KR101500805B1 - 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 및 이를 이용한 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가금 살모넬라증(Avian Salmonellosis)의 주 원인균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum, SG)의 병원성 유전자군을 불활성화시켜 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 및 이의 여러 가지 용도에 관한 것으로, 구체적으로 살모넬라 특이적 용균성 박테리오파아지 생산에 적용하기 위한 용도 및 상기 변이주를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물 또는 사료 첨가제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 및 이를 이용한 약제학적 조성물 {AVIRULENT MODIFIED SALMONELLA GALLINARUM STRAINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE SAME}
본 발명은 비병원성화된 살모넬라 변이주 및 이의 여러 가지 용도에 관한 것이다.
현존하는 살모넬라균의 종류는 약 2,000여종 이상으로, 숙주특이성을 가지는 균종과 인수공통 전염병으로 동물과 사람에 질병을 유발할 수 있는 숙주 비특이성 균종으로 크게 분류된다. 가금류에 특이적으로 병원성을 유발하는 균으로는 추백리와 가금티푸스의 원인균으로 알려져 있는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum, SG)과 살모넬라 플로룸(Salmonella Pullorum, SP)이 대표적이다. 이러한 가금 살모넬라 질병들은 선진국에서는 발병 횟수가 적으나 개도국과 국내의 경우는 어린 병아리, 중추 및 성계에 미치는 피해가 대단히 크다.
그 중 살모넬라 갈리나룸은 혈청학적으로 동일한 균체항원(O-항원) 구조를 가지고, 살모넬라 균종 중 편모가 없어 운동성을 가지지 못하는 균으로 분류된다. 오염된 사료나 환경을 통해 살모넬라 균이 침투하게 되는 경우, 먼저 위장관을 통과하고, 동물 숙주의 소장 내 Peyer's patch M(microfold)세포를 통해 장 상피로 침투, 장점막을 통과한다. M세포는 인근 장점막에 있는 대식세포에게 살모넬라 균을 수송하게 되면서 전신성 질병으로 발전하게 된다.
제3형 분비계(Type III secretion system, TTSS)는 그람음성균에 발달된 병원성 물질 전달 방법으로, 숙주 세포막을 통과하여 직접 세포질로 병원성 활성 단백질을 주입하는 주사기 형태의 기구(Mota LJ et al, Ann Med. (2005);37(4):234-249)로 다중 단백질 복합구조체이다. 살모넬라균의 감염 경로에서 제3형 분비계를 통한 병원성 물질 전달 과정이 매우 중요하다고 알려져 있다(Schlumberger MC et al, Curr Opin Microbiol. (2006);9(1):46-54). 야생형의 살모넬라는 TTSS 단백질을 이용하여 숙주의 장내 상피세포(epithelial cell)에 부착(adhesion), 침투(invasion)하고, 대식세포(macrophage)의 식균작용(phagocytosis) 중에도 생존하여, 경우에 따라서는 혈류를 타고 전신감염(Systemic infection)을 일으키는 현상을 보이게 된다. 따라서, TTSS 단백질이 정상적으로 기능할 때, 살모넬라 감염이 진행된다. 살모넬라균이 감염초기 장상피세포(intestinal epithelial cell) 침투(invasion)에 필요한 제3형 분비계와 독성 단백질의 유전자 전체 군을 가지고 있는 살모넬라 유전체내의 특정부위를 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1)라고 한다(Kimbrough TG et al, Microbes Infect, (2002);4(1):75-82). 또한 살모넬라균이 상피세포를 통과한 후 장 면역기관이나 비장, 간 등의 면역기관 내의 대식세포에게 식균(phagocytosis)된 후 식포(phagozome)내에서 용균되지 않고 살아남도록 하는 기작에 관여하는 반응기 단백질과 이들 단백질을 분비하도록 하는 제3형 분비계의 유전자군을 포함하는 특정 유전체부위를 SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2)라고 한다(Waterman SR et al, Cell Microbiol, (2003);5(8):501~511, Abrahams GL, Cell Microbiol, (2006);8(5):728-737). SPI-1와 SPI-2 내에 있는 각각의 유전자와 기능은 다음과 같다 (표 1 참고).
　 유전자 특징
SPI -1 avrA 추정의 내부 막 단백질
sprB 전사조절인자
hilC 세균성 조절의 나선 대 나선 단백질, araC 패밀리
orgA 추정의 편모 생합성/제 3형 분비계 경로 단백질
prgK 세포 침투단백질; 지질단백질, 내부 및 외부 막에 연결됨
prgJIH 세포 침투 단백질
hilD 조절의 나선 대 나선 단백질, araC 패밀리
hilA 침윤 유전자 전사 활성자
iagB 세포 침투 단백질
sptP 단백질 티로신 포스페이트
sicP 병원성과 연관된, 셰프론
iacP 추정의 아실 운반 단백질
sipADCB 세포 침투 단백질
sicA 항원의 표면 프레젠테이션; 분비 단백질들
spaSRQPO 항원의 표면 프레젠테이션; 분비 단백질들
invJICB 항원의 표면 프레젠테이션; 분비 단백질들
invAEGFH 침투 단백질
SPI -2 ssaUTSRQPONVMLKJIHG 분비계 기관
sseGF 분비계 반응기
sscB 분비계 샤페론
sseEDC 분비계 반응기
sscA 분비계 샤페론
sseBA 분비계 반응기
ssaE 분비계 반응기
ssaDCB 분비계 기관
ssrA 분비계 조절기:센서 구성요소
ssrB 분비 시스템 조절기: 전사 활성자, degU/uvrY/bvgA 와 상동임
이들 제3형 분비계 이외에 살모넬라 병원성 플라스미드 상에 존재하는 핌브리애 유전자(faeHI)(Edwards RA et al, PNAS (2000);97(3):1258-1262)와 병독성 인자(spvRABCD 오페론)가 병원성에 관여한다고 알려져 있다(Gulig PA et al, Mol Microbiol (1993);7(6):825-830).
가금 살모넬라균은 난계대 전염, 사료나 환경으로부터의 감염 등 질병의 전파방법이 다양하고, 감염 후 항생제 등의 치료약제로는 재발율이 높은 특성 등 통제의 어려움이 있기 때문에, 철저한 종계장 및 사료 위생 관리뿐 아니라 백신 등을 이용한 예방 또한 중요하다. 최근 양계에서 가금티푸스에 대한 생균백신(병원성 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주- SG9S, SG9R)과 사균백신(겔백신, 오일백신 등)의 이용을 통해 발병 예방을 위한 노력이 진행 중이나, 백신 접종 농도와 접종 대상 닭의 상태 및 계사환경 등에 따라 그 효과가 다양하게 나타나며, 다른 질병의 백신과 비교시 예방 효과가 상당히 떨어진다고 알려져 있다. 그리고 항생제처리의 경우 병변을 낮추는 효과는 있지만 감염된 개체가 만성보균계로 전환되는 문제를 안고 있다(참고: 닭 살모넬라증의 발생과 예방, 국립수의과학검역원).
따라서, 이러한 백신이나 항생제의 효과를 뛰어넘기 위한 새로운 살모넬라 통제 방법이 연구되어야 한다. 최근 많은 과학자들이 항생제를 대체할 강력한 수단으로, 인체에는 무해하며 세균에 특이적으로 침투하여 용균하는 박테리오파아지(Bacteriophage)에 주목하고 있다. 기존 박테리오파아지에 대한 연구나 특허에서는 박테리오파아지를 이용한 질병의 예방 및 치료제(Atterbury RJ et al, Appl Environ Microbiol, (2007);73(14):4543-4549), 음식물의 이상부패를 막는 소독제나 세척제(PCT 1998-08944, PCT 1995-31562, EP 1990-202169, PCT 1990-03122), 혹은 진단을 위한 파아지 디스플레이 기술 개발에 대한 내용(Ripp S et al, J Appl Microbiol, (2006);100(3):488-499)이 보고된 바 있다. 최근 SPI-2에 속하는 유전자군 하나 이상의 유전자의 결손이나 변이를 통한 살모넬라 백신에 대한 특허가 공개된 바 있다(US 6923957, US 7211264, US 7887816).
상기와 같이 산업적 이용을 위한 박테리오파아지는 대량 배양한 숙주세포에 박테리오파아지를 접종하여 용균, 증식한 박테리오파아지를 분리하는 과정을 통해 생산할 수 있다. 그러나, 병원균을 숙주로 하는 박테리오파아지의 경우 용균액 내에 미처 제거되지 않은 병원성 숙주가 잔존하거나 병원성 숙주가 보유하고 있던 병원성 단백질 등의 독성 물질이 포함되어 있을 가능성이 있어, 이런 점들은 병원균을 숙주로 생산된 박테리오파아지의 안전성에 큰 위험요소가 된다.
또한, 많은 세균들은 염색체상에 용원성 파아지(lysogenic phage) 를 가지고 있지만, 이들 파아지 대부분은 잠재적이고, 선대의 잔유물로로 많은 돌연변이의 축척으로 인해 후대(progeny)를 생산할 수 없다. 이들은 활성이 없는 파아지이지만, 잠정적으로 파아지의 용균성과 용원성 성장에 필요한 유전자들은 가지고 있을 뿐 아니라, 이 유전자들 일부는 병원성 인자를 가지고 있기 때문에 살모넬라가 동물에 감염할 때 생존 능력을 증가시켜주는 효과도 있다. 하지만 이 유전자들로 인해 다른 유사한 파아지가 감염될 경우 침투한 파아지의 염기서열 상동성에 의한 재조합의 가능성이 있어, 유전적으로 변이된 파아지가 생겨날 수 있다. 대표적인 살모넬라 균인 티피뮤리움의 경우 fels-1, fels-2, gifsy-1, gifsy-2 프로파아지(prophage)와 2개의 잠재적 파아지(cryptic phage)를 가지고 있다. 하지만, 살모넬라 갈리나룸은 이들 프로파아지와 잠재적 파아지가 모두 결손되어, 파아지 생산숙주로 사용할 경우 생산하는 파아지가 재조합에 의해 유전적으로 변이된 파아지가 생겨날 가능성이 없다(Edwards RA et al, Trends Microbiol, (2002);10(2):94-99).
이에 본 발명자들은 상기 위험요소를 해결하기 위한 방편으로 생산과정에서 잔여 독성에 대한 문제점을 최소화하고 목적하는 파아지에 변이발생 기회를 제거하는 방법을 고안하던 중 살모넬라 갈리나룸의 병원성 유전자군을 불활성화시킨 비병원성 박테리오파아지 생산숙주 개발에 대한 아이디어를 착상하였다. 병원성 유전자군을 불활성화하여 병원성 균을 비병원성화된 균으로 전환한 이러한 아이디어는 지금까지 박테리오파아지 생산숙주로의 활용에 적용된 전례가 없었다.
한편, 박테리오파아지 생산 이외에 병원성 유전자군을 불활성화시킨 병원성이 제거된 살모넬라균 자체를 효과적으로 이용할 경우, 살모넬라 통제용 약독화 생균 백신개발이나 세포 공정을 통한 생물산업에의 응용 등 상당한 부가가치를 얻을 수 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 가금 살모넬라 통제용 박테리오파아지 생산과정에서의 잔류 병원균 문제와 잔여 독성 물질 발생을 최소화하기 위한 방법으로, 생산숙주인 살모넬라 갈리나룸의 주요 병원성 유전자군 4가지(SPI-1, SPI-2, spvRABCD, 및 faeHI 오페론) 중 하나 이상의 유전자를 불활성화시킨 병원성이 약화된 박테리오파아지 생산숙주를 개발하였다. 또한, 병원성 유전자군이 불활성화된 살모넬라 갈리나룸의 조류 상피 세포 내 침투 효율성 측정을 통해 유전자군 불활성화를 통한 병원성 감소를 1차 확인하였으며, 산란계에서의 감염 후 치사율 측정을 통해 유전자군 불활성화 균주의 비병원성화를 재검증함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 다른 한편으로는 야생형 균주와 비병원성 균주를 이용하여 가금 살모넬라에 특이적으로 감염하는 박테리오파아지의 생산성을 비교하는 실험을 통하여 박테리오파아지의 생산 균주로의 용도 및 가금 살모넬라증에 대한 약제학적 조성물 및 사료첨가제로의 용도를 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 살모넬라 병원성 유전자군인 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1), SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2), spvRABCD, 및 faeHI으로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상의 유전자군이 불활성됨으로써 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 특이적 박테리오파아지를 생산하기 위한 용도로 병원성 유전자군이 불활성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 또는 이를 이용한 파아지 생산방법을 제공하는 것이다. 개발된 비병원성화된 미생물을 효과적으로 이용할 경우, 잔여 독성의 우려가 없는 살모넬라 특이적인 용균성 박테리오파아지를 대량생산할 수 있으며, 산업적 효용가치가 높은 새로운 개념의 대체항생 물질 개발 연구에 적용하여 상당한 부가가치를 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원성 유전자 결손 과정 중에 생산되는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물, 또는 생균 백신과 사료 첨가제를 제공하는 것이다. SPI-1 유전자군은 항원으로 작용할 세포 표면의 제3형 분비계 단백질이고, SPI-2 유전자군은 살모넬라균이 상피세포를 통과, 대식세포에게 식균(phagocytosis)된 후, 식포(phagozome)내에서 용균되지 않고 살아남는데 관여하는 단백질이다. 따라서 SPI-1 유전자군은 남기고 SPI-2 유전자군만 불활성화하면, 면역반응을 유도하는 항체를 만드는데 필요한 항원은 존재하면서, 대식세포 내에서는 살아남지 못하기 때문에 전신 질환으로 이어지지 않는 결과를 보이므로 생균 백신으로서의 가능성을 고려해 볼 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸의 병원성 기능이 현저히 저하된 살모넬라 유전자군 불활성화 변이체인 살모넬라 변이주를 제공한다.
상기 변이주는 살모넬라 병원성 유전자군인 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1), SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2), spvRABCD, 및 faeHI으로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상의 유전자군이 불활성됨으로써 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주일 수 있다.
상기 변이주는 SPI-1, SPI-2, spvRABCD, 및 faeHI 중 각각 하나 이상의 유전자군을 조합하여 변이시킨 변이주일 수 있다.
본 발명에서 용어 "살모넬라 병원성 유전자군"은 살모넬라 갈리나룸의 SPI-1(Salmonella Pathogenicity Island-1) 내의 제3형 분비계 구성 단백질과 독성 작용기 단백질의 모든 유전자군과 SPI-2(Salmonella Pathogenicity Island-2) 내의 제3형 분비계 구성 단백질과 독성 작용기 단백질의 모든 유전자군, 조류 살모넬라 특이적 병원성 플라스미드 상의 병원성 활성 단백질을 코딩하는 spvRABCD 오페론 및 가금 살모넬라의 핌브리애 기능을 조절하는 faeHI 오페론의 4가지 유전자군을 말한다. 상기 유전자군은 살모넬라 갈리나룸에서 작동하는 것이라면 어느 것이라도 포함된다.
본 발명에서 용어, "유전자군"이란 특정 기능에 공통적으로 관여하면서, 염색체상 또는 플라스미드상에서 이웃한 유전자들의 집단을 말한다. 이러한 유전자군은 일반적으로 공통된 조절 유전자들에 의해 영향을 받아 특정 기능을 수행하게 된다.
일반적으로 균주 내 유전자군의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다(Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)), 및 Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995) 또는 Winnacker ("Genes and Clones", 1990)).
또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자군 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu와 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991), 및 Hagemann ("General Genetics", 1986)).
