CN105377276A - 用于治疗和/或预防癌症的沙门氏菌菌株 - Google Patents

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P·济奇林斯基
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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防癌症复发/发展的药物组合物，其包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体。优选地，所述癌症为膀胱癌。

Description

用于治疗和/或预防癌症的沙门氏菌菌株
技术领域
本发明涉及包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型(Salmonellaentericaserovartyphi)菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力(non-viable)的减毒非重组突变体的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症。优选地，所述癌症为膀胱癌。
背景技术
在欧洲和美国，膀胱癌是男性中排第四位的最常见的癌症病因。3/4的肿瘤被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)并局限于膀胱粘膜中。根据具体的肿瘤阶段和级别特征，使用卡介苗(BCG)的膀胱内(ives)免疫疗法部分地限制了这些肿瘤在经尿道内窥镜切除手术后复发和可能发展的高的倾向。BCG减少膀胱癌的复发和发展。但是，在接近90％的患者中出现与BCG细菌感染膀胱组织并可能扩散的能力或所诱导的强炎症相关的副作用，范围从膀胱炎到败血症和死亡。
BCG的精确作用机理仍然未知。但是，已证明在膀胱内滴注后BCG感染尿道上皮细胞和癌细胞并被其内化，引起导致抗肿瘤应答的炎性细胞和细胞因子的大量涌入(综述参见Askeland,Newton,O'Donnell,&Luo,2012)。在临床试验或动物模型中对一些策略进行了测试，所述策略例如将细胞因子与BCG结合，降低BCG的剂量，使用分枝杆菌细胞壁替代BCG，或使用toll样受体(TLR)激动剂刺激免疫系统(综述参见Kresowik&Griffith,2009)，但是迄今为止BCG仍是减少NMIBC复发/发展的最佳选择。两项使用ivesTLR激动剂的研究已在MB49原位膀胱癌模型中证明了治疗潜力，第一项研究证明CpG——一种TLR9激动剂——优于BCG疗法(Mangsbo,Nanalga,Essand,Loskog,&Totterman,2008)，第二项研究证明在该模型中R-837具有抗肿瘤作用(Hayashietal.,2010)。类似地，Seow等人最近也已报道了ives乳杆菌的抗肿瘤作用(Seowetal.,2010)。
已进行了大量尝试，以开发包含减毒重组细菌和/或减毒肿瘤靶向细菌(特别是减毒的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi))的组合物，用于抑制实体瘤癌症的生长或减小其体积，例如WO03/063593(VionPharmaceuticals)、US2007/0298012(I.King&L.-M.Zheng)、WO2009/098246(AeternaZentarisGmbH)、WO2006/076678(Univ.JohnHopkins)，但是这些尝试都未能在人类临床试验中获得可持续的功效(Chorobik,Czaplicki,Ossysek,&Bereta,2013)。
基于这些原因，仍需要提供比BCG更安全、更有效的组合物以治疗癌症，特别是膀胱癌。
发明内容
本发明涉及包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物，其用于治疗和/或预防膀胱癌。
本发明还提供了用于诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
另一目的涉及治疗和/或预防膀胱癌的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物，其中所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
本发明的其他目的是提供诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
还提供了肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体用于制备用于治疗和/或预防膀胱癌的药物的用途，其特征在于所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
附图说明
图1：BCG或Ty21a处理时原位膀胱肿瘤消退的比较。在22％的EtOH预处理之后，用200’000个MB49-luc细胞对10-20只雌性C57BL/6小鼠组进行ives滴注(第0天)。使用能够检测生物发光的体内成像系统Xenogen监测肿瘤生长，在第8天荷瘤小鼠的代表性结果如(A)所示。在第1、8、15和22天，使用不同剂量的BCG或Ty21a对小鼠组进行ives处理，同时一组小鼠保持未处理。所述处理的范围从Ty21a初始胶囊或BCG小瓶的1/10(B)，到1/100和1/1000(C)。示出了每一组的随时间的小鼠存活百分数。经校正的对数秩检验之后的显著性差异表示为：在B中*p<0.025或*<0.0125，**p<0.0025，在C中***p<0.00025。
图2：Ty21a或BCG处理后细菌从膀胱的回收。在第0天使用Ty21a对7组小鼠(每组4只)进行ives激发(平均值±SEM1.3×108±4.3×107CFU/小鼠)(A)。在第-1天使用200’000个MB49-luc细胞对6组小鼠进行ives激发，并在24h之后，在第0天用Ty21a处理(平均值±SEM3.9×108±2.4×108CFU/小鼠)(B)或用BCG(2-8×107CFU/小鼠)(C)处理。在感染后的不同时间点处死小鼠。处理膀胱并将其置于盘中，如材料和方法中所述。数据被表示为CFU数/组织。水平线代表平均应答。
图3：单剂量Ty21a之后健康膀胱中的先天和适应性免疫应答的特征。在第0天使用Ty21a(平均值±SEM1.3×108±4.3×107CFU/小鼠)对小鼠组(每组5只)进行ives激发，并在处理后的不同时间点处死小鼠。增加一组4只首次用于实验的小鼠(mouse)。回收膀胱细胞，进行流式细胞术染色。使用aquadead试剂盒排除死细胞。示出了先天免疫细胞(A)：嗜中性粒细胞、NK、巨噬细胞和DC’s，以及适应性免疫细胞(B)：CD4和CD8T细胞的百分数。水平线代表平均百分数。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验之后表示出不同时间点和首次用于实验的小鼠之间的显著性差异，*p<0.05。
图4：单剂量Ty21a之后健康膀胱中的先天和适应性免疫应答的特征。在第0天使用200’000个MB49-luc细胞对小鼠组(每组4至10只)进行ives激发，并在第1、8、15和22天用PBS或1/10的BCG或Ty21a处理。在不同的时间点——每次处理后24h或7天以后处死小鼠。处理并回收膀胱癌细胞，进行流式细胞术染色。使用aquadead试剂盒排除死细胞。在每个时间点的先天免疫细胞(A)：嗜中性粒细胞、NK、巨噬细胞和DC’s，以及适应性免疫细胞(B)：CD4和CD8T细胞的百分数代表整体的一部分。在每个饼形图的下方表示出所有细胞群的百分数的总和。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验之后表示出显著性差异，*p<0.05。
图5：MB49凋亡和坏死细胞群的百分数。使用不同MOI的Ty21a感染MB49细胞系，24h或72h之后回收细胞，进行AnnexinV和7AAD染色并通过流式细胞术进行分析。代表性的图如(A)所示。数据代表每个细胞群的百分数：早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示(B)。在双因素Anova之后，处理和对照细胞之间的显著性差异是由***p<0.001或****p<0.0001表示。
图6：MB49细胞分泌的炎性细胞因子的浓度。使用不同MOI的Ty21a感染MB49细胞系，24h后使用鼠炎症试剂盒分析细胞上清液的炎性细胞因子，以检测和定量IL-12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子。检测到两种细胞因子：MCP-1和IL-6。每个柱对应于相应处理的细胞因子浓度；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验之后，每次处理和对照(MOI0)之间的显著性差异是由*p<0.05、***p<0.001和****p<0.0001表示。
图7：人尿道上皮细胞系分泌的炎性细胞因子的浓度。使用不同MOI的Ty21a感染两种人尿道上皮细胞系RT4(A)和RT112(B)，24h后使用炎症试剂盒分析细胞上清液的炎性细胞因子分泌，以检测和定量IL-12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子，或使用人炎症试剂盒进行分析以检测和定量IL-12p70、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8。每个柱对应于相应处理的细胞因子浓度；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验之后，每次处理和对照(MOI0)之间的显著性差异是由*p<0.05、***p<0.001和****p<0.0001表示。
具体实施方式
尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发明，但适合的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式全文纳入本文。提供本文所讨论的出版物和申请，仅因为它们的公开先于本申请的申请日。本文不应被解释为承认本发明由于在先发明而没有资格早于这些出版物。此外，所述材料、方法和实施例只是举例说明性的，而不意欲进行限制。
除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明主题所属技术领域的技术人员通常所理解的含义相同。提供本文使用的以下定义，以促进对本发明的理解。
术语“包含(comprise)”或“包括(comprising)”通常用作“包括(include/including)”的意义，即允许存在一个或多个特征或组分。此外，术语“包括”也包含术语“由……组成”。
除非上下文中另有明确说明，说明书和权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。
本文使用的“至少一个”意指“一个或多个”。
出乎意料地，本发明的申请人已证明包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的(有活力的)减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症。
所述癌症可选自非限制性癌症组，其包括黑色素瘤、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑脊膜瘤、腺癌、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellularcancer)、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、肝细胞瘤(hepatoma)、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈癌。
