CN101204584A - 以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗及其制备方法。该肿瘤疫苗的活性成分是重组减毒沙门氏菌,所述重组减毒沙门氏菌的构建方法包括以下步骤:1)构建表达如下融合蛋白的重组原核细胞表达载体;所述融合蛋白由沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白(SPI-2 TTSS)的N侧信号区(即N侧指导分泌区[1])和肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位组成;所述重组原核细胞表达载体是将所述融合蛋白的编码基因导入原核细胞表达载体的多克隆位点得到的;2)将所述重组原核细胞表达载体导入减毒沙门氏菌中,得到表达所述融合蛋白的重组减毒沙门氏菌。本发明的肿瘤疫苗可用于预防肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术
有效的肿瘤疫苗是全世界科学家多年奋斗的目标。然而,人类迄今尚未成功。主要原因是由于肿瘤特异抗原的免疫原性往往非常弱,难以刺激机体产生足够强度的抗肿瘤免疫反应。因此,如何使肿瘤细胞的免疫原性充分表达就成了这一研究领域最突出的挑战。
肿瘤疫苗的作用是应用特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原,来激活、恢复或加强机体抗肿瘤的免疫反应,清除残存和转移的肿瘤细胞。目前,肿瘤疫苗已发展到第二代。第一代疫苗是在整个肿瘤组织或肿瘤细胞的提取液中加入非特异性佐剂制成,它可以产生20%左右的临床反应;第二代肿瘤疫苗为基因工程疫苗,包括以重组质粒、病毒或细菌为基础的肿瘤疫苗。第二代肿瘤疫苗具有使机体产生特异性免疫反应和最小毒性的特点。
可以作为基因工程疫苗载体的细菌有很多,但是从疫苗的安全性和能诱导特异性免疫反应的角度出发,减毒的沙门氏菌和卡介苗是最重要和用途最广的载体。
沙门氏菌减毒株作为疫苗载体,其优势有如下几个方面:(1)细菌的宿主细胞特异性。沙门氏菌主要寄生在巨噬细胞内,但也有大量的文献报道该细菌还寄生于树突状细胞等专职抗原呈递细胞内。无论是在巨噬细胞或者树突状细胞内,由于它们都直接参与抗原呈递,因此理论上其外源抗原的呈递应该是高效率的。(2)体内连续表达及投递抗原。这是由于细菌能在细胞内存活一段时间,从而可有效地表达和投递抗原。(3)抗原的表达水平可调。通过改变表达抗原的启动子或者更换基因组内不同拷贝数的抗原融合基因,可以调节细菌体内投递疫苗抗原量。(4)免疫佐剂。细菌菌体成分是很好的天然免疫佐剂。(5)无创、方便、成本低(SprengS,Dietrich G,Weidinger G:Rational design of Salmonella-based vaccinationstrategies.Methods 2006,38(2):133-143;Medina E,Guzman CA:Use of livebacterial vaccine vectors for antigen delivery:potential and limitations.Vaccine 2001,19(13-14):1573-1580;White AP,Collinson SK,Burian J,Clouthier SC,Banser PA,Kay WW:High efficiency gene replacement inSalmonella enteritidis:chimeric fimbrins containing a T-cell epitope fromLeishmania major.Vaccine 1999,17(17):2150-2161)。
沙门氏菌与人体之间的相互作用复杂多样。同样是利用沙门氏菌作为疫苗载体,但是根据细菌与机体相互作用的不同机理和疫苗的具体目的,人们可采取不同的抗原投递方式,主要有以下三种:
1、细菌体内投递真核表达质粒
Darji A等发现沙门氏菌可以通过某种机制向寄生的细胞内投递质粒(Darji A,Guzman CA,Gerstel B,Wachholz P,Timmis KN,Wehland J,Chakraborty T,WeissS:Oral somatic transgene vaccination using attenuated S.typhimurium.Cell1997,91(6):765-775)。他们在实验室内构建表达外源抗原的真核质粒并将其转化至细菌细胞内,再令小鼠口服该疫苗菌株,发现小鼠在巨噬细胞内表达了质粒所携带的外源抗原。该外源抗原可被高效提呈,进而激发机体产生特异的CTLs和分泌免疫因子的T细胞。近来,很多人对此进行了进一步的研究,以开发针对各种抗原和不同实验动物的疫苗。也有人通过沙门氏菌来投递表达特异细胞因子或其它辅助免疫因子的质粒,以达到增强和优化免疫效果的目的(Yuhua L,Kunyuan G,HuiC,Yongmei X,Chaoyang S,Xun T,Daming R:Oral cytokine gene therapy againstmurine tumor using attenuated Salmonella typhimurium.International journalof cancer 2001,94(3):438-443)。
2、体内暴露菌体融合抗原
根据沙门氏菌的体内暴露及胞内寄生等特性,通过各种方式使得细菌在菌体表面表达含有外源抗原的蛋白,有助于机体抗原呈递细胞的识别、摄取、加工及提呈。细菌表达外源抗原主要是通过抗原肽与细菌菌体蛋白的融合。用于融合表达的菌体基因多种多样,如菌毛、鞭毛等等。融合的外源抗原长短不一,而融合的方法包括构建原核重组质粒表达菌体基因及外源抗原的融合蛋白,或者直接将抗原编码DNA整合至细菌染色体基因相应位点。
3、细菌向真核细胞胞浆投递抗原蛋白
