JP2006501304A - 組換え型細胞内病原体免疫原性組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、健康および福祉部門からの研究助成金番号AI31338による政府の支援によりなされた。政府は、この発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、一般に、組換え型の弱毒化細胞内病原菌に由来する免疫原組成物に関する。より詳しくは、本発明は主要細胞外のタンパク質を過剰発現および分泌する組換え型の弱毒化ミコバクテリアを含む免疫原組成物に関する。さらに、本発明の免疫原組成物も、栄養要求性菌株を含む組換え型の弱毒化ミコバクテリアを含む。本発明の免疫原組成物は、宿主で免疫応答を誘発するにとって有用である。
動物に感染して疾患を起こしたり、しばしば死に至らしめる能力を寄生微生物が備えていると、長いあいだ認識されていた。病原体は、歴史全体にわたって主要な死因であり、計り知れない苦痛を負わせ続けている。ここ数百年の間、多くの感染症の予防および処置における劇的な進歩が見られたにも係わらず、治療的手段の普遍的な効果をいまだ制限している。多くの病原微生物によって示される複雑な浸潤メカニズムに対処する際の問題点は、細菌およびウイルスの薬剤抵抗性株が数多く出現していることと同様に、結核等の種々の疾患の再起によって明示されている。
これらの融合タンパク質をコードするDNAは、ミコバクテリア熱ショック・タンパク質およびストレス・タンパク質プロモータの制御下、染色体外プラスミドにある。開示された免疫原組成物は、該組成物に対する抗体産生を目的としてヒト以外の動物で免疫応答を引き出すことを意図したものであり、ほ乳類動物での細胞内病原体疾患を予防するために示されたものではない。そのうえ、’475号特許では、細胞外の非融合タンパク質を発現するためにタンパク質特異的なプロモータを使用する組換え型の免疫原組成物を開示されていない。
本発明は、ほ乳類動物における細胞内病原体疾患の診断、処置、予防、阻害、または緩和のための新たな部類の免疫原組成物および免疫療法剤と方法とを提供する。歴史的に、細胞内病原体免疫原組成物および免疫療法剤は、細胞内病原体自体または密接に関連した種から調製されていた。これらの昔ながらの免疫原組成物モデルは、完全な微生物またはそのサブユニットから構成されていた。例えば、第一に、また現在のところ入手可能な免疫原組成物は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に対して、近縁種である細胞内病原体ウシ型結核菌(M.bovis)から得た弱毒化生免疫原組成物である。近年では、本発明者は、増殖培地中に分泌される細胞内病原体の特異的な細胞外生産物が、個々のサブユニットまたは該サブユニットの組み合わせとして、ほ乳類動物で強力な免疫応答を引き出すために用いることができる。しかし、これらのサブユニット免疫原組成物は、ウシ型結核菌(M.bovis)に由来する原弱毒化免疫原組成物より優れているとは証明されなかった。
本明細書で用いられるように、「増殖制御可能な(growth regulatable)」とは、特定の栄養素が与えられた場合に増殖する栄養要求性微生物のことをいう。特定の栄養素は、免疫原組成物と同時投与または引き続いて免疫原組成物レシピエントに与えられる。
以下の詳細な説明、実施例、および添付された特許請求の範囲の理解を容易にするために、以下の定義に言及することは有用である。これらの定義は事実上非限定的であり、あくまでも読者に便宜を与えるだけである。
本発明は、一般に、同一種または別種の組換え型免疫原性抗原を発現および/または分泌する弱毒化または非病原性の組換え型細胞内病原体を含む免疫原組成物に関する。本発明の別の実施形態では、弱毒化細胞内病原体は、対立遺伝子の置換(allelic exchange)を介して弱毒化される。本発明の典型的な実施形態は、弱毒化または非病原性の組換え型BCGに基づいている。しかし、本発明は、組換え型BCGに限定されるものではない。
A.組換え型BCGタイス(Tice)(rBCG30タイス(Tice))
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa湯用細胞外非融合タンパク質を発現する組換え型BCGタイス(TICE)(rBCG30 Tice)は、以下のように調製した。プラスミドpMTB30(大腸菌(E.coli)/ミコバクテリア・シャトル・プラスミドpSMT3の組換え型構築物)は、Harth, G., B.−Y.Lee and M.A.Horwitz.1997, “High−level heterologous expression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four majorMycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading immunogenic candidates and drug targets”, Infect.Immun.65:2321−2328(この文献の全内容を本明細書で援用する)で本発明者らが既に記述したとおりに調製した。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa細胞外非融合タンパク質を過剰発現する組換え型BCG30タイス(Tice)II(pNBV1−pglnA−MTB30)株を以下のように調製した。ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa遺伝子のコード領域(開始コドンにNdel制限部位および停止コドンの直下流にHindIII制限部位を含む)を増幅し、このPCR産物をpNBV1−BFRBのNdel→HindIII制限部位のヒト型結核菌(M.tuberculosis)gln1部位の下流にクローニングすることによって、プラスミドpNBV1 −pgInA1 −MTB30を構築した (Tullius, M., G.Harth, and M.A.Horwitz.2001, “The high extracellular levels of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase and superoxide dismutase are primarily due to high expression and extracellular stability rather than to a protein specific export mechanism”, Infect.Immun.69:6348−6363)。 