优选地，所述癌症为膀胱癌，最优选地为非肌层浸润性膀胱癌。
在膀胱癌的情况下，本发明的药物组合物优选地被局部给予到膀胱，最优选地通过滴注(例如通过膀胱内滴注(ives))。
可所述药物组合物局部给予到膀胱数次。初始给药(首次给药)之后，可每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周再给予本发明的药物组合物，但是优选每1-2周再给予。例如，可每1周对患者进行治疗，使其接受最多6次滴注，取决于药物组合物和待治疗的癌症。
根据待治疗的癌症，其他给药途径也可以是适合的。所述药物组合物的给药形式可以是全身或局部的。例如，本发明的药物组合物可通过任何方便的途径给予，包括口服、含服(buccal)、舌下、胃肠外、经皮、阴道、直肠等。
通常，使用本发明的药物组合物进行的治疗在于减少或限制癌症(例如膀胱癌)的复发和/或发展。
本文使用的“减毒沙门氏菌菌株”是指沙门氏菌突变体，即不同于野生型，当以药物有效剂量给予时其基本上不感染/存留于组织中并且基本上不能够恢复为完整的毒力。优选地，本发明的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒突变体是非重组的。该术语“非重组的”是指这些菌株不含有来自其他属或种的基因和/或不表达重组蛋白。这不同于现有技术(特别是以下专利文件)中已知的内容：US2007/0298012(I.King&L.-M.Zheng)；WO2009/098246(AeternaZentarisGmbH)；WO2006/076678(Univ.JohnHopkins)；US6,962,696(D.Bermudesetal.)；WO98/15631(Fond.pourleperfectionnementetlarechercheengynécologie-obstétrique)；WO2008/091375(美国政府)和WO2005/123762(IndianImmunologicalsLtd)。在以上提及的专利/专利申请中所述的菌株都是重组菌株，因为它们含有来自其他属或种的基因和/或表达重组蛋白，并且所述沙门氏菌菌株被用作靶向肿瘤的载体。通常，以上现有技术中所述的菌株中含有的来自其他属或种的基因编码针对肿瘤或癌细胞的重组蛋白。
“药物有效剂量”是指当被给予至人或动物生物体时诱导可检测的药理学和/或生理作用的化学物质或化合物。在本发明中，药物有效剂量的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体诱导有效的肿瘤或癌症消退(regression)和/或对肿瘤或癌症的复发/发展的限制。
通常，与适合的对照相比，本发明的药物组合物可显著使肿瘤的大小或体积减少2％或更多，3％或更多，4％或更多，5％或更多，例如10％或更多，例如20％或更多，例如30％或更多，例如50％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，或显著减少复发肿瘤的组织学阶段(例如从低到高阶段)。
肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物有效剂量可由本领域技术人员确定，并且可以基于患者的临床状况，以及药物组合物的效力、佐剂或制剂的使用和类型、给药途径和方案、接受者的免疫状态、体重等。优选地，所述药物组合物包含溶于可药用载体或稀释剂(例如但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS))中的具有至少约1×108菌落形成单位和1×108细菌细胞，更优选1×109菌落形成单位和1×109细菌细胞，甚至更优选2×109菌落形成单位和5×109细菌细胞的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体。
减毒沙门氏菌菌株现已在用于癌症治疗的小鼠模型中使用多年，这是由于它们的特异性靶向肿瘤细胞的独特能力：这些细菌是能够在含氧量低或坏死的肿瘤区域中生长的兼性厌氧菌，导致小鼠中的肿瘤消退(综述参见Wall,Srikanth,&McCormick,2010)。但是，这种情况并未出现在癌症患者中，在其中静脉注射减毒的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株未显示优先的肿瘤定植(colonization)和/或随后的肿瘤消退的诱导(Tosoetal.,2002)。不同于该出版物和现有技术，本发明的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体不在癌组织(例如膀胱癌组织)中生长，如实施例2所示。因此，本发明的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体不存留于肿瘤或癌组织中，这不同于现有技术中已知的情况。
通常，本发明的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09或χ9633、χ9639和χ9640、χ8444。
这些菌株记载于以下文献中：LevineMM,TacketCO,SzteinMB.Host-Salmonellainteraction:humantrials.MicrobesInfect2001；3:1271–9；LevineMM.Typhoidfevervaccines.In:PlotkinSA,MortimerEA,eds.Vaccines,2nded.Philadelphia:W.B.Saunders,1994:597–633；CrumpJA,LubySP,MintzED.Theglobalburdenoftyphoidfever.BullWorldHealthOrgan2004；82:346–53；LevineMM,GalenJE,TacketCO,BarryEM,PasettiMF,SzteinMB.AttenuatedstrainsofSalmonellaentericaserovarTyphiasliveoralvaccinesagainsttyphoidfever.In:LevineMM,KaperJB,RappuoliR,LiuM,GoodM,eds.Newgenerationvaccines,3rded.NewYork:MarcelDekker,2004:479–86；ShiH,SantanderJ,BrennemanKE,WandaSY,WangS,SenechalP,SunW,RolandKL,CurtissR.LiverecombinantSalmonellaTyphivaccinesconstructedtoinvestigatetheroleofrpoSinelicitingimmunitytoaheterologousantigen.PLoSOne.2010Jun18；5(6))。这些文章的教导全文纳入本文。