沙门氏菌进入巨噬细胞或其他抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APCs),不完全是一个被动的摄取过程。相反,很大程度上是一个主动入侵的过程。至于细菌如何特异识别这些宿主细胞目前还没有共识,但是比较明确的是,细菌入侵细胞与细菌表达和组装的一种元件及经过这种元件分泌的特异效应蛋白有关。这种元件称作III型分泌系统(Type III secretion system,TTSS),是一种针状管道结构,而经此管道分泌的效应蛋白称为III型效应蛋白(Yip CK,Kimbrough TG,Felise HB,Vuckovic M,Thomas NA,Pfuetzner RA,Frey EA,Finlay BB,MillerSI,Strynadka NC:Structural characterization of the molecular platform fortype III secretion system assembly.Nature 2005,435(7042):702-707)。之所以称为III型分泌系统,是因为经其分泌的蛋白分泌方式有别于I型和II型等分泌系统的分泌机制。III型蛋白没有分泌信号,蛋白分子分为两个部分——N侧指导分泌区和C侧效应区(Ehrbar K,Mirold S,Friebel A,Stender S,Hardt WD:Characterization of effector proteins translocated via the SPI1 type IIIsecretion system of Salmonella typhimurium.Int J Med Microbiol 2002,291(6-7):479-485)。研究发现,如果保留III型效应蛋白的N侧指导分泌区,将效应区更换成外源抗原分子,该融合蛋白可以有效地进入细菌接触的细胞。体内实验发现利用这种方法可以有效地激发机体产生有效的CD8+T细胞免疫和CD4+辅助T细胞免疫反应(Panthel K,Meinel KM,Domenech VE,Retzbach H,Igwe EI,Hardt WD,Russmann H:Salmonella pathogenicity island 2-mediatedoverexpression of chimeric SspH2 proteins for simultaneous induction ofantigen-specific CD4 and CD8 T cells.Infect Immun 2005,73(1):334-341)。已经发现沙门氏菌具有两类TTSSs,即SPI-1 TTSS和SPI-2 TTSS。前者在细菌入侵过程中起作用,而后者在系统免疫过程中发挥作用。
上述几种主要类型的疫苗开发制备方法各具特点和优势,但也都有各自的局限性。投递真核质粒既可以激发细胞免疫也可以激发体液免疫,还可以引入细胞因子促进或优化免疫效果。但是由于其质粒如何进入真核细胞体内至今尚不明了,因此最终效果基本上是凭运气,人们对其尚无法完全控制,这种方法的效率也就有待进一步的评价。菌体暴露融合抗原的方法目前主要用于B细胞抗原疫苗的研究,一些CD4+T细胞抗原也通过这种方法呈递。此方法的主要不足是,融合抗原的长度有一定的局限。与前两种方法相比,利用TTSS作为疫苗投递的方案机理相对清楚,能够投递较长的抗原片断,同时能够激发机体产生CD8+和CD4+T细胞反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗及其制备方法。
本发明所提供的肿瘤疫苗,它的活性成分是重组减毒沙门氏菌,所述重组减毒沙门氏菌的构建方法包括以下步骤:
1)构建表达如下融合蛋白的重组原核细胞表达载体,所述融合蛋白由沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白(SPI-2 TTSS)的N侧信号区(即N侧指导分泌区(Panthel K,Meinel KM,Domenech VE,Retzbach H,Igwe EI,Hardt WD,RussmannH:Salmonella pathogenicity island 2-mediated overexpression of chimericSspH2 proteins for simultaneous induction of antigen-specific CD4 and CD8T cells.Infect Immun 2005,73(1):334-341))和肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位组成;
所述重组原核细胞表达载体是将所述融合蛋白的编码基因导入原核细胞表达载体的多克隆位点得到的;
2)将所述重组原核细胞表达载体导入减毒沙门氏菌中,得到表达所述融合蛋白的重组减毒沙门氏菌。
所述肿瘤疫苗中还可包括佐剂。
其中,所述融合蛋白中,所述肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位融合在所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区的羧基末端。
所述融合蛋白中,所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区可来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis或伤寒沙门氏菌Salmonella typhi,或沙门氏菌属第I、II、IIIa、IIIb、IV、VI或VII亚群中其它种的沙门氏菌(Popoff MY,Bockemuhl J,GheeslingLL:Supplement 2002(no.46)to the Kauffmann-White scheme.Res Microbiol2004,155(7):568-570;Popoff MY,Le Minor LE:Genus XXXIII.Salmonella.In:Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology.Edited by Brenner DJ,KriegNR,Stanley JT,vol.2,2 edn:Springer;2005:764-799)。
