ES2903026T3

ES2903026T3 - Cepas de Salmonella para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga

Info

Publication number: ES2903026T3
Application number: ES14725051T
Authority: ES
Inventors: Haefliger Denise Nardelli; Patrice Jichlinski; Pereira Sonia Domingos
Original assignee: Centre Hospitaller Univ Vaudois Chuv
Current assignee: Centre Hospitaller Univ Vaudois Chuv
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2022-03-30
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: WO2014180929A1; CN105377276A; US20160074441A1; MX2015015341A; EP2996699B1; US9795641B2; CA2910072A1; EP2996699A1; CA2910072C; EP2801364A1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga, caracterizada porque dichos mutantes no recombinantes atenuados vivo y/o no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi se seleccionan del grupo que consiste en Ty21a, CVD 908-htrA, CVD 909, Ty800, M01ZH09, χ9639, χ9640 y χ8444 y en la que la administración de la composición farmacéutica es tópica.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas de Salmonella para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga.

Antecedentes de la invención

El cáncer de vejiga es la 4a causa más común de cáncer en hombres tanto en Europa como en EE.UU. Las tres cuartas partes de los tumores se diagnostican como no invasivos del músculo (NMIBC, non-muscle invasive bladder cancer) y permanecen confinados en la mucosa de la vejiga. Según el estadio tumoral específico y las características del grado, la inmunoterapia intravesical (ives) con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) limita parcialmente la alta propensión de estos tumores a la recidiva y posiblemente a la progresión después de la resección endoscópica transuretral. BCG reduce la recidiva y la progresión del cáncer de vejiga. Sin embargo, los efectos secundarios vinculados o bien con la capacidad de las bacterias BCG para infectar los tejidos de la vejiga y posiblemente propagarse o bien con la fuerte inflamación inducida se encuentran en casi el 90% de los pacientes, que van desde cistitis hasta septicemia y la muerte.

El mecanismo de acción preciso de BCG sigue siendo desconocido. Sin embargo, se demostró que, después de la instilación ives, BCG infecta y lo internalizan las células uroteliales y cancerosas y provoca una elevada afluencia de citocinas y células inflamatorias que conduce a una respuesta antitumoral (revisado en (Askeland, Newton, O'Donnell y Luo, 2012). Algunas estrategias, como combinar citocinas con BCG, reducir las dosis de BCG, usar la pared celular micobacteriana para reemplazar a BCG o usar el agonista del receptor tipo Toll (TLR) para estimular el sistema inmunitario, se sometieron a prueba en ensayos clínicos o modelos animales (revisado en (Kresowik y Griffith, 2009)), sin embargo, BCG sigue siendo la mejor opción hasta la fecha para reducir la recidiva/progresión del NMIBC. Dos estudios que usan agonistas de TLR por vía ives han demostrado potencial terapéutico en el modelo de cáncer de vejiga ortotópico MB49, mostrando el primero que CpG, un agonista de TLR-9, fue superior a la terapia con BCG (Mangsbo, Nanalga, Essand, Loskog y Totterman, 2008) y mostrando el segundo que R-837 tuvo un efecto antitumoral en este modelo (Hayashi et al., 2010). De manera similar, Seow et al. también han notificado recientemente el efecto antitumoral de Lactobacillus por vía ives (Seow et al., 2010).

Se han realizado numerosos intentos de desarrollar composiciones que comprendan bacterias recombinantes atenuadas y/o bacterias dirigidas a tumor atenuadas, especialmente Salmonella typhi atenuadas, para la inhibición del crecimiento o la reducción del volumen de un cáncer de tumor sólido, tales como, por ejemplo, el documento WO03/063593 (Vion Pharmaceuticals); el documento US2007/0298012 (I. King y L.-M. Zheng); el documento WO2009/098246 (Aeterna Zentaris GmbH); el documento EP2085466 (Aeterna Zentaris GmbH); el documento WO2006/076678 (Univ. John Hopkins); VENDRELL A et al, 2011; pero ninguno de ellos ha logrado una eficacia sostenible en ensayos clínicos en seres humanos (Chorobik, Czaplicki, Ossysek y Bereta, 2013).

Por estos motivos, sigue existiendo la necesidad de proporcionar una composición que sea más segura y más eficiente que BCG para tratar el cáncer de vejiga.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga, caracterizada porque dichos mutantes no recombinantes atenuados vivo y/o no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi se seleccionan del grupo que consiste en Ty21a, CVD 908-htrA, CVD 909, Ty800, M01ZH09, %9639, %9640 y x8444 y en la que la administración de la composición farmacéutica es tópica.

Figuras

Figura 1. Comparación de la remisión del tumor de vejiga ortotópico tras los tratamientos con BCG o Ty21a. A grupos de 10-20 ratones C57BL/6 hembra se les instiló por vía ives 200.000 células MB49-luc después de un tratamiento previo con EtOH al 22% (día 0). El crecimiento tumoral se monitorizó usando un sistema de obtención de imágenes in vivo Xenogen, que puede detectar la bioluminiscencia, un resultado representativo se muestra en (A) de ratones que portan tumor en el día 8. En los días 1, 8, 15 y 22, a los grupos de ratones se les trató por vía ives con diferentes dosis de BCG o Ty21a, mientras que un grupo de ratones permaneció sin tratar. Los tratamientos variaron desde 1/10 de la cápsula de Ty21a o vial de BCG inicial (B), hasta 1/100 y 1/1000 (C). Se muestran los porcentajes de supervivencia de los ratones en función del tiempo para cada grupo. Las diferencias significativas tras la prueba de rangos logarítmicos ajustada se indican como * p< 0,025 en B o * p< 0,0125, ** p< 0,0025 y *** p< 0,00025 en C.

Figura 2. Recuperación de bacterias de la vejiga después de los tratamientos con Ty21a o BCG. A siete grupos de cuatro ratones se les expuso por vía ives a Ty21a en el día 0 (media ± EEM 1,3 x 108± 4,3 x 107 UFC/ratones) (A). A seis grupos de ratones se les expuso por vía ives a 200.000 células MB49-luc en el día -1 y 24 h más tarde se les trató con Ty21a en el día 0 (media ± EEM 3,9 x 108 ± 2,4 x 108 UFC/ratones) (B) o BCG (2-8 x 107 UFC/ratones) (C). Se sacrificaron los ratones en diferentes puntos de tiempo después de la infección. Se procesaron y sembraron en placa las vejigas tal como se describe en materiales y métodos. Los datos se expresan como el número de UFC por tejido. Las barras horizontales representan las respuestas medias.

Figura 3. Perfil de respuesta inmunitaria innata y adaptativa en vejiga sana después de una única dosis de Ty21a. A grupos de cinco ratones se les expuso por vía ives a Ty21a (media ± EEM 1,3 x 108 ± 4,3 x 107 UFC/ratones) en el día 0 y se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo tras el tratamiento. Se añadió un grupo de cuatro ratones no sometidos previamente a experimentación. Se recuperaron las células de la vejiga y se realizaron tinciones por citometría de flujo. Se excluyeron las células muertas con el kit Aqua Dead. Se muestra el porcentaje de células inmunitarias innatas (A): