KR101066951B1

KR101066951B1 - 재조합 세포내 병원체 면역원성 조성물 및 사용 방법

Info

Publication number: KR101066951B1
Application number: KR1020057005499A
Authority: KR
Inventors: 마커스 에이 호위츠; 군터 하스; 마이클 브이 투리어스
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2011-09-23
Also published as: JP2006501304A; ATE487489T1; ZA200502596B; CA2500433A1; MXPA05003407A; US20040009184A1; AU2003272808B2; EP1556081A2; RU2337707C2; BR0314937A; CN1703238B; RU2005113266A; KR20050075343A; WO2004031356A2; CN1703238A; EP1556081A4; EP1556081B1; AU2003272808A1; WO2004031356A3; US6924118B2

Abstract

본 발명은 동일한 또는 다른 세포내 병원체의 재조합 면역원성 항원을 발현하도록 형질전환시킨 재조합 약독화 세포내 병원체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 대표적인 면역원성 조성물은, 비제한적으로, 마이코박테리아 및/또는 다른 세포내 병원체의 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 약독화된 재조합 마이코박테리아를 포함한다. 재조합 약독화 세포내 병원체가 영양요구성인 다른 구체예도 제공한다.

Description

재조합 세포내 병원체 면역원성 조성물 및 사용 방법{RECOMBINANT INTRACELLULAR PATHOGEN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE}

정부와의 관련성

본 발명은 미국 보건복지부가 지원하는 승인 번호 AI31338의 정부 지원으로 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 소유한다.

본 발명은 재조합 약독화 세포내 병원성 박테리아로부터 유래한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 주요 세포외 단백질을 과발현 및 분비하는 재조합 약독화 마이코박테리아를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 영양요구성 균주를 비롯한 재조합 약독화 마이코박테리아를 포함한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 유용하다.

기생성 미생물은 동물을 감염시켜 질환을 야기하며 때로는 사망에 이르게 하는 것으로 오래 전부터 알려져 있다. 병원체는 역사적으로 사망의 주요한 원인이 되어 왔으며, 이는 계속해서 막대한 피해를 주고 있다. 지난 수백년간 많은 감염 질환의 예방 및 치료에서 급격한 진보가 이루어지긴 하였으나, 복잡한 숙주-기생체의 상호작용으로 인하여 보편적인 치료 수단의 유효성이 여전히 제한되고 있다. 다수의 병원성 유기체에 의해 나타나는 복잡한 침입성 기전을 무력화하는 데 있어서의 어려움은 결핵과 같은 각종 질환의 재발뿐 아니라 박테리아 및 바이러스의 다수의 약물 내성 균주의 출현에 의해 입증된다.

주요한 역학적 관련의 병원체 중에서, 세포내 박테리아가 치료적 또는 예방적 조치에 대하여 특히 난치성이 되는 것으로 입증되었다. 마이코박테리움속을 비롯한 세포내 박테리아는 세포외에서보다는 감염된 숙주 유기체의 세포내에서 생활사의 전부 또는 일부를 마감한다. 전세계적으로, 세포내 박테리아는 매년 막대한 피해와 수백만명의 사망의 원인이 되고 있다. 결핵은 전세계적으로 매년 1천만명의 신규 사례가 발생하며 이백 구십만명이 사망하게 되어 단일 질환으로서는 선두적인 사망 원인이 되고 있다. 또한, 세포내 박테리아는 수백만의 나병 사례의 원인이 된다. 세포내 물질에 의해 매개되는 다른 쇠약화 질환으로는 피부 및 내장 리슈만편모충증, 아메리카 트리파노소마증(샤가스병), 리스테리아증, 톡소플라스마증, 히스토플라스마증, 트라코마, 앵무새병, Q-열 및 레지오넬라증 등이 있다.

현재, 전세계 인구의 대략 1/3이 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 감염되어 매년 수백만건의 폐결핵이 발생하는 것으로 파악되고 있다. 더 구체적으로, 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의해 주로 야기되는 인간 폐결핵은 개발도상국에서 사망의 주요한 원인이 되고 있다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스는 대식세포 및 단핵구 내에서 생존할 수 있기 때문에 만성 세포내 감염을 일으킬 수 있다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스는 외래 물질의 검출 및 차후의 면역계 활성화를 주로 담당하는 세포 내에 그 자신을 숨기어 숙주 유기체의 정상 방어를 비교적 성공적으로 피해 간다. 또한, 결핵의 치료에 사용되는 대수의 최첨단 화학요법제는 세포외 유기체에 비하여 세포내 유기체에 대한 활성이 비교적 낮다. 지금까지, 이와 같은 병원성에 관한 특성은 결핵 감염에 대한 면역요법제 또는 면역원성 조성물의 유효성을 제한하였다.

최근, 미국의 50개 주 중 36개 주에서 1종 이상의 약물에 대한 결핵 내성이 보고된 바 있다. 뉴욕시에서는, 테스트한 모든 사례 중 1/3이 1종 이상의 주요 약물에 대한 내성을 나타내었다. 비내성 결핵이 장기간 항생제로 치유될 수 있기는 하나, 약물 내성 균주에 대한 전망은 어둡다. 2종 이상의 주요 항생제에 대한 내성을 갖는 균주로 감염된 환자는 치사율이 약 50%에 육박한다. 따라서, 이와 같은 각종의 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 대한 안전하고도 유효한 면역원성 조성물이 절실히 요구되고 있다.

마이코박테리움 튜버쿨로시스의 초기 감염은 거의 항상 에어로졸화된 입자의 흡입을 통해서 발생하는데, 이는 병원체가 젖은 침 또는 마른 침 중에서 수주 내지 수개월 동안 생존할 수 있기 때문이다. 감염의 1차 부위가 폐이더라도, 그 병원체는 뼈, 비장, 신장, 뇌막 및 피부를 포함하나 이에 한정되지 않는 거의 모든 기관의 감염을 야기할 수 있다. 특정 균주의 병독성 및 숙주의 내성에 따라, 감염 및 이에 따른 조직의 손상은 미미할 수도 있고 광범위할 수도 있다. 인간의 경우, 박테리아의 병독성 균주에 노출된 대다수의 개체에 있어서 초기 감염은 제어된다. 초기 항원 공격 이후의 후천성 면역의 형성은 박테리아 증식을 감소시켜서 병변이 치유되도록 하며 대개는 개체에게 무증상이 되도록 한다.

마이코박테리움 튜버쿨로시스가 감염된 개체에 의해 제어되지 않는 경우, 이는 종종 폐조직의 광범위한 손상을 초래하게 된다. 감수성 개체에서, 병변은 일반적으로 폐에서 형성되는데, 이는 결핵균이 폐포 또는 폐 대식세포 내에서 번식하기 때문이다. 그 유기체가 증폭함에 따라, 이들은 림프계를 통하여 원위 림프절로 퍼지게 되며, 혈류를 통하여 허파 꼭대기, 골수, 신장 및 뇌를 둘러싼 뇌막으로 퍼질 수 있다. 주로 세포 매개 과민 반응의 결과로서, 감염의 경중도에 비례하여 특징적인 육아종 병변 또는 결절이 발생한다. 이러한 병변은 단핵구, 림프세포, 섬유아세포와 접하는 유상피 세포로 이루어진다. 대부분의 경우에서, 병변 또는 결절은 결국 괴사성이 되어 건락화된다(감염된 조직이 연질의 치즈형 물질로 바뀜).

마이코박테리움 튜버쿨로시스가 중요한 병원체이지만, 마이코박테리움속의 다른 종들 역시 인간을 비롯한 동물에게서 질병을 유발하며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 명백하다. 예를 들면, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)는 마이코박테리움 튜버쿨로시스와 밀접한 관련이 있으며, 이는 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이와 같은 가축에서 결핵 감염을 일으키는 원인이 된다. 또한, 특히 마이코박테리움 보비스는 일반적으로 원유의 섭취로부터 장관을 통해 인간을 감염시킬 수 있다. 국소 장관 감염은 궁극적으로는 기도로 퍼지게 되며, 그 후 곧바로 결핵의 전형적 증상이 나타나게 된다. 마이코박테리움속의 또 다른 중요한 병원성 벡터는 고대 질환인 나병의 수백만 사례를 일으키는 마이코박테리움 래프리(Mycobacterium leprae)이다. 동물 및 인간에게서 질환을 일으키는 이러한 속의 그 밖의 종의 예로는 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아비움 인트라셀룰라레(M. avium intracellulare), 마이코박테리움 포르투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 마리눔(M. marinum), 마이코박테리움 첼로네이(M. chelonei) 및 마이코박테리움 스크로풀라세움(M. scrofulaceum) 등이 있다. 병원성 마이코박테리아종은 종종 이들의 각각의 DNA 및 해당 단백질 서열에 있어서 높은 수준의 상동성을 나타내며, 일부 종, 예컨대 마이코박테리움 튜버쿨로시스와 마이코박테리움 보비스는 크게 관련되어 있다.

명백하게 현실적이고 도덕적인 이유로 인하여, 이러한 질병에 대한 실험 조성물의 효능을 측정하기 위해 인간을 대상으로 초기 시험을 실시하는 것은 가능하지 않다. 따라서, 임의의 약물 또는 면역원성 조성물의 초기 개발에 있어서는, 안전성 및 비용의 이유로 적절한 동물 모델을 이용하는 것이 표준 절차이다. 실험 동물 모델을 이용하여 실시하는 것의 성공은, 면역원성 에피토프가 상이한 숙주 종에서 종종 활성을 나타낸다는 이해로부터 예측된다. 따라서, 하나의 종, 예를 들면 설치류 또는 기니 피그에서의 면역원성 결정인자는 일반적으로 인간과 같은 상이한 종에서 면역 반응을 나타낸다. 적절한 동물 모델이 충분히 개발된 후에야, 인간에게서의 면역원성 조성물의 안전성 및 효능을 추가로 입증하기 위해 인간을 대상으로 하는 임상 시험이 수행될 수 있다.

마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 폐포 또는 폐 감염과 관련하여, 기니 피그 모델은 여러 가지 관점에서 인간의 질병 병리와 매우 유사하다. 따라서, 당업자라면, 이러한 질환의 기니 피그 모델에 의거하여 인간 및 기타 포유동물에 대해 추정하는 것이 적절하다는 것을 주지하고 있다. 인간에서와 같이, 기니 피그는 소량의 에어로졸화된 인간 병원체 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 결핵 감염에 감수성을 갖는다. 초기 감염이 일반적으로 제어되는 인간과는 달리, 기니 피그는 에어로졸화된 병원체에 노출시 산재성 질환을 지속적으로 발달시켜, 차후의 분석을 용이하게 한다. 또한, 기니 피그와 인간 둘 다 피부 테스트 부위에서 조밀한 단핵 세포 경결 또는 경질 부위의 발생을 특징으로 하는 지연형 피부 과민 반응을 나타낸다. 마지막으로, 인간 및 기니 피그의 특징적인 결핵 병변은 랑한스 거대 세포의 존재를 비롯하여 유사한 형태를 나타낸다. 기니 피그는 질환의 초기 감염 및 진행에 대하여 인간보다 감수성이 더 크기 때문에, 이러한 동물 모델을 사용한 실험에서 얻게 되는 임의의 보호는 동일한 방어 면역이 인간 또는 감수성이 덜한 다른 포유동물에게서 생성될 수 있다는 것을 강력하게 시사한다. 따라서, 제한적인 의미가 아니라 설명을 위하여, 본 발명은 포유동물 숙주로서 기니 피그를 예로 들어 주로 예시할 것이다. 당업자라면, 본 발명이 인간 및 가축을 비롯한 다른 포유동물 숙주를 사용하여 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

면역원성 조성물을 사용하여 결핵을 박멸하고자 하는 시도는 칼메트(Calmette) 및 게랭(Guerin)이 프랑스 릴리에 소재하는 엥스띠뛰 빠스뙤르에서 마이코박테리움 보비스의 병독성 균주를 성공적으로 약독화시킨 이후 1921년에 개시되었다. 이러한 약독화 마이코박테리움 보비스는 바실 칼메트 게랭(Bacille Calmette and Guerin) 또는 약어로 BCG로 알려졌다. 약 80년이 지나서도, BCG로부터 유래한 면역원성 조성물이 현재 사용되고 있는 결핵에 대한 유일한 예방 요법으로 되어 있다. 사실상, 오늘날 입수 가능한 모든 BCG 면역원성 조성물은 엥스띠뛰 빠스뙤르에서의 칼메트(Calmette) 및 게랭(Guerin)에 의해 개발된 마이코박테리움 보비스의 오리지날 균주로부터 유도된 것이다.

세계 보건 기구에서는 BCG 면역원성 조성물을 전세계, 특히 개발도상국에서의 결핵을 감소시키는 데 있어서 필수 요인으로서 간주하고 있다. 이론상으로는 BCG 면역원성 조성물은 마이코박테리움 튜버쿨로시스와 면역학적으로 관련되어 있는 약독화 마이코박테리움에 대한 세포 매개 면역성을 부여한다. 발생된 면역 반응은 1차 결핵을 억제하여야만 한다. 따라서, 1차 결핵이 억제되면 잠복 감염은 발생하지 않으며 그리하여 질환의 재활성화가 방지된다.

현재 이용되는 BCG 면역원성 조성물은 동결건조된 배양물로서 제공되며, 이는 투여 직전에 무균 희석제로 재수화시킨다. BCG 면역원성 조성물은 개발도상국 및 선진국을 비롯한 BCG 백신 접종을 실시하는 국가에서 출생시, 유아기 또는 초기 유년기에 투여한다. 다량의 감염성 마이코박테리아에 노출될 수도 있는 풍토병 지역으로의 성인 방문객은 피부 테스트에서 비반응성인 경우 예방 차원에서 BCG를 접종할 수 있다. 면역원성 조성물에 대한 부작용은 드물며, 일반적으로 주사 부위 부근에서의 피부 궤양 형성 및 림프절염으로 한정되어 있다. 그러나, 이러한 드문 부작용에도 불구하고, BCG 면역원성 조성물은 1930년 이후 전세계적으로 30억회 이상의 투여에서 유례 없는 안전성 이력을 갖고 있다.

그러나, 종래의 BCG 면역원성 조성물의 유례 없는 안전성에 대한 정밀 조사가 증가하고 있는 추세이며, 이는 보건의료 개업의에게 역설이 되고 있다. 마이코박테리아 감염에 대한 감수성이 가장 큰 인구 집단은 면역억제된 집단이다. 초기 또는 말기 HIV 감염을 앓고 있는 환자는 특히 감염에 대한 감수성을 갖는다. 불행하게도, HIV 감염의 초기 단계의 대부분의 환자는 자신의 면역 상태를 자각하지 못한다. 이러한 개체는 특유의 위험성을 미리 경고받지 못한 채, BCG와 같은 생 약독화 면역원성 조성물을 사용한 면역화를 자발적으로 받을 수 있을 것이다. 또한, 다른 약간 면역억제된 개체도 마이코박테리아성 질환을 예방하고자 하는 바램에서 BCG를 사용한 면역화를 무의식중에 받을 수 있다. 그러므로, 더욱 안전하고, 더욱 효능이 큰 BCG 및 BCG 유사 면역원성 조성물이 요구되고 있다.

최근, 각종 세포 관련 항원을 발현시키는 면역원성 조성물을 제조하고자 형질전환된 BCG 균주를 사용하는 것에 대한 상당한 관심이 집중되고 있다. 예를 들면, C. K. Stover 외 다수는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)의 막 관련 지단백질 OspA를 발현시키는 재조합 BCG(rBCG)를 사용한 라임병 면역원성 조성물을 발표하였다. 유사하게, C. K. Stover 외 다수는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 폐렴구균 표면 단백질(PsPA)을 발현시키는 rBCG 면역원성 조성물을 생성하였다. 문헌 [Stover, C. K., G. P. Bansal, S. Langerman, and M. S. Hanson. 1994. Protective Immuinity Elicited by rBCG Immunogenic Compositions. In: Brown F. (ed): Recombinant Vectors in Immunogenic Composition Development. Dev Biol Stand. Dasel, Karger, Vol. 82, 163-170].

B. R. Bloom 외 다수의 미국 특허 제5,504,005호 및 미국 특허 제5,854,055호에서는 다양한 종의 미생물로부터 광범위한 세포 회합형 융합 단백질을 발현시키는 이론적 rBCG 벡터가 개시되어 있다. 이들 특허에 개시된 이론적 벡터는 세포외 비융합 단백질 항원이 아니라 세포 회합형 융합 단백질에 관한 것이고/이거나, rBCG는 가정적으로는 먼 관계에 있는 종으로부터의 융합 단백질을 발현시킨다. 또한, 이러한 모델에서 발현된 재조합 세포 회합형 융합 단백질은 열 충격 프로모터의 제어 하에 숙주 게놈으로 통합된 DNA 상에서 코딩된다. 그 결과, 발현된 항원은 융합 단백질이며, 이러한 발현은 벡터의 천연 단백질과 거의 같거나 그보다 낮은 수준으로 한정된다.

또한, 미국 특허 제5,504,005호 및 미국 특허 제5,854,055호 어느 것에서도 인간 질환과 매우 가까운 동물계에서의 면역 반응 형성 또는 방어 면역을 테스트하는 동물 모델 안전성 테스트가 개시되어 있지 않다. 또한, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 융합 단백질을 발현하는 이론적 rBCG 벡터만이 이들 특허 문헌에 개시되어 있어서, 실제적인 면역원성 조성물은 얻을 수 없다. 이와 같이 개시된 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 대한 면역원성 조성물 모델은 세포외 비융합 단백질이 아니라 세포 회합형 열 충격 융합 단백질에 관한 것이다.

미국 특허 제5,830,475호에는 융합 단백질을 발현하는 데 사용되는 이론적 마이코박테리아성 면역원성 조성물이 개시되어 있다. 이러한 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 마이코박테리아성 열 충격 단백질 및 스트레스 단백질 프로모터의 제어 하에 염색체외 플라스미드에 존재한다. 개시된 면역원성 조성물은 그에 대한 항체를 생성하기 위한 목적으로 인간을 제외한 동물에서 면역 반응을 유발시키고자 한 것이나, 포유동물에서 세포내 병원체를 방지하지 못하는 것으로 확인되었다. 또한, 미국 특허 제5,830,475호에는 세포외 비융합 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 특이성 프로모터를 사용하는 재조합 면역원성 조성물은 개시하지 않았다.

본 발명자에게 허여된 미국 특허 제6,467,967호에는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물을 청구하며, 여기서 상기 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질은 과발현되어 분비된다. 또한, 본 발명자는 2002년 9월 30일자로 출원된 일부 계속 출원인 미국 출원 제10/261,981호를 출원하였으며, 이 출원에서는 다른 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 단백질을 과발현하는 또 다른 재조합 BCG를 청구한다.

그러므로, 면역원성 조성물과 밀접한 관련이 있는 세포내 병원체의 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 재조합 세포내 병원체 면역원성 조성물에 대한 수요가 존재하고 있다. 또한, 비-열 충격 유전자 프로모터 또는 비-스트레스 단백질 유전자 프로모터를 갖는 염색체외 DNA에 의한 재조합 세포외 비융합 단백질을 과발현시킬 수 있는 재조합 세포내 병원체 면역원성 조성물에 대한 수요가 존재하고 있다.

특히, BCG 면역원성 조성물 수용자에게 제공된 보호보다 우수한 질병으로부터의 수용체 보호를 제공하는 세포내 병원체 면역원성 조성물을 제공하고자 하는 시급한 수요가 여전히 존재하고 있다. 또한, 결핵 및 기타의 세포내 병원체에 대한 가격면에서 효율적인 면역요법 및 예방 치료를 선진국 및 개발도상국 모두에게 공급하여야 하는 시급한 수요가 존재하고 있다.

또한, 면역억제되거나 또는 부분적으로 면역억제된 개체에게 안전하게 투여될 수 있는 세포내 병원체 면역원성 조성물에 대한 수요가 존재하고 있다.

그러므로, 본 발명은 세포내 병원체에 의해 야기되는 질환의 진단, 치료, 예방, 억제 또는 완화를 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 동일한 세포내 병원체, 또 다른 세포내 병원체 또는 둘 다의 주요 재조합 면역원성 항원을 발현시키도록 형질전환시킨 세포내 병원체를 사용하여 세포내 병원체에 의해 야기된 질환을 진단, 치료, 예방, 억제 또는 완화시키기 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 병원성 마이코박테리움의 세포외 단백질(들)을 발현시키는 재조합 BCG를 사용한 마이코박테리아 질환에 의해 야기되는 질환의 진단, 치료, 예방, 억제 또는 완화를 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 1종 이상의 주요 세포외 단백질을 발현 및 분비시키는 BCG의 재조합 균주를 사용한 결핵의 진단, 치료, 예방, 억제 또는 완화를 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 면역억제되거나 또는 부분적으로 면역억제된 개체에게 안전하게 투여할 수 있는 형태의 전술한 면역원성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개요

본 발명은 포유동물에 있어 세포내 병원체 질환의 진단, 치료, 예방, 억제 또는 완화를 위한 신규 부류의 면역원성 조성물 및 면역요법을 제공함으로써 상기한 목적 및 기타 목적을 달성한다. 종래에는, 세포내 병원체 면역원성 조성물 및 면역요법은 세포내 병원체 자체 또는 밀접히 관련된 종으로부터 제조하여 왔다. 이러한 종래의 면역원성 조성물 모델은 전체 미생물 또는 그 서브유닛으로 이루어졌다. 예를 들어, 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 대한 최초이자 현재 유일하게 이용되고 있는 면역원성 조성물은 매우 가까운 종인 세포내 병원체 마이크로박테리움 보비스로부터 제조된 약독화 생 면역원성 조성물이다. 최근에, 본 발명자들은 성장 배지로 분비되는 세포내 병원체의 특이적인 세포외 생성물이 개개의 서브유닛으로서 또는 서브유닛 조합체로서 포유동물에서 강력한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나, 이러한 서브유닛 면역원성 조성물은 마이코박테리움 보비스로부터 유래된 원래의 약독화 면역원성 조성물에 비하여 우수하지 않은 것으로 입증되었다.

본 발명은 다른 또는 동일한 세포내 병원체의 세포외 단백질(들)(재조합 면역원성 항원)을 발현하도록 형질전환시킨 재조합 약독화 세포내 병원체로 이루어진 면역원성 조성물 및 면역요법에 관하여 상술한다. 한 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 바실 칼메트 게랭, 즉 BCG의 재조합 균주를 사용하여 제조한다. 이러한 구체예에서, 재조합 BCG는, 비제한적으로, 몇 가지 예를 들면 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 래프리 및 마이코박테리움 보비스를 비롯한 병원성 마이코박테리아의 주요 세포외 단백질을 발현한다.

재조합 BCG에 의해 발현되는 주요 세포외 단백질은 비제한적으로 마이코박테리움 종의 12 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 23 kDa, 23.5 kDa, 30 kDa, 32A kDa, 32B kDa, 45 kDa, 58 kDa, 71 kDa, 80 kDa, 및 110 kDa 및 재조합 비융합 단백질, 융합 단백질 및 이의 유도체를 비롯하여 상기의 각각의 유사체, 동족체 및 서브유닛을 포함한다. 당업자에게는 마이코박테리아 및 기타 세포내 병원체의 주요 세포외 단백질을 확인하기 위해 사용되는 분자량은 단지 근사값을 의미한다는 것을 잘 알 것이다. 재조합 기술 및 분자생물학 분야의 전문가라면 추가 아미노산을 갖는 이들 단백질, 폴리펩티드 및 단백질을 동시에 발현(동시에 번역)시킬 수 있으며, 또한 이들 단백질을 절두형으로 발현시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 생성된 변형 단백질은 그것이 천연의 비융합 단백질, 융합 단백질, 하이브리드 단백질 또는 키메라 단백질 중 어느 것으로 불리든 간에 여전히 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 함께 클로닝되어 번역 후 단일 폴리펩티드 서열을 형성할 수 있는 상이한 유전자들로부터의 2 이상의 코딩 서열의 생성물을 포함하는 것으로 정의되나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 하나 이상의 다른 세포내 병원체로부터 비융합 단백질을 과발현하는 재조합 약독화 세포내 병원체 면역원성 조성물에 대해 기술한다. 이는, 하나 이상의 재조합 면역원성 항원 유전자를 발현하는 염색체외 핵산을 사용하고, 비-열 충격 유전자 프로모터 또는 비-스트레스 단백질 유전자 프로모터, 바람직하게는 단백질 특이적 프로모터 서열의 제어 하에 상기 유전자(들)을 배치함으로써 달성한다. 그 결과, 재조합 면역원성 항원을 코딩하는 유전자가 면역원성 조성물의 게놈 DNA로 안정하게 통합될 때 가능한 것보다 더 많은 양으로 발현되는 비융합 재조합 면역원성 항원을 갖는 면역원성 조성물이 제공된다. 결과적으로, 기존의 서브유닛 또는 약독화된 세포내 병원체 면역원성 조성물보다 특이성 및 효능이 훨씬 더 우수한 세포내 병원체 면역원성 조성물이 제공된다.

뿐만 아니라 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 사용하여 세포내 병원체에 의해 야기되는 포유동물 질환을 치료 및 예방하는 방법을 기술한다. 약독화 유기체 및/또는 재조합 면역원성 항원의 공급원으로서 사용될 수 있는 다수의 세포내 병원체의 일부 예로는, 비제한적으로, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 래프리, 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 종, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 롱비시(Legionella longbeachae), 레지오넬라 보제마니(Legionella bozemanii), 레지오넬라 종(Legionella sp.), 리켓시아 리켓시(Rickettsia rickettsii), 리켓시아 티피(Rickettsia typhi), 리켓시아 종(Rickettsia sp.), 에리치아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 에리치아 파고사이토필라 게노 군(Ehrlichia phagocytophila geno group), 에리치아 종(Ehrlichia sp.), 콕실라 버네티(Coxiella burnetii), 레이쉬마이나 종(Leishmania sp.), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 클라미디아 뉴모니(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 종(Chlamydia sp.), 리스테리아 모노사오토겐(Listeria monocytogenes), 리스테 리아 종(Listeria sp.) 및 히스토플라스마 종(Histopiasma sp.)을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 적절한 면역 반응으로 유도하는 임의의 방법, 비제한적인 예로, 피내, 피하, 근육내, 비내, 복강내, 경구 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 적절한 후 접종 기간 후, 포유동물에 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에어로졸로 항원을 투여하였다. 본 발명의 면역원성 조성물이 투여된 포유동물은 BCG 단독, 주요 세포외 단백질 단독 또는 이의 임의의 조합이 투여된 포유동물에 비하여 현저하게 병이 치유되었다.

본 발명의 한 구체예에서, 하나 이상의 마이코박테리아 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되는데, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질은 동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비된다.

또 다른 구체예에서, 프로모터 제어 하에 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되는데, 상기 프로모터는 열 충격 프로모터 또는 스트레스 단백질 프로모터가 아니며, 상기 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비된다.

또 다른 구체예에서, 프로모터 제어 하에 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32A kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되는데, 상기 프로모터는 열 충격 프로모터 또는 스트레스 단백질 프로모터가 아니며, 상기 32A kDa 주요 세 포외 비융합 단백질은 동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비된다

또 다른 구체예에서, 마이코박테리아 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자들을 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되는데, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 동물에서 면역 반응이 유도되도록 과별현되어 분비된다.

또 다른 구체예에서, 프로모터 제어 하에 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 개시되는데, 상기 프로모터는 열 충격 프로모터 또는 스트레스 단백질 프로모터가 아니며, 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 동물에서 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응이 둘 다 유도되도록 상기 재조합 BCG로부터 과발현되고 분비된다.

또 다른 구체예에서, 프로모터 제어 하에 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물이 개시되는데, 상기 프로모터는 열 충격 프로모터 또는 스트레스 단백질 프로모터가 아니며, 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 동물에서 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응이 둘 다 유도되도록 재조합 BCG로부터 과발현되고 분비된다.

본 발명의 다른 구체예는 약독화 세포내 병원체(예, 재조합 BCG)가 생육 조 절성 영양요구성 유기체인 면역원성 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "생육 조절성"이란 특수 영양소가 제공될 때 성장하는 영양요구성 유기체를 의미한다. 특수 영양소는 면역원성 조성물과 동시에 투여되거나 또는 면역원성 조성물 수용자에 차후에 제공된다.

한 구체예에서, 생육 조절성 영양요구성 유기체는 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 하나 이상의 주요 세포외 단백질을 과발현하고 분비하도록 변형된 재조합 BCG이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생육 조절성 영양요구성 유기체의 생육을 조절하는 데 필요한 특수 영양소는 아미노산이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 니트레이트 리덕타제 알파 서브유닛 유전자(narG 유전자)가 대립유전자 교환에 의해 파괴된 약독화된 재조합 BCG(Tice 균주)를 포함한다. 이러한 고도로 약독화된 narG BCG는 그 후 하나 이상의 주요 세포외 Mtb 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 핵산으로 형질전환시킨다. 형성된 고도로 약독화된 narG 돌연변이 형질전환체는 면역억제된 포유동물에서 면역원성 조성물로서 유용하다.

당업자라면 본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 도면과 함께 바람직한 대표적인 구체예의 상세한 설명을 참조하면 명백하게 이해될 것이다. 먼저, 도면에 관하여 간략히 설명한다.

도 1은 배양 여액으로부터의 BCG의 형질전환 균주에 의한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 재조합 30 kDa의 분비를 나타낸, 1a 및 1b로 표시된 코마시 블루로 염색된 젤을 도시한다.

도 2는 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현시키는 재조합 BCG 면역원성 조성물, BCG 단독, 재조합 30 kDa 단백질 단독 또는 가성(sham) 면역원성 조성물을 사용하여 접종한 기니 피그의 피부 테스트 결과를 비교하기 위하여 디자인된, 2a 및 2b로 표시된 두 실험으로부터의 결과를 그래프로 도시한 것이다.

도 3은 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 후 면역화 항원 공격한 후의, 3a 및 3b로 표시된 기니 피그에서의 중량 변화를 그래프로 도시한 것이다.

도 4a는 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 후 면역화 항원 공격한 후의, 기니 피그의 폐로부터 회수한 감염성 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 콜로니 형성 단위(CFU)를 그래프로 도시한 것이다.

도 4b는 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 후 면역화 항원 공격한 후의, 기니 피그의 비장으로부터 회수한 감염성 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 콜로니 형성 단위(CFU)를 그래프로 도시한 것이다.

도 5는 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 재조합 30 kDa를 투여한 BCG, BCG 단독 및 가성 면역원성 조성물에 대한 기니 피그의 피부 테스트 반응을 그래프로 도시한 것이다.

도 6은 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30), 32A kDa 주요 세포외 단백질(r32A) 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질(r23.5)에 대한 항체 역가를 그래프로 나타낸 것이다.

용어의 간단한 정의

하기 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 청구의 범위의 이해를 돕기 위하여, 하기와 같은 정의를 언급해 두는 것이 유용할 수 있을 것이다. 이러한 정의는 사실상 비제한적이며 독자의 편의를 위해서만 제공되는 것이다.

영양요구주 또는 영양요구성: 본원에서 "영양요구주"란 야생형 유기체가 요구하지 않는 특정 영양 요건을 갖는 미생물을 의미한다. 요구되는 영양소가 없을 경우, 영양요구주는 생육하지 않을 것이나 반면 야생형은 증식할 것이다.