所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区具体来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium;所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区的氨基酸序列参考Salmonella typhimurium LT2(GenBank Accession NumberNC_003197)碱基序列同源区第866944位至第869241位碱基。
作为载体,所述减毒沙门氏菌保留了沙门氏菌的侵袭性,但无致病性,而且能有效地刺激免疫系统。
所述减毒沙门氏菌在染色体上拥有功能完好的III型分泌系统基因。普通的技术人员经过简单的训练,就可以选择出特定的沙门氏菌菌株以及合适的突变以使菌株减毒。所述减毒沙门氏菌优选的来源是鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi,或其他血清型的沙门氏菌,包括Salmonella enterica subsp.entericaserovars;Salmonella enterica subsp.salamae serovars;Salmonella entericasubsp.arizonae serovars;Salmonella enterica subsp.diarizonae serovars;Salmonella enterica subsp.houtenae serovars;或Salmonella enterica subsp.VI serovars,由所选沙门氏菌构建减毒菌株。
人们利用现代分子生物学技术结合对沙门氏菌致病机制的知识,迄今已鉴定出对于这种生物在体内生长和存活所必需的数种基因。例如,利用基因工程手段改造沙门氏菌中的某些基因(主要通过基因突变、删除)以降低其毒性,可得到减毒的沙门氏菌。可以改造的基因包括芳香族氨基酸生物合成相关基因(如aro突变株)、磷酸生物合成相关基因(phoP/phoQ突变株)、腺苷酸环化酶调控相关基因(cyah和cyp突变株)、鸟嘌呤生物合成相关基因(guaBA突变株)、脂多糖生物合成相关基因(galE突变株)、嘌呤生物合成相关基因(purine突变株)等。未来的疫苗菌株可以通过对其DNA序列进行遗传操作而获得适合作为载体的减毒株。
人类和鼠是鼠伤寒沙门氏菌的自然宿主,所述减毒沙门氏菌具体可为敲除鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的芳香族氨基酸生物合成相关基因得到的菌株。具体可通过转座子Tn10插入法(详细步骤见(Liu SL:Physical Mapping ofSalmonella Genomes.In:Methods in Molecular Biology.Edited by SchattenHaE,A.:The Humana Press Inc.;2007)或基因置换法(gene replacement;详细步骤见:White AP,Collinson SK,Burian J,Clouthier SC,Banser PA,KayWW:High efficiency gene replacement in Salmonella enteritidis:chimericfimbrins containing a T-cell epitope from Leishmania major.Vaccine 1999,17:2150-2161)敲除芳香族氨基酸生物合成相关基因。
所述减毒沙门氏菌具体可为鼠伤寒沙门氏菌SL3261。这个菌株已被广泛用于疫苗构建(例如Ugrinovic S,Brooks CG,Robson J,Blacklaws BA,Hormaeche CE,Robinson JH:H2-M3 major histocompatibility complex class Ib-restricted CD8T cells induced bv Salmonella enterica serovar Typhimurium infectionrecognize proteins released by Salmonella serovar Typhimurium.Infect Immun2005,73(12):8002-8008),并可以从Salmonella Genetic Stock Center(www.ucalgary.ca/~kesander)获得。
本发明广泛适用于各种肿瘤,在构建不同肿瘤的疫苗时采取该肿瘤细胞的特异抗原。使用者可根据具体需要(例如不同肿瘤、该肿瘤的各种抗原特征等)制备出所需的肿瘤疫苗。
本发明的肿瘤疫苗,其抗原表位包括诱导抗体表位、CTL表位、T辅助细胞表位等几类。所述抗原表位包括中外科学文献中所有公开发表的天然肿瘤抗原表位和经过实验室分子生物学操作改变了的肿瘤细胞抗原表位。
所述原核细胞表达载体可为在沙门氏菌中所有能表达外源基因的载体,包括pET系列。
由上述方法制备的肿瘤疫苗均属于本发明的保护范围。
本发明的肿瘤疫苗可经口服、鼻黏膜或直肠等不同途径给药。本发明的肿瘤疫苗的用量一般为1-100μg/kg体重/次,每7-30天给药一次,一般共需2-6次。
本发明的肿瘤疫苗是将肿瘤抗原表位基因融合到III型分泌系统效应蛋白基因的下游,使肿瘤抗原表位基因与TTSS基因形成嵌合体,进而由III型分泌系统分泌到宿主细胞质中。这种融合分子与原始效应蛋白一样,可以经TTSS分泌并转运至胞浆。TTSS效应蛋白(或效应蛋白-抗原融合蛋白)可以进入巨噬细胞或树突状细胞等抗原递呈细胞,因此它们和宿主细胞自身表达的一些蛋白或者病毒蛋白相似,能够激发机体产生MHC-1限制性T细胞免疫反应。另外,这些蛋白还可以通过某些未知机制激发机体产生MHC-2限制的T细胞免疫反应。
本发明的肿瘤疫苗具有以下优点:
(1)高效。抗原表达量大而且稳定,可诱导机体产生足够滴度且持续时间长的抗体或特异性T细胞,能显著地增强肿瘤细胞免疫原性。
(2)可以根据需要(如特定的肿瘤、肿瘤抗原的特点等)制备,以应对不同肿瘤。
(3)安全性好。由于所用载体系统是减毒的,因此可以保证其安全性。