바람직하게는, 유전자군의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition (Cold SpringHarbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다(Russell CB et al, J. Bacteriol.(1989);171:2609-2613, Hamilton CM et al, J. Bacteriol.(1989);171:4617-4622, Link AJ et al, J. Bacteriol. (1997);179:6228-6237). 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화 시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 병원성 유전자를 가장 확실하게 불활성화하기 위해 마지막 방법인 염색체내의 염기서열을 모두 결손하는 방법을 사용하였다. 유전자군을 결손하는 방법은 대장균 유전자 결손 방법으로 널리 알려진 Datsenko KA 등이 개발한 람다레드 재조합 효소(lamda Red recombinase)를 이용한 '1 단계 불활성화 방법(One-step deletion method)'(Datsenko KA et al, PNAS, (2000);97(12):6640-6645)을 이용할 수 있다.
결손 대상 병원성 유전자 정보 중 SPI-1, SPI-2 염기서열은 'NCBI'에서 공개한 미생물 유전체 정보 중, 살모넬라 갈리나룸 유전자(Salmonella enterica subsp . enterica serovar Gallinarum str . 287/91, NC 011274) 내부의 병원성 유전자 염기서열을 참고하였고. faeHI 오페론 염기서열은 살모넬라 갈리나룸 병원성 플라스미드 유전자(Salmonella gallinarum virulence plasmid minor fimbrial subunit genes, AF005899) 염기서열을 참고하였다. spvRABCD 오페론의 경우에는 NCBI에 서열이 공개되어 있지 않기 때문에, 염기서열 상동성이 높은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella Typhimurium LT2)의 동명 유전자 염기서열을 참고로 하여 불활성화 균주를 제작하였고, 살모넬라 타이피뮤리움 염기 서열을 참고로 하여 spvRABCD 오페론의 염기 서열 분석도 추가로 실시하였다.
상기 살모넬라 병원성 유전자의 예는 살모넬라 갈리나룸 287/91의 SPI-1 유전자군(서열번호 1), SPI-2 유전자군(서열번호 2), spvRABCD 오페론(서열번호 3), 및 faeHI 오페론(서열번호 4) 일 수 있다.
더욱 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 균주를 제작하기 위해 하나 이상의 병원성 유전자군을 결손시킨 통합 균주를 제작할 수 있다.
바람직하게 상기 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주는 상기 유전자군 중 SPI-2 유전자군만을 불활성화한 균주(SG3-d2), SPI-1와 SPI-2 유전자군이 불활성화되고 통합된 살모넬라 갈리나룸 균주(SG3-d1d2), 추가로 상기 4가지 병원성 유전자군(SPI-1, SPI-2, spvRABCD , faeHI)이 전부 불활성화되고 통합된 살모넬라 갈리나룸 균주(SG3-d4) 일 수 있다. 상기 SG3-d2는 기탁번호 KCCM11009P, SG3-d1d2는 기탁번호 KCCM11010P, SG3-d4는 기탁번호 KCCM11011P일 수 있다.
상기 유전자군들에 포함된 각각의 유전자의 독립적인 결손 연구(Hapfelmeier S et al, J Immunol, (2005);174(3):1675-1685, Brumme S et al, Vet Microbiol, (2007);124(3-4):274-285, Desin TS et al, Infect Immun, (2009);Apr 13)는 보고된 바 있으나, 둘 이상의 전체 유전자군을 불활성하여 통합된 비병원성 살모넬라 균주 개발의 예는 본 발명자들에 의한 본 발명이 처음이다. 살모넬라 갈리나룸의 SPI-2 유전자군을 불활성화한 균주를 살모넬라 갈리나룸 SG2293-d2로, SPI-1 및 SPI-2 유전자군을 통합하여 불활성화한 균주를 SG2293-d1d2로 명명하였다. 추가로 SPI-1, SPI-2, spvRABCD , faeHI 유전자를 모두 불활성화하여 통합시킨 비병원성 균주를 SG2293-d4로 명명하였다. 본 발명에서 용어 "SG2293-d2"와 "SG3-d2", "SG2293-d1d2"와 "SG3-d1d2", 및 "SG2293-d4"와 "SG3-d4"는 혼용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 병원성 유전자를 불활성화시켜 비병원성화된 균주를 검증하기 위하여 살모넬라속 미생물의 숙주세포 내 침투효율성 실험 및 상기 미생물을 가금에 감염시켜 폐사율(%)과 병변유무를 측정할 수 있다. 바람직하게 상기의 병원성 관련 유전자가 불활성화된 살모넬라 갈리나룸 균주에 대해 조류 상피세포에서의 침투효율성 측정, 가금 중 갈색산란계에 주사하여 이의 폐사율 측정을 통해 병원성의 감소를 검증하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 비병원성화된 살모넬라 속 균주의 용도로서 가금 살모넬라 특이적인 용균성 박테리오파아지를 생산하기 위한 병원성이 약화된 살모넬라 변이주 또는 이를 이용한 파아지 생산 방법을 제공한다.
비병원성 살모넬라 갈리나룸 변이주에서의 박테리오파아지 생산성을 확인하는데 사용한 ФCJ1(US 20100135962)은 가금 살모넬라 특이적인 파아지로 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)과 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum) 특이적 사멸능을 갖고, 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid) 및 수축성이 없는 꼬리(long non-contractile tail)를 갖는 형태형(morphotype) B1, 시포비리데(siphoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 61 kb이며, 38 kDa 및 49 kDa 크기의 단백질을 주요 구조 단백질로 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지이다.
본 발명에서는 상기 기술된 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 배지에서 배양하는 단계, 상기 배지에 박테리오파아지를 접종하는 단계, 및 상기 박테리오파아지를 회수하는 단계를 포함하는, 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 이용한 박테리오파아지의 생산 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법으로 파아지를 생산하기 위해서는 간단하게는 플레이트에서 생산할 수도 있고, 대량으로 생산하기 위해서는 액체 배지 상에서 생산할 수 있다. 구체적으로 플레이트에서 생산할 경우에는, 박테리아를 배양해서 log-phage에 들어갔을 때, 박테리오파아지를 적당한 비율로 감염시킨 뒤, top agar와 섞어서 고체 플레이트 위에 붓는다. 파아지 플라크가 보이면, top agar 부분을 모아서 원심분리해서 상등액만을 취해 여과하면, 파아지 스톡을 얻을 수 있다. 액체 배지 상에서 대량 생산할 경우에는 플레이트에서 생산할 때와 동일한 방법으로 박테리아와 파아지를 섞은 배양액을 준비한 뒤, top agar 대신에 새로운 액체 배지에서 다시 5시간 정도 배양해서 많은 양의 파아지를 생산할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 비병원성화된 살모넬라 속 균주의 다른 용도로서 당해 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 바람직하게는 가금티푸스 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 백신은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명에서 용어 "백신"은 항원, 즉 병원체를 약하게 만들어 인체에 주입하여 항체를 형성하게 하여 그 질병에 저항, 면역성을 가지게 하는 의약품을 총칭하는 것으로, 백신의 종류는 완전히 병원체를 죽여 만드는 사백신과 약독화시켜 만드는 생백신이 있다. 본 발명에서 살모넬라 갈리나룸 변이주는 야생주와 비교했을 때 항원으로 작용하는 단백질은 동일하게 존재하고, 병원성은 매우 낮춘 균주이기 때문에 가금티푸스 예방용 생백신으로 유용하게 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 포함하는 가축용 사료, 바람직하게는 사료 첨가제를 제공한다. 이는 사료첨가제로 사용되면서 생백신 역할을 하여 가금티푸스를 예방할 수 있다.
본 발명의 가축용 사료는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 살모넬라 갈리나룸 변이주는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 가축용 사료는 본 발명의 살모넬라 갈리나룸 변이주 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 살모넬라 갈리나룸 변이주를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물 부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성 유지류, 단세포 단밸질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 살모넬라 갈리나룸 변이주를 포함하는 사료 첨가제의 예로는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병의 예방용 조성물을 이용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병인 가금티푸스를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 비경구, 동맥내, 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내 투여경로를 포함한 다양한 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 나이, 체중, 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하나, 일반적으로 104 내지 108 CFU의 양으로 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 병원성 유전자를 불활성화시켜 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 제공함으로써, 살모넬라 특이적인 용균성 박테리오파아지의 생산용 숙주를 제공하여 산업적 규모에서 박테리오파아지를 용이하고 효율적이며 경제적으로 생산하는데 유용하다는 것을 뒷받침한다. 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 사용하여 생산하면 박테리오파아지 생산 후 독성을 제거하기 위해 진행되는 정제 단계가 간소화되어 생산 비용이 매우 절감되고, 생산 숙주의 병원성 약화로 인해 제품의 안전성 문제도 해결될 수 있다. 또한, 상기 균주를 생백신으로 활용함으로써 기존의 공개된 백신에 비하여 면역학적으로 효과가 좋으면서 안정성이 보장된 백신을 제공할 수 있다.
도 1은 가금 살모넬라균의 병원성 관련 유전자(SPI-1, SPI-2, spvRABCD, 및 faeHI) 불활성화 부위 프라이머를 나타내는 모식도이다.
도 2는 비병원성 가금 살모넬라균의 조류상피세포 내 침투 효율성 측정(in vitro invasion assay) 실험 결과를 나타내는 도면이다. 병원성 유전자군이 불활성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주(SG3-d1, SG3-d2, SG3-d1d2, 및 SG3-d4)의 비병원성 검증 결과를 대조군으로 야생형 살모넬라 갈리나룸 주(SG2293), 살모넬라 갈리나룸 생균 백신 주(SG9R), 비병원성 대장균(MG1655)의 비병원성 결과를 나타낸다.
세포 내 침투효율성(%)은 세포 내 침투한 미생물 수를 배양액 내 미생물 수로 나눈 값을 백분율로 나타낸 것이다. 실험에 사용한 배양액 내 미생물 수는 한 웰 당 8.0 X 10 7 CFU를 사용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 살모넬라 갈리나룸 병원성 유전자의 비교를 통한 불활성화 대상 유전자 탐색
비병원성 조류 살모넬라 균주 제작을 위한 첫 단계로, 불활성화 대상 병원성 유전자를 탐색하였다. 살모넬라의 병원성 전달에 필수적인 제3형 분비계(TTSS) 관련 유전자군인 SPI-1(Salmonella Pathogenicity Island-1), SPI-2(Salmonella Pathogenicity Island-2)와 병원성 플라스미드 상 유전자인 spvRABCD와 f aeHI를 불활성화 대상 유전자로 결정하였고, NCBI 내 염기서열 검색하였다(참조: Salmonella enterica subsp . enterica serovar Gallinarum str . 287/91, NC 011274). 이 중 살모넬라 갈리나룸의 spvRABCD 유전자의 염기 서열 유전적 정보는 현재 공개되어 있지 않기 때문에 염기서열 상동성이 높은 살모넬라 타이피뮤리움 LT2의 동명 유전자 염기서열을 참고하여 프라이머를 제작하였다(참조 : Salmonella typhimurium LT2 plasmid pSLT, NC 003277). faeHI 오페론 염기서열은 살모넬라 갈리나룸 병원성 플라스미드 유전자(Salmonella gallinarum virulence plasmid minor fimbrial subunit genes, AF005899) 염기서열을 참고하였다.
실시예 2: 살모넬라 갈리나룸의 병원성 유전자 불활성화 및 불활성화 부위 통합을 통한 비병원성 균주 제작
2-1. 살모넬라 갈리나룸의 병원성 유전자 불활성화
상기 실시예 1에서 언급한 바와 같이, 결손 대상 유전자로 결정한 야생형 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, SGSC No.2293)에 존재하는 TTSS 관련 병원성 유전자를 결손시키기 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다레드 재조합 효소(lamda Red recombinase)를 이용한 '1단계 불활성화 방법(One-step deletion method)'(Datsenko KA et al, PNAS, (2000);97(12):6640-6645)을 이용하였다.
유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 항생제 표지인자로는 pKD3 벡터의 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자를 사용하였다. 결손 대상 유전자군의 양쪽 바깥 끝부분인 avrA 유전자의 5' 말단 바깥쪽 염기서열 50 bp, invH 유전자의 3' 말단 바깥쪽 염기서열 50 bp와 pKD3 벡터 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표2의 프라이머 SPI-1-P1(서열번호 5)와 SPI-1-P2(서열번호 6)를 이용하여 pKD3 벡터를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]에 의해 약 1100 bp의 유전자 단편을 증폭하였다. 이때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트(PCR HL premix kit, BIONEER(사) 제품)이며, 변성(Denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(Annealing), 55℃ 30초, 신장(Elongation) 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.
Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46 벡터가 형질 전환된 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주를 컴피턴트 세포로 제작 후, PCR로 얻어진 1100 bp 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된(30 mg/L) LB 고체배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 결손된 유전자 양쪽 바깥으로 약 1kb에 위치한 프라이머 SPI-1-P3(서열번호 7)와 SPI-1-P4(서열번호 8)를 이용하여 PCR로 확인하였다. 이때 얻어진 PCR 생성물의 크기가 3100 bp인 것으로 SPI-1 유전자군이 불활성화되었다는 것을 확인하였다.
확인이 완료된 균주는 37℃에서 배양하여, pKD46 벡터를 제거하는 조건에서 배양하여 엠피실린 (Ampicillin)이 함유된 (100 mg/L) LB 고체배지에서 자라지 못하는 균주를 선별하였다.
이후 pCP20 벡터를 형질 전환하여 불활성화된 유전자군 내부에 삽입된 항생제 표식인자를 제거하였다. 항생제 표식인자 제거 여부는 프라이머 SPI-1-P3 및 SPI-1-P4 를 이용하여 PCR법으로 확인하였다. 그 결과로 얻어진 PCR 생성물은 DNA 단편의 크기가 2000 bp인 것으로, 불활성화되었다는 것을 또한 확인하였다.
항생제 표식인자 제거가 확인된 균주는 pCP20 벡터를 제거하는 조건인 42℃에서 배양하여, 최종적으로 엠피실린이 함유된 LB 고체배지에서 자라지 못하는 균주를 선별하였다. 제작된 SPI-1 유전자군 불활성화 균주를 SG3-d1(Salmonella gallinarum SG2293::△SPI-1)이라 명명하였다.
SPI-1 유전자군을 불활성화시킨 상기와 같은 방법으로 SPI-2, spvRABCD, faeHI 유전자군의 불활성화 또한 진행하였다. 제작된 SPI-2 유전자군 불활성화 균주를 SG3-d2(Salmonella gallinarum SG2293::△SPI-2, 기탁번호 KCCM11009P), spvRABCD 유전자군 불활성화 균주를 SG3-ds(Salmonella gallinarum SG2293::△spv), faeHI 유전자군 불활성화 균주를 SG3-df(Salmonella gallinarum SG2293::△fae)라 명명하였다. 유전자 결손 및 결손 부위 확인에 사용된 프라이머 다음과 같다(표 2 참고).
염색체상 SPI-1 유전자 결손 관련 프라이머
SPI-1-P1 (서열번호 5) TTATGGCGCTGGAAGGATTTCCTCTGGCAGGCAACCTTATAATTTCATTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
SPI-1-P2 (서열번호 6) ATGCAAAATATGGTCTTAATTATATCATGATGAGTTCAGCCAACGGTGATCATATGAATATCCTCCTTAG
염색체상 SPI-2 유전자 결손 관련 프라이머
SPI-2-P1 (서열번호 9) ACCCTCTTAACCTTCGCAGTGGCCTGAAGAAGCATACCAAAAGCATTTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
SPI-2-P2 (서열번호 10) ACTGCGTGGCGTAAGGCTCATCAAAATATGACCAATGCTTAATACCATCGCATATGAATATCCTCCTTAG
병원성 플라스미드상 spvRABCD 유전자 결손 관련 프라이머
spv-P1 (서열번호 13) GTGCAAAAACAGGTCACCGCCATCCTGTTTTTGCACATCAAA ACATTTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
spv-P2 (서열번호 14) TTACCCCAACAGCTTGCCGTGTTTGCGCTTGAACATAGGGAT GCGGGCTTCATATGAATATCCTCCTTAG
병원성 플라스미드 상 faeHI 유전자 결손 관련 프라이머
fae-P1 (서열번호 17) TTACCGATATTCAATGCTCACCGCCAGGGAGGTATGCCAGCG GGACGGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTT C
fae-P2 (서열번호 18) ATGAAAATAACGCATCATTATAAATCTATTATTTCCGCC CTGGCCGCGCTCATATGAATATCCTCCTTAG
염색체상 SPI-1 유전자 결손 확인 프라이머
SPI-1-P3 (서열번호 7) ATGTTCTTAACAACGTTACTG
SPI-1-P4 (서열번호 8) AGGTAGTACGTTACTGACCAC
염색체상 SPI-2 유전자 결손 확인 프라이머
SPI-2-P3 (서열번호 11) TGTTCGTACTGCCGATGTCGC
SPI-2-P4 (서열번호 12) AGTACGACGACTGACGCCAAT
병원성 플라스미드 상 spvRABCD 유전자 결손 확인 프라이머
spv-P3 (서열번호 15) GACCATATCTGCCTGCCTCAG
spv-P4 (서열번호 16) CAGAGCCCGTTCTCTACCGAC
병원성 플라스미드 상 faeHI 유전자 결손 확인 프라이머
fae-P3 (서열번호 19) CAGGCTCCCCTGCCACCGGCT
fae-P4 (서열번호 20) CAGGCCAACTATCTTTCCCTA
2-2. 제3형 분비계 ( TTSS ) 관련 병원성 유전자 불활성화 부위 통합
불활성화된 유전자군을 한 균주에 통합하기 위해, SG3-d1 균주에 SPI-2, spvRABCD, faeHI 유전자군을 실시예 2-1에서 언급한 방법과 비슷한 방법을 사용하여, 순차적으로 불활성화 하였다.
우선적으로 SPI-2 유전자군을 불활성화하기 위해서 프라이머 SPI-2-P1(서열번호 9), SPI-2-P2(서열번호 10)와 pKD4 벡터를 주형으로 PCR하여 얻은 1600 bp 크기의 유전자 단편을 제작하였다. 거기서 얻은 유전자 단편을 pKD46 벡터를 제거하지 않은 SG3-d1 균주(실시예 1-2)에 유입하여, 카나마이신이 함유된(50 mg/L) LB 고체 배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 결손된 유전자 바깥쪽에 위치한 프라이머 SPI-2-P3(서열번호 11)와 SPI-2-P4(서열번호 12)를 이용한 PCR법으로 확인하였다. 이때 얻어진 크기가 3600 bp인 것으로, SPI-2 유전자군이 불활성화되었다는 것을 확인하였다.
확인이 완료된 균주는 37℃에서 배양하여 pKD46 벡터를 제거하는 조건에서 배양하여 엠피실린(Ampicillin)이 함유된(100 mg/L) LB 고체배지에서 자라지 못하는 균주를 선별하였다.
이후 pCP20 벡터를 형질 전환하여 불활성화된 유전자군 내부에 삽입된 항생제 표식인자를 제거하였다. 항생제 표식인자 제거 여부는 SPI-1 불활성화의 경우 프라이머 SPI-1-P3 및 SPI-1-P4, SPI-2 불활성화의 경우에는 프라이머 SPI-2-P3 및 SPI-2-P4를 이용하여 PCR로 확인하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편의 크기가 2000 bp인 것으로 불활성화 여부를 또한 확인하였다.
항생제 표식인자 제거가 확인된 균주는 pCP20 벡터를 제거하는 조건인 42℃에서 배양하여, 최종적으로 엠피실린이 함유된 LB 고체배지에서 자라지 못하는 균주를 선별하였다. 제작된 SPI-1과 SPI-2 유전자 불활성화 통합 균주를 SG3-d1d2 (Salmonella gallinarum SG2293::△SPI-1△SPI-2, 기탁번호 KCCM11010P)라 명명하였다. 상기 SG3-d1d2 균주는 2009년 7월 2일 대한민국 서울 서대문구 홍제동 유림빌딩의 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM11010P로 기탁하였다.
SG-d1d2 균주에 추가적으로 spvRABCD, faeHI 유전자 군을 불활성화하기 위해 실시예 1-2에서 SPI-1을 불활성화한 것과 동일한 방법으로 spvRABCD 유전자군(항생제 표지인자로는 pKD4 벡터의 카나마이신 사용)을 불활성화하고, SPI-1 불활성화 균주에 SPI-2를 불활성화한 것과 동일한 방법으로 faeHI 유전자군(항생제 표지인자로는 pKD3 벡터의 클로람페니콜 사용)을 불활성화하였다. 얻어진 균주는 spvRABCD 의 경우 결손된 유전자 양쪽 바깥으로 약 1kb에 위치한 프라이머 spv-P3(서열번호 15)와 spv-P4(서열번호 16)를 사용하였고, faeHI 의 경우 fae-P3(서열번호 19)와 fae-P4(서열번호 20)를 이용한 PCR로 확인하였다. 이때 얻어진 크기가 각각 3600, 3100 bp인 것으로 spvRABCD, faeHI 유전자군이 불활성화되었다는 것을 확인하였다. 확인이 완료된 균주는 37℃에서 배양하여 pKD46 벡터를 제거하는 조건에서 배양하여 엠피실린(Ampicillin)이 함유된(100 mg/L) LB 고체배지에서 자라지 못하는 균주를 선별하였다. 제작된 SPI-1, SPI-2, spvRABCD, faeHI 4가지 유전자군이 불활성화된 살모넬라 갈리나룸 통합 변이주를 SG3-d4(Salmonella gallinarum SG2293::△SPI-1△SPI-2△spvRABCD△faeHI)라 명명하고, 기탁번호 KCCM11011P로 기탁하였다. 상기 SG3-d4 균주는 2009년 7월 2일 대한민국 서울 서대문구 홍제동 유림빌딩의 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM11011P로 기탁하였다.
2-3. 살모넬라 갈리나룸 spvRABCD operon 염기서열 분석
살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, SGSC No.2293)의 spvRABCD 유전적 정보는 현재 공개되어 있지 않기 때문에 추가적으로 유전자의 염기 서열을 분석하였다. 염기 서열은 하기의 표 3에 나와있는 프라이머를 이용하여 실시하였다.
spv-S1 (서열번호 21) GGTCAATTAAATCCACTCAGAA
spv-S2 (서열번호 22) ACGGGAGACACCAGATTATC
spv-S3 (서열번호 23) TTCAGTAAAGTGGCGTGAGC
spv-S4 (서열번호 24) CCAGGTGGAGTTATCTCTGC
spv-S5 (서열번호 25) ACTGTCGGGCAAAGGTATTC
spv-S6 (서열번호 26) TTTCTGGTTACTGCATGACAG
spv-S7 (서열번호 27) TCCAGAGGTACAGATCGGC
spv-S8 (서열번호 28) GAAGGAATACACTACTATAGG
spv-S9 (서열번호 29) GTGTCAGCAGTTGCATCATC
spv-S10 (서열번호 30) AGTGACCGATATGGAGAAGG
spv-S11 (서열번호 31) AAGCCTGTCTCTGCATTTCG
spv-S12 (서열번호 32) AACCGTTATGACATTAAGAGG
spv-S13 (서열번호 33) TAAGGCTCTCTATTAACTTAC
spv-S14 (서열번호 34) AACCGCTTCTGGCTGTAGC
spv-S15 (서열번호 35) CCGTAACAATGACATTATCCTC
염기 서열의 분석 결과는 서열 번호 3에 명시하였다.