优选地，所述非重组肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株为Ty21a。Ty21a通常以已知安全的口服疫苗形式存在(Begier,Burwen,Haber,Ball,&VaccineAdverseEventReportingSystemWorking,2004；Engels,Falagas,Lau,&Bennish,1998)，并且如果发生全身感染，Ty21a对抗生素非常敏感。之前已证明，人Ty21a的口服免疫诱导特异性的CD8T细胞，其分泌炎性细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-2。在小鼠中，已证明其他减毒的伤寒沙门氏菌菌株可诱导Th1型免疫应答。
不同于该出版物和现有技术，本发明的肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体i)未用来自其他属或种的基因转化；ii)不表达一种或多种异源蛋白或抗原；和/或iii)不充当疫苗载体。
参照实施例，申请人进行了对ivesTy21a和BCG治疗使已建立的小鼠原位MB49-luc肿瘤消退的能力的并列比较，表明Ty21a具有更好的功效，因为使用1/100剂量时维持了有效的肿瘤消退。
已进行了在先的研究来试图替代对膀胱癌的BCG治疗。使用TLR-9激动剂CpG时，不同的研究已证明同时使皮下(s.c.)(Hegeleetal.,2004；Loskogetal.,2005)或膀胱(Hegeleetal.,2005；Mangsboetal.,2008；Ninalga,Loskog,Klevenfeldt,Essand,&Totterman,2005)MB-49肿瘤消退的能力。但是，仅Mangsbo等人(Mangsboetal.,2008)证明这种疗法优于BCG。检验其他细菌菌株的作用的研究使用了益生菌(probiotic)。热灭活的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)(Takahashietal.,2001)或活的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)GG(Seowetal.,2010)的ives滴注导致与BCG相似的膀胱肿瘤消退。本发明人的数据表明，在用Ty21a处理的健康膀胱中，可观察到嗜中性粒细胞和巨噬细胞的短暂浸润。此外，在滴注后一周，CD4T细胞的频率增加。在患者的ivesBCG治疗的过程中，存在于膀胱内的主要免疫细胞群是嗜中性粒细胞，相当于尿液中存在的细胞的75％，然后是巨噬细胞和NK细胞(DeBoeretal.,1991)。在小鼠中，在早期时间点，BCG诱导急性膀胱炎症，其具有嗜中性粒细胞的重要浸润，到第21至28天，巨噬细胞显著增加(Sabanetal.,2007)。此外，与本发明人使用Ty21a的观察结果相比，在这些小鼠中存在膀胱水肿形成，并且在治疗中止之后炎症水平维持最长达三周。因为细菌不存留于膀胱中，炎性细胞浸润是短暂的。申请人已表明Ty21a诱导比BCG更少的副作用，BCG存留于膀胱中并诱导重要的炎症反应，导致患者所遭受的大部分副作用(Alexandroff,Jackson,O'Donnell,&James,1999)。此外，Ty21a不能感染鼠和人尿道上皮细胞系，表明在人体中，Ty21a不能感染尿道上皮细胞，降低了扩散的风险并提高了安全性。
本发明的药物组合物中使用的具体可药用载体和/或稀释剂在本领域中是常规的。稀释剂的实例包括：用于缓冲胃中的胃酸的缓冲剂，例如包含蔗糖的柠檬酸盐缓冲剂(pH7.0)、单独的碳酸氢盐缓冲剂(pH7.0)(Blacketal.,1990；Levine,Ferreccio,Black,Tacket,&Germanier,1989)，或包含抗坏血酸、乳糖和任选的阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲剂(pH7.0)(Levineetal.,1988)。载体的实例包括：蛋白质，例如在脱脂乳中存在的蛋白质；糖类，例如蔗糖；或聚乙烯吡咯烷酮。
例如，药物组合物(TyphoidVaccineLiveOralTy21a)包含在处于受控条件下的发酵罐中的培养基中生长的Ty21a菌株，所述培养基包含酵母提取物的消化产物、酪蛋白的酸消化产物、葡萄糖(dextrose)和半乳糖。然后通过离心收集细菌，与包含蔗糖、抗坏血酸和氨基酸的稳定剂混合，并冻干。将冻干的细菌与乳糖和硬脂酸镁混合，并填充到明胶胶囊中，所述胶囊被有机溶液包被以使其抵抗胃酸的溶解作用。
一粒(TyphoidVaccineLiveOralTy21a)*的肠溶胶囊的内容物如表1所示。
表1
有活力的伤寒沙门氏菌Ty21a 2-6.8×109菌落形成单位*
无活力的伤寒沙门氏菌Ty21a 5-50×109细菌细胞
蔗糖 26-130mg
抗坏血酸 1-5mg
氨基酸混合物 1.4-7mg
乳糖 100-180mg
硬脂酸镁 3.6-4.4mg
*来源：FDA的制造商(Crucell)说明(2006版)