(4)所用沙门氏菌的融合蛋白具有佐剂功能,在制备疫苗时不用再添加其他佐剂。
(5)使用简单,通过口服进行接种,因此可大大减少接种时的人工成本。
(6)生产方法简单,便于大规模生产,并且生产成本非常低廉。同时,本发明保存和运输简单,随时可根据需要生产不同的肿瘤疫苗。
本发明的肿瘤疫苗可用于预防肿瘤。
附图说明
图1为PCDB-HBx的XhoI和HindIII双酶切鉴定结果
图2为克隆的HBx基因与参考序列(NC_003977)比对结果
图3A为RT-PCR检测HBx在B16/PCDB-HBx细胞中的稳定表达
图3B为Western Blot检测HBx在B16/PCDB-HBx细胞中的稳定表达
图4为pNSspH-HBx及对照重组质粒构建及表达
(A)NSspH及NSspH-HBx插入片段序列模式;(B)pET-28a(+)原始质粒及pET-NSspH(即pNSspH)重组质粒模式图;(C)SspH2蛋白的表达及转运Western Blot结果。
图5为LDH释放率检测C57BL小鼠经SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH免疫后,测定B16/PCDB-HBx细胞经脾淋巴细胞杀伤后的LDH释放百分率
图6为IFN-γELISPOT检测C57BL小鼠经SL3261/pNSspH-HBx或SL3261/pNSspH免疫后释放IFN-γ的脾淋巴细胞数目(每百万个淋巴细胞)
具体实施方式
本发明以乙型肝炎病毒抗原HBx为例,描述构建以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗的详细方法。本发明选用HBx为例详细说明肿瘤疫苗的构建方法,主要是考虑到如下因素:(1)乙肝病毒感染是公认的重要肝癌危险因素;(2)乙肝病毒导致肝癌的发生发展过程与HBx基因活性有关,HBx已被认为是癌基因;(3)国际上已有大量关于HBx抗原性的报道,因此人们对其了解比较深入;(4)在肝癌组织中,从基因组、转录本到蛋白,HBx检测到的频率明显高于HBs或者HBc(Wang Y,Cui F,Lv Y,Li C,Xu X,Deng C,Wang D,Sun Y,Hu G,Lang Z et al:HBsAgand HBx knocked into the p21 locus causes hepatocellular carcinoma in mice.Hepatology(Baltimore,Md 2004,39(2):318-324;Chisari FV,Ferrari C:Hepatitis B virus immunopathogenesis.Annu Rev Immunol 1995,13:29-60;Takeuchi M,Fujimoto J,Niwamoto H,Yamamoto Y,Okamoto E:Frequent detectionof hepatitis B virus X-gene DNA in hepatocellular carcinoma and adjacentliver tissue in hepatitis B surface antigen-negative patients.Digestivediseases and sciences 1997,42(11):2264-2269;Kobayashi S,Saigoh K,Urashima T,Asano T,Isono K:Detection of hepatitis B virus x transcriptsin human hepatocellular carcinoma tissues.The Journal of surgical research1997,73(2):97-100;Su Q,Schroder CH,Hofmann WJ,Otto G,Pichlmayr R,Bannasch P:Expression of hepatitis B virus X protein in HBV-infected humanlivers and hepatocellular carcinomas.Hepatology(Baltimore,Md 1998,27(4):1109-1120)。
本方法的第一步,是克隆HBx基因,并利用传统的方法(沙门氏菌投递真核表达质粒)检测HBx的免疫原性。以往关于HBx免疫原性的知识是在裸鼠和人鼠嵌合型MHCI分子的小鼠中得到的(Su Q,Schroder CH,Hofmann WJ,Otto G,PichlmayrR,Bannasch P:Expression of hepatitis B virus X protein in HBV-infectedhuman livers and hepatocellular carcinomas.Hepatology(Baltimore,Md 1998,27(4):1109-1120;Malmassari S,Lone YC,Zhang M,Transy C,Michel ML:Invivo hierarchy of immunodominant and subdominant HLA-A*0201-restrictedT-cell epitopes of HBx antigen of hepatitis B virus.Microbes Infect 2005,7(4):626-634;Chun E,Lee J,Cheong HS,Lee KY:Tumor eradication by hepatitisB virus X antigen-specific CD8+T cells in xenografted nude mice.J Immunol2003,170(3):1183-1190),而如果采用其他动物进行实验,由于其免疫原性是未知的,因此要重新进行评价。以下本方法的介绍中,使用的举例实验动物是纯种H2-KbC57BL小鼠(中国医学科学院实验动物研究所)。