실시예 3: 조류상피세포 내 침투 효율성 측정을 통한 병원성 유전자군 불활성화 살모넬라 갈리나룸 SG3 - d4 균주의 비병원성 검증
운동성 편모가 발달하지 않은 유일한 살모넬라 균종인 살모넬라 갈리나룸과 살모넬라 플로룸은 조류세포에 특이적으로 감염하며, 타 동물세포로의 침투 효율성이 매우 낮다. 본 연구에서는 Georgia 대학의 MD LEE로부터 제공받은 조류 상피세포인 BAT(Budgerigar Abdominal Tumor) 세포주를 이용하여, 상피세포 내 세균의 침투효율성 측정(in vitro cell invasion assay)을 진행하였다(Henderson SC et al, Infect Immun, (1999);67(7):3580-3586). 상기 유전자 결손을 통해 개발된 비병원성 살모넬라 갈리나룸 변이주 SG3-d1d2와 SG3-d4는 TTSS 관련 단백질의 발현이 저해되어, 숙주 세포 내로의 침투 효율성이 현저히 감소할 것으로 예상된다. 현재까지의 병원성 미생물 감염 기작 연구 동향을 보면, SPI-1 내의 특정 유전자만을 결손시켜도, 살모넬라 균주는 상피세포 내부로의 침투율이 감소한다는 보고가 알려져 있다(Lostroh CP et al, Microbes Infect, (2001);3(14-15):1281-1291).
본 발명에서는, 조류상피세포인 BAT 세포주를 이용한 침투 효율성 측정을 통하여 TTSS 관련 유전자 결손에 의한 조류 살모넬라 변이주의 병원성 감소를 증명하였다.
조류상피세포 내 침투 효율성 측정은 24 웰-플레이트에서 3회 진행하여, 평균값을 명시하였다. BAT 세포주는 10% 소 태아 혈청, 1 mM 글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에 배양하였다. BAT 세포주를 24 웰-플레이트에 2.5 X 105개/웰로 분배하여, 세포가 단층을 이루도록 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 1-2일간 배양하였다. 세포를 분배한 후, 하루가 지난 다음에는 무항생제 DMEM 배지로 배양배지를 교체하였다. 침투효율성 비교를 위하여, 야생형 살모넬라 갈리나룸 SG3 (SGSC#: 2293), 병원성 유전자군 불활성화 살모넬라 갈리나룸 SG3-d1, SG3-d2, SG3-d1d2, 및 SG3-d4와 시판되고 있는 가금 살모넬라용 생균 백신 SG9R, 대조군으로 비병원성 대장균인 MG1655의 총 7종의 균종을 실험에 사용하였다.
모든 실험 균종을 1차 seed 배양 후, main LB 배지에 4-5시간 2차 활성 배양하고, OD600= 1.0의 값을 가지도록 배양액을 희석하여, 각 실험군별 농도를 조절하였다. 무항생제 배지 200 ㎕로 교체해 준 동물세포에 미생물 활성배양액 200 ㎕를 첨가하여, 한 웰당 2.0 X 108 CFU/mL의 균이 들어가도록 접종하였다. 미생물이 상피세포 내로 침투하도록 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 1시간 배양하였다. 침투과정 후, 미생물이 포함된 배지를 제거하고, 1 X PBS로 잔여 미생물이 없도록 세척하고, 세포 내 침투에 성공한 미생물을 제외한 세포 외부의 잔여 미생물을 모두 제거하기 위하여, 50 ㎍/mL 농도의 젠타마이신이 첨가된 배지로 교체하고, 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 2시간 배양하였다. 이후, 1 X PBS 세척을 통해 잔여 항생제를 제거하고, 세포 내로 침투한 미생물을 확인하기 위하여 500 ㎕의 0.1% 트리톤 X-100으로 15-30분간 동물세포를 용해시켰다. 용해물을 희석하여 LB 배지에 도말하고, 37℃ 미생물 배양기에서 하루 동안 배양한 후, 자라난 균의 수를 측정하였다. OD600 = 1.0 의 미생물 배양액 200 ㎕도 함께 희석하여, 침투 효율성을 계산하였다.
* 세포 내 침투효율성(%)
= 세포 내 침투된 미생물 수/ (OD600= 1.0) 배양액 내 미생물 수 X 100
병원성 유전자군 불활성화 과정에서 제작된 형질전환 살모넬라 갈리나룸 균주 4종의 BAT 세포 내로의 침투효율성(%)을 비교하였다.
그 결과, 병원성 유전자군 불활성화 과정에서 제작된 형질전환 살모넬라 갈리나룸 변이주 4종 중, 세포 내 침투 기작에 작용하는 SPI-1 유전자군만 불활성화된 균주인 SG3-d1은 야생형에 비해 침투효율이 약 84% 감소하였고, SPI-1과 SPI-2이 동시에 결손된 SG3-d1d2 균주와 4가지 유전자군이 모두 결손된 SG3-d4 균주는 야생형 살모넬라 갈리나룸(SG3)에 비해 세포 내 침투효율성이 각각 약 89%, 91% 감소하며, 시판되고 있는 가금티푸스 생균 백신인 노빌리스 SG9R와 비교한 결과 침투 능력이 현저히 감소하였음을 확인하였다. 이를 통해, TTSS 관련 유전자군 불활성화에 의한 살모넬라 갈리나룸의 병원성 감소를 검증하였다 (표 4 및 도 2 참고).
구분 균주명 특성 유전형 내부화 지수(%)
실험
대조군 		MG1655 비병원성 대장균 야생형 2%
SG3 병원성
살모넬라 갈리나룸
(야생형, SGSC No. 2293)		 야생형 100%
노빌리스SG9R 살모넬라 갈리나룸
생균백신 균주
(시판 중)		 SG::
△recA 		67%
실험군
(비병원성
살모넬라
갈리나룸)		 SG3-d1 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-1		 16%
SG3-d2 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-2		 34%
SG3-d1d2 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-1/△SPI-2		 11%
SG3-d4 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-1/△SPI-2/△spv/
△fae		 9%
(SG3 100%= 실제 0.36% 침투 효율성)
시험관내 시험에서 조류상피세포 내 침투효율성이 현저히 감소한 것으로 확인된 비병원성 살모넬라 갈리나룸 변이주 SG3-d4는 동물실험을 통해 비병원성을 재확인하였으며, 실시예 4에 그 결과를 명시하였다.
실시예 4: 닭의 폐사율(%) 측정을 통한 비병원성 살모넬라 갈리나룸 SG3 - d4 균주의 비병원성 검증
본 실험은 서울대학교 수의과학연구소에 위탁 연구로 진행하였다. 공시동물로는 1주령 갈색 산란계 (Hy-Line chicken)을 사용하였으며, 병원균 감염 실험은 격리된 별도의 병원균 감염 계사에서 실험을 수행하였으며, 실험동물은 부화 후 일체의 백신 프로그램을 생략하였다.
본 실험은 각 그룹별로 10마리씩 모두 격리된 계사에서 진행하였다. 야생형 살모넬라 갈리나룸 SG3(SGSC#: 2293), 병원성 유전자군 불활성화 살모넬라 갈리나룸 SG3-d2와 SG3-d4(세포 내 침투효율성 측정을 통해, 병원성 감소를 1차 확인한 유전체 변이주)와 시판되고 있는 생균백신 노빌리스 SG9R, 및 비병원성 대장균인 MG1655의 총 5종의 조류 살모넬라를 실험에 사용하였다.