切断解析によってプラスミドが正しかったことを確認した後に、上記プラスミドをウシ型結核菌(M bovis)BCGタイス(Tice)株に電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL −1ハイグロマイシンにより7H11培地上で選別した。いくつかの個々のハイグロマイシン耐性クローンをランダムに選択して50μgmL −1ハイグロマイシン含有7H9培地で培養した。組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaタンパク質の発現および送出をポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および高特異性多価ウサギ抗30kDaタンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって確認した。rBCG30タイス(Tice)II株が、ベクター(pNBV1)に単に組み込まれているBCGタイス(Tice)株に比べて、培養液1mlあたり24倍以上の30kDa抗原を産生することがわかった。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)23.5kDa細胞外非融合タンパク質を過剰発現する組換え型BCG23.5タイス(Tice)I(pNBV1−pglnA−MTB23.5)株を以下のように調製した。ヒト型結核菌(M.tuberculosis)23.5kDa遺伝子のコード領域(開始コドンにNdel制限部位ならびに停止コドンの直下流にBamHI制限部位およびHindIII制限部位を含む)を増幅し、このPCR産物をpNBV1−BFRBのNdel→HindIII制限部位のヒト型結核菌(M.tuberculosis)gln1部位の下流にクローニングすることによって、プラスミドpNBV1 −pgInA1 −MTB23.5を構築した(Tullius, M., G.Harth, and M.A.Horwitz.2001, “The high extracellular levels of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase and superoxide dismutase are primarily due to high expression and extracellular stability rather than to a protein specific export mechanism”, Infect.Immun.69:6348−6363)。切断解析によってプラスミドが正しかったことを確認した後に、上記プラスミドをウシ型結核菌(M bovis)BCGタイス(Tice)株に電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL −1ハイグロマイシンにより7H11培地上で選別した。いくつかの個々のハイグロマイシン耐性クローンをランダムに選択して50μgmL −1ハイグロマイシン含有7H9培地で培養した。組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)23.5kDaタンパク質の発現および送出をポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および高特異性多価ウサギ抗23.5kDaタンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって確認した。rBCG23.5タイス(Tice)II株が、rBCG30タイスII株によって産生される組換え型30kDaタンパク質と等量またはそれよりもわずかに多い量である高レベルで、23.5kDaタンパク質を産生した。BCGが23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子を持たないことから、30kDaタンパク質でなされたような親株との比較をおこなうことができない(BCGタイス(Tice)は23.5kDaタンパク質を発現しない。なぜなら、対応するヒト型結核菌(M.tuberculosis)遺伝子Rv1978ないしRv1988[23.5kDaタンパク質遺伝子=Rv1980]を包含する〜11.5kbのRD2ゲノム欠失(欠失は、1931前の野生型ウシ型結核菌(M.bovis)由来のBCG株の発生のあいだに起こった)であるためである)。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaおよび23.5kDa細胞外非融合タンパク質を過剰発現する組換え型BCG30/23.5タイス(Tice)I(pNBV1−pglnA−MTB30/23.5)株を以下のように調製した。プラスミドpNBV1 −pgInA1 −MTB30/23.5を、pNVB1−pglnA1−MTB23.5(ヒト型結核菌(M.tuberculosis)glnA1プロモータおよび23.5kDaコード領域の各々を完全に含む)から1kbBamHIフラグメントをpNBV1−pglnA1−MTB30のユニークBamHI制限部位にクローニングすることによって、構築した。2つのタンパク質をコードする遺伝子を、30kDaタンパク質をコードする遺伝子の上流に23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子がある上記プラスミド上の同一方向に配置した。切断解析によってプラスミドが正しかったことを確認した後に、上記プラスミドをウシ型結核菌(M bovis)BCGタイス(Tice)株に電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL −1ハイグロマイシンにより7H11培地上で選別した。いくつかの個々のハイグロマイシン耐性クローンをランダムに選択して50μgmL −1ハイグロマイシン含有7H9培地で培養した。組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaおよび23.5kDaタンパク質の発現および送出をポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および高特異性多価ウサギ抗30kDaタンパク質および抗23.5kDaタンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって確認した。rBCG30/23.5タイス(Tice)I株が、ベクター(pNBV1)に単に組み込まれているBCGタイス(Tice)株に比べて、培養液1mlあたり24倍以上の30kDa抗原を産生することがわかった。