유전자: 본원에서 "유전자"는 유전자 구성체의 발현을 변경하거나 또는 유전자 구성체에 필요한 프로모터 및/또는 조절 서열을 갖는 유전자 구성체의 적어도 일부를 의미한다.

유전자 구성체: 본원에서 "유전자 구성체"는 하나 이상의 세포외 병원체로부터의 하나 이상의 주요 세포외 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 유전자 구성체는 염색체외 DNA이다.

생육 조절성: 본원에서 "생육 조절성"은 본 발명 면역원성 조성물의 영양요구성 형태를 의미한다. 생육은 영양요구주의 생육에 필수적인 영양소를 생육을 유도하기에 충분한 농도로 투여하는 것에 의해 조절된다.

숙주: 본원에서 "숙주"는 본 발명 면역원성 조성물의 수용체를 의미한다. 예컨대 숙주는 영장류, 설치류, 소, 말, 개, 고양이, 양, 염소 및 돼지를 비롯한 포유동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 구체예에서, 숙주는 인간이다.

면역원: 본원에서 "면역원"은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 임의의 기질을 의미한다. 본 발명 면역원은 마이코박테리움 속의 구성원(이에 한정되지 않음)과 같은 세포내 병원체로부터 유도된 주요 세포외 단백질 및 이들의 재조합 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

면역원성 조성물: 본원에서 "면역원성 조성물"은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 면역원을 생체에서 발현 및/또는 분비하는 세포내 병원체와 같은 재조합 벡터를 면역증강제와 함께 또는 면역증강제 없이 포함한다. 본원에 개시된 면역원성 조성물은 형질전환체와 같은 영양요구성 유기체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

핵산 서열: 본원에서 "핵산 서열"은 임의의 연속적인 핵산 서열을 의미한다.

형질전환체: 본원에서 "형질전환체"는 발현 및/또는 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 이종성 핵산으로 형질전환된 미생물을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 형질전환체는 BCG이다.

본 발명은 일반적으로 동일한 종 또는 또 다른 종의 재조합 면역원성 항원을 발현 및/또는 분비하는 약독화 또는 비독성 재조합 세포내 병원체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 약독화 세포내 병원체는 생육 조절성 영양요구주이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 약독화 세포내 병원체는 대립유전자 교환을 통하여 약독화된다. 예컨대 본 발명의 구체예는 약독화 또는 비독성 재조합 BCG를 주성분으로 한다. 그러나, 본 발명은 재조합 BCG에 한정되는 것은 아니다.

면역원성 조성물은 피하, 근육내, 비강내, 복강내, 피내, 경구 또는 흡입을 비롯한 하나 이상의 경로를 사용하여 투여되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 면역원성 조성물은 원위치(in situ)에서 면역원(들)을 발현 및 분비시키는 숙주내에서 생존한다. 영양요구성 균주를 사용할 경우, 면역원성 조성물은 충분한 양의 적절한 영양소가 숙주에 제공될 때까지 사실상 면역학적으로 불활성인 상태로 남아있다. 필수 영양소가 제공되면, 영양요구성 면역원성 조성물(영양요구주)은 면역원의 발현 및 분비를 개시한다. 이후, 필요에 따라, 필수 영양소의 공급을 억제하여 영양요구주의 생육 및 원위치 항원 발현을 정지시킬 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물이 면역원을 발현시키는 영양요구성 형질전환체를 사용할 경우, 숙주내에서 영양요구주의 생육을 개시하는 데 필요한 필수 영양소는 면역원성 조성물의 투여 직전, 면역원성 조성물의 투여와 동시에 또는 면역원성 조성물의 투여 직후에 투여할 수 있다. 필수 영양소의 투여를 면역원성 조성물의 투여후 수일 또는 심지어 수주 후로 지연시키는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 면역원성 조성물의 투여 후 어느 때라도 숙주가 필수 영양소를 이용하지 못하게 하여 영양요구성 형질전환체의 증식을 중단시킬 수 있다.

본 발명은 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 보비스 또는 마이코박테리움 래프리의 주요 세포외 비융합 단백질을 과발현시키는 BCG 균주(이에 한정되지 않음)를 비롯한 여러가지 세포내 병원체에 대한 면역원성 조성물을 제조하는 데 유용하다. 본 발명의 교시에 따라 제조된 면역원성 조성물은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 유용하다. 유도된 면역 반응은 체액성(항체계) 면역 반응 또는 세포성 면역 반응일 수 있으며 진단, 보호 또는 경감 용도로 유용하다.

본 발명의 각 면역원성 조성물은 소정 세포내 병원체에 특이적인 여러 분자량의 하나 이상의 면역원을 발현시킬 수 있다. 예컨대, 본 발명자는 이미, 주요 세포외 단백질 12 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 23 kDa, 23.5 kDa, 30 kDa, 32A kDa, 32B kDa, 45 kDa, 58 kDa, 71 kDa, 80 kDa, 110 kDa 및 이의 재조합 비융합 단백질, 융합 단백질 및 유도체를 비롯한 이들의 각 유사체, 동족체, 서브유닛 및 축퇴성 변이체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 면역원을 밝혀냈다. (계류중인 미국 특허 출원 제08/156,358호, 제09/157,689호, 제09/175,598호, 제09/226,539호, 및 제09/322,116호 참조, 이 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음). 마이코박테리아의 주요 세포외 단백질 및 기타 세포내 병원체를 확인하는 데 사용되는 분자량은 오직 근사치로 의도되었음은 당업자에게 분명할 것이다. 재조합 기술 및 분자 생물학의 당업자는 이들 단백질을 추가의 아미노산, 폴리펩티드 및 단백질과 동시 발현(동시 번역)시킬 수 있으며, 이들 단백질을 절두형으로 발현시킬 수도 있음을 알 것이다. 생성되는 변형 단백질도 천연의 비융합 단백질, 융합 단백질, 하이브리드 단백질 또는 키메라 단백질과 같은 명칭과 무관하게 본 발명 범위 내에 속하는 것으로 고려된다. 본 발명의 목적에서, 융합 단백질은, 함께 클로닝되어, 번역 후 단일 폴리펩티드 서열을 형성하는 상이한 유전자들로부터의 둘 이상의 코딩 서열의 생성물을 포함하는 것으로 정의되나 이에 한정되지 않는다.

세포외 단백질을 비롯한 항원 발현은 일반적으로, 재조합 비융합 단백질을 코딩하는 유전자가 숙주 게놈 내로 통합되기보다 하나 이상의 플라스미드(염색체외 DNA) 상 및 이의 제어 하에 위치될 경우 증강된다. 또한, 특정 단백질에 특이적인 프로모터 서열에 의해 유도된 단백질 발현은 비융합 단백질 항원의 증강된 발현과 개선된 단백질 폴딩 및 프로세싱을 제공한다. 따라서, 본 발명은 비-열 충격 유전자 프로모터 또는 비-스트레스 단백질 유전자 프로모터, 바람직하게는 단백질 특이적 프로모터 서열에 의해 제어되는 염색체외 DNA 상에서 코딩된 재조합 세포외 비융합 단백질을 제공한다.

본 발명은 밀접한 관련이 있고/있거나 다른 세포내 병원체의 재조합 세포외 비융합 단백질 외에 그 자신의 내인성 세포외 단백질을 발현시키는 재조합 약독화 세포내 병원체 면역원성 조성물, 예컨대 rBCG를 제공한다. 그러나, 80년간의 연구를 통해 BCG의 내인성 세포외 단백질 단독으로는 모든 수용체에서 완전한 보호(방어)를 제공하지 못하는 것으로 증명되었다. 또한, 이하에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 마이코박테리움 튜버쿨로시스 세포외 단백질을 종래의 BCG와 동시에 주사하는 것만으로는 BCG 단독에 비하여 우수한 면역원성 조성물을 얻지 못함도 밝혀냈다.

본 발명의 한 구체예에서, 면역원성 조성물은 오직 하나의 면역원, 예컨대 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 23.5 kDa, 30 kDa 또는 32 kDa 주요 세포외 단백질(이에 한정되지 않음)을 발현시키는 재조합 BCG 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 재조합 BCG는 둘 이상의 면역원, 예컨대 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 23.5 kDa 및 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현시킬 수 있다. 후자는 포유동물에서 질병을 예방하기 위한 면역원성 조성물로서 특히 효과적일 수 있다. 본 발명자들은 재조합 BCG에 의한 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 23.5 kDa 및 30 kDa 주요 세포외 단백질의 동시적 과발현이 본 발명의 세포내 병원체에 대한 포유동물의 면역 반응을 상승적으로 증가시키는 작용을 할 수 있다는 비제한적 이론을 제안하였다. 이 이론은 부분적으로는, 야생형 및 재조합 BCG가 자연에서 그 자신의 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 발현시키지 않는 마이코박테리움 보비스의 결실 돌연변이체라는 관찰에 기초한다.

그러나, 형질전환체로서 BCG를 이용하는 면역원성 조성물은 에이즈와 같은 면역저하 환자에서 산재성 질환을 야기할 수 있다. 드물게, 이러한 산재성 질환은 치명적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서는, 면역저하 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 안전하다고 예상되는 야생형 모체로서 BCG Tice를 사용하여 재조합 BCG 균주를 개발하였다. 이들 균주 중 4개는 영양요구주이므로, 이들이 영양요구성을 보이는 과량의 아미노산의 존재 하에서만 증식한다. 본 발명의 한 구체예에서, 비제한적 실시예는 BCG 트립토판 또는 글루타민 영양요구주를 포함한다. 이러한 이유에서, 이들의 생육은 이하에서 더 논의되는 바와 같이 숙주에 의해 조절될 수 있다. 면역억제 또는 부분적 면역억제 포유동물에 사용하기 적당한 두 추가의 BCG 균주는 영양요구주가 아니므로 생육 조절성이 아니다. 이들 비영양요구성 BCG 균주는 대립유전자 교환 돌연변이체이고, 면역저하 숙주에서 약독화될 것으로 예상된다.

그러나, 전술한 바와 같이, 본 발명은 형질전환체의 영양요구성 균주에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 영양요구주가 본 면역원성 조성물이 필요한 모든 용도에 적절할 수는 없다고 예상한다. 예컨대, 영양요구주는 생체내에서 형질전환체의 생육을 조절하는 데 유용한 반면, 숙주가 소정 면역 반응을 보이도록 하기 위해서 시기적절하고 일관되게 제2의 조성물을 투여할 것을 요한다. 이것은 투여자, 숙주 및 숙주의 보호자 모두에 주의를 요한다. 따라서, 위험 범발성 면역원성 조성물 관련 질환이 극미할 경우, 비영양요구성 형질전환체를 투여하는 것이 더 바람직하다. 따라서, 유전자 구성체, 플라스미드 및 약학 조성물을 비롯한 본 발명의 여러 구체예의 제조에 관한 이하의 설명은 영양요구성 및 비영양요구성 형질전환체에 똑같이 적용된다.

미생물학의 당업자는, 필수 영양소가 영양요구성 생육에 필요할 것이라는 것을 제외하고, 영양요구주 및 비영양요구주에 대하여 배지, 온도, 시간 등의 생육 조건이 일반적으로 동일함을 용이하게 이해할 것이다. 또한, 면역학의 당업자는 숙주에 면역원성 조성물을 투여하는 것은 영양요구주 및 비영양요구주 둘 다에 대하여 동일함을 이해할 것이다.

본 발명의 한 예시적 구체예에서, 재조합 BCG 면역원성 조성물은 글루타민 신세타제 유전자(glnA1)에 바로 인접한 상류 영역으로부터의 프로모터 및 플라스미드 pNBV1을 이용하여 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 단백질을 발현시킨다. 또 다른 예시적 구체예에서, 재조합 BCG 면역원성 조성물은 세포외 단백질을 코딩하는 유전자에 바로 인접한 상류 영역으로부터의 프로모터 및 플라스미드 pNBV1을 이용하여 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 단백질을 발현시킨다. 본 발명의 또 다른 예시적 구체예에서, 재조합 BCG 면역원성 조성물은 30 kDa 세포외 단백질을 코딩하는 유전자에 바로 인접한 상류 영역으로부터의 프로모터 및 플라스미드 pNBV1을 이용하여 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현시킨다. 또 다른 예시적 구체예에서, 재조합 BCG 면역원성 조성물은 30 kDa 세포외 단백질을 코딩하는 유전자에 바로 인접한 상류 영역으로부터의 프로모터 및 플라스미드 pNBV1을 이용하여 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현시킨다.

제한의 의도는 아니나 명세서가 과도하게 복잡해지지 않도록 간결의 목적에서, 백신 제제로서 재조합 BCG(rBCG)와 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 보비스 및 마이코박테리움 래프리 세포외 비융합 단백질, 구체적으로는 본 발명의 예시적 구체예로서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 23.5 kDa, 30 kDa 및 32A kDa 주요 세포외 비융합 단백질과 마이코박테리움 보비스 및 마이코박테리움 래프리의 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 사용하여 보다 구체적으로 본 발명을 개시하기로 하겠다. 또한, 다중 이종성 항원 과발현 및 분비의 예로서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 23.5 kDa 및 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 rBCG로부터 동시발현 및 분비될 것이다.

임의의 재조합 면역원성 항원은 임의의 재조합 약독화 세포내 병원체에 의해 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물로서 rBCG에 한정되지 않는다. 또한, 면역원은 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 보비스 및 마이코박테리움 래프리의 주요 세포외 비융합 단백질에 한정되지 않는다.

면역원성 조성물 균주 변이체의 효과를 알아보기 위해서, 상이한 BCG 균주들을 사용하여 본 발명의 여러 구체예: BCG Tice(타이스) 및 BCG Connaught(코노트)를 제조하였다. 야생형 마이코박테리움 보비스 BCG Tice는 오가논사에서 구입하였고, 야생형 마이코박테리움 보비스 BCG Connaught는 캐나다 토론토 소재의 코노트 래보러토리즈에서 입수하였다. 균주를 진탕하지 않은 배양액으로서 5% C0₂-95% 공기 분위기 중에서 37℃, pH 6.7의 7H9 배지(Difco)에서 유지시켰다. 배양액을 주당 1회 또는 2회 5분간 초음파 처리 수조에서 초음파 처리하여 박테리아 응집을 감소시켰다.

비면역저하 숙주에서 사용하기 적합한 면역원성 조성물

A. 재조합 BCG TICE(rBCG30 Tice)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 발현시키는 재조합 BCG TICE(rBCG30 Tice)를 하기와 같이 제조하였다. 이 콜라이/마이코박테리아 셔틀 플라스미드의 재조합 구성체인 플라스미드 pMTB30을 전에 본 발명자들이 [Harth, G., B.-Y. Lee 및 M. A. Horwitz. 1997]에서 개시한 바와 같이 제조하였다. 빠르게 성장하는 비병원성 마이코박테리아에서의 4개의 주요 마이코박테리움 튜버쿨로시스 세포외 단백질의 고도의 이종성 발현 및 분비는 이들을 면역원성 조성물 후보 물질 및 약물 표적이 되게 하는 것으로 사료된다[Infect. Immun. 65: 2321-2328(이의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음)].