5종의 균을 1차 seed 배양 후, main LB 배지에 4~5시간 2차 활성 배양하고, OD600= 1.0. 배양액을 희석하여, 각 실험군별로 1.0 X 108 CFU/mL로 농도를 조절하였다. 활성 배양한 균주는 감염 균주 수에 맞춰 피하로 접종한 뒤 2주간 폐사율을 관찰하였고, 생존한 시험계는 부검하여 병변유무를 확인하였고 세균을 분리하였다.
병원균의 농도(1.0 X 108CFU/mL)로 인공 감염한 계군을 2주간 관찰한 결과, 야생형 살모넬라 갈리나룸(SG3)에 감염된 닭은 가금티푸스의 일반적인 외부증상인 운동성 저하, 푸른 설사 증상을 보이며, 사료섭취가 떨어지고 폐사가 진행되는 경향을 보였다. 폐사율은 아주 높지 않은 경향을 보이나, 생존한 시험계를 부검한 결과 대부분의 닭에서 병변을 관찰할 수 있었다.
반면, 동물세포 내 침투 효율성으로 1차 비병원성이 검증된 살모넬라 갈리나룸 유전자 변이주(SG3-d4) 감염 계군에서는 2주 동안 일부 설사 증상이 나타나기는 했으나, 운동성도 좋으며, 폐사가 거의 일어나지 않음을 확인하였고, 생존한 시험계의 닭 부검시 병변이 거의 없는 결과를 보임으로써, 살모넬라 갈리나룸의 병원성이 감소하는 효과를 재확인하였다. 또한, 숙주 세포 내 1차 침투 기작에 관여하는 유전자는 야생형으로 존재하지만 전심감염 및 대식세포 내 생존 기작에 관여하는 SPI-2 유전자가 불활성화된 SG3-d2 균주가 감염된 계군과 병원성에 관여하는 것으로 알려진 spv 유전자가 불활성화된 SG3-ds 균주의 경우도 폐사율(%)이 매우 낮거나 없는 경향을 보임으로써, 단일 유전자군의 불활성화도 병원성 감소에 매우 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다(표 5 참고).
구분 균주명 특성 유전형 폐사율
(%)		 생존 계의 병변발생률 (%)
실험
대조군 		MG1655 비병원성 대장균 야행형 0% 20% (2/10)
SG3 병원성
살모넬라 갈리나룸
(야생형, SGSC No. 2293)		 야생형 20% 88% (7/8)
노빌리스SG9R 살모넬라 갈리나룸
생균백신 균주 (시판 중)		 SG::
△recA 		0% 40% (4/10)
실험군
(비병원성
살모넬라
갈리나룸)		 SG3-d1 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-1		 40% 17% (1/6)
SG3-d2 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-2		 10% 0% (0/9)
SG3-ds 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△spv		 0% 20% (2/10)
SG3-d4 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG::
△SPI-1/△SPI-2/△spv/
△fae		 0% 10% (1/10)
부검소견으로는 야생형 살모넬라 갈리나룸(SG3)에 감염된 계군은 간 및 비장이 부어있고 약해져 있으며 때로는 간이 녹갈색 또는 청록색으로 띄는 병변을 보였으나, 병원성 관련 유전자군이 불활성화된 유전자 변이주(SG3-d1d2 및 SG3-d4)는 시판되는 생균백신인 노빌리스 SG9R나 비병원성 대장균 MG1655와 마찬가지로 병변이 거의 없음을 확인함으로써, 닭에게 무해함을 증명하였다.
실시예 5: 살모넬라 갈리나룸 변이주에 특이적인 Ф CJ1 박테리오파아지의 생산성 비교
비병원성 살모넬라 균주의 개발은 궁극적으로 살모넬라 특이적 용균성 박테리오파아지 생산에 적용하기 위한 것이다. 위의 실시예 2에서 제작된 살모넬라 변이주는 실시예 3과 4를 통해 병원성이 매우 감소된 것을 확인하였다. 최종적으로 조류 살모넬라에 특이적으로 감염하는 ФCJ1(대한민국 출원번호 10-2008-121500/ US 20100135962)를 사용해 실제 야생형 균주와 비병원성 균주간의 박테리오파아지 생산성에 차이가 없는지를 확인하였다.
조류 특이적 박테리오파아지 ФCJ1를 생산하기 위해 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주(SG3) 또는 변이주를 숙주 세포로 이용하여 대량 배양을 실시하였다. 각각의 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 플라스크에서 진탕 배양하여 OD600가 0.5가 되도록 키운 뒤 (2.5 X 1010 CFU, Colony Forming Unit), ФCJ1를 1.25 X 109 PFU (Plaque Forming Unit)로 접종해 MOI (Multiplicity Of Infection)=0.05로 만든 후 37℃에서 20분간 정치하였다. 이를 다시 37℃에서 4시간 동안 추가 배양한 뒤, 최종 부피의 2%가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20분간 흔들어 주었다. 얻어진 상등액은 0.2 ㎛ 필터로 여과한 뒤, ФCJ1의 역가를 측정하였다.
야생형 균주(SG3)를 사용하여 생산한 경우와 비병원성 살모넬라 갈리나룸 변이주(SG3-d4)를 사용해서 생산한 경우를 비교해 보았을 때, 생산된 ФCJ1의 역가는 야생형은 6 X 1011 PFU/mL, 비병원성 균주는 8 X 1010 PFU/mL로 생산되었다. 이를 통해 병원성 인자가 불활성화된 비병원성 변이주가 박테리오파아지 감염에 아무 문제가 없으며 박테리오파아지를 생산하는 균주로 사용할 수 있음을 확인하였다(표 5 참고). 추가로 당사에서 특허 출원한 박테리오 파아지 ФCJ2 (US 20100158870), ФCJ3 (US 20100166709)에 대해서 생산해 본 결과, ФCJ2의 경우 약 2 X 1010 PFU/mL, ФCJ3의 경우 5 X 109 PFU/mL 정도의 양이 생산되었다. 즉, ФCJ1와 마찬가지로 ФCJ2, ФCJ3 파아지의 경우에서도 야생형 균주에서 생산한 것과 많은 차이를 보이지 않았다.