この株はまた、組換え型30kDaタンパク質と等量またはそれよりもわずかに多い量である高レベルで、23.5kDaタンパク質を産生した。なぜなら、BCGは23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子を持たないので、30kDaタンパク質でなされたような親株との比較がおこなえなかったからである。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa細胞外タンパク質を過剰発現する組換え型BCG30タイス(Tice)III(pNBV−1−MTB30)株を以下のように調製した。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびBamHI制限部位によってフランクされ、30kDa主要細胞外タンパク質とコード領域の直上流にあるプロモータ領域とを含むヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdman)DNAの〜1.5キロ塩基対(kB)断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、30kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(分析開始時のBCGタイス(Tice)野生型よりも14.4倍高く、また該分析終了時で11.5倍高い)、組換え型30kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。ストック(ストック#1)を、2.5x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa細胞外タンパク質を過剰発現する組換え型BCG23.5タイス(Tice)II(pNBV−1−MTB23.5)株を以下のように調製した。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、PstIおよびBamHI制限部位によってフランクされ、23.5kDa主要細胞外タンパク質とコード領域の直上流にあるプロモータ領域とを含むヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdman)DNAの〜1.4キロ塩基対(kb)断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、23.5kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(分析開始時で16.2mg/L、また該分析終了時で15.1mg/L)、組換え型23.5kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。なぜなら、BCGは23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子を持たないので、30kDaタンパク質でなされたような親株との比較がおこなえなかったからである。ストック(ストック#1)を、3x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に2001年8月24日に確立し、−80℃で保存した。
組換え型BCG30/23.5タイス(Tice)IIA (pNBV1−MTB30/23.5↑↑)(以下に用いられるように、「↑↑」は、遺伝子構築物の5′末端に関して、各タンパク質をコードする核酸配列[遺伝子]が同一方向に配向している複数の主細胞外タンパク質をコードする遺伝子構築物を示す)は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaおよび23.5kDa主細胞外タンパク質の両方を過剰発現する。これら2つのタンパク質をコードする遺伝子が同一方向に配向している。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびNdeI制限部位(30kDaタンパク質遺伝子およびプロモータ)ならびにNdeIおよびNdeI−BamHI(23.5kDaタンパク質遺伝子およびプロモータ)制限部位によってフランクされ、30および23.5kDa主要細胞外タンパク質の2つのコード領域の各々の直上流にあるコード領域およびプロモータ領域とを含むヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdman)DNAの〜1.5および〜1.4キロ塩基対(kb)の2つの断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、30および23.5kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(30kDaタンパク質に関しては、発現が分析開始時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの23.3倍を上回り、また該分析の終了時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの16.5倍を上回り、さらに23.5kDaタンパク質に関しては、分析開始時で18.7mg/L、また該分析終了時で12.2mg/Lであった)、組換え型30および23.5kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。上記したように、組換え型23.5kDaタンパク質の発現は、絶対項で測定する。なぜなら、BCGタイス(Tice)は、23.5kDaタンパク質を発現しないからである。ストック(ストック#1)を、3x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