B. 재조합 BCG30 Tice II (pNBV1-pglnA-MTB30)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 세포외 비융합 단백질을 과발현시키는 재조합 BCG30 Tice II(pNBV1-pglnA-MTB30)를 하기와 같이 제조하였다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 유전자(개시 코돈에서 NdeI 제한 부위 및 종결 코돈의 직하류에서 HindIII 제한 부위 포함)의 코딩 영역을 증폭시키고 이 PCR 생성물을 pNBV1-BFRB의 NdeI -> HindIII 부위에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 프로모터의 하류에 클로닝함으로써 플라스미드 pNBV1-pglnA1-MTB30을 작제하였다(Tullius, M., G. Harth, 및 M. A. Horwitz. 2001). 마이코박테리움 튜버쿨로시스 글루타민 신세타제 및 수퍼옥시드 디스뮤타제의 세포외 수준이 높은 것은 단백질 특이적 외부 수송 메카니즘에 기인하기보다는 주로 발현 및 세포외 안정성이 높은 것에 기인한다(Infect. Immun. 69: 6348-6363). 제한 분석에 의해 플라스미드가 정확한지를 확인한 후, 플라스미드를 전기천공으로 마이코박테리움 보비스 BCG Tice 내로 도입하고, 형질전환체를 50 ㎍/mL하이그로마이신를 포함하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 몇몇 개개의 하이그로마이신 내성 클론을 무작위 선별하여, 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유하는 7H9 배지에서 배양하였다. 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 단백질의 발현 및 외부 수송은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 단백질 면역글로불린을 사용한 면역블로팅으로 확인하였다. rBCG30 Tice II는 단지 벡터(pNBV1)를 보유하는 BCG Tice보다 배양액 1 mL당 30 kDa 항원을 24배 더 많이 생성시키는 것으로 밝혀졌다.

C. 재조합 BCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB23.5)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 세포외 비융합 단백질을 과발현시키는 재조합 BCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB23.5)는 하기와 같이 제조하였다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 유전자(개시 코돈에서 NdeI 제한 부위 및 종결 코돈 직하류에서 BamHI 및 HindIII 제한 부위 포함)의 코딩 영역을 증폭시키고 이 PCR 생성물을 pNBV1-BFRB의 NdeI -> HindIII 부위에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 프로모터의 하류로 클로닝함으로써 플라스미드 pNBV1-pglnA1-MTB23.5를 작제하였다(Tullius, M., G. Harth, 및 M. A. Horwitz. 2001). 마이코박테리움 튜버쿨로시스 글루타민 신세타제 및 수퍼옥시드 디스뮤타제의 세포외 수준이 높은 것은 단백질 특이적 외부 수송 메카니즘에 기인하기보다는 주로 발현 및 세포외 안정성이 높은 것에 기인한다(Infect. Immun. 69: 6348-6363). 제한 분석에 의해 플라스미드가 정확한지를 확인한 후, 플라스미드를 전기천공에 의해 마이코박테리움 보비스 BCG Tice 내로 도입하고, 형질전환체를 50 ㎍/mL 하이그로마이신를 포함하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 몇몇 개개의 하이그로마이신 내성 클론을 무작위 선별하여, 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유하는 7H9 배지에서 배양하였다. 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 단백질의 발현 및 외부 수송은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가의 고특이성 토끼 항-23.5 kDa 단백질 면역글로불린을 사용한 면역블로팅으로 확인하였다. rBCG23.5 Tice I은 BCG30 Tice II에 의해 생성된 재조합 30 kDa 단백질의 양보다 약간 많거나 이것과 동등한 높은 수준으로 23.5 kDa 단백질을 생성하였다. BCG는 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 가지지 않으므로, 30 kDa 단백질에 대하여 행한 바와 같은 모 균주에 대한 비교를 할 수 없었다. (BCG Tice는 해당 마이코박테리움 튜버쿨로시스 유전자 Rv1978 내지 Rv1988을 포함하는 약 11.5 kb의 RD2 게놈 결실로 인하여 23.5 kDa 단백질을 발현시키지 않으며[23.5 kDa 단백질 유전자 = Rv 1980]; 결실은 1931년 이전에 야생형 마이코박테리움 보비스로부터의 BCG 균주의 생성시 일어났음).

D. 재조합 BCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB30/23.5)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 및 23.5 kDa 세포외 비융합 단백질을 과발현시키는 재조합 BCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB30/23.5)는 하기와 같이 제조하였다. pNBV1-pglnA1-MTB23.5로부터의 1 kb BamHI 단편(마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 프로모터 및 23.5 kDa 코딩 영역 전체를 포함)을 pNBV1-pglnA1-MTB30의 특유의 BamHI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pNBV1-pglnA1-MTB30/23.5를 작제하였다. 두 단백질을 코딩하는 유전자는 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자 상류에 있는 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자와 플라스미드 상에서 동일한 방향으로 배향된다. 제한 분석에 의해 플라스미드가 정확한지를 확인한 후, 플라스미드를 전기천공으로 마이코박테리움 보비스 BCG Tice 내로 도입하고, 형질전환체를 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 포함하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 몇몇 개개의 하이그로마이신 내성 클론을 무작위 선별하여, 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유하는 7H9 배지에서 배양하였다. 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 및 23.5 kDa 단백질의 발현 및 외부 수송은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 단백질 및 항-23.5 kDa 단백질 면역글로불린을 사용한 면역블로팅으로 확인하였다. rBCG30/23.5 Tice I은 단지 벡터(pNBV1)를 보유하는 BCG Tice보다 배양액 1 mL당 30 kDa 항원을 24배 더 많이 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 이 균주는 재조합 30 kDa 단백질의 양보다 약간 더 많은 수준으로 23.5 kDa 단백질을 생성하였다. BCG는 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 가지지 않으므로, 30 kDa 단백질에 대하여 행한 바와 같은 모 균주에 대한 비교를 할 수 없었다.

E. 재조합 BCG30 Tice III(pNBV-1-MTB30)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 과발현하는 재조합 BCG30 Tice III(pNBV-1-MTB30)는 다음과 같이 제조하였다. 이 재조합 균주는 벡터 골격 및 ClaI 및 BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만(Erdman) DNA의 ∼1.5 킬로염기쌍(kb) 단편으로 구성되며, 30 kDa 주요 세포외 단백질의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 30 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 30 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 14.4배, 분석 말미에 11.5배). 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 2.5 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

F. 재조합 BCG23.5 Tice II(pNBV-1-MTB23.5)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 과발현하는 재조합 BCG23.5 Tice II(pNBV-1-MTB23.5)는 다음과 같이 제조하였다. 이 재조합 균주는 벡터 골격 및 PstI 및 BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.4 킬로염기쌍(kb) 단편으로 구성되며, 23.5 kDa 주요 세포외 단백질의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 23.5 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 23.5 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(분석 초기에 16.2 mg/l, 분석 말미에 15.1 mg/l). BCG는 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 보유하지 않기 때문에, 30 kDa의 경우에서 실시한 바와 같이 모 균주와 비교할 수는 없었다. 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 3 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 2001년 8월 24일 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

G. 재조합 BCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)

재조합 BCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)(이하, "↑↑"는 다수의 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자 구성체를 의미하는데, 이때 각각의 단백질을 코딩하는 핵산 서열[유전자]은 상기 유전자 구성체의 5' 말단에 대해 동일한 방향으로 배향되어 있음)는 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 30 kDa 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질 둘 다를 과발현한다. 상기 두개의 단백질을 코딩하는 유전자는 동일한 방향으로 배향되어 있다. 이 재조합 균주는 벡터 골격, 및 2개의 단편 즉, ClaI 및 NdeI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.5 킬로염기쌍(kb) 단편(30 kDa 단백질 유전자 및 프로모터)과 NdeI 및 NdeI-BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.4 킬로염기쌍(kb) 단편(23.5 kDa 단백질 유전자 및 프로모터)으로 구성되며, 30 kDa 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질의 2개의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 30 kDa 및 23.5 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 30 kDa 및 23.5 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(30 kDa 단백질에 있어서, 발현은 분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 23.3배, 분석 말미에 16.5배였으며; 23.5 kDa 단백질에 있어서, 발현은 분석 초기에 18.7 mg/l, 분석 말미에 12.2 mg/l였음). 상기한 바와 같이, 재조합 23.5 kDa 단백질의 발현은 절대적인 수치로 측정하였는데, 그 이유는 BCG Tice는 23.5 kDa 단백질을 발현하지 않기 때문이다. 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 3 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

H. 재조합 BCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)

재조합 BCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)(이하, "↑↓"는 다수의 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자 구성체를 의미하는데, 이때 각각의 단백질을 코딩하는 핵산 서열[유전자]은 상기 유전자 구성체의 5' 말단에 대해 반대 방향으로 배향되어 있음)는 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 30 kDa 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질 둘 다를 과발현한다. 상기 두개의 단백질을 코딩하는 유전자는 플라스미드 상에 반대 방향으로 배향되어 있다. 이 재조합 균주는 벡터 골격, 및 2개의 단편 즉, ClaI 및 NdeI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.5 킬로염기쌍(kb) 단편(30 kDa 단백질 유전자 및 프로모터)과 NdeI 및 NdeI-BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.4 킬로염기쌍(kb) 단편(23.5 kDa 단백질 유전자 및 프로모터)으로 구성되며, 30 kDa 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질의 2개의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 바로 위에 기재한 균주(rBCG30/23.5 Tice IIA)와는 대조적으로, 23.5 kDa 단백질의 코딩 영역 및 프로모터 영역을 보유하는 NdeI 제한 단편의 배향은 역전되었다. 30 kDa 및 23.5 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 30 kDa 및 23.5 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(30 kDa 단백질에 있어서, 발현은 분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 25.7배, 분석 말미에 21.1배였으며; 23.5 kDa 단백질에 있어서, 발현은 분석 초기에 16.6 mg/l, 분석 말미에 12.8 mg/l였음). 상기한 바와 같이, 재조합 23.5 kDa 단백질의 발현은 절대적인 수치로 측정하였는데, 그 이유는 BCG Tice는 23.5 kDa 단백질을 발현하지 않기 때문이다. 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 3 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

I. 재조합 BCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)

마이코박테리움 튜버쿨로시스 32A kDa 주요 세포외 단백질(a.k.a. 항원 85A)을 과발현하는 재조합 BCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)은 다음과 같이 제조하였다. 이 재조합 균주는 벡터 골격 및 ClaI 및 BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 DNA의 ∼1.5 킬로염기쌍(kb) 단편으로 구성되며, 32A kDa 주요 세포외 단백질의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 32A kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 32A kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 10.5배, 분석 말미에 8.1배). 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 3 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

J. 재조합 BCG(MB)30 Tice(pNBV1-MB30)

마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 과발현하는 재조합 BCG(MB)30 Tice(pNBV1-MB30)는 다음과 같이 제조하였다. 이 재조합 균주는 벡터 골격 및 ClaI 및 BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 보비스 야생형(ATCC# 19210) DNA의 ∼1.5 킬로염기쌍(kb) 단편으로 구성되며, 30 kDa 주요 세포외 단백질의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 30 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 30 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 9.7배, 분석 말미에 7.8배). 모액(모액 #2)은 10% 글리세롤 중에서 2.5 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

K. 재조합 BCG(ML)30 Tice(pNBV1-ML30)

마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질을 과발현하는 재조합 BCG(ML)30 Tice(pNBV1-ML30)는 다음과 같이 제조하였다. 이 재조합 균주는 벡터 골격 및 ClaI 및 BamHI 제한 부위에 측접한 마이코박테리움 래프리 DNA의 ∼1.3 킬로염기쌍(kb) 단편으로 구성되며, 30 kDa 주요 세포외 단백질의 코딩 영역 및 상기 코딩 영역 직상류의 프로모터 영역을 포함하는 재조합 플라스미드 pNBV1을 전기천공에 의해 BCG Tice 박테리아(모액 #2) 내로 도입함으로써 생성하였다. 30 kDa 단백질 특이성 항혈청을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인한 바에 따르면, 상기 균주는 재조합 플라스미드를 안정하게 유지하였으며, 재조합 30 kDa 단백질 발현 수준은 항생제의 부재 하에서도 12개월에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다(분석 초기에 BCG Tice 야생형 바탕값에 비해 9.7배, 분석 말미에 9.3배). 모액(모액 #1)은 10% 글리세롤 중에서 3 x 10⁸ 입자/ml의 농도로 제조하였으며, -80℃에서 저장하였다.

면역저하 숙주에서 사용하기에 적합한 면역원성 조성물

I. 생육 조절성 BCG(영양요구주)의 개발

A. BCG Tice glnA1

BCG Tice glnA1 유전자는 본 발명자들이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 돌연변이체를 생성하기 위해 이전에 사용한 플라스미드 pEX1-Mtb-glnA1::Km^r을 이용하여 대립유전자 교환에 의해 파괴하였다(M. V., G. Harth 및 M. A. Horwitz. 2003). 글루타민 신세타제(glnA1)는 인간 대식세포 및 기니 피그 내에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 성장을 위해 필수적이다(Infect. Immun. Vol. 71: 7). pEX1-Mtb-glnA1::Km^r은 온도 민감성-sacB 벡터인 pPR27로부터 유도하였으며, glnA1 코딩 영역의 중앙 부근에 위치하는 독특한 부위 내에 삽입된 Km^r과 함께 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 유전자좌를 포함하는 1.8 kb 및 hyg^r 유전자를 포함한다(Pelicic, V., M. Jackson, J. M. Reyrat, W. R. Jacobs, Jr., B. Gicquel 및 C. Guilhot. 1997. Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10955-10960). pEX1-Mtb-glnA1::Km^r은 전기천공에 의해 BCG Tice 내로 도입하고, 형질전환체는 50 ㎍/mL의 하이그로마이신을 함유하는 7H11 상에서 선별하였다. 상기 평판은 초기에는 허용 온도(32℃)에서 6일 동안 유지하였으며, 이어서 제한 온도(39℃)에서 46일 동안 항온처리하였다. 단일 형질전환체는 제한 온도에서 약 25세대 동안 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 20 mM의 L-글루타민을 함유하는 7H9-10% OADC-0.05% 트윈-80 브로스 배양액 중에서 성장시킨 후, 2%(w/v) 수크로스, 20 mM의 L-글루타민 및 50 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 7H11 상에서 평판배양하여 2차 상동성 재조합을 수행한 클론을 선별하였다. 무작위로 선별한 35개의 Km^r 클론 중 12개의 클론은 올바른 표현형(즉, Hyg^s 및 글루타민 영양요구주)을 보유하는 것으로 확인되었다. 순수 배양액을 확보하기 위해, 본 발명자들은 12개의 클론 중 하나를 저밀도로 평판배양하여 단일 콜로니를 재분리하였다. 상기 균주의 초기 냉동 모액은 재분리한 클론으로부터 제조하였다. 상기 돌연변이체의 올바른 유전형은 서던 블롯 분석법으로 확인하였다.

BCG Tice glnA1 균주는 글루타민 영양요구주이다. L-글루타민을 첨가하지 않은 7H11 평판 상에서는 성장이 관찰되지 않았다. 또한, glnA1 돌연변이체는, 인간 대식세포가 0.2 mM L-글루타민을 함유하는 배지 중에서 배양되는 경우, 인간 대식세포 내에서 세포내 성장이 거의 없거나 전혀 없었다. 그러나, 야생형 균주와 유사한 세포내 성장은 조직 배양 배지에 과량의 L-글루타민(10 mM)을 첨가하면 달성되었다. 상보성 분석은 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 유전자(pNBV1-MtbGS) 또는 살모넬라 타이피무리움 glnA 유전자를 포함하는 플라스미드(pNBV1-StGS)로 BCG Tice glnA1을 형질전환함으로써 수행하였다. 상기 플라스미드 둘 다 상기 돌연변이체에 야생형 성장 표현형을 회복시켜 주었다.