구분 균주명 특성 유전형 ФCJ1의 생산
역가 (PFU/mL)
실험
대조군		 SG3
 병원성
살모넬라 갈리나룸
(야생형, SGSC No. 2293)		 야생형 6 X 1011
실험군
(비병원성 살모넬라 플로룸)		 SG3-d4 병원성 유전자 결손
살모넬라 갈리나룸		 SG3::
△SPI-1/ △SPI-2/ △spv/ △fae		 8 X 1010
지금까지 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 병원성 유전자를 불활성화시켜 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주는, 살모넬라 특이적인 용균성 박테리오파아지의 생산용 숙주를 제공하여 산업적 규모에서 박테리오파아지를 용이하고 효율적이며 비용 절감적으로 생산하는데 유용하다는 것을 뒷받침한다. 비병원성화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 사용하여 생산하면 박테리오파아지 생산 후 독성을 제거하기 위해 진행되는 정제 단계가 간소화되어 생산 비용이 매우 절감되고, 생산 숙주의 병원성 약화로 인해 제품의 안전성 문제도 해결될 수 있다. 또한, 상기 균주를 생백신으로 활용함으로써 기존의 공개된 백신에 비하여 면역학적으로 효과가 좋으면서 안정성이 보장된 백신을 제공할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11009P 20090702 한국미생물보존센터(국외) KCCM11010P 20090702 한국미생물보존센터(국외) KCCM11011P 20090702
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> AVIRULENT MODIFIED SALMONELLA GALLINARUM STRAINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE SAME <130> PA120357KR <150> US61/487,137 <151> 2011-05-17 <150> US13/274,854 <151> 2011-10-17 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34934 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella pathogenicity island-1 <400> 1 ttacgattta agtaaagact tatattcagc tatccttttt ttatgagcgg atatagagag 60 ttttttatcg tttagcataa cggcattgtt atcgaatcgc tcataaagcg tttcattctt 120 tttgtttact atactgcttc ccgccgccgg attggcctcc acatattcat ttaatcgttg 180 tacgccttga gtatgtttgt aaaaactcac cggcagataa cggtctgctt tatcggacgg 240 gagaaaaggt tcttcaccac acagacgttc acaaatatta tcttcatgaa tttttactaa 300 gttcataaat tcaagctgaa gttttttggc gagcgccagg ctaaaaatac cgcattcaga 360 agagcttcgt tgaatgtcca gctcgaccat agcaaaataa caatcaggca gttgttcacg 420 ttcaagagct gctttggtcc tcaacgccag taaagcaggt ccaaaagcgc tacacgctgc 480 tggttcgaac aaaatcaccg atgtctttcc gtccataact ctaaaatcga cgactgaaat 540 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Artificial Sequence <220> <223> faeHIoperon <400> 4 atgaaaataa cgcatcatta taaatctatt atttccgccc tggccgcgct ggccctgttt 60 tattccgcag caccccgggg ccgaattctt gacggcgggg aaatacagtt tcaccgtctg 120 gtcactgacg aggctccgaa atggacctgg caggtgggct cccctgacca gacatgggcg 180 gtggataccg ctgatgcccg tacagcgaac ggacaactgg tttttgattt acgcggcaag 240 ggctccctgc cgtttctgga aggccatctg tatgaggtgg cagagcgcgg tggtcccggc 300 ttcacccctt ttatctcctc cagcagtaac gggcagccgt tttccgtgac ggatggcggc 360 acgacgacgg cgcaacactt ccgcgcctct gtcccggtac gtaacccgga gaacggtcac 420 gtggcgggac agctttcttt cacccttgac cagggaatgg ccgtcagcgc cggacaccag 480 gaagacgggg cggttctacc ggcagcgatg tcgctcgtaa acgggcagag cgtgacgggt 540 gtgcaggccg gcaccctgcc gcagtggctc aaaaaccgtc tgccttccct gctgatgctg 600 aaccggggct tcggtaacgg aatgagcacg gcagataacg gtcaggttat cagtcagggc 660 gtgctggctg acggccgggt gacccggctg gcggcggcct atgcgtccgc cgtctcggat 720 tttgagctga cgctgccggc agaaaacacg ccggtgcagt ggcaggccgg gctgagtgtg 780 acggtgacgg tccagtaaag aacgggcagg gagaggaaga acacaatgaa acgaatgacg 840 attttactgc tggccgccag tctgctgccg tcctgtgtgc tggcgtggaa cacgccgggg 900 gaagacttca gcggagagct gaagctgggc gggccggtga ccagcacccg taatccctgg 960 gtctggaagg tcggggaagg gaacacacag ataaacacga aagctgtctc tgtcctgcgc 1020 agtggggagg aggtaatacc ggttcccctg ccggccatga cggtcctgct gggaaaaact 1080 atcctgacca cccgggccgg ccgggagggg cttgcgccgc aggtgacgta cggtaaggac 1140 acagagggtt ttgcactgac gtggacggca ccgggtatgg catcggtgac actgccggtg 1200 acgggggagg gaaatgtccg taccgggaca ttcaccttcc ggatgcaggc ggcgggtgtg 1260 ctgcgccatg tcctggggaa ccgggcggag tatgccgggc tgtatggcga cctgcagggc 1320 aacggcttgc cgccacagac gcaggtgatg ccggcagggc agacgccggg tgtgctgcag 1380 accctgtttg acagtgaagg cccggtctgg ctccgggaga tgacggtcag cagcgtgtcc 1440 ggactgagcc ggttcagtga cgccgccctg cgccaggttg acggggtata cggcgcacag 1500 acggtggcgg acagcggtga gctgcgtttt aagggggcgg taccgtcccg ctggcatacc 1560 tccctggcgg tgagcattga atatcggtaa 1590 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1-P1 primer <400> 5 ttatggcgct ggaaggattt cctctggcag gcaaccttat aatttcatta gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1-P2 primer <400> 6 atgcaaaata tggtcttaat tatatcatga tgagttcagc caacggtgat catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1-P3 primer <400> 7 atgttcttaa caacgttact g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1-P4 primer <400> 8 aggtagtacg ttactgacca c 21 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2-P1 primer <400> 9 accctcttaa ccttcgcagt ggcctgaaga agcataccaa aagcatttat gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2-P2 primer <400> 10 actgcgtggc gtaaggctca tcaaaatatg accaatgctt aataccatcg catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2-P3 primer <400> 11 tgttcgtact gccgatgtcg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2-P4 primer <400> 12 agtacgacga ctgacgccaa t 21 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-P1 primer <400> 13 gtgcaaaaac aggtcaccgc catcctgttt ttgcacatca aaacattttt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-P2 primer <400> 14 ttaccccaac agcttgccgt gtttgcgctt gaacataggg atgcgggctt catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-P3 primer <400> 15 gaccatatct gcctgcctca g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-P4 primer <400> 16 cagagcccgt tctctaccga c 21 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fae-P1 primer <400> 17 ttaccgatat tcaatgctca ccgccaggga ggtatgccag cgggacggta gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 18 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fae-P2 primer <400> 18 atgaaaataa cgcatcatta taaatctatt atttccgccc tggccgcgct catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fae-P3 primer <400> 19 caggctcccc tgccaccggc t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fae-P4 primer <400> 20 caggccaact atctttccct a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S1 primer <400> 21 ggtcaattaa atccactcag aa 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S2 primer <400> 22 acgggagaca ccagattatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S3 primer <400> 23 ttcagtaaag tggcgtgagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S4 primer <400> 24 ccaggtggag ttatctctgc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S5 primer <400> 25 actgtcgggc aaaggtattc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S6 primer <400> 26 tttctggtta ctgcatgaca g 21 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S7 primer <400> 27 tccagaggta cagatcggc 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S8 primer <400> 28 gaaggaatac actactatag g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S9 primer <400> 29 gtgtcagcag ttgcatcatc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S10 primer <400> 30 agtgaccgat atggagaagg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S11 primer <400> 31 aagcctgtct ctgcatttcg 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S12 primer <400> 32 aaccgttatg acattaagag g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S13 primer <400> 33 taaggctctc tattaactta c 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S14 primer <400> 34 aaccgcttct ggctgtagc 19 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spv-S15 primer <400> 35 ccgtaacaat gacattatcc tc 22

Claims (13)

  1. 하기 a) 내지 b) 중에서 하나 이상이 불활성됨으로써, 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주:
    a) SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2) 전체 유전자군; 및
    b) faeHI 유전자군.
  2. 제 1항에 있어서, SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1) 유전자군 또는 spvRABCD 유전자군 중 하나 이상의 유전자군이 추가로 불활성됨으로써 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호 KCCM11009P인 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 2인 SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2) 전체 유전자군 및 추가로 서열번호 1인 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1) 유전자군이 모두 결실됨으로써 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호 KCCM11010P인 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  6. 제 1항에 있어서, 서열번호 2인 SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2), 서열번호 3인 spvRABCD, 서열번호 4인 faeHI 유전자군 및 추가로 서열번호 1인 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1) 유전자군이 모두 결실됨으로써 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주(SG3-d4).
  7. 제 6항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호 KCCM11011P인 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서 상기 변이주는 살모넬라 특이적 용균성 박테리오파아지를 생산하기 위한 것인 살모넬라 갈리나룸 변이주.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신 조성물인 가금티푸스 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제.
  12. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병인 가금티푸스를 치료하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 상기 배지에 박테리오 파아지를 접종하는 단계; 및 상기 박테리오 파아지를 회수하는 단계를 포함하는, 병원성이 약화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 이용한 박테리오 파아지의 생산 방법.

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