組換え型BCG30/23.5タイス(Tice)IIB(pNBV1−MTB30/23.5↑↓)(以下に用いられるように、「↑↓」は、遺伝子構築物の5′末端に関して、各タンパク質をコードする核酸配列[遺伝子]が反対方向に配向している複数の主細胞外タンパク質をコードする遺伝子構築物を示す)は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaおよび23.5kDa主細胞外タンパク質の両方を過剰発現する。これら2つのタンパク質をコードする遺伝子が相反する方向に配向している。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびNdeI制限部位(30kDaタンパク質遺伝子およびプロモータ)ならびにNdeIおよびNdeI−BamHI(23.5kDaタンパク質遺伝子およびプロモータ)制限部位によってフランクされ、30および23.5kDa主要細胞外タンパク質の2つのコード領域の各々の直上流にあるコード領域およびプロモータ領域とを含むヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdman)DNAの〜1.5および〜1.4キロ塩基対(kB)の2つの断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。直前に記載した株(rBCG30/23.5タイス(Tice)IIA)と比較して、23.5kDaタンパク質のコードおよびプロモータ領域を担持するNdeI制限フラグメントの配向が逆転している。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、30および23.5kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(30kDaタンパク質に関しては、発現が分析開始時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの25.7倍を上回り、また該分析の終了時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの21.1倍を上回り、さらに23.5kDaタンパク質に関しては、分析開始時で16.67mg/L、また該分析終了時で12.8mg/Lであった)、組換え型30および23.5kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。上記したように、組換え型23.5kDaタンパク質の発現は、絶対項で測定する。なぜなら、BCGタイス(Tice)は、23.5kDaタンパク質を発現しないからである。ストック(ストック#1)を、3x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)32AkDa主細胞外タンパク質(a.k.a.抗原85A)を過剰発現する組換え型BCG32Aタイス(Tice)IB(pNBV1−MTB32A)を以下のように調製した。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびBamHI制限部位によってフランクされ、32AkDa主要細胞外タンパク質のコード領域と該コード領域の直上流にあるプロモータ領域とを含むヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdman)DNAの〜1.5キロ塩基対(kB)の断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、32AkDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(分析開始時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの10.5倍を上回り、また該分析の終了時では8.1倍であった)、組換え型32AkDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。ストック(ストック#1)を、3x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
ウシ型結核菌(M.bovis)30kDa主細胞外タンパク質を過剰発現する組換え型BCG30タイス(Tice)(pNBV1−MB30)を以下のように調製した。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびBamHI制限部位によってフランクされ、30kDa主要細胞外タンパク質のコード領域と該コード領域の直上流にあるプロモータ領域とを含むウシ型結核菌(M.bovis)野生型(ATCC#19210)DNAの〜1.5kb断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、30kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(分析開始時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの9.7倍を上回り、また該分析の終了時では7.8倍であった)、組換え型30kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。ストック(ストック#2)を、2.5x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
ライ菌(M.leprae)30kDa主細胞外タンパク質を過剰発現する組換え型BCG(ML)30タイス(Tice)(pNBV1−ML30)を以下のように調製した。この組換え型の株の生成は、ベクター主鎖と、ClaIおよびBamHI制限部位によってフランクされ、30kDa主要細胞外タンパク質のコード領域と該コード領域の直上流にあるプロモータ領域とを含むライ菌(M.leprae DNAの〜1.3kb断片とを含む組換え型プラスミドpNBV1を、BCGタイス(Tice)株菌(ストック#2)に電気穿孔によって導入することによって、おこなった。この株は、組換え型プラスミドを安定に維持し、30kDaタンパク質特異的抗血清による免疫ブロットによって確認されるように(分析開始時ではBCGタイス(Tice)野生型バックグラウンド・レベルの9.7倍を上回り、また該分析の終了時では9.3倍であった)、組換え型30kDaタンパク質発現のレベルを抗生物質無しで12ヶ月間にわたりほぼ一定に保った。ストック(ストック#1)を、3x108粒子/mlの濃度で10%グリセロール中に確立し、−80℃で保存した。
I.増殖制御可能なBCG(栄養要求株)の発生
A.BCGタイス(Tice)glnA1