如果要通过ives滴注来给予肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株Ty21a，则将Ty21a的口服疫苗Vivotif的胶囊，例如，在缓冲液中复原，所述缓冲液优选PBS，最优选无菌PBS。
可选地或额外地，本文所述的本发明组合物可单独给予或与其他治疗、疗法或试剂组合给予(同时或惯序)，取决于待治疗的癌症。例如，本发明的组合物可与放射疗法、化学疗法或免疫疗法联合给予。
本发明还涉及诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
通常，本发明的药物组合物在给定浓度下可特异性地增加癌细胞中的细胞凋亡。例如，与合适的对照相比，本发明的方法可将癌细胞中的细胞凋亡率提高2％或更多，例如5％或更多，例如10％或更多，例如25％或更多，例如50％或更多，例如75％或更多，例如100％。
本发明还涉及肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体用于制备用于治疗和/或预防膀胱癌的药物的用途，其特征在于所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤或癌症组织中存留。优选地，所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
本发明还包括治疗和/或预防癌症(特别是膀胱癌)的方法，所述方法包括向需要其的患者给予肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体。优选地，所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
本发明还包括促进人癌细胞系分泌炎性细胞因子的方法，所述炎性细胞因子可参与人体中的抗肿瘤免疫应答和肿瘤消退，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
可选地或额外地，还显而易见的是，本发明的药物组合物可单独给予或者与其他治疗、疗法或试剂组合给予(同时或惯序)，取决于待治疗的病症。例如，其他治疗、疗法或试剂可适用于治疗癌症如膀胱癌。
参考以下实施例，将会更充分地理解前述说明。
实施例
实施例1：材料和方法
小鼠和细胞培养
按照瑞士兽医局的伦理准则，使用8至10周龄的雌性C57BL/6WT小鼠(CharlesRiver,L’Arbresle,France)。MB49细胞系(由瑞典乌普萨拉大学A.Loskog教授惠赠)是来自C57Bl/6雄性小鼠的致癌物诱导的移行细胞癌(Summerhayes&Franks,1979)。人尿道上皮细胞系RT4(Rigby&Franks,1970)和RT112(Mastersetal.,1986)是由瑞士伯恩的Thalmann教授惠赠。将所有的细胞系维持在DMEM培养基(杜尔贝科氏改良伊格尔培养基)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和链霉素，以及Hepes(10mM)(全部来自于瑞士Invitrogen,Lifetechnologies,Zug)。使用Lenti-luc感染MB49细胞以产生MB49-luc细胞，如Decrausazetal.,2011中所述。使用FluostarOmega光度计(BMGLabtech,Offenburg,Germany)，在添加D-荧光素(终浓度为0.15mg/ml，Promega，Dübendorf，瑞士)之后测量荧光素酶表达。
BCG和Ty21a在麻醉的小鼠中使用Introcan24G/3/4(Braun,Melsungen,德国)通过导管插入术ives滴注BCG(EssexChemieSA,Luzern,瑞士)或Ty21a(Crucell,Bern,瑞士)(如下文所述)。在85℃水浴孵育30分钟之后获得热灭活的细菌，然后涂板以确认灭活。通过在LB琼脂(BDDifco,Basel,瑞士)平板(对于Ty21a)或在富含OADC(BD,Basel,瑞士)的M7H11(Remel,Kansas,USA)平板(对于BCG)上涂布确认所滴注的每种细菌的剂量，以及细菌灭活的确定。Ty21a胶囊包含至少2×109个有活力的细菌和5-50×109个死细菌。每个BCG小瓶包含2-8×108个细菌。在封闭的容器中将LB琼脂平板在37℃下孵育48h，将M7H11平板在37℃下孵育4周，每周增湿一次。使用凝集测试沙门氏菌O抗血清D1群因子1、9、12(BDDifco)测试LB琼脂平板中的菌落生长。
使用肿瘤细胞和ives处理激发小鼠
按照如下进行鼠原位模型：将小鼠深度麻醉(使用溶于PBS中的10％Rompun(Bayer,ProvetAG,Lyssach，瑞士)和10％Ketanarcon(StreuliPharma,Uznach,瑞士)的混合物(每10g体重100μl)进行腹膜内麻醉)，使用Introcan24G/3/4(Braun,Melsungen,Germany)插入导管，在用22％的乙醇预处理15分钟后在膀胱中滴注200’000个MB49-luc细胞(第1天)。在腹膜内注射D-荧光素(Promega,150μg/g体重)后15分钟在Xenogen成像系统(Xenogen/CaliperLifeScience，由cellularimagingfacility(CIF),UNIL,Lausanne,Switzerland惠供)中通过生物发光监测肿瘤生长。在肿瘤消退测定实验中，按照Mangsboetal.,2008所公开的方案，在第2、9、16和23天进行处理。
细菌存活
通过在小鼠中ives滴注进行体内细菌存活测定，将所述小鼠在不同时间点通过CO2吸入处死，以回收脾、BLN和膀胱。在蔗糖溶液中将器官匀浆，然后根据所接受的处理在LB或M7H11中涂布(分别为Ty21a或BCG)。
对于体外细菌存活测定，在37℃下使用不同MOI的Ty21a感染细胞系1.5小时，然后在37℃下加入50μg/ml庆大霉素1小时以杀死胞外细菌。将细胞培养物维持在15μg/ml庆大霉素(Gibco,Zug,Switzerland)中。在不同的时间点，用0.1％Triton-X-100(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)裂解细胞并收集用于在LB琼脂平板中涂布。