肿瘤细胞系是来自该品系小鼠的B16黑色素瘤细胞(http://show.bioon.com/ trade/business_info.asp?info_id=215436)。采取这种组合主要是基于下列考虑:(1)这个肿瘤细胞系源自C57BL小鼠自发肿瘤,不存在免疫排斥问题;(2)比起小鼠肝癌细胞,B16细胞接种及观察均相对容易,因此适合于本方法有效性的评价;以及(3)转染HBx至B16细胞,其表达的检测简单易行。尽管皮肤肿瘤和肝脏肿瘤之间存在着组织学差异,但是根本的CTL机理是一致的。
本方法的第二步,是以TTSS作为沙门氏菌疫苗投递工具、构建HBx疫苗,并对该疫苗的抗肿瘤效果进行评价。本发明首次将这种方法用于肿瘤免疫。实验中选取HBx蛋白作为III型分泌系统效应蛋白中之SspH2的融合抗原及免疫效果检测对象。HBx已成为一种公认的癌基因,它可以促进肝癌的发生及进展。在裸鼠或者转基因鼠体内,已有文献报道HBx的免疫原性及其多肽分子内存在的T细胞表位。实验中通过检测免疫小鼠脾细胞LDH释放、γ-IFN分泌能力以及接种肿瘤的生长情况,检测该疫苗的免疫保护效果。
下面通过实施例具体阐明本发明的肿瘤疫苗制备方法及其效果。
实施例1、肿瘤疫苗的制备及其效果
一、肿瘤疫苗的制备
该肿瘤疫苗为重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261/pNSspH-HBx,具体的制备方法如下:
1、材料
(1)细菌及细胞培养:
鼠伤寒沙门氏菌SL3261已被广泛用于疫苗构建(例如(Ugrinovic S,BrooksCG,Robson J,Blacklaws BA,Hormaeche CE,Robinson JH:H2-M3 majorhistocompatibility complex class Ib-restricted CD8 T cells induced bySalmonella enterica serovar Typhimurium infection recognize proteinsreleased by Salmonella serovar Typhimurium.Infect Immun 2005,73(12):8002-8008),并可以从Salmonella Genetic Stock Center(www.ucalgary.ca/~kesander)获得)。细菌培养于营养肉汤或Luria Bertani肉汤(详细成分见文献(Liu SL,Sanderson KE:A physical map of the Salmonellatyphimurium LT2 genome made by using XbaI analysis.J Bacteriol 1992,174(5):1662-1672)),必要时肉汤中加入1.5%的琼脂做成平板。根据需要,添加抗生素氨苄西林(Amp)100μg/ml。
小鼠B16黑色素瘤细胞培养于RPMI1640(Invitrogen)+10%小牛血清(Invitrogen/Gibco),RAW264.7细胞培养于DMEM(Invitrogen)+10%小牛血清。细胞生长至70%汇合,胰酶消化传代。
2、稳定表达HBx的肿瘤细胞构建
(1)HBx基因扩增、克隆、转染及转化:HBV感染病人血清取血于急性乙肝发病期,利用DNAout试剂(天来生物,北京)提取血清HBV基因组DNA,引物HBx-up-1(序列为5’CGCCTCGAGATGGCTGCTAGGGTGTGCTG3’)及HBx-down-1(序列为5’CGCAAGCTTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCAGAGGTGAAAAAGTTG3’)扩增HBx基因,并在其3’末端引入6个组氨酸标签。XhoI和HindIII(Takara,大连)双酶切PCR产物,克隆至pCDNA3.1质粒(Invitrogen)的XhoI和HindIII识别位点间,将该连接产物转化Escherichia coli DH5α细胞(天根),在含有100μg/ml氨苄西林的LB平板(Liu SL,Sanderson KE:A physical map of the Salmonella typhimuriumLT2 genome made by using XbaI analysis.J Bacteriol 1992,174(5):1662-1672)筛选阳性克隆,提质粒酶切并测序鉴定。得到的重组质粒(即载有HBx的质粒)记作PCDB-HBx。PCDB-HBx及对照pCDNA3.1质粒(简称为PCDB)用酶XhoI和HindIII(Takara,大连)双切后的电泳结果如图1所示。其中,泳道1和4分别为1kb和100bp Marker,泳道2为对照质粒PCDB,泳道3为PCDB-HBx。结果表明PCDB-HBx经XhoI和HindIII双酶切后得到5.5kb的载体片段和500bp的HBx片段;PCDB经XhoI和HindIII双酶切后只得到5.5kb的载体片段。克隆的HBx基因序列如图2所示,Query:克隆的HBx基因测序结果;Sbjct:HBV参考序列(NCBI参考序列号:NC_003977)。克隆的HBx基因序列与GenBank参考序列NC_003977具有91%的核酸序列一致性。
分别转染PCDB-HBx及对照PCDB至B16细胞,得到PCDB-HBx转染的重组细胞B16/PCDB-HBx和PCDB转染的重组细胞B16/PCDB,具体方法参考转染试剂产品说明(梭华转染试剂盒,北京天来公司代理)。简述如下:接种细胞于24孔板培养,待细胞生长至70%汇合后,各孔加入转染试剂和2μg的PCDB-HBx或PCDB,37℃孵育6小时,更换培养液。24小时后,每孔加入800ug/ml G418(Amresco)并维持此浓度筛选72小时,此后逐渐减低浓度维持两周。挑选单克隆细胞分离培养,利用RT-PCR及Western Blot验证所得细胞株HBx的表达。
(2)稳定表达HBx的肿瘤细胞的获得:
RT-PCR及Western blot:分别收集转染细胞B16/PCDB-HBx和B16/PCDB细胞,提取总RNA,使用引物HBx-up-3(序列为5’CCCGTCTGTGCCTTCTCATC3’)和HBx-down-3(序列为5’CCAATTTATGCCTACAGCCTCC 3’扩增片段长度为241bp)通过RT-PCR检测HBx的表达。RT-PCR使用high-plus试剂盒(Toyobo,日本),程序及步骤参照相应产品手册。其中,同一反应体系中加入两对引物:HBx序列特异的HBx-up-3和HBx-down-3(预期扩增片段长度为241bp);对照G3PDH特异引物G3PDH-F(序列为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’)和G3PDH-R(序列为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’)(预期扩增片段长度为450bp)。结果如图3A所示,泳道2和3分别代表B16/PCDB-HBx细胞(泳道2)和B16/PCDB细胞(泳道3)的RT-PCR结果。
裂解B16/PCDB-HBx及B16/PCDB细胞,提取细胞蛋白、定量,用12%的SDS-PAGE分离蛋白。电转蛋白至PVDF膜,使用1∶1000稀释的兔抗鼠anti-6His单克隆抗体(Tiangen,北京)作为一抗检测His标签的HBx蛋白表达。二抗使用辣根过氧化物酶耦连的羊抗兔IgG(1∶2000,博奥通,北京)。β-actin作为内参,使用兔抗鼠β-actin单克隆抗体(1∶1000,博奥通,北京)作为一抗。结果如图3B所示,左侧泳道为B16/PCDB-HBx细胞,右侧泳道为B16/PCDB细胞,表明用anti-6His只有B16/PCDB-HBx细胞检测到杂交条带。
同蛋白参考序列相比,本实验克隆的HBx预测编码蛋白氨基酸序列存在一个C末端8-aa片段的缺失和少数点突变(见图2)。这些突变没有影响HBx序列中已经鉴定的或者预测出的可能免疫表位。同时,通过免疫表位信息分析,在HBx基因碱基序列3’端增加的6组氨酸标签也不会改变HBx的表位谱。RT-PCR(图3A)证实了在一个PCDB-HBx转染的单克隆细胞中HBx稳定表达(241bp条带),而在PCDB转染细胞中则不见HBx条带。Western blot(图3B)同样证实在PCDB-HBx转染细胞(B16/PCDB-HBx)中HBx蛋白能够稳定表达(约17kDa条带)。
3、重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261/pNSspH-HBx的获得
(1)SspH2-HBx融合蛋白表达质粒的构建:热裂解法提取Salmonellatyphimurium SL3261的基因组DNA,以此作为模板,使用引物NSspH-pro(序列为5’GACAGATCTAGTTGCCTGATACGGATGAAAACC3’)及NSspH-rev(序列为5’GACGAATTCGGTAAGACCTGATTCTCCCAC3’)PCR扩增SspH2片段(+1-642碱基)连同启动序列(-361-0碱基),得到的片段(简称NSspH),经测序验证;sspH的核苷酸序列为GenBank Accession Number NC_003197的自5′末端第866583位至第867585位碱基。
该PCR产物经BglII和EcoRI(Takara,大连)双酶切,克隆至pET-28a(+)质粒(Novagen)的BglII和EcoRI位点间,得到重组质粒pNSspH。利用PCDB-HBx作为模板,引物HBx-up-2(序列为5’GACGAATTCATGGCTGCTAGGGTGTGCTGC3’)和HBx-down-2(序列为5’GTCCTCGAGGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCA3’)重新PCR扩增HBx,得到产物经EcoRI和XhoI(Takara,大连)消化,连入pNSspH的EcoRI和XhoI位点之间,得到重组质粒pNSspH-HBx。将pNSspH-HBx及pNSspH分别转化至大肠杆菌DH5α,经卡那霉素(50μg/ml)筛选及提质粒酶切鉴定,最终通过测序鉴定重组质粒内插入的片段序列。NSspH及NSspH-HBx插入片段序列模式如图4A,其中,SspH2promoter(-361-0)的核苷酸序列为GenBank Accession Number NC_003197)的自5′末端第866583位至第866943位碱基;SspH2(1-642)的核苷酸序列为GenBankAccession Number NC_003197的自5′末端第866944位至第867585位碱基;HBx的核苷酸序列如图2所示。
图4B显示了pNSspH及其原始质粒pET-28a的结构模式(pNSspH-HBx进一步由pNSspH和HBx重组而成)。
实验中所用的原始质粒及上述重组质粒归纳于表1。
用电击转化(Bio-Rad电转仪)将pNSspH-HBx及pNSspH分别转入到鼠伤寒沙门氏菌SL3261,将含有pNSspH-HBx的鼠伤寒沙门氏菌SL3261命名为SL3261/pNSspH-HBx,含有pNSspH质粒的鼠伤寒沙门氏菌SL3261命名为SL3261/pNSspH。为检测SspH2-HBx融合蛋白的表达及鼠伤寒沙门氏菌SL3261将该融合蛋白转运至胞浆的能力,将SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH分别与RAW264.7细胞共孵育,再分离细胞内入侵的细菌和细胞胞浆蛋白,分别进行Westernblot。具体方法如下:SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH分别在LB肉汤中,37℃剧烈震荡培养3小时;100mm直径的培养皿中RAW264.7细胞生长至70%汇合,弃去培养液,加入Hanks平衡盐溶液(HBSS)孵育1小时;按照30∶1的细菌∶细胞比例(个数比)将上述震荡培养的SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH分别均匀加入到RAW264.7细胞中。细胞、细菌共培养1小时,弃去皿中HBSS液,用新鲜HBSS洗涤细胞5次,用DMEM培养基培养细胞30分钟。最初感染18小时后,收集细胞,利用0.01%Triton X-100溶液裂解细胞,离心,收集上清(Triton X-100溶解部分,含有胞浆内细菌转运蛋白)和沉淀(Triton X-100不溶部分,含有胞内不溶的细菌蛋白),定量,10%SDS-PAGE分离及进行Western blot。一抗用Tiangen公司的anti-6His单克隆抗体,二抗及Western blot方法同上述。