BCGタイス(Tice)glnA1遺伝子を、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)glnA1突然変異体を生成するために以前に本発明者らが用いたプラスミドpEX1−Mtb−glnA1::Kmrを用いて対立遺伝子置換を介して中断させた(M.V., G.Harth, and M.A.Horwitz.2003, “Glutamine Synthetase (GlnA1) is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages and in guinea pigs”, Infect.Immun.Vol.71:7)。プラスミドpEX1−Mtb−glnA1::Kmrは、温度感受性sacBベクターpPR27に由来するもので、hygr遺伝子とglnA1コード領域の中間近くに位置したユニーク部位に挿入されたKmrカセットを持つヒト型結核菌(M.tuberculosis)glnA1遺伝子座を含む1.8kbフラグメントとを含む(Pelicic, V., M.Jackson, J.M.Reyrat, W.R.Jacobs, Jr., B.Gicquel, and C.Guilhot.1997, “Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis”, Proc.NatI.Acad.Sci.USA 94:10955−10960)。プラスミドpEX1−Mtb−glnA1::Kmr をBCGタイス(Tice)に電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL−1ハイグロマイシンにより7H11培地上で選択した。 プレートを最初に許容温度(32℃)に6日間保ち、つぎに制限温度(39℃)で46日間インキュベートした。単一の形質転換体を50μgmL−1カナマイシンおよび20mM L−グルタミン含有7H9−10%OADC−0.05%TWEEN−80ブロス培地中、上記制限温度で、約25世代にわたって増殖させ、さらに2%(w/v)スクロース、20mM L−グルタミン、および50μgmL−1カナマイシンを含む7H11上で平板培養することで、第2の相同性組換えイベントをおこなったクローンの選択をおこなった。ランダムに選択した35のKmrクローンのうちの12クローンが正しい表現型(すなわち、Hygsおよびグルタミン栄養要求性)を持つことがわかった。純粋培養を確実にするために、本発明者らは12クローンのうちの1クローンを低密度で平板培養し、単一のコロニーを再び単離した。上記株の最初の凍結ストックを再単離クローンから調製した。突然変異体の正しい遺伝子型を、サザンブロット分析によって確認した。
BCGタイス(Tice)trpD遺伝子を対立遺伝子置換を介して中断させた。対立遺伝子置換基質の生成は、588bpの欠失を有するBCGタイス(Tice)trpD遺伝子座が生成され、かつKmrカセットが該欠失の部位に挿入されるPCR戦略を用いておこなった。この突然変異体対立遺伝子は、対立遺伝子置換ベクターpEX2(緑色蛍光タンパク質をコードするgfpuv遺伝子が、シトシン・デミナーゼをコードする大腸菌(E.coli)codBAオペロンによって置換されるpEX1の誘導体)に導入されて、pEX2ΔtrpD::Kmr(Tullius, M.V., G.Harth, and M.A.Horwitz.2003, “Glutamine Synthetase (GlnA1) is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis) in human macrophages and in guinea pigs”, Infect.Immun.Vol.71:7)を生成する。
プラスミドpSMT3−MTB30を、BCGタイス(Tice)glnA1に電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL −1ハイグロマイシン、50μgmL −1カナマイシン、および20mM L−グルタミンにより7H11寒天上で選別した。それぞれ別個の2種類のハイグロマイシンおよびカナマイシン耐性クローンをランダムに選択して、50μgmL −1ハイグロマイシン、50μgmL −1カナマイシン、および20mM L−グルタミンを含有する7H9培地で培養した。組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaタンパク質の発現および送出を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および高特異性多価ウサギ抗30kDaタンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって確認した。BCGタイス(Tice)glnA1pSMT3−MTB30がBCGタイス(Tice)glnA1 よりも培養液1mLあたりの30kDa抗原が約10〜20倍多く産生されることがわかった。BCGタイス(Tice)glnA1pSMT3−MTB30は、親株であるBCGタイス(Tice)glnA1と同様に、グルタミン栄養要求株である。
プラスミドpSMT3−MTB30を、BCGタイス(Tice) TrpDに電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL −1ハイグロマイシン、50μgmL −1カナマイシン、および50μgmL −1 L−トリプトファンにより7H11寒天上で選別した。それぞれ別個の10種類のハイグロマイシンおよびカナマイシン耐性クローンをランダムに選択して、50μgmL −1ハイグロマイシン、50μgmL −1カナマイシン、および50μgmL −1 L−トリプトファン含有7H9−10%OADC−0.05% TWEEN−80ブロスで培養した。組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDaタンパク質の発現を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および高特異性多価ウサギ抗30kDaタンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって確認した。BCGタイス(Tice)TrpDpSMT3−MTB30が対照BCGタイス(Tice)株よりも培養液1mLあたりの30kDa抗原が約10〜20倍多く産生されることがわかった。
BCGタイス(Tice)narG遺伝子(硝酸レダクターゼαサブユニットをコード)は、対立遺伝子置換を介して中断された。対立遺伝子置換基質の生成は、2952bpの欠失を有するBCGタイス(Tice)narG遺伝子座が生成され、かつKmrカセットが該欠失の部位に挿入されるPCR戦略を用いておこなった。この突然変異体対立遺伝子は、対立遺伝子置換ベクターpEX2(gfpuv遺伝子が、大腸菌(E.coli)codBAオペロンによって置換されるpEX1の誘導体)に導入されて、pEX2ΔnarG::Kmr(Tullius, M.V., G.Harth, and M.A.Horwitz.2003, “Glutamine Synthetase (GlnA1) is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis) in human macrophages and in guinea pigs”, Infect.Immun.Vol.71:7)を生成する。