制备鼠细胞悬液
通过CO2吸入处死小鼠并收集BLN和膀胱，如之前所述获得单细胞悬液(Revaz,Debonneville,Bobst,&Nardelli-Haefliger,2008)。简言之，通过机械解离获得BLN细胞悬液。切碎膀胱并用0.5mg/ml嗜热菌蛋白酶(Roche,Basel,Switzerland)和1mg/ml胶原酶/分散酶(Roche)逐步消化。将所有的细胞悬液重悬于补充有10％FCS的DMEM培养基中。
流式细胞术标记和分析
使用以下单克隆抗小鼠抗体对BLN和膀胱细胞进行染色：PE-抗-CD11c(HL3,BDBiosciences,Basel,Switzerland)、PE/TXRD-抗-CD8(53-6.7,SouthernBiotech,Birmingham,USA)、eF450-抗-CD4(GK15,eBiosciences,Vienna,Austria)、FITC-抗-IA/IE(M5/114.15.2)、PerCp/Cy5.5-抗-CD3(17A2)、PE/Cy7-抗-GR1(RB6-8C5)、APC-抗-CD11b(M1/70)、AF700-抗-NK1.1(PK136)、APC/Cy7-抗-F4/80(BM8)，全部来自于Biolegend(London,UK)。使用活/死的可固定aqua死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Lifetechnologies,Zug,Switzerland)对死细胞进行染色。使用Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter,Nyon,Switzerland)获得细胞，并使用FlowJo9.6.1软件(TreeStar,Ashland,USA)进行分析。
细胞因子分析
回收感染的尿道上皮细胞的上清液并贮存于-80℃直至分析。按照制造商的方案，使用BD细胞计数微珠阵列(CytometricBeadAssay，CBA)人炎症试剂盒分析人细胞系，以检测和定量以下细胞因子：IL-12p70、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8。按照制造商的使用说明，使用BDCBA小鼠炎症试剂盒检测和定量MB49细胞系的IL-12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子。然后使用BDFACSArray生物分析系统分析样品。
肿瘤细胞凋亡
使用不同MOI的活的或热灭活的Ty21a感染MB49细胞。感染后24h和72h，回收细胞，并按照制造商的方案，使用PEAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒(BD)用AnnexinV和7-AAD标记物对细胞进行染色。使用Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter)获得细胞，并使用FlowJo9.6.1软件(TreeStar)进行分析。
统计学分析
如在正文中或图注中所示，使用针对Windows的Prism6.00(GraphAPad软件，California，USA)进行统计学分析。
实施例2：结果
IvesTy21a处理提高膀胱癌原位模型中的小鼠存活率
使用MB49细胞在原位膀胱癌模型中评估ivesTy21a使膀胱肿瘤消退的可能性。在细胞表面标记物、对细胞凋亡的敏感度和免疫学特征方面，该小鼠模型类似于人浅表性膀胱癌(Chen,Zhang,Cao,Hessner,&See,2009)，其通常已被用于了解和/或评估ivesBCG免疫疗法(Loskogetal.,2005)。为了确保膀胱肿瘤监测，本发明人使用表达荧光素酶(luc)的慢病毒载体转导MB49细胞以产生MB49-luc细胞。在本发明人的设置中，在ives滴注200’000个MB49-luc细胞之前用22％乙醇预处理获得接近100％的成瘤(tumor-take)(关于第8天的代表性实验，参见图1A)。按照该模型中BCG处理的通常方案(Arnold,deBoer,O'Donnell,Bohle,&Brandau,2004；Mangsboetal.,2008)，在第0天使用200’000个MB49-luc细胞对三组小鼠(每组10只)进行ives滴注，并在第1、8、15和22天用BCG或Ty21a处理或不进行处理。细菌的剂量由Ty21a的口服疫苗Vivotif的复原胶囊(至少2×109CFU/胶囊)或BCG的Oncotice小瓶(2-8×108CFU/小瓶)的1/10组成。示出了每组中随时间的小鼠存活百分数(图1B)。本发明人的数据表明，与未经处理的小鼠相比，Ty21a和BCG都能够使肿瘤显著消退。Ty21a导致10只小鼠中的7只发生消退(与未经处理的小鼠相比，p＝0.01，使用校正的对数秩检验)，而BCG导致10只小鼠中的6只发生消退(p＝0.01)。本发明人观察到，在首次处理后肿瘤继续生长约两周，但是在第四次滴注时，大多数小鼠均具有完全消退的肿瘤。本发明人进一步评估了降低的细菌剂量的作用(图1C)。在第0天已经用200’000个MB49-luc细胞进行ives滴注的5组小鼠，在第1、8、15或22天接受1/100或1/1000的Ty21a或BCGives的接种物，或未经处理。Ty21a的两种剂量(1/100和1/1000)都引起肿瘤消退(分别有17/20和7/10的小鼠消退)，都与对照存在显著差异(分别为p＝0.0002和p＝0.002)。相比之下，仅1/100的BCG接种物与对照有显著差异(p＝0.0054)，导致10只小鼠中的7只的肿瘤消退。BCG小瓶的1/1000诱导10只小鼠中5只中的肿瘤消退，这与对照无显著差异(p＝0.024)。总之，这些结果表明，在使原位MB49膀胱肿瘤消退方面，Ty21a比BCG更有效，因为Ty21a在更低剂量时仍然有效。
Ty21a细菌不存留于健康膀胱或肿瘤中