表1.SspH2-HBx构建所用质粒
质粒名称 | 描述 | 来源 |
pCDNA3.1质粒PCDB-HBxpET-28a(+)pNSspHpNSspH-HBx | 真核质粒HBx全序列插入到pCDNA3.1质粒,带有组氨酸标签原核细胞质粒,带有组氨酸标签和T7启动子SspH2基因的第1-642碱基及其启动子(从-361至-1碱基)克隆到了pET-28a,无组氨酸标签HBx融合于pNSspH中的NSspH之下游,其下游连有组氨酸标签 | InvitrogenNovagen |
结果如图4C所示,SL3261/pNSspH-HBx感染细胞18小时后,入侵细胞的细菌菌体表达SspH2-HBx融合蛋白,而RAW264.7胞浆中也检出大约等量的融合蛋白;SL3261/pNSspH感染细胞中未见SspH2-HBx融合蛋白条带。
图4中,泳道1和2分别反映SL3261/pNSspH-HBx感染细胞后细菌体内表达蛋白(Triton X-100不溶部分煮沸后上样)和感染细胞胞浆蛋白(Triton X-100溶解部分);泳道3和4分别反映SL3261/pNSspH感染细胞后细菌体内表达蛋白(TritonX-100不溶部分煮沸后上样)和感染细胞胞浆蛋白(Triton X-100溶解部分)。
4、本发明肿瘤疫苗的效果
(1)免疫小鼠
C57BL小鼠,雌性,6-8周龄,用于LDH释放及ELISPOT检测(免疫指标组)。利用钝端灌胃针分别口饲小鼠SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH。每只小鼠给予108CFU的细菌。间隔14天,经口重复免疫小鼠一次。SL3261/pNSspH-HBx共免疫小鼠18只,SL3261/pNSspH共免疫小鼠18只。
(2)CTL活性检测
SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH末次免疫2周后,处死小鼠,取出脾脏,分离淋巴细胞。将免疫小鼠的脾淋巴细胞作为效应细胞,将B16/PCDB-HBx细胞作为靶细胞,测定B16/PCDB-HBx细胞经免疫小鼠的脾淋巴细胞杀伤后的LDH释放百分率。实验共设三次重复,每个重复中,SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH免疫小鼠各3只。
脾细胞抗原刺激程序如下:SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH末次免疫2周后小鼠的脾脏,去除红细胞后,取脾淋巴细胞(1×106个细胞/ml)作为效应细胞。以丝裂霉素C处理的B16/PCDB-HBx细胞(1×106个细胞/ml)为靶细胞。按照效应细胞与靶细胞的个数比(效靶比)E∶T=20∶1及80∶1,分别将效应细胞与B16/PCDB-HBx细胞(5×105个细胞/ml)共同种植于96孔板(每组4平行复孔),37℃孵育4小时,800×g离心10分钟,取上清检测LDH释放量。
每孔吸出150μl上清液,对应加入另一块96孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液、20μl 4mmol/L-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑,20μl反应液(含0.03%BSA,2.7U/ml硫辛酰胺脱氢酶,4.5mmol/L氢化型辅酶I(NAD+),1.2%蔗糖的PBS),室温中放置20分钟。在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值),检测波长492nm,参考波长650nm。
特异性杀伤活性的计算
杀伤活性(%)=[(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)]×100%。
LDH释放检测结果如图5所示,表明经SL3261/pNSspH-HBx疫苗免疫后,小鼠脾淋巴细胞杀伤B16/PCDB-HBx细胞引起的LDH释放率在效靶比E∶T=20∶1和80∶1时均明显高于SL3261/pNSspH免疫小鼠(图5)。图5中,纵坐标表示LDH释放百分数值(%);E∶T表示效靶比;pNSspH表示SL3261/pNSspH免疫小鼠的结果,pNSspH-HBx表示SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠的结果。
(3)小鼠IFN-γELISPOT检测
末次免疫2周后,处死小鼠,取出脾脏,分离淋巴细胞,进行IFN-γELISPOT检测。实验共设三次重复,每个重复中,SL3261/pNSspH-HBx和SL3261/pNSspH免疫小鼠各3只。
ELISPOT程序参考试验试剂盒产品说明(mouse IFN-γELISPOT kit,U-CyTech,荷兰)。简述如下:去除红细胞的小鼠脾淋巴细胞与丝裂霉素C处理的B16/PCDB-HBx细胞(按1∶1的个数比)在含25U/ml rmIL-2(U-CyTech,荷兰)的培养基中共孵育5天。经B16/PCDB-HBx细胞刺激的淋巴细胞按4平行复孔(106个细胞/孔)加入包被有抗小鼠IFN-γ抗体(mouse IFN-γELISPOT kit自带)的96孔平板。37℃孵育24小时,洗涤各孔,加入生物素标记检测抗体(mouse IFN-γELISPOT kit自带),37℃孵育1小时。加入酶标亲和素(mouse IFN-γELISPOT kit自带),用AEC显色液(mouse IFN-γELISPOT kit自带)显色。利用ELISPOT斑点计数仪计数形成的斑点。结果如图6所示,SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠的脾细胞经抗原刺激后,每106个淋巴细胞形成的斑点数明显高于SL3261/pNSspH免疫小鼠的脾细胞。