BCGタイス(Tice) narG pSMT3−MTB30
プラスミドpSMT3−MTB30を、BCGタイス(Tice)narGに電気穿孔によって導入し、形質転換体を50μgmL−1ハイグロマイシンおよび10μgmL−1カナマイシンにより7H11培地上で選択した。それぞれ別個の5種類のハイグロマイシンおよびカナマイシン耐性クローンをランダムに選択して、50μgmL−1ハイグロマイシン含有7H9−10%OADC−0.05%TWEEN−80ブロス培地で培養した。
簡潔に言えば、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)エルドマン(Erdoman)30kDa主要細胞外非融合タンパク質を発現させるために、組換えDNA技術の当業者に公知の方法を用いて、30kDa非融合タンパク質遺伝子と広範囲のフランキングDNA配列とを含む大きなゲノムDNA制限フラグメントをプラスミドのマルチ・クローニング部位に挿入することによって、プラスミドpMTB30を操作した。最初にプラスミドを大腸菌(E.coli)DH5αに導入して、組換え型プラスミドを大量に得た。組換え型大腸菌(E.coli)株(ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa非融合タンパク質を発現させることができない)を250μg/mlハイグロマイシンの存在下で増殖させ、プラスミド・インサートのDNA配列を完全に決定した。陽性形質転換体を大量に得るための条件として6.25kV/cm、25pF、および1000mQを用いた電気穿孔法によって、プラスミドを恥垢菌(M.segmatis)に導入した。本発明は、組換えDNA技術の当業者に公知の方法を用いて、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および多価の高特異的ウサギ抗30kDa非融合タンパク質免疫グロブリンによる免疫ブロットによって、50μg/mlハイグロマイシンの存在下での増殖と組換え型30kDa非融合タンパク質の構成的発現および送出とから組換え型プラスミドの存在を確認した。さらに、本発明者は、N末端アミノ酸配列決定法ではその天然の相対物から見分けがつかない組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa非融合タンパク質の正しい発現および処理を確認した。
プラスミドPNBV1とグルタミン・シンセターゼ遺伝子glnA1または細胞外タンパク質をコードする遺伝子に直に隣接した上流領域のプロモータとを利用して、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)主要細胞外タンパク質を発現する本発明の種々の組換え型BCG株の安定性を、調べた。rBCG30タイス(Tice)II、rBCG23.5タイス(Tice)I、およびrBCG30/23.5タイス(Tice)Iによる30kDaおよび/または23.5kDaタンパク質の発現は、プラスミドの陽性選択のためにハイグロマイシンを含んだ培地中で少なくとも3ヶ月にわたる連続培養(約30世代)で安定であった。ハイグロマイシン欠乏培地での1ヶ月(約10世代)に対する株の培養では、発現レベルの低下は無かった。しかし、ハイグロマイシンを含まない連続培養を6ヶ月間おこなった後(約60世代)では、rBCG30タイス(Tice)IIによる30kDaタンパク質の発現は大きく減少し、rBCG30/23.5タイス(Tice)Iによる30kDaおよび23.5kDaタンパク質の発現は検出不可能なレベルまで減少した。rBCG23.5タイス(Tice)Iによる23.5kDaの発現のみが高いままであった。2つの株での発現の低下は、培養物に占める割合が大きい細胞からプラスミドが失われることによる(ハイグロマイシンを含むまたは含まない7H11プレート上に上記株を平板培養して測定)。rBCG23.5タイス(Tice)Iは、ハイグロマイシン無しでの6ヶ月間にわたる培養後でも高い発現が保たれ手いることと一致してプラスミドの喪失は示されなかった(細胞の約100%がハイグロマイシン耐性)。
免疫原組成物の生産が成功した後、本発明の免疫原組成物を、動物モデルを使用して安全性および有効性について試験する。モルモットは特に臨床的、免疫学的、および病理学的にヒト結核症に関連していることから、モルモットを研究に用いた。マウスおよびラットとは対照的に、しかしヒトのように、モルモットは、(a)エアロゾル化した低量のヒト型結核菌(M.tuberculosis)に対して感受性があり、(b)ツベルクリンに対して強い皮膚DTHを示し、(c)肺病巣でラングハンス巨細胞および乾酪化を示す。しかし、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)に感染する約10%の免疫能力のあるヒトだけが、その寿命にわたって活動性疾患を呈するのに対して(暴露後半分が早く、潜在性期間の後に半分)、感染したモルモットは常に初期の活動性疾患を呈する。モルモットがこの点でヒトと異なる一方で、モルモットがヒト型結核菌(M.tuberculosis)に感染した後、活動性疾患を呈する一貫性は免疫原組成物の有効性を試行する上での利点である。
A群: BCG Tice 親対照
B群: rBCG30 Tice I (pSMT3−MTB30)
C群: rBCG30 Tice II (pNBV1−pglnA1−MTB30)
D群: rBCG23.5 Tice I (pNBV1−pglnA1−MTB23.5)
E群: rBCG30/23.5 Tice II (pNBV1−pglnA1−MTB30/23.5)
F群: rBCG30 TiceII (pNBV1−pglnA1−MTB30)およびrBCG23.5Tice I (pNBV1−pglnA1−MTB23.5)
(各株5x102)
また、18匹の動物を以下のようにして緩衝液のみで偽免疫化した。すなわち、G群: 12匹の偽動物(後の抗原投与のみ)およびH群: 6匹の偽動物(皮膚試験のみ)。
I群: BCG Tice 親対照
J群: rBCG30 Tice I (pSMT3−MTB30)
K群: rBCG30 Tice III (pNBV1−MTB30)
L群: rBCG23.5 Tice II (pNBV1−MTB23.5)
M群: rBCG30/23.5 Tice IIA (pNBV1−MTB30/23.5↑↑)
N群: rBCG30/23.5 TiceIIB (pNBV1−MTB30)およびrBCG23.5Tice I (pNBV1−MTB30/23.5↑↓)