本发明人首先研究了Ty21a是否能够感染和/或存活于小鼠膀胱中。本发明人对不同的小鼠组(每组4只)进行ives滴注Ty21a(平均值±SEM7.9±0.16log10CFU/小鼠)，并在不同的时间点将其处死(图2A)。本发明人的结果表明，Ty21a不能够存留于膀胱中24h以上。此外，滴注后6小时，膀胱中细菌大量减少(少于滴注量的1/100)，最可能是由于排尿(micturation)。本发明人还确定了向膀胱引流淋巴结(BLN)和脾的侵入；但是，从这些器官未回收到细菌，证明了缺少Ty21a定殖(colonization)和侵入。由于另一种肠道沙门氏菌伤寒菌株在瘤内注射后在鼠肿瘤中表现出优先的生态位(niche)(Vendrelletal.,2011)，本发明人检测了ivesTy21a是否可优先地定殖于肿瘤中。本发明人用200’000个MB49-luc细胞ives滴注不同的小鼠组(每组4只)，24h后本发明人进行ives滴注Ty21a(平均值±SEM8.19±0.27log10CFU/小鼠)，一周后两组接受第二剂量，一周后该两组之一接受第三剂量。在不同时间点处死小鼠，测定CFU/器官(图2B)。本发明人的数据表明，在膀胱肿瘤中可检测到细菌直至第5天，但是滴注后24h活细菌的数量大大减少(最高达100000倍)。滴注后一周，本发明人在膀胱肿瘤中未检测到任何细菌，甚至在细菌再激发之后存留也未增加。因此，Ty21a似乎在肿瘤存在时在膀胱中的停留时间更长(尽管是少量存在)，同样在BLN或脾中也未检测到细菌。这与BCG相反(Biotetal.,2012)，图2C中的本发明人的数据表明其能够在膀胱肿瘤中存留至少一周。此外，滴注后5天在4只小鼠中的3只的膀胱BLN中检测到BCG细菌。所有这些结果表明，Ty21a可能是更安全的，因为与BCG的至少7天相比，它在膀胱肿瘤中仅持续存留不到48小时，并且Ty21a未侵入深层器官。
Ty21a在膀胱粘膜中短暂地诱导局部炎性细胞
为了评估ivesTy21a的安全性，本发明人检查了被吸引到膀胱中的炎性/免疫细胞。在不同的时间点处死膀胱内接受1/10的Ty21a胶囊的小鼠，对来自膀胱的细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析(对于门控策略(gatingstrategy)，参见补充的图1)。分析嗜中性粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和树突细胞(DC)的浸润(图3A)。本发明人观察到，Ty21a滴注后24h嗜中性粒细胞大量浸润(平均值±SEM％3.46±1.42，对比首次用于实验的小鼠中的0.16±0.02，依据单因素ANOVA和Dunnet多重比较检验，p<0.05)。这种强烈的浸润是短暂的，72h后迅速恢复到对照水平。本发明人还观察到，ives处理后24h巨噬细胞显著增加5倍(1.00±0.33，对比首次用于实验的小鼠中的0.21±0.03，p<0.05)，其在72h缓慢减少。处理后24h，NK和DC细胞少量增加但是并不显著。滴注后7天CD4T细胞也显著增加(1.22±0.21，对比首次用于实验的小鼠中的0.48±0.11，p<0.05)，而CD8T细胞未受影响(图3B)。这表明Ty21a仅在膀胱中短暂地诱导局部炎症应答。
活的BCG或Ty21a的重复ives滴注导致淋巴样细胞向膀胱肿瘤中差异化浸润
在BCG、Ty21a或作为对照的PBS的重复ives剂量之后，进一步检查白细胞肿瘤浸润。在第0天ives滴注MB49肿瘤细胞的小鼠，在第1、8和15天接受ives细菌或PBS，并且在每剂量之后24h或7天被处死。第一剂量之后24小时，Ty21a诱导淋巴样细胞的强烈浸润(11.36％对比2.19％，依据单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验，p<0.05)，而BCG诱导少量但并不显著的浸润(6.26％)。但是，7天后，BCG诱导的浸润显著增加(11.76％，对比PBS处理的小鼠中的5.89％，p<0.05)，而Ty21a浸润与PBS处理的荷瘤小鼠无差异。值得注意的是，在PBS处理的荷瘤小鼠中随时间出现了淋巴样细胞的显著肿瘤浸润(与第2天相比，第8天p<0.05，第16天p<0.01)，与肿瘤生长相关。在本文中，淋巴样细胞肿瘤浸润未受到第二次细菌处理的很大影响，除了在第15天较高的BCG诱导的浸润(尽管并不显著)。在第三剂量之后24h，再次观察到向细菌诱导的淋巴样细胞浸润的趋势。本发明人的数据表明，在每次处理后24hTy21a诱导炎性细胞的高度浸润，随时间缓慢降低。相反，在每次剂量后7天BCG似乎诱导更高的浸润。这表明长期来看Ty21a可能具有更低的炎性，与诱导持续炎症的BCG相比，Ty21a可减少与炎症相关的不利事件。
Ty21a诱导MB49细胞的细胞凋亡
为了阐明Ty21a介导的肿瘤消退的机制，本发明人研究了这些细菌体外感染MB49细胞的能力。证明情况并非如此(数据未示出)，因此确认了在膀胱中获得的结果(图2B)。然后，本发明人推论Ty21a可能不感染鼠细胞，仅感染人细胞，因为它是人限制性病原体。但是，使用感染复数(MOI)最高达6000的Ty21a感染人膀胱肿瘤细胞系RT4和RT112并未显示任何侵入或存活。与Ty21a相反，广泛报道BCG同时感染鼠和人肿瘤细胞系。本发明人接下来检查了Ty21a是否对肿瘤细胞的存活/细胞凋亡具有直接影响。使用不同的MOI“感染”(该术语将用于根据感染方案加入细菌)MB49细胞，24h或72h之后，回收细胞并进行AnexinV和7AAD染色，并通过流式细胞术进行分析。早期凋亡细胞仅对AnnexinV为阳性，因为保证了膜的完整性，但是晚期凋亡细胞对7AAD也是可透过的。此外，坏死细胞被区分为对7AAD呈单一阳性(对于代表性方案，参见图6A)。本发明人的数据表明，Ty21a能够在“感染”后24h诱导凋亡，与MOI0相比，使用高MOI的Ty21a(MOI3000)“感染”后5％的细胞处于早期凋亡或坏死并且20％的细胞处于晚期凋亡(p<0.0001)。这些结果表明，在细菌接触后24h之内，Ty21a能够引起肿瘤细胞的细胞凋亡和坏死。
Ty21a在鼠和人细胞系中诱导细胞因子分泌