图6中,横坐标代表每106个脾淋巴细胞中斑点形成细胞数;pNSspH表示SL3261/pNSspH免疫小鼠的结果,pNSspH-HBx表示SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠的结果。
(4)肿瘤接种及生长抑制观察:
末次免疫2周后,取SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠3只,SL3261/pNSspH免疫小鼠3只,每只右侧腋下皮下分别接种B16/PCDB-HBx细胞,每只小鼠接种1×105个(70%汇合生长的细胞重悬于100ulPBS)。起始每日观察小鼠体征,每隔2日触摸小鼠肿瘤生长情况。1周后,改为每日一次触摸小鼠肿瘤生长情况。等到可触及第一例小鼠肿瘤长出时,每日利用夹径器测量并记录各小鼠的肿瘤长径及宽径,记录1周。根据下述公式估算肿瘤体积:1/2(长径×宽径2)。记录1周以后,处死小鼠,称量小鼠体重,剥瘤,观察并称重,计算瘤重指数,公式如下:瘤重指数=瘤重/体重。
结果表明肿瘤接种后第13天,SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠和SL3261/pNSspH免疫小鼠均开始可以触摸肿瘤的生长。第13-19天,每日记录肿瘤的体积。取第17、18和19天的平均肿瘤体积进行比较分析,发现SL3261/pNSspH-HBx免疫小鼠肿瘤体积均显著小于SL3261/pNSspH免疫小鼠(p<0.01)。第19天将小鼠全部处死,测算各组平均瘤重指数,得出与肿瘤体积一致的结论。
Claims (10)
1.一种肿瘤疫苗,它的活性成分是重组减毒沙门氏菌,所述重组减毒沙门氏菌的构建方法包括以下步骤:
1)构建表达如下融合蛋白的重组原核细胞表达载体;所述融合蛋白由沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区和肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位组成;所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白为SPI-2 TTSS;
所述重组原核细胞表达载体是将所述融合蛋白的编码基因导入原核细胞表达载体的多克隆位点得到的;
2)将所述重组原核细胞表达载体导入减毒沙门氏菌中,得到表达所述融合蛋白的重组减毒沙门氏菌。
2.一种制备权利要求1所述肿瘤疫苗的活性成分的方法,包括以下步骤:
1)构建表达如下融合蛋白的重组原核细胞表达载体;所述融合蛋白由沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区和肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位组成;所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白为SPI-2 TTSS;
所述重组原核细胞表达载体是将所述融合蛋白的编码基因导入原核细胞表达载体的多克隆位点得到的;
2)将所述重组原核细胞表达载体导入减毒沙门氏菌中,得到表达所述融合蛋白的重组减毒沙门氏菌,所述重组减毒沙门氏菌即为肿瘤疫苗的活性成分。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述融合蛋白中,所述肿瘤的至少一个蛋白质抗原或蛋白质抗原表位融合在所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区的羧基末端。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述融合蛋白中,所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis或伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi,或沙门氏菌属第I、II、IIIa、IIIb、IV、VI或VII亚群中其它种的沙门氏菌。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述沙门氏菌的III型分泌系统效应蛋白的N侧信号区来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium。
6.根据权利要求2至5中任一所述的方法,其特征在于:所述减毒沙门氏菌来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、Salmonella enterica subsp.enterica serovars、Salmonella enterica subsp.salamae serovars、Salmonellaenterica subsp.arizonae serovars、Salmonella enterica subsp.diarizonaeserovars、Salmonella enterica subsp.houtenae serovars或Salmonella entericasubsp.VI serovars。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述减毒沙门氏菌是敲除鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的芳香族氨基酸生物合成相关基因得到的菌株。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述减毒沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌SL3261。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述抗原表位包括诱导抗体表位、CTL表位和T辅助细胞表位。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述抗原表位为乙型肝炎病毒抗原HBx。
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