O群: rBCG32A Tice I (pNBV1−MTB32A)
P群: 緩衝液のみで免疫化した偽物(6匹の動物)。
I群: BCG Tice 親対照
J群: rBCG30TiceI (pSMT3−MTB30)
K群: rBCG30TiceIII (pNBV1−MTB30)
L群: rBCG23.5TiceII (pNBV1−pMTB23.5)
M群: rBCG30/23.5TiceIIA (pNBV1−MTB30/23.5↑↑)
N群: rBCG30/23.5 Tice IIB (pNBV1− MTB30/23.5↑↓)
O群: rBCG32ATiceI (pNBV1−MTB32A)
P群: 抗原を含まない緩衝液で免疫化した12匹の偽動物。
BCGと組換え型ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa主要細胞外タンパク質(r30)とでのモルモットの免疫化は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)での抗原投与に対して高レベルの防御を誘導しない。
自然の形態と識別不能な形態のヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa主要細胞外タンパク質(r30)を発現する生存恥垢菌(M.smegmatis)でのモルモットの免疫化は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)での抗原投与に対して高レベルの防御を誘導しない。
BCGとほぼ同じ大きさであり、かつBCGと同様に60〜90日にわたってヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa主要細胞外タンパク質(r30)を徐放するミクロスフェアでのモルモットの免疫化は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)での抗原投与に対して高レベルの防御を誘導しない。
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)30kDa主要細胞外タンパク質を含有するリポソームでのモルモットの免疫化は、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)での抗原投与に対して高レベルの防御を誘導しない。
増殖調節可能な栄養要求性菌株の使用
増殖調節可能な栄養要求性ワクチンを次のように用いる。免疫無防備状態のヒトを、ワクチン、例えば、トリプトファン栄養要求株BCG菌株で免疫化する。該ヒトは、該栄養要求株が正常レベルで増殖して結核に対する高レベルの感染防御免疫を誘導するように充分に高量のトリプトファンを用いた食事を即座に補給し始める。大部分のヒトでは、組換え型BCGの増殖は、健康問題を引き起こさない。該生物は、組織中で少なめのレベルへ増殖し、その後、免疫系によって排除される。しかし、複数の免疫無防備状態のヒトでは、細菌増殖に由来する播種性疾患または他の問題が発症する。その後、これらのヒトは、食事補給を即座に止める。食事補給の不在下では、栄養要求株は、急速に死滅し、健康問題を引き起こすことを止める。
非栄養要求性弱毒化菌株の使用
BCGワクチンを投与する、すなわち任意の食事補給なしでの通常の方法で、これらの菌株を免疫無防備状態のヒトに投与する。
Claims (32)
- 23.5kDa、30kDa、32kDa、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- 前記核酸配列が、熱ショック・プロモータでもストレス・タンパク質プロモータでもないプロモータの制御下にある、請求項1記載の免疫原組成物。
- 前記主要細胞外タンパク質が非融合タンパク質である、請求項1記載の免疫原組成物。
- 前記染色体外核酸配列が、複数のミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子構築物を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して同一方向に配向している、請求項1記載の免疫原組成物。
- 前記染色体外核酸配列が、複数のミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子構築物を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して反対方向に配向している、請求項1記載の免疫原組成物。
- 前記ミコバクテリア主要細胞外タンパク質が、Mycobacterium tuberculosis(Mtb)、Mycobacterium bovis(MB)、およびMycobacterium leprae(ML)からなる群から選択されるミコバクテリアの一種由来である、請求項1〜5のいずれか1つに記載の免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium tuberculosis 23.5kDa主要細胞外非融合タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型BCGを含み、該プロモータが熱ショック・プロモータでもストレス・タンパク質プロモータでもなく、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該23.5kDa主要細胞外非融合タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium tuberculosis 32A kDa主要細胞外非融合タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型BCGを含み、該プロモータが熱ショック・プロモータでもストレス・タンパク質プロモータでもなく、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該32A kDa主要細胞外非融合タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外非融合タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外非融合タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該Mtb 30kDa主要細胞外非融合タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外非融合タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium bovis 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該30kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium leprae 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該30kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌され、該遺伝子構築物が、該Mtb 23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子および該Mtb 30kDaタンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して同一方向に配向している、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌され、該遺伝子構築物が、該Mtb 23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子および該Mtb 30kDaタンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して反対方向に配向している、免疫原組成物。
- 前記免疫応答が防御的免疫応答である、請求項7、8、9、10、または11のいずれか1つに記載の免疫原組成物。
- 23.5kDa、30kDa、32kDa、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- 前記核酸配列が、熱ショック・プロモータでもストレス・タンパク質プロモータでもないプロモータの制御下にある、請求項15記載の免疫原組成物。
- 前記主要細胞外タンパク質が非融合タンパク質である、請求項15記載の免疫原組成物。
- 前記染色体外核酸配列が、複数のミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子構築物を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して同一方向に配向している、請求項15記載の免疫原組成物。
- 前記染色体外核酸配列が、複数のミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子構築物を含み、該ミコバクテリア主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して反対方向に配向している、請求項15記載の免疫原組成物。
- 前記ミコバクテリア主要細胞外タンパク質が、Mycobacterium tuberculosis(Mtb)、Mycobacterium bovis(MB)、およびMycobacterium leprae(ML)からなる群から選択されるミコバクテリアの一種由来である、請求項15〜19のいずれか1つに記載の免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該30kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis 32A kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該32A kDa主要細胞外非融合タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外非融合タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium bovis 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するようにして該30kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium leprae 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に免疫応答を誘導するように該30kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- プロモータの制御下、Mycobacterium leprae 30kDa主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型BCGを含み、ほ乳類動物に体液性免疫応答および細胞性免疫応答両方を誘導するように該ライ菌Mycobacterium leprae 30kDa主要細胞外タンパク質が該組換え型BCGから過剰発現および分泌される、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌され、該遺伝子構築物が該Mtb 23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子および該Mtb 30kDaタンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して同一方向に配向している、免疫原組成物。
- Mycobacterium tuberculosis(Mtb)30kDa主要細胞外タンパク質およびMtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を持つ遺伝子構築物を含む染色体外核酸配列を持つ増殖調節可能な組換え型カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を含み、該Mtb 30kDa主要細胞外タンパク質および該Mtb 23.5kDa主要細胞外タンパク質が過剰発現および分泌され、該遺伝子構築物が該Mtb 23.5kDaタンパク質をコードする遺伝子および該Mtb 30kDaタンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が、該遺伝子構築物内で互いに対して反対方向に配向している、免疫原組成物。
- 前記増殖調節可能な組換え型BCGが栄養要求株であり、トリプトファンまたはグルタミンを用いて該栄養要求株の増殖を調節する、請求項15、21、22、または23のいずれか1つに記載の免疫原組成物。
- 前記免疫応答が防御的免疫応答である、請求項21、22、23、25、26、27、または28のいずれか1つに記載の免疫原組成物。
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