 발현하는 살모넬라 균주를 혼합하여 투여한 실험동물군의 IgG와 IgA의 역가를 확인한 결과, 전체 브루셀라 균 특이 항체 IgG와 IgA는 벡터 대조군인 그룹 G와 대조군 그룹 A를 제외한 모든 그룹에서 3주차까지 증가하는 추세를 보였다. 그룹 D는 4주차까지 증가세를 보였으며 브루셀라 생백신 RB51을 접종한 그룹 H에서 IgG가 유의하게 증가하였다. 브루셀라 특이 IgG 농도는 투여경로에 따라 큰 차이를 보이지 않았지만 반대로 경구투여를 한 그룹 B와 C에서 점막면역을 유도하는 IgA 농도는 유의한 증가세를 보였다. 브루셀라 전체를 타겟으로 한 항체 생성에서는 기존의 RB51 생백신에서 더 높은 항체 생성을 보였다. 하지만 도 3-II에서 나타나듯이 브루셀라 항원 발현 약독화 살모넬라 생백신 투여 그룹들에서 BLS 단백질 특이 항체의 생성이 증가되었음을 확인하였다.
실시예 3. 면역 사이토카인 분석
브루셀라 항원으로 재자극한 마우스의 비장세포에서 IL-4 및 IL-12 농도를 RT-PCR를 이용하여 측정한 결과는 도 4-I에 개시되었다. IL-4 수치의 유의한 증가가 그룹 B,D,E,H 에서 관찰되었다(도 4-I A). 같은 백신 균주 접종시 경구 접종보다 복강으로 접종시 사이토카인의 수치가 증가하였고 IL-12 사이토카인 수치는 그룹 B,C,D,E,H 에서 유의한 증가가 나타남을 확인하였다(도 4-I B). 한편, 브루셀라 항원 또는 살모넬라 외막 단백질로 자극한 비장세포에서 분비되는 IFN-γ 농도를 측정한 결과, 그룹 D의 실험동물에서 검출된 비장세포(살모넬라 외막 단백질로 자극)에서 가장 높은 IFN-γ 수치가 나타났다(도 4-II, 도 5). 그룹 C, E, H의 브루셀라 항원 자극 비장세포에서도 유의하게 증가한 IFN-γ 수치가 관찰되었다.
실시예 4. 백신 면역 실험동물에서 T 세포 림프구의 변화
자극하지 않은 비장세포(US)에서의 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T 세포의 비율과 비교시 살모넬라 자극(SS) 혹은 브루셀라 자극(BS) 비장세포에서 전반적인 증가가 확인되었다(표 4). 그룹 D(브루셀라 항원 발현 JOL912 균주 + LPS 접종 그룹, 경구투여)에서 가장 높은 CD4+ T 세포의 증가세를 보였고 CD8+ T 림프구에서는 비자극 비장세포와 비교시 확연한 증가세가 나타나지 않았다.
Figure 112016127239544-pat00003
실시예 5. 도전감염시 백신 방어 효과
도전감염 15일 후 비장세포에서 검출된 도전 감염 균주의 수를 통하여 백신으로 인한 방어효과가 평가되었다. 도 6 및 도 7에서 개시된 바와 같이, 그룹 E(브루셀라 항원 발현 JOL1800 균주 + LPS, 복강 접종)에서 가장 높은 방어 효율이 나타났다. 또한 그룹 D(브루셀라 항원발현 JOL912 균주+LPS, 복강 접종)에서와 그룹 E에서 보여준 방어 효과는 기존의 백신인 RB51면역화된 그룹 F 에 비해서도 확연한 증가를 보였다(P < 0.05).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Vaccine composition for preventing or treating brucellosis comprising attenuated Salmonella mutant expressing pan-Brucella immunogen <130> PN16415 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 1 Met Asn Gln Ser Cys Pro Asn Lys Thr Ser Phe Lys Ile Ala Phe Ile 1 5 10 15 Gln Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Glu Ala Arg Lys Ser Phe 20 25 30 Val Ala Glu Leu Ala Ala Lys Thr Gly Gly Ser Val Glu Val Glu Ile 35 40 45 Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Lys Thr Leu 50 55 60 Ala Arg Thr Gly Arg Tyr Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Phe Val Ile 65 70 75 80 Asp Gly Gly Ile Tyr Arg His Asp Phe Val Ala Thr Ala Val Ile Asn 85 90 95 Gly Met Met Gln Val Gln Leu Glu Thr Glu Val Pro Val Leu Ser Val 100 105 110 Val Leu Thr Pro His His Phe His Glu Ser Lys Glu His His Asp Phe 115 120 125 Phe His Ala His Phe Lys Val Lys Gly Val Glu Ala Ala His Ala Ala 130 135 140 Leu Gln Ile Val Ser Glu Arg Ser Arg Ile Ala Ala Leu Val 145 150 155 <210> 2 <211> 177 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 2 Met Gly Ile Ser Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Ala Ala Ala Gly Ile 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Cys Gln Ser Ser Arg Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val 20 25 30 Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Val Asn Ala Val Pro Ala Gly Thr 35 40 45 Val Gln Lys Gly Asn Leu Asp Ser Pro Thr Gln Phe Pro Asn Ala Pro 50 55 60 Ser Thr Asp Met Ser Ala Gln Ser Gly Thr Gln Val Ala Ser Leu Pro 65 70 75 80 Pro Ala Ser Ala Pro Asp Leu Thr Pro Gly Ala Val Ala Gly Val Trp 85 90 95 Asn Ala Ser Leu Gly Gly Gln Ser Cys Lys Ile Ala Thr Pro Gln Thr 100 105 110 Lys Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Ala Gly Pro Leu Arg Cys Pro Gly Glu 115 120 125 Leu Ala Asn Leu Ala Ser Trp Ala Val Asn Gly Lys Gln Leu Val Leu 130 135 140 Tyr Asp Ala Asn Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Gly Gln 145 150 155 160 Gly Arg Phe Asp Gly Gln Thr Thr Gly Gly Gln Ala Val Thr Leu Ser 165 170 175 Arg <210> 3 <211> 333 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 3 Met Ala Arg His Ser Phe Phe Cys Val Asp Gly His Thr Cys Gly Asn 1 5 10 15 Pro Val Arg Leu Val Ala Gly Gly Gly Pro Asn Leu Asn Gly Ser Thr 20 25 30 Met Met Glu Lys Arg Ala His Phe Leu Ala Glu Tyr Asp Trp Ile Arg 35 40 45 Thr Gly Leu Met Phe Glu Pro Arg Gly His Asp Met Met Ser Gly Ser 50 55 60 Ile Leu Tyr Pro Pro Thr Arg Pro Asp Cys Asp Val Ala Val Leu Phe 65 70 75 80 Ile Glu Thr Ser Gly Cys Leu Pro Met Cys Gly His Gly Thr Ile Gly 85 