상기 BCG glnA1 영양요구주의 L-글루타민 요구는 본 발명자들이 이미 그 특성을 상세하게 규명한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 균주의 L-글루타민 요구와 매우 유사할 것으로 예상된다(Tullius, M. V., G. Harth, and M. A. Horwitz. 2003). 글루타민 신세타제(glnA1)는 인간 대식세포 및 기니 피그에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 성장에 필수적이다(Infect. Immun. Vol. 71: 7). 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 균주의 경우에서, 고형 배지 내에서 상기 돌연변이체가 정상적으로 성장하기 위해서 높은 수준의 L-글루타민(10-20 mM)이 필요하다. 액상 배지에서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 돌연변이체는 ≥1 mM L-글루타민에서 정상 성장 속도로 성장하였다. 초기 성장은 1-2 mM L-글루타민에서 정상적이지만, 이들 배양액은 5 mM 및 20 mM L-글루타민을 함유하는 배양액처럼 높은 밀도에 이르지 않았으며, 이들은 대수 증식기 직후 생존율의 급격한 감소를 나타냈다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 균주는 L-글루타민 결핍 배지에서 희석하는 경우, 생존력을 급격히 상실하였다. 인간 대식세포를 0.2 mM L-글루타민의 존재 하에서 배양하는 경우, 상기 조건은 야생형 균주가 정상적으로 성장할 수 있는 조건임에도 불구하고, 인간 대식세포 내에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 돌연변이체의 성장은 관찰되지 않았다. 인간 대식세포를 2 mM L-글루타민을 함유하는 표준 조직 배양 배지 중에서 배양하는 경우, 인간 대식세포 중에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 돌연변이체의 성장은 불량하였다. 그러나, 야생형 균주와 유사한 세포내 성장은 대식세포를 과량의 L-글루타민(10 mM) 중에서 배양하는 경우 달성되었다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 돌연변이체는 폐결핵의 기니 피그 모델에서 매우 약독화되었다.

B. BCG Tice trpD

BCG Tice trpD 유전자는 대립유전자 교환에 의해 파괴하였다. 대립유전자 교환 기질은 PCR 방법을 이용하여 생성하였는데, 이때 588 bp 결실부를 보유하는 BCG Tice trpD 유전자좌가 생성되었으며, Km^r 카세트가 결실 부위에 삽입되었다. 이 돌연변이된 대립유전자는 대립유전자 교환 벡터 pEX2(녹색 형광 단백질을 코딩하는 gfpuv 유전자가 시토신 데아미나제를 코딩하는 이 콜라이 codBA 오페론으로 대체된 pEX1의 유도체)로 클로닝하여 pEX2 ΔtrpD::Km^r을 생성하였다(Tullius, M. V., G. Harth 및 M. A. Horwitz. 2003). 글루타민 신세타제(GlnA1)는 인간 대식세포 및 기니 피그 내에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 성장을 위해 필수적이다(Infect. Immun. Vol. 71: 7).

pEX2 ΔtrpD::Km^r은 전기천공에 의해 BCG Tice 내로 도입하고, 형질전환체는 허용 온도(32℃)에서 50 ㎍/mL의 하이그로마이신을 함유하는 7H11 상에서 선별하였다. 수집한 형질전환체는 허용 온도에서 약 10세대 동안 10 ㎍/mL의 카나마이신 및 50 ㎍/mL의 L-트립토판을 함유하는 7H9-10% OADC-0.05% 트윈-80 브로스 배양액 중에서 성장시킨 후, 제한 온도(39℃)에서 2%(w/v) 수크로스, 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 50 ㎍/mL의 L-트립토판을 함유하는 7H10 상에서 평판배양하여 상동성 재조합을 수행한 클론을 선별하였다. 선별한 10개의 Km^r 클론 중 4개의 클론은 올바른 표현형(즉, Hyg^s 및 트립토판 영양요구주)을 보유하는 것으로 확인되었다. 순수 배양액을 확보하기 위해, 본 발명자들은 4개의 클론 중 하나를 저밀도로 평판배양하였으며, 단일 콜로니를 재분리하였다. 상기 균주의 초기 냉동 모액은 재분리한 클론으로부터 제조하였다. 상기 돌연변이체의 올바른 유전형은 서던 블롯 분석법으로 확인하였다.

BCG Tice trpD 균주는 트립토판 영양요구주이다. L-트립토판을 첨가하지 않은 7H11 평판 상에서는 성장이 관찰되지 않았다. 브로스 배양액 중에서, BCG Tice trpD 균주는 ≥10 ㎍/mL의 L-트립토판의 존재 하에서 야생형 균주와 유사한 속도로 성장하였다. 상기 균주는 3 ㎍/mL의 L-트립토판에서는 성장이 거의 2배로 느려졌으며, L-트립토판이 결핍된 배지 중에 희석하는 경우 생존력을 상실하였다. trpD 돌연변이체는, 인간 대식세포를 5 ㎍/mL의 트립토판(야생형 균주가 정상적으로 성장하는 조건)을 함유하는 표준 조직 배양 배지 중에서 배양하는 경우, 인간 대식세포 내에서 세포내 성장이 거의 없거나 전혀 없었다. 그러나, 야생형 균주와 유사한 세포내 성장은 조직 배양 배지에 100 ㎍/mL의 L-트립토판을 추가로 첨가하면 달성되었다. 상보성 분석은 BCG Tice trpD 유전자를 함유하는 플라스미드(pNBV1-trpD)로 BCG Tice trpD를 형질전환함으로써 수행하였다. 상기 플라스미드는 상기 돌연변이체에 야생형 성장 표현형을 회복시켜 주었다.

II. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 분비성 단백질을 과발현하는 생육 조절성 BCG(영양요구주)

A. BCG Tice glnA1 pSMT3-MTB30

플라스미드 pSMT3-MTB30은 전기천공에 의해 BCG Tice glnA1 내로 도입하고, 형질전환체는 50 ㎍/mL의 하이그로마이신, 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 20 mM의 L-글루타민을 함유하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 2개의 개별적인 하이그로마이신 및 카나마이신 내성 클론을 무작위로 선별하여, 50 ㎍/mL의 하이그로마이신, 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 20 mM의 L-글루타민을 함유하는 7H9 배지 중에서 배양하였다. 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 단백질의 발현 및 외부 수송은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 단백질 면역글로불린을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인하였다. BCG Tice glnA1 pSMT3-MTB30은 BCG Tice glnA1보다 배양액 1 ml당 ∼10-20배 더 많은 30 kDa 항원을 생산하는 것으로 확인되었다. BCG Tice glnA1 pSMT3-MTB30는 그의 모 균주 BCG Tice glnA1과 같이 글루타민 영양요구주이다.

B. BCG Tice trpD pSMT3-MTB30

플라스미드 pSMT3-MTB30는 전기천공에 의해 BCG Tice trpD 내로 도입하고, 형질전환체는 50 ㎍/mL의 하이그로마이신, 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 50 ㎍/mL의 L-트립토판을 함유하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 10개의 개별적인 하이그로마이신 및 카나마이신 내성 클론을 무작위로 선별하여, 50 ㎍/mL의 하이그로마이신, 50 ㎍/mL의 카나마이신 및 50 ㎍/mL의 L-트립토판을 함유하는 7H9-10% OADC-0.05% 트윈-80 브로스 중에서 배양하였다. 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 단백질의 발현은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 단백질 면역글로불린을 이용하는 면역블로팅에 의해 확인하였다. BCG Tice trpD pSMT3-MTB30은 대조용 BCG Tice 균주보다 배양액 1 ml당 ∼10-20배 더 많은 30 kDa 항원을 생산하는 것으로 확인되었다.

III. 약독화 BCG(비영양요구주) BCG Tice narG

BCG Tice narG 유전자(니트레이트 리덕타제 알파 서브유닛을 코딩함)는 대립유전자 교환에 의해 파괴하였다. 대립유전자 교환 기질은 PCR 방법을 이용하여 생성하였는데, 이때 2952 bp 결실부를 보유하는 BCG Tice narG 유전자좌가 생성되었으며, Km^r 카세트가 결실 부위에 삽입되었다. 이 돌연변이된 대립유전자를 대립유전자 교환 벡터 pEX2(gfpuv 유전자가 이 콜라이 codBA 오페론으로 대체된 pEX1의 유도체)로 클로닝하여 pEX2 ΔnarG::Km^r을 생성하였다(Tullius, M. V., G. Harth 및 M. A. Horwitz. 2003). 글루타민 신세타제(GlnA1)는 인간 대식세포 및 기니 피그 내에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 성장을 위해 필수적이다(Infect. Immun. Vol. 71: 7).

pEX2 ΔnarG::Km^r은 전기천공에 의해 BCG Tice 내로 도입하고(2001년 12월 13일), 형질전환체는 허용 온도(32℃)에서 50 ㎍/mL의 하이그로마이신 및 50 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 7H11 아가 상에서 선별하였다. 수집한 형질전환체는 허용 온도에서 약 30세대 동안 카나마이신 10 ㎍/mL를 함유하는 7H9-10% OADC-0.05% 트윈-80 브로스 배양액 중에서 성장시킨 후, 제한 온도(39℃)에서 2%(w/v)의 수크로스 및 10 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 7H10 아가 상에서 평판배양하여 상동성 재조합을 수행한 클론을 선별하였다. 선별한 8개의 Km^r 클론 모두는 올바른 표현형(즉, Hyg^s)을 보유하는 것으로 확인되었다. 순수 배양액을 확보하기 위해, 본 발명자들은 8개의 클론 중 하나를 저밀도로 평판배양하여, 단일 콜로니를 재분리하였다. 상기 균주의 초기 냉동 모액은 재분리한 클론으로 제조하였다. 상기 돌연변이체의 올바른 유전형을 서던 블롯 분석법으로 확인하여 상기 돌연변이체에는 전장 narG가 결여되어 있음을 입증하였다.

상기 narG 돌연변이체는 평판 상에서, 브로스 배양액 중에서, 대식세포의 세포 내에서 정상적으로 성장하였다. 그러나, 다른 곳에서 생성된 BCG narG 돌연변이체는 면역결핍 SCID 마우스 모델에서 모 BCG 균주와 비교하여 매우 약독화되는 것으로 보고되었다(Weber, I., Fritz, C., Ruttkowski. S., Kreft, A., and F. C. Bang. 2000. Anaerobic nitrate reductase(narGHJI) activity of Mycobacterium bovis BCG in vitro and its contribution to virulence in immunodeficient mice. Mol. Microbiol. 35 (5): 1017-1025). 따라서, narG 돌연변이 균주는 SCID 마우스 내에서 유사하게 약독화될 것이며, 또한 면역저하 상태의 인간에서도 약독화될 것으로 생각된다.

IV. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 분비성 단백질을 과발현하는 약독화된 BCG(비영양요구주)

BCG Tice narG pSMT3-MTB30

플라스미드 pSMT3-MTB30을 BCG Tice narG에 전기천공하고, 형질전환체를 50 ㎍/mL의 하이그로마이신과 10 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 7H11 아가에서 선별하였다. 5개의 개별적인 하이그로마이신과 카나마이신 내성 클론을 무작위 선별하고, 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유하는 7H9-10% OADC-0.05% TWEEN-80 배지에서 배양하였다.

재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 단백질의 발현은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 단백질 면역글로불린을 이용한 면역블로팅으로 확인하였다. BCG Tice narG pSMT3-MTB30은 대조 그룹 BCG Tice 균주보다 배양액 mL당 ∼10-20배 더 많은 30 kDa 항원을 생산하는 것으로 확인되었다.

전술한 방법을 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법과 함께 사용하면, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32(A) kDa 주요 세포외 비융합 단백질, 16 kDa 주요 세포외 비융합 단백질, 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질, 및 기타 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 재조합-BCG 균주들(영양요구주와 비영양요구주 모두)을 제조할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 유사한 방법론을 마이코박테리움 래프리 주요 세포외 비융합 단백질(마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질의 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질 동족체(a.k.a. 항원 85B), 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32(A) kDa 주요 세포외 비융합 단백질의 마이코박테리움 래프리 32(A) kDa 주요 세포외 비융합 단백질 동족체(a.k.a. 항원 85A), 및 기타 마이코박테리움 래프리 주요 세포외 비융합 단백질을 포함하나 이로 제한되지 않음)을 발현하는 재조합 BCG 균주를 제조하는 데 사용할 수 있다. 또한, 유사한 방법론을 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질의 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질 동족체(a.k.a. 항원 85B), 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32(A) kDa 주요 세포외 단백질의 마이코박테리움 보비스 32(A) kDa 주요 세포외 비융합 단백질 동족체(a.k.a. 항원 85A), 및 기타 마이코박테리움 보비스 주요 세포외 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG를 제조하는 데 사용할 수 있다.

플라스미드와 형질전환체 제조를 위한 대표적인 방법들

요약하면, 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 30 kDa 비융합 단백질 유전자와 광범위한 측접 DNA 서열을 함유하는 큰 게놈 DNA 제한 단편을 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입함으로써, 플라스미드 pMTB30이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 그 자신의 프로모터(또는 임의의 비-열 충격 및 비-스트레스 단백질 유전자 프로모터)로부터 발현하도록 조작하였다. 이 플라스미드를 먼저 이 콜라이 DH5α로 도입하여, 다량의 재조합 플라스미드를 얻었다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 비융합 단백질을 발현할 수 없는 재조합 이 콜라이 균주를 250 ㎍/mL 하이그로마이신의 존재 하에 배양하고, 플라스미드 삽입체의 DNA 서열 전체를 결정하였다. 이 플라스미드를 6.25 kV/cm, 25 μF, 및 1000 mΩ의 조건을 이용한 전기천공으로 마이코박테리움 스멕마티스에 도입하여, 많은 수의 양성 형질전환체를 얻었다. 본 발명자는 50 ㎍/mL 하이그로마이신의 존재 하에 성장시킴으로써, 재조합 플라스미드의 존재를 확인하고, 재조합 30 kDa 비융합 단백질의 구성적 발현과 외부 수송을 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가의 고특이성 토끼 항-30 kDa 비융합 단백질 면역글로불린을 사용한 면역블로팅으로 확인하였다. 부가적으로, 본 발명자들은 N-말단 아미노산 서열 분석으로 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 비융합 단백질이 정확히 발현 및 가공되어 이의 천연 대응물과 구별이 불가능함을 확인하였다.

그 후 재조합 pSMT3 플라스미드 pMTB30를 마이코박테리움 보비스 BCG Tice에 6.25 kV/cm, 25 μF, 및 200 mΩ의 최적 전기천공 조건을 이용하여 도입하였다. 형질전환체를 2% 글루코스가 보충된 7H9 배지에서, 4시간 동안 37℃에서 쉐이커 내에서 항온처리하고, 그 후 20 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유하는 7H11 아가에 도말하였다. 형질전환체를 새로운 성장 배지로 계대 배양함에 따라 하이그로마이신의 농도는 50 ㎍/mL까지 점진적으로 증가시켰다. 재조합 BCG Tice 배양액은 7H9 배지가 50 ㎍/mL 하이그로마이신을 함유한다는 점을 제외하고는 야생형과 동일한 조건 하에 유지하였다.

재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 비융합 단백질의 발현과 외부 수송은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 다가 고특이성 토끼 항-30 kDa 비융합 단백질 면역글로불린을 사용한 면역블로팅으로 확인하였다. 전형적으로, 10개의 형질전환체 중 1개는 다른 형질전환체들보다 상당히 많은 양의 재조합 비융합 단백질을 발현하고 외부 수송시켰다; 이러한 형질전환체 중 2개를 선택하여, 이 형질전환체의 대규모 모액을 제조하고, 10% 글리세롤을 함유하는 7H9 배지내에서 -70℃에서 동결하였다. 이러한 형질전환체는 기니 피그에서 면역원성 조성물의 효능 연구시 사용하였다. 도 1a는 SDS-PAGE 젤과 면역블롯 상에서, 재조합 BCG Tice에 의한, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질의 발현을 보여준다. 코마시 블루로 염색된 젤과 면역블롯 상에서, 이 재조합 균주는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 야생형보다 더 많이 발현하였다.