本发明人接下来研究了Ty21a诱导尿道上皮细胞分泌炎性细胞因子的能力，如之前针对BCG所示的(综述参见Alexandroffetal.,1999)。使用不同MOI的Ty21a“感染”鼠(MB49)和人(RT4和RT112)尿道上皮细胞系，24h后使用鼠炎症试剂盒(CBA)分析细胞上清液的炎性细胞因子分泌，以检测和定量IL-12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子，或使用人炎症试剂盒以检测和定量IL-12p70、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8。根据针对Ty21a胶囊所述的CFU范围计算理论MOI，然后通过在LB平板上涂布细菌来校正，这解释了实验之间真实MOI的差异。在MB49细胞上清液中仅检测到两种细胞因子MCP-1和IL-6(图7)。未经处理的细胞已经高水平分泌MCP-1细胞因子，但是用MOI300和3000的Ty21a感染后MCP-1的分泌显著增加(多于10倍)(与MOI0相比，所有处理p<0.0001)。相反，未感染的细胞不分泌IL-6，用MOI300的Ty21a感染后IL-6显著增加(与MOI0相比，p<0.05)。但是，用MOI3000的Ty21a感染后获得最高应答(与MOI0相比，p<0.0001)。本发明人的结果表明，Ty21a能够诱导鼠尿道上皮细胞分泌细胞因子，所述细胞因子可参与膀胱肿瘤消退。在人尿道上皮细胞系(RT4)中，在不存在细菌的情况下在上清液中同时分泌IL-8和IL-6。MOI200或2000的Ty21a感染导致IL-8和IL-6的较高分泌(与MOI0相比，p<0.001)。TNF-α和IL-1β仅在用较高剂量的Ty21a(MOI2000)“感染”后被诱导(与MOI0相比，p<0.0001)。在不存在细菌的情况下，RT112人肿瘤细胞比RT4细胞分泌更少量的IL-8和IL-6。用MOI600或6000的Ty21a感染后两种细胞因子都增加。这表明Ty21a促使人肿瘤细胞系分泌不同的炎性细胞因子，所述细胞因子可参与人体中的抗肿瘤免疫应答和肿瘤消退。
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Claims (21)

1.一种药物组合物，其包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体，用于治疗和/或预防膀胱癌，其特征在于，所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的和/或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，其选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
2.权利要求1的药物组合物，其特征在于将所述药物组合物局部给予到膀胱。
3.权利要求2的药物组合物，其特征在于通过滴注将所述药物组合物局部给予到膀胱。
4.权利要求2至3中任一项的药物组合物，其特征在于将所述药物组合物局部给予到膀胱数次。
5.前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌。
6.前述权利要求中任一项的药物组合物，还包含可药用载体和/或赋形剂。
7.前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述治疗在于减少膀胱癌的复发。
8.前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述预防在于减少或限制膀胱癌的复发和/或发展。
9.前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是
10.一种诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
11.一种治疗和/或预防膀胱癌的方法，包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物，其中所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
12.权利要求11的治疗和/或预防方法，其中将所述药物组合物局部给予到膀胱。
13.权利要求12的治疗和/或预防方法，其中通过滴注将所述药物组合物局部给予到膀胱。
14.权利要求12至13中任一项的治疗和/或预防方法，其中将所述药物组合物局部给予到膀胱数次。
15.权利要求11至14中任一项的治疗和/或预防方法，其中所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌。
16.权利要求11至15中任一项的治疗和/或预防方法，还包括可药用载体和/或赋形剂。
17.权利要求11至16中任一项的治疗和/或预防方法，其中所述治疗在于减少膀胱癌的复发。
18.权利要求11至17中任一项的治疗和/或预防方法，其中所述预防在于减少或限制膀胱癌的复发和/或发展。
19.权利要求11至18中任一项的治疗和/或预防方法，其中将所述药物组合物与放射疗法、化学疗法或免疫疗法或它们的组合联合给予，所述药物组合物包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体。
20.一种诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
21.肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体用于制备用于治疗和/或预防膀胱癌的药物的用途，其特征在于所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、M01ZH09、χ9633、χ9639、χ9640和χ8444。
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