90 95 Thr Val Thr Met Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Thr Pro Lys Thr Pro 100 105 110 Gly Lys Leu Asn Leu Asp Thr Pro Ala Gly Leu Val Ala Ile Glu Tyr 115 120 125 Glu Gln Asp Gly Gln Tyr Val Glu Arg Val Arg Leu Thr Asn Val Pro 130 135 140 Ala Phe Leu Tyr Ala Glu Gly Leu Glu Val Glu Cys Pro Asp Leu Gly 145 150 155 160 Pro Ile Lys Val Asp Val Ala Tyr Gly Gly Asn Phe Tyr Ala Ile Val 165 170 175 Glu Pro Gln Glu Asn Tyr Thr Asp Met Asp Asp Tyr Ser Ala Leu Gln 180 185 190 Leu Ile Ala Trp Ser Pro Val Leu Arg Gln Arg Leu Asn Glu Lys Tyr 195 200 205 Lys Phe Gln His Pro Glu Leu Pro Asp Ile Asn Arg Leu Ser His Ile 210 215 220 Leu Trp Thr Gly Lys Pro Lys His Pro Gln Ala His Ala Arg Asn Ala 225 230 235 240 Val Phe Tyr Gly Asp Lys Ala Ile Asp Arg Ser Pro Cys Gly Thr Gly 245 250 255 Thr Ser Ala Arg Met Ala Gln Leu Ala Ala Lys Gly Lys Leu Lys Pro 260 265 270 Cys Asp Glu Phe Ile His Glu Ser Ile Ile Gly Ser Leu Phe His Gly 275 280 285 Arg Val Glu Arg Ala Ala Glu Val Ala Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro 290 295 300 Ser Ile Ala Gly Trp Ala Arg Met Thr Gly Tyr Asn Thr Ile Phe Ile 305 310 315 320 Asp Asp Arg Asp Pro Phe Ala His Gly Phe Ser Met Ala 325 330 <210> 4 <211> 173 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 4 Met Lys Ser Leu Phe Ile Ala Ser Thr Met Val Leu Met Ala Phe Pro 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Ser Thr Thr Val Lys Met Tyr Glu Ala Leu Pro Thr 20 25 30 Gly Pro Gly Lys Glu Val Gly Thr Val Val Ile Ser Glu Ala Pro Gly 35 40 45 Gly Leu His Phe Lys Val Asn Met Glu Lys Leu Thr Pro Gly Tyr His 50 55 60 Gly Phe His Val His Glu Asn Pro Ser Cys Ala Pro Gly Glu Lys Asp 65 70 75 80 Gly Lys Ile Val Pro Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly 85 90 95 Asn Thr His His His Leu Gly Pro Glu Gly Asp Gly His Met Gly Asp 100 105 110 Leu Pro Arg Leu Ser Ala Asn Ala Asp Gly Lys Val Ser Glu Thr Val 115 120 125 Val Ala Pro His Leu Lys Lys Leu Ala Glu Ile Lys Gln Arg Ser Leu 130 135 140 Met Val His Val Gly Gly Asp Asn Tyr Ser Asp Lys Pro Glu Pro Leu 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ala Arg Phe Ala Cys Gly Val Ile Glu 165 170 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgtctcatcc caaacctatt gtggagaaaa gatgctaacc gtgtaggcta gagctgcttc 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgatggaaa acgcgctgat accgtaataa gtatcagcgc atgggaatta gccatggtcc 60 60 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaattcaacc aaagctgtcc gaacaa 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagctttcag acaagcgcgg cgatgc 26 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gaattcgcaa gacattcctt cttctgcg 28 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aagcttttat gccatgctga acccatgagc a 31 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaattcggaa tttcaaaagc aagtctgctc 30 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aagctttcag cgcgacagcg tcacggc 27 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccgcgaattc aagtccttat ttattgcatc g 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccgcaagctt ttattcgatc acgccgcagg 30

Claims (9)

  1. 삭제
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  6. 하기 각각의 약독화 살모넬라 변이주를 모두 포함하는 약독화 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신 조성물로서,
    각각의 약독화 살모넬라 변이주는 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BLS(Brucella lumazine synthase), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Omp19(outer membrane protein 19), 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 PrpA(Proline racemase subunit A) 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 SOD(superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화 살모넬라 변이주인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 백신 조성물은 브루셀라 유래 LPS(lipopolysaccharide)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 백신 조성물은 복강 내 투여용인 것을 특징으로 하는 브루셀라증 및 살모넬라증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  9. 삭제
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FEMS Microbiology Reviews. Vol.34, No. 3, 페이지379-394 (2010.02.18.)*

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