다음으로, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG 코노트 균주(rBCG30 Conn)를 전술한 pMTB30 플라스미드를 사용하여, 재조합 BCG Tice(rBCG30 Tice)에 대해 전술한 것과 유사하게 제조하였다. 50 ㎍/mL 농도로 하이그로마이신을 함유하는 배지 중에, 재조합 BCG Tice 균주에 대해 기재한 것과 동일한 조건 하에 두었다. 도 1b는 SDS-PAGE 젤과 면역블롯 상에서, 재조합 BCG 코노트에 의한, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질의 발현을 나타낸다. 코마시 블루로 염색된 젤과 면역블롯 상에서, 이 재조합 균주는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 야생형보다 더 많이 발현하였다.

부가적으로, 플라스미드 pNBV1과 글루타민 신세타제 유전자인 glnA1 또는 세포외 단백질을 코딩하는 유전자에 바로 인접하는 상류 영역의 프로모터를 사용하는 rBCG 균주에서의 주요 세포외 단백질의 상대적인 발현을 모 BCG 균주와 비교하였다. 각각의 재조합 균주의 재조합 단백질의 면역블롯을 CreoScitex EverSmart Jazz 스캐너를 사용하여 디지털화하며, 단백질 밴드는 NIH 이미지 1.62 소프트웨어 프로그램을 사용하여 면적을 측정함으로써, 밀도 측정법으로 분석하였다. 이러한 재조합 단백질의 발현 수준을 표 8에 나타낸다.

재조합 균주 BCG의 플라스미드 안정성을 생화학적으로 평가하였다. 이 생화학적 분석은 하이그로마이신의 존재 하에, 재조합 BCG 균주의 배양액이 3개월의 성장 기간에 걸쳐 재조합 비융합 단백질의 발현을 일정한 수준으로 유지함을 확인하였다. 하이그로마이신의 부재 하에, 동일한 배양액은 비융합 단백질을 단지 약간 적게 발현함을 보여주는데(세포를 기준을 한 것임), 이는 재조합 플라스미드가 안정적으로 유지되며, 선별 압력없이 성장하는 박테리아에서도 단지 매우 점진적으로 소실된다는 것을 나타낸다(도 1a 및 도 1b, 레인 3).

플라스미드 pNBV1과 글루타민 신세타제 유전자인 glnA1에 바로 인접하는 상류 영역의 프로모터를 사용하여 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 단백질을 발현하는 본 발명의 다양한 재조합 BCG 균주의 안정성을 조사하였다. rBCG30 Tice II, rBCG23.5 Tice I, 및 rBCG30/23.5 Tice I에 의한 30 kDa 및/또는 23.5 kDa 단백질의 발현은 플라스미드의 양성 선별을 위해 하이그로마이신을 함유하는 배지에서, 적어도 3개월 동안 연속하는 동안(약 30 세대) 안정하였다. 또한, 하이그로마이신이 결여된 배지에서 1개월 동안(약 10 세대) 배양한 균주의 배양액에서는 발현 수준이 감소되지 않았다. 그러나, 하이그로마이신의 부재 하에 연속 배양한지 6개월 이후에는(약 60 세대), rBCG30 Tice II에 의한 30 kDa 단백질의 발현이 크게 감소하였으며, rBCG30/23.5 Tice I에 의한 30 kDa과 23.5 kDa 단백질의 발현은 검출 불가능한 수준으로 감소하였다. rBCG23.5 Tice I에 의한 23.5 kDa 단백질의 발현만이 높게 유지되었다. 2가지 균주에서의 발현 감소는 배양액 중의 높은 비율(%)의 세포들로부터 플라스미드가 소실하기 때문인 것으로 확인되었다(하이그로마이신의 존재 및 부재 하에 7H11 평판에 균주를 평판배양함으로써 측정함). rBCG23.5 Tice I은 플라스미드의 소실을 보이지 않았으며(약 100%의 세포들이 하이그로마이신 내성이었음), 이는 하이그로마이신의 부재 하에 6개월 배양한 이후에도 여전히 높은 수준으로 발현된다는 것과 일관된다.

부가적으로, 플라스미드 pNBV1과 세포외 단백질을 코딩하는 유전자에 바로 인접하는 상류 영역의 프로모터를 이용하여 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 보비스, 및 마이코박테리움 래프리 주요 세포외 단백질을 발현하는, 신규한 재조합 BCG 균주의 안정성도 조사하였다. 재조합 단백질, 즉, 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 30, 23.5, 및 32A kDa 주요 세포외 단백질, 및 마이코박테리움 보비스와 마이코박테리움 래프리의 30 kDa 주요 세포외 단백질의 발현은 하이그로마이신(플라스미드 pNBV1의 양성 선별 마커임)을 함유하거나 이것이 결여된 배지에서 적어도 12개월 동안의 연속 배양 동안 안정하였다(∼120 세대). 플라스미드의 소실은 검출되지 않았다.

이들 실험은 다양한 재조합 균주가 재조합 단백질의 발현 수준과 관련하여 넓은 범위의 안정성을 나타내었음을 보여준다. 아마도 재조합 단백질의 발현과 분비가 박테리아 세포의 대사 상태와 상응하는 내인성 단백질의 발현과 균형이 맞춰지도록, 재조합 단백질의 발현 수준이 시간이 경과함에 따라 전형적으로 다소 감소하긴 하지만, 일반적으로, 이들의 내인성 프로모터 영역에 융합된 재조합 단백질의 코딩 DNA 서열을 함유하는 플라스미드는 적어도 12개월 동안 재조합 단백질을 꽤 안정적으로 발현한다. 대조적으로, 이종성 glnA1 프로모터가 재조합 단백질의 발현을 이끌어내는 경우의 플라스미드를 함유하는 균주는 시간이 경과함에 따라 발현 안정성에 있어 큰 변화성을 나타낸다. 재조합 단백질이 전술한 균주에서 발현된 것과 동일하다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 발현에 있어서의 변화성은 명백하게 프로모터 서열과 상관관계가 있다.

본 발명의 면역원성 조성물의 안전성과 효능을 테스트하기 위한 대표적인 방법들

성공적인 면역원성 조성물 제조에 이어, 본 발명의 면역원성 조성물에 대해 동물 모델을 이용하여 그 안전성과 효능을 테스트하였다. 이 연구는 기니 피그를 사용하는데, 이는 기니 피그 모델이 인간 결핵과 임상적으로, 면역학적으로, 또 병리학적으로 특히 연관되어 있기 때문이다. 마우스 및 래트와는 다르나, 인간과는 유사하게, 기니 피그는 a) 소량의 에어로졸화된 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 대해 감수성이 있으며; b) 투베르쿨린에 대해 강한 피부 DTH를 나타내고; c) 폐손상시 건락화와 랑한스 거대 세포를 나타낸다. 그러나, 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 감염된 면역적격성 인간의 약 10%만이 생애 동안 활동성 질병으로 발전시키는 반면(절반은 노출 초기에 절반은 잠복 기간 이후에), 감염된 기니 피그는 항상 초기에 활동성 질병을 발전시킨다. 기니 피그는 이러한 점에서 인간과 상이하나, 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의해 감염된 이후 활동성 질병을 발전시킨다는 점에서는 일치하여, 면역원성 조성물의 유효성 시험에 있어 유용하다.

본 발명의 교시에 따라 제조된 면역화 접종물은 대수 성장기의 야생형 또는 재조합 BCG 배양액으로부터 분리된 분액으로부터 제조하였다("박테리아"). 각각의 박테리아 분액을 3,500 x g에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화한 후, 1 x 인산염 완충 염수(1 x PBS, 50 mM 인산나트륨 pH 7, 150 mM 염화나트륨)로 세척하였다. 그 후, 면역화 접종물을 1 x PBS ml당 1 x 10⁴ 콜로니 형성 유닛의 최종 농도로 재현탁하였으며, 100 ㎕당 1,000개의 생존 박테리아를 함유하였다.

특정 병원체가 없는 250-300 g의 이계교배된 하틀리(Hartley) 계통의 수컷 기니 피그(챨스 리버 브리딩 래보러토리즈에서 입수)를 9 마리를 한 그룹으로 하여, 이하 중 하나를 피내 주사하여 면역화하였다: 1) BCG 코노트[10³ 콜로니 형성 유닛(CFU)] 단지 한번(시간 0주); 2) rBCG30 코노트(10³ CFU) 단지 한번(시간 0주); 3) 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질(r30), 100 ㎕의 Syntex 면역증강제 제제(SAF) 중 100 ㎍, 3주 간격으로 3번(시간 0, 3, 및 6주); Pluronic L121, 스쿠알란, 및 Tween 80으로 구성된 SAF, 1차 면역화시에는 알라닐 무라밀 디펩티드; 및 4) SAF 단독(100 ㎕)(가성 면역화), 3주 간격으로 3번(시간 0, 3, 및 6주). 3 마리로 구성된 추가 그룹의 동물을 SAF 단독(100 ㎕)으로 가성 면역화하고, 피부 테스트 대조 그룹으로 이용하였다. 이들과 3∼6 마리의 다른 가성 면역화 동물들은 항원 공격 실험시 비감염된 대조 그룹으로서 이용되었다.

단독 면역화(BCG 및 rBCG30 그룹) 또는 1차 면역화(r30 그룹 및 가성 면역화 피부 테스트 그룹) 9주 이후, 기니 피그의 등을 면도하고, 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 10 ㎍의 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질(r30)을 피내 주사하였다. 24시간 후, 홍반과 경결의 직경을 측정하였다. (항원 공격 연구에 사용되는 동물과 별개의 그룹의 가성 면역화 동물을 피부 테스트에 사용하였다. 항원 공격 연구에 사용되는 가성 면역화 동물의 경우, 피부 테스트 자체가 결과에 영향을 줄 가능성을 배제하기 위해, 피부 테스트를 하지 않았다).

1차 또는 단독 면역화 9주 후와 피부 테스트 직후, 동물을 1 x 10⁵ 콜로니 형성 단위(CFU)의 마이코박테리움 튜버쿨로시스를 함유하는 10 ml의 단일 세포 현탁액으로부터 생성된 에어로졸로 항원 공격하였다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 균주(ATCC 35801)를 병독성을 유지하도록 이계교배 기니 피그를 통해 계대하여 7H11 아가에서 배양하고, 약하게 초음파 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻어, 동물 항원 공격 실험에서 사용하기 위해 -70℃에서 동결하였다. 항원 공격 에어로졸 투여량은 각각의 동물의 폐에 ∼40개의 생 간균을 송달하였다. 공기에 의한 감염 경로가 폐결핵의 자연 감염 경로이기 때문에 이 경로를 이용하였다. 대조 그룹 동물의 100%에서 상대적으로 짧은 시간 이내에(10주) 측정 가능한 임상적 질환을 유도하기 위해 다량의 투여량을 이용하였다. 그 후, 기니 피그를 층류형의 바이오해저드 안전 보관대(enclosure) 내에 포함된 스테인레스 스틸 케이지에 개체별로 수용하고, 표준 실험실 사료와 물은 자유롭게 먹을 수 있게 해주었다. 이 동물들에 대해 질환을 관찰하고, 10주 동안 매주 체중을 측정한 후 안락사시켰다. 각각의 동물의 우측 폐와 비장을 적출하여 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 CFU를 위해 배양하였다.

2가지 실험 각각에서, 가성 면역화 동물과 야생형 BCG로 면역화된 동물은 재조합 30 kDa 마이코박테리움 튜버쿨로시스 주요 세포외 비융합 단백질(r30)로 테스트시, 홍반과 경결이 거의 나타나지 않거나 전혀 나타나지 않았다. 대조적으로, r30 또는 rBCG30으로 면역화된 동물은 두드러진 홍반과 경결을 나타냈으며, 이는 가성 면역화 또는 야생형 BCG 면역화 동물에서보다 유의적으로 높은 것이었다(표 1 및 도 2).

2가지 실험의 각각에서, 비감염된 대조 그룹은 항원 공격 이후 일반적으로 체중이 증가하였으며, rBCG30 또는 야생형 BCG로 면역화된 동물에서도 그러하였다(도 3). 실제로, 3 그룹 중에서 체중 증가에는 유의적인 차이가 없었다. 대조적으로, 가성 면역화 동물과 더 적은 정도로 r30 면역화된 동물은 실험 과정에 걸쳐 감소된 체중 증가를 나타내었다(표 2 및 도 3). 따라서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스로의 항원 공격 이후, BCG와 rBCG30 모두 동물을 체중 손실로부터 완벽하게 보호하며, 이러한 체중 손실은 인간에게 있어서 결핵의 주요 물리적 신호이며 임상 감염성 질병의 기니 피그 모델에서 결핵의 특징이다.

2가지 실험 각각에서, 10주의 관찰 기간 종반부에, 기니 피그를 안락사시키고, 각각의 동물의 우측 폐와 비장을 무균 적출하여, 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 CFU를 분석하였다. 가성 면역화된 동물은 폐와 비장에 가장 많은 박테리아를 보유하고 있었다(표 3 및 도 4a 및 도 4b). r30으로 면역화된 동물은 가성 면역화 동물보다 폐와 비장에 더 적은 미생물을 가졌고; BCG로 면역화된 동물은 r30으로 면역화된 동물보다 더 적은 미생물을 가졌으며; 두드러진 점은, rBCG30으로 면역화된 동물은 BCG로 면역화된 동물보다 더 적은 미생물을 가졌다는 것이다. 평균을 비교하기 위한 2원 배치 분산 분석법(two way factorial analysis)을 이용한 통계 검정은 실험 1에서의 4개의 "처리" 그룹(가성, r30, BCG, 및 rBCG30)의 평균이 실험 2에서의 4개의 처리 그룹의 평균과 유의적으로 다르지 않았으므로, 두 실험에서의 데이타를 조합하는 것이 적절하였음을 입증하였다. 조합된 데이타를 표 4와 도 3에 나타낸다. 가장 흥미롭고 중요한 것은 rBCG30으로 면역화된 동물이 BCG로 면역화된 동물보다 폐에서는 0.5 log만큼 적은 미생물을, 비장에서는 1 log만큼 적은 미생물을 보유하였다는 것이다. 통계 분석시, 평균을 비교하기 위해서는 분산 분석법을, 통계적 유의성을 평가하기 위해서는 터키-피서(Tukey-Fisher) 최소 유의성 차이(least significant difference, LSD) 기준을 이용하였을 때, 폐와 비장 모두에서 4 그룹 각각의 평균은 서로의 각각의 평균과 유의적으로 달랐다(표 4). rBCG30으로 면역화된 동물과 BCG로 면역화된 동물 간의 차이는 폐에서는 p=0.02에서 유의적이며, 비장에서는 p=0.001에서 유의적이었다. 총체적인 점검시, 폐에서의 CFU의 차이를 대등하게 하였을 때, rBCG30으로 면역화된 동물의 폐는 BCG로 면역화된 동물보다 폐 손상이 적게 일어났다(20±4% 대 35±5%, 평균±SE).

따라서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 재조합 BCG의 투여는 감수성이 큰 폐 결핵의 기니 피그 모델에서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 에어로졸 항원 공격에 대해 고도의 방어 효과를 유도하였다. 대조적으로, 이하의 실시예에서 기술하는 바와 같이, BCG와 함께 면역증강제로서, 동일한 마이코박테리아 세포외 비융합 단백질(마이코박테리움 튜버쿨로시스 재조합 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질)을 투여하는 것은 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 에어로졸 항원 공격에 대해 고도의 방어 효과를 유도하지 못하며; 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스멕마티스의 투여시에도 그러하고; BCG와 거의 동일한 크기이고, BCG와 같이 60-90일에 걸쳐 단백질을 천천히 방출하는 미세구로 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 투여한 경우에도 그러하며; 리포좀 내에 캡슐화된 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 투여한 경우에도 그러하다.

본 발명의 매우 놀라운 점은 야생형이 내인성인 고도로 상동성인 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현하고 분비함에도 불구하고, rBCG30 균주가 야생형 BCG보다 더 뛰어난 방어를 유도한다는 것이다(도 1 참조). 아주(substrain) BCG 코노트 유래의 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자는 서열 분석되지 않았다. 그러나, 이들 아주의 클로닝된 유전자의 서열로부터 추론된, 2가지의 다른 아주 BCG의 30 kDa 단백질의 서열은 마이코박테리움 튜버쿨로시스 단백질과 단지 하나의 아미노산(BCG Paris 1173 P2) 또는 2개의 부가적인 아미노산을 포함하여 5개의 아미노산만이 상이하다(BCG Tokyo). (p. 3041-3042, Harth, G., B.-Y. Lee, J. Wang, D. L. Clemens, 및 M. A. Horwitz. 1996. Novel insights into the genetics, biochemistry, and immunocytochemistry of the 30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 64: 3038-3047 참조, 전체 내용은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함됨). 따라서, 재조합 균주의 개선된 방어 효과가 재조합 단백질과 내인성 단백질 간의 적은 아미노산 차이로 인한 것일 가능성은 없어 보인다. 이보다는, 내인성 단백질과 비교시 재조합 비융합 단백질의 개선된 발현에 기인할 것으로 보인다. 만약 그렇다면, 높은 카피수를 가지는 플라스미드를 사용하여 발현을 많이 하도록 하는 것이 재조합 면역원성 조성물의 성공에 있어 중요한 인자로 여겨진다.

제3 실험으로, 특정 병원체가 없는 이계교배된 250-300 g의 하틀리 계통의 수컷 기니 피그(챨스 리버 브리딩 래보러토리즈에서 입수)를 9 마리를 한 그룹으로 하여, 이하 균주 중 하나를 10³ CFU로 피내 주사하여 면역화하였다:

A 그룹: BCG Tice 모 대조 그룹

B 그룹: rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)

C 그룹: rBCG30 TiceII(pNBV1-pglnA1-MTB30)

D 그룹: rBCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA1-MTB23.5)

E 그룹: rBCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglnA1-MTB30/23.5)

F 그룹: rBCG30 Tice II(pNBV1-pglnA1-MTB30) 및 rBCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA1-MTB23.5)(각각의 균주 5 x 10²).

추가적으로, 18 마리의 동물을 이하와 같이 완충액으로만 가성 면역화하였다:

G 그룹: 12 마리의 가성 동물(단지 이후의 항원 공격용임) 및 H 그룹: 6 마리의 가성 동물(단지 피부 테스트용임).

면역화 9주 후, 상기 A-F 그룹 각각에서 9 마리의 기니 피그와 가성 H 그룹에서 6 마리의 동물의 등을 면도하고, 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 10 ㎍의 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 피내 주사하였다. r23.5를 발현하는 균주로 면역화된 동물(A 그룹, D 그룹, E 그룹, F 그룹)과 H 그룹의 6 마리의 가성 동물에 대해 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 10 ㎍의 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 사용하여 추가적으로 피부 테스트를 하였다. 24시간 후, 홍반과 경결의 직경을 측정하였다. (항원 공격 연구에 사용되는 동물과 별개 그룹의 가성 면역화 동물을 피부 테스트에 사용하였다. 항원 공격 연구에 사용된 가성 면역화 동물의 경우, 피부 테스트 자체가 결과에 영향을 줄 가능성을 배제하기 위해, 피부 테스트를 하지 않았다).

표 9에 요약된 결과는 모 BCG Tice 균주로 면역화된 동물(A 그룹)과 가성 면역화 동물(H 그룹)이 r30 또는 r23.5로 테스트시 홍반과 경결을 거의 또는 전혀 나타내지 않았음을 보여준다. 대조적으로, r30을 발현하는 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물은 r30에 반응하여 두드러진 홍반과 경결을 나타내었는데, 이는 BCG Tice 또는 가성 면역화 동물에서보다 유의적으로 높은 것이었다. 유사하게, r23.5를 발현하는 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물은 r23.5에 반응하여 두드러진 홍반과 경결을 나타내었는데, 이는 BCG Tice 또는 가성 면역화 동물에서보다 유의적으로 높은 것이었다. 또한, r30과 r23.5 모두를 발현하는 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물은 이들 단백질 모두에 반응하여 두드러진 홍반과 경결을 나타내었는데, 이는 BCG Tice 또는 가성 면역화 동물에서보다 유의적으로 높은 것이었다. 마지막으로, 동시에 2가지의 상이한 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물(하나는 r30을 발현하고, 다른 하나는 r23.5을 발현함)은 이들 단백질 모두에 반응하여 두드러진 홍반과 경결을 나타내었는데, 이는 BCG Tice 또는 가성 면역화 동물에서보다 유의적으로 높은 것이었다.

흥미롭게도, 신규한 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물(C 그룹, D 그룹, E 그룹 및 F 그룹)(이 모두는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 glnA1 유전자의 상류 영역에서 유래된 프로모터를 사용하여 재조합 단백질을 발현함)은 rBCG30 Tice I 균주로 면역화된 동물(30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 유전자의 상류 영역에서 유래된 프로모터를 사용하여 r30을 발현함)보다 r30에 대해 더 많은 홍반과 경결을 나타내지 않았다.

면역화 9주 후에 그리고 피부 테스트 직후에, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 5 x 10⁴ 콜로니 형성 단위(CFU)를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 형성된 에어로졸로 A-G 그룹의 모든 동물을 항원 공격하였다. (항원 공격 이전에, 항원 공격 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 균주[ATCC 35801]를 이계교배된 기니 피그를 통해 계대 배양하여 병독성을 유지하고, 7H11 아가에서 배양하고, 가볍게 초음파 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, -70℃에서 동결하였다). 이 에어로졸 투여량은 각 동물의 폐에 ∼20개의 생 간균을 전달하였다. 공기에 의한 감염 경로는 폐 결핵에 대한 자연 감염 경로이기 때문에, 이 경로를 이용하였다. 비교적 단시간(10주) 내에 대조 그룹 동물의 100%에서 측정 가능한 임상적 질병을 유도할 수 있도록 다량을 사용하였다. 이후, 층류형의 바이오해저드 안전 보관대 내에 놓여 있는 스테인레스 스틸 케이지에 개체별로 기니 피그를 수용하고, 표준 실험실 사료 및 식수에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 동물을 질병에 대해 관찰하고, 10주 동안 매주 체중을 측정한 다음, 안락사시켰다. 각 동물의 우측 폐와 비장을 적출하여, 37℃, 5% C0₂-95% 공기 분위기에서 2주 동안 Middlebrook 7H11 아가에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 CFU를 위해 배양하였다.

폐 및 비장에서의 CFU 분석 결과는 표 10에 제시되어 있다. 이들 결과는, BCG 또는 임의의 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물이 가성 면역화된 동물에서보다 폐 및 비장에서의 CFU가 휠씬 낮다는 것을 보여준다. 중요한 점은, 임의의 재조합 BCG 균주로 면역화시킨 동물은 BCG Tice 모 균주로 면역화시킨 동물에서보다 폐 및 비장에서 CFU가 낮다는 것이다. 그러나, 본 실험에서 테스트된 재조합 균주 중 rBCG30 Tice I보다 우수한 것은 없었다.

제4 실험에서는, 특정 병원체를 포함하지 않는 250∼300 g의 이계교배된 하틀리 계통의 기니 피그(챨스 리버 브리딩 래보러토리즈에서 입수) 수컷을 6 마리 한 그룹으로 하고, 하기 균주 중 하나를 10³ CFU로 피내 면역화하였다.

I 그룹: BCG Tice 모 대조 그룹

J 그룹: rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)

K 그룹: rBCG30 Tice III(pNBV1-MTB30)

L 그룹: rBCG23.5 Tice II(pNBV1-pMTB23.5)

M 그룹: rBCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)

N 그룹: rBCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)

O 그룹: rBCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A).

P 그룹: 완충액만으로 가성 면역화됨(6 마리의 동물)

면역화 9주 후에, 상기 I-P 그룹의 기니 피그의 등을 면도하였다. r30을 발현하는 균주로 면역화시킨 동물(I 그룹, J 그룹, K 그룹, M 그룹 및 N 그룹)과 P 그룹의 6 마리의 가성 면역화된 동물에게, 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질 10 ㎍을 피내 주사하였다. r23.5를 발현하는 균주로 면역화시킨 동물(L 그룹, M 그룹, N 그룹)과 P 그룹의 6 마리의 가성 면역화된 동물을, 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 주요 세포외 단백질 10 ㎍로 피부 테스트하였다. r32A를 발현하는 균주를 주사한 동물(O 그룹)과 P 그룹의 6 마리의 가성 면역화된 동물을, 100 ㎕ 인산염 완충 염수 중 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32A kDa 주요 세포외 단백질 10 ㎍로 피부 테스트하였다. 24 시간 후에, 홍반 및 경결의 직경을 측정하였다.

표 11에 요약된 바와 같이, 이 결과로부터 BCG Tice 모 균주로 면역화된 동물(A 그룹)은 r30으로 테스트시 홍반 및 경결을 나타내지 않지만, 재조합 30 kDa 단백질을 발현하는 균주로 면역화된 동물(J 그룹, K 그룹, M 그룹, N 그룹)은 현저한 홍반 및 경결을 나타낸다는 것이 확인된다. 또한, rBCG30 Tice I보다 더욱 풍부하게 r30을 발현하고 30 kDa 단백질 유전자의 상류 영역으로부터 유도된 프로모터를 이용하는 균주로 면역화된 동물(K 그룹, M 그룹 및 N 그룹)에서는, rBCG30 Tice I로 면역화된 동물과 비교하여, 홍반보다 피부 지연형 과민증의 더욱 확실한 지시자인 경결이 더 컸다. BCG 모 균주에는 없는 단백질인 r23.5를 발현하는 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물(L 그룹, M 그룹 및 N 그룹)은 r23.5에 반응하여 현저한 홍반 및 경결을 나타낸 반면, 가성 면역화된 동물은 r23.5에 반응하여 홍반은 거의 나타내지 않고 경결은 전혀 나타내지 않았다. r32A를 과발현하는 재조합 BCG 균주로 면역화된 동물(O 그룹)은 가성 면역화된 동물보다 32A kDa 단백질에 반응하여 휠씬 큰 홍반과 경결을 나타내었다.

또한, 면역화 10주 후에, I-P 그룹의 몇몇 기니 피그로부터 채혈하고, 정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30), 32A kDa 주요 세포외 단백질(r32A) 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질(r23.5)에 대해 혈청 항체 역가를 측정하였다. ELISA로 항체 역가를 분석하고, 각 동물에 대한 항체 역가 역수를 측정하였다. 도 6은 이들 결과를 그래프로 도시한다.

면역화된 동물이 감염으로부터 보호된다는 것을 입증하기 위해 고안된 제5 실험에서는, 특정 병원체를 포함하지 않는 250∼300 g의 이계교배된 하틀리 계통의 기니 피그(챨스 리버 브리딩 래보러토리즈에서 입수) 수컷을 6 마리 한 그룹으로 하고, 하기 균주 중 하나를 10³ CFU로 피내 면역화하였다.

I 그룹: BCG Tice 모 대조 그룹

J 그룹: rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)

K 그룹: rBCG30 Tice III(pNBV1-MTB30)

L 그룹: rBCG23.5 Tice II(pNBV1-pMTB23.5)

M 그룹: rBCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)

N 그룹: rBCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)

O 그룹: rBCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)

P 그룹: 항원 무함유 완충액으로 면역화된 12 마리의 가성 면역화 동물

면역화 9주 후에 그리고 피부 테스트 직후에, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 5 x 10⁴ 콜로니 형성 단위(CFU)를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 형성된 에어로졸로 I-P 그룹의 모든 동물을 항원 공격하였다. (항원 공격 이전에, 항원 공격 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 균주[ATCC 35801]를 이계교배된 기니 피그를 통해 계대 배양하여 병독성을 유지하고, 7H11 아가에서 배양하고, 가볍게 초음파 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, -70℃에서 동결하였다). 이 에어로졸 투여량은 각 동물의 폐에 ∼20개의 생 간균을 전달하였다. 공기에 의한 감염 경로는 폐 결핵에 대한 자연 감염 경로이기 때문에, 이 경로를 이용하였다. 비교적 단시간(10주) 내에 대조 그룹 동물의 100%에서 측정 가능한 임상적 질병을 유도할 수 있도록 다량을 사용하였다. 이후, 층류형의 바이오해저드 안전 보관대 내에 포함되어 있는 스테인레스 스틸 케이지에 개체별로 기니 피그를 수용하고, 표준 실험실 사료 및 식수에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 동물을 질병에 대해 관찰하고, 10주 동안 매주 체중을 측정한 다음, 안락사시켰다. 각 동물의 우측 폐와 비장을 적출하여, 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 CFU를 위해 배양하였다. 결과는 하기 표 12에 제시되어 있다.

[표 1]

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질에 대한 피부의 지연형 과민증

[표 2]

병독성 마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 균주로 에어로졸 항원 공격한 후의 순 체중 증가량

[표 3]

마이코박테리움 튜버쿨로시스 에드만 균주를 포함하는 에어로졸에 의해 항원 공격받은 동물의 폐 및 비장에서의 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 콜로니 형성 단위(CFU)

병행 실험 1 및 2

[표 4]

통계 분석(ANOVA)의 요약

폐 및 비장에서의 CFU

병행 실험 1 및 2

[표 5]

면역증강제 중 BCG 또는 BCG + 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 단백질로 면역화된 동물 또는 가성 면역화된 동물

[표 6]

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현하는 생 재조합 마이코박테리움 스멕마티스(rM. 스멕마티스 30)로 면역화된 동물

[표 7]

BCG와 대략 크기가 동일하고 BCG와 같이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 서서히 방출하는 미세구로 면역화된 동물

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 포함하는 리포좀으로 면역화된 동물

[표 8]

BCG Tice 재조합 균주에 의한 재조합 단백질의 발현

[표 9]

정제된 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30) 및 23.5 kDa 주요 세포외 단백질(r23.5)에 대한 피부 지연형 과민증(DTH)

[표 10]

에어로졸 항원 공격에 대한 방어 면역: 폐 및 비장에서의 CFU

[표 11]

[표 12]

에어로졸 항원 공격에 대한 방어 면역: 폐 및 비장에서의 CFU

하기 실시예는 본 발명의 신규한 측면을 예시하기 위한 것이다. 각 실시예는 본 발명의 면역원성 조성물과 긴밀하게 관련되어 있지만 상이한 방법들을 사용하여 본 발명의 면역원을 전달하는 수단을 예시한다. 구체적으로, 실시예 1은, 본 발명의 면역원이 BCG와 함께 투여되었지만 생체내에서 발현되지 않는 경우, 고도의 방어 면역이 실현될 수 없다는 것을 입증한다.

실시예 2는, BCG와 밀접하게 관련되어 있지만 포유류 숙주에서 복제할 수 없는 마이코박테리움 종을 사용하여 본 발명의 면역원을 생체내 발현하는 경우 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 유의적인 수준으로 유도하지 못한다는 것을 입증한다. 실시예 3 및 4는 합성 면역원성 조성물 미세담체에 의해 본 발명의 면역원의 방출이 느려지면 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 유의적인 수준으로 유도할 수 없다는 것을 입증한다.

실시예 5는 본 발명의 영양요구성 구체예를 투여하기 위한 대표적인 방법을 제공한다. 유사하게, 실시예 6은 본 발명의 비영양요구성 약독화 균주의 용도에 관하여 상세히 설명한다.

따라서, 하기 실시예는 본 발명의 세포내 병원체 면역원성 조성물이 감염성 질병 면역학 분야에 제공하는 완전히 놀랍고 주목할 만한 진보성을 강조하기 위한 것이다. 이들 실시예는 단지 예시용이며, 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.

실시예 1

BCG + 재조합 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)로 기니 피그를 면역화시키면 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 높은 수준으로 유도하지 않는다.

본 발명자들은 강력한 면역증강제(SAF; Syntex Adjuvant Formulation) 중의 BCG와 r30으로 기니 피그를 미리 면역화시켰다. r30 단백질(면역화 1회당 100 ㎍)을 3회 피내 투여하였다. 그 결과 r30에 반응하여 강한 피부 지연형 과민증(C-DTH)이 유도되었다(도 5). 실제로, C-DTH 반응은 r30을 발현하는 재조합 BCG에 의해 유도된 반응과 유사하였다. 그렇지만, BCG와 r30 모두를 이용한 면역화는 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 높은 수준으로 유도하지 않았다(표 5). BCG와 r30 모두로 면역화된 동물은 BCG만으로 면역화된 동물보다 폐 및 비장에서의 CFU의 수준이 낮지 않았다. 이 결과는 r30을 발현하는 재조합 BCG로 면역화된 동물이 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 항원 공격받은 경우 높은 수준의 방어 면역을 나타낸 상기 개시된 결과와는 정반대되는 것이다.

실시예 2

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 천연형과 구별할 수 없는 형태로 발현하는 생 재조합 마이코박테리움 스멕마티스로 기니 피그를 면역화시키면 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역이 높은 수준으로 유도되지 않는다.

본 발명자들은 BCG로 동물을 면역화시킨 동일한 실험들 중 한 실험에서, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 천연형과 구별할 수 없는 형태로 발현하는 생 재조합 마이코박테리움 스멕마티스로 기니 피그를 면역화시켰다. 마이코박테리움 스멕마티스에 의한 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)의 발현 및 분비는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현 및 분비하는 재조합 BCG 균주에서와 동일하거나 또는 더 높았다. 또한, 마이코박테리움 스멕마티스의 투여량인 10⁹ 박테리아는, 재조합 BCG(10³ 박테리아)의 투여량의 100만배로서, 동물 숙주에서의 마이코박테리움 스멕마티스의 증식 불량을 보상하는 것을 감안하더라도 너무 높았다. 추가로 보충하기 위해서도, 재조합 마이코박테리움 스멕마티스는 3회 피내 투여한 반면에, 재조합 BCG는 1회만 피내 투여하였다. r30 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스멕마티스로 면역화시키면 r30에 대한 강한 피부 지연형 과민(C-DTH) 반응이 유도되었다. 실제로, C-DTH 반응은 r30을 발현하는 재조합 BCG에 의해 유도되는 반응과 유사하거나 또는 더 컸다. 그렇지만, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현하는 생 재조합 마이코박테리움 스멕마티스는 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 높은 수준으로 유도하지 않았다(표 6). 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 발현하는 생 재조합 마이코박테리움 스멕마티스로 면역화시킨 동물은 BCG만으로 면역화시킨 동물에서보다 폐 및 비장에서 CFU 수준이 더 낮지 않았다. 이 결과는 r30을 발현하는 재조합 BCG로 면역화된 동물이 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 항원 공격받은 경우 방어 면역을 높은 수준으로 나타낸 상기 개시된 결과와는 정반대되는 것이다.

실시예 3

BCG와 대략 동일한 크기를 갖고 BCG와 같이 60∼90일에 걸쳐 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 서서히 방출하는 미세구로 기니 피그를 면역화시키면 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역이 높은 수준으로 유도되지 않는다.

rBCG30 및 BCG로 동물을 면역화시킨 동일한 실험들 중 한 실험에서, 본 발명자들은 BCG와 대략 동일한 크기를 갖고 BCG와 같이 60∼90일에 걸쳐 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질(r30)을 서서히 방출하는 미세구로 기니 피그를 면역화시켰다. 한 세트의 동물은 r30을 10 mg 포함하는 미세구로 1회 면역화시켰다. 다른 세트의 동물은 r30을 3.3 mg 포함하는 미세구로 3회 면역화시켰다. 이 양은 재조합 BCG 균주에 의해 발현되는 r30 단백질의 양을 크게 초과하도록 계산되었다. 미세구를 이용하는 방법으로 면역화시키면 r30에 대한 강한 피부 지연형 과민(C-DTH) 반응이 유도되었다. 실제로, 이 C-DTH 반응은 r30을 발현하는 재조합 BCG에 의해 유도된 반응과 유사하였다. 그렇지만, BCG와 대략 동일한 크기를 갖고 BCG와 같이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 서서히 방출하는 미세구에 의한 면역화는 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대항하는 방어 면역을 높은 수준으로 유도하지 않았다(표 7). 미세구로 면역화시킨 동물은 BCG만으로 면역화시킨 동물보다 폐 및 비장에서의 CFU 수준이 더 낮지 않았다. 이 결과는 r30을 발현하는 재조합 BCG로 면역화된 동물이 마이코박테리움 튜버쿨로시스로 항원 공격받은 경우 방어 면역을 높은 수준으로 나타낸 상기 개시된 결과와는 정반대되는 것이다.

실시예 4

마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 함유하는 리포좀을 사용한 기니 피그의 면역화는 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대하여 높은 수준의 방어를 유도하지 못한다.

실시예 3에서와 동일한 실험에서, 본 발명자들은 기니 피그를 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 함유하는 리포좀으로 면역화하였다. 이 동물들을 50 ㎍의 r30을 함유하는 리포좀으로 3회 면역화하였다. 이것은 r30에 대하여 약간 강한 피부 지연형 과민성(C-DTH) 반응을 유도하였다. 이 C-DTH 반응은 BCG 및 대조 그룹 리포좀에 의해 유도된 것보다 더 컸지만, r30을 발현하는 재조합 BCG에 의해 유도된 것보다는 작았다. 그러나, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 함유하는 리포좀을 사용한 면역화는 마이코박테리움 튜버쿨로시스에 의한 항원 공격에 대하여 높은 수준의 방어를 유도하지 못하였다(표 7). 마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 함유하는 리포좀으로 면역화한 동물은 BCG 만으로 면역화한 동물보다 폐 및 비장에서 낮은 수준의 CFU를 나타내지 않았다. 이 결과는, r30을 발현하는 재조합 BCG로 면역화한 동물들이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 항원을 투여하였을 때 높은 수준의 방어를 나타낸 전술한 결과와는 정반대의 결과이다.

실시예 5

생육 조절성 영양요구성 균주의 사용

생육 조절성 영양요구성 백신을 다음과 같이 사용한다. 면역저하자를 백신, 예를 들어 트립토판 영양요구성 BCG 균주로 면역화하였다. 이 사람에게 즉시, 영양요구주가 정상 수준으로 증식할 수 있고 결핵에 대한 높은 수준의 방어 면역을 유도할 수 있도록 충분히 많은 양의 트립토판을 식이 보충물로 제공하였다. 대부분의 사람에 있어, 재조합 BCG의 증식은 건강 문제를 야기하지 않는다. BCG는 적당한 수준으로 조직 내에서 증식하고 그 후 면역계에 의해 제거된다. 그러나 면역저하자의 경우, 박테리아 증식으로 인하여 산재성 질환 또는 기타 문제가 발생할 수 있다. 이러한 사람들은 즉시 식이 보충물을 중단하게 된다. 식이 보충물이 없을 경우, 영양요구주는 빨리 사멸하여 더 이상 건강 문제를 일으키지 않는다.

이 방법은 의료 관리를 쉽게 이용할 수 없는 개발도상국에서 특히 매력적인 방법이다. 면역화로부터 부작용이 없다면 비용이 많이 들고/들거나 입수가 용이하지 않은 건강 관리 시스템을 이용하거나 항생제를 입수할 필요가 없다. 단지 식이 보충물의 섭취만 중단하면 된다 - 능동적 개입이 아니라 수동적 개입임.

실시예 6

비영양요구성 약독화 균주의 사용

이러한 균주들을, BCG 백신의 통상적인 투여 방식으로, 즉 어떠한 식이 보충물도 없이 면역저하자에게 투여한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 세포내 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 완전히 새로운 방법을 제시한다. 일련의 제대로 계획된 실험 및 신중한 분석을 통해, 본 발명자들은, 본 발명의 교시에 따라 정확하게 선별된 세포내 병원체 또는 밀접한 관련성이 있는 종들을, 동일한 또는 상이한 세포내 병원체의 재조합 세포외 단백질을 발현하도록 형질전환시킬 경우에만 방어 면역이 유도된다는 것을 입증하였다.

본 발명은 또한 다수의 세포내 병원체에 대하여 동시에 진단적, 예방적 및 치료적 이익을 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이코박테리움 보비스와 같은 재조합 약독화 세포내 면역원성 조성물은 마이코박테리움 튜버쿨로시스 및 레지오넬라 종에 대하여 동시에 면역 방어성 면역원을 발현시키도록 고안될 수 있다. 그 결과, 면역원성 조성물의 전달 효율을 크게 높일 수 있다. 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 주요 세포외 단백질을 발현하는 재조합 BCG의 비제한적인 예는 본 발명의 완전한 실시 형태가 될 수 있을 뿐 아니라 의학 및 인류에 큰 진전을 가져다 줄 수 있다.

달리 나타내지 않는다면, 본 명세서 및 청구의 범위에서 사용된 분자량, 반응 조건 등과 같은 특성, 성분들의 양을 나타내는 모든 수에는 모든 경우에 있어 "약"이라는 용어가 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는다면, 명세서 및 첨부하는 청구의 범위에 기재된 수치 매개변수는 본 발명이 달성하고자 하는 소정의 특성들에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. 청구의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하고자 하는 것은 아니나, 각 수치 매개변수는 적어도 통상적인 반올림법에 의해 기록된 유의적인 숫자로 간주되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 기재하는 수치 범위 및 매개변수는 근사값이지만, 구체적인 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 기록된 것이다. 그러나 임의의 수치는 본래 그 개개의 테스트 측정에서 발견되는 표준 오차로부터 발생하는 특정한 오차를 반드시 포함하기 마련이다.

본 발명을 설명하는 데 있어서 사용된(특히 하기 특허청구의 범위에서 사용된) 단수의 표현 등은 본원에서 달리 명시하지 않는 한 단수의 표현과 복수의 표현을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용한 것은 단지, 그 범위 내에 속하는 각각의 값을 개별적으로 인용하는 것의 약기로서 사용된 것이다. 달리 나타내지 않는다면, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에 개별적으로 인용되는 것처럼 포함된다. 본원에서 기술한 모든 방법은 달리 나타내거나 정황상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제시된 임의의 모든 예, 또는 예시적 표현(예, 예컨대)은 단지 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명의 청구 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 본원에서 사용되는 어떠한 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 요소를 나타내려는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 개시된 대체 요소 및 구체예의 그룹화는 제한적으로 해석되어서는 안된다. 각 그룹의 구성 요소는 개별적으로, 또는 동일 그룹의 다른 구성 요소 또는 본원에 개시된 다른 구성 요소와 조합하여 인용되고 청구될 수 있다. 한 그룹의 하나 이상의 구성 요소는 편리성 및/또는 특허성을 이유로 그룹 내에 포함될 수도 있고 삭제될 수도 있다. 이러한 임의의 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 본원은 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어야 하며, 따라서 첨부한 특허청구의 범위에 사용된 모든 마커쉬 그룹의 기재 내용을 충족시킨다.

본 발명을 수행하기 위한 발명자들에게 공지된 최적 양태를 비롯하여 본 발명의 바람직한 구체예를 본원에 개시하였다. 물론, 당업자에게는 전술한 설명을 읽게 되면 이들 바람직한 구체예에 대한 변형예가 명백할 것이다. 본 발명자들은 당업자들이 이러한 변형예를 적절히 이용할 수 있을 것으로 예상하며, 또한 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술한 방식과는 다른 방식으로 실시될 수 있음을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용되는, 첨부한 특허청구의 범위에서 언급한 발명의 주제의 모든 변형예 및 균등예를 포함한다. 또한, 본원에서 달리 언급하거나 정황상 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명의 가능한 모든 변형예에서의 전술한 요소들의 임의의 조합도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 명세서 전반에서 특허공보, 간행물 등의 다양한 참고 문헌을 인용하였다. 상기 인용된 참고 문헌 및 간행물 각각은 그 전체가 개별적으로 참고로 포함된다.

끝으로, 본원에 개시한 본 발명의 구체예는 본 발명의 기술 사상을 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 모든 변형예도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 제한적인 것이 아니라 예로서 제시된 본 발명의 대안적인 구성도 본원의 교시 내용에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 제시되고 기술된 바로 그것에만 한정되는 것은 아니다.

본원에서 참고로 인용하는 추가 참고 문헌

Claims

23.5 kDa, 30 kDa, 32A kDa 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 바실 칼메트-게랭(Bacille Calmette-Guerine; BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 주요 세포외 단백질은 비융합 단백질인 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 상기 염색체외 핵산 서열은 다수의 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들을 갖는 유전자 구성체를 포함하며, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들은 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 동일한 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 상기 염색체외 핵산 서열은 다수의 마이코박테리아 주요 세 포외 단백질을 코딩하는 유전자들을 갖는 유전자 구성체를 포함하며, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들은 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 반대 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제1항, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질은 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; Mtb), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis; MB) 및 마이코박테리움 래프리(Mycobacterium laprae; ML)로 이루어진 군에서 선택되는 마이코박테리움 종으로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 튜버쿨로시스 32A kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 32A kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 비융합 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되며;

상기 유전자 구성체는 상기 Mtb 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 Mtb 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자들은 상기 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 동일한 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되며;

상기 유전자 구성체는 상기 Mtb 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 Mtb 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자들은 상기 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 반대 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 방어 면역 반응인 면역원성 조성물.
23.5 kDa, 30 kDa, 32A kDa 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
삭제
제15항에 있어서, 상기 주요 세포외 단백질은 비융합 단백질인 면역원성 조성물.
제15항에 있어서, 상기 염색체외 핵산 서열은 다수의 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들을 갖는 유전자 구성체를 포함하며, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들은 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 동일한 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제15항에 있어서, 상기 염색체외 핵산 서열은 다수의 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들을 갖는 유전자 구성체를 포함하며, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자들은 유전자 구성체 내에서 서로 에 대하여 반대 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제15항, 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이코박테리아 주요 세포외 단백질은 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb), 마이코박테리움 보비스(MB) 및 마이코박테리움 래프리(ML)로 이루어진 군에서 선택되는 마이코박테리움 종으로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스 32A kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 32A kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 비융합 단백질은 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 보비스 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 면역 반응이 유도되도록 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
프로모터 제어 하에 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 BCG를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 마이코박테리움 래프리 30 kDa 주요 세포외 단백질은 포유동물에서 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응이 둘 다 유도되도록 상기 재조합 BCG로부터 과발현되고 분비되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되며;

상기 유전자 구성체는 상기 Mtb 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 Mtb 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자들은 상기 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 동일한 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mtb) 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 갖는 유전자 구성체를 포함하는 염색체외 핵산 서열을 갖는 생육 조절성 재조합 바실 칼메트-게랭(BCG)을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 Mtb 30 kDa 주요 세포외 단백질 및 상기 Mtb 23.5 kDa 주요 세포외 단백질은 과발현되고 분비되며;

상기 유전자 구성체는 상기 Mtb 23.5 kDa 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 Mtb 30 kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자들은 상기 유전자 구성체 내에서 서로에 대하여 반대 방향으로 배향되는 것인 면역원성 조성물.
제15항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생육 조절성 재조합 BCG는 영양요구주이며, 트립토판 또는 글루타민이 상기 영양요구주의 생육을 조절하기 위해 사용되는 것인 면역원성 조성물.
제21항 내지 제23항 또는 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 방어 면역 반응인 면역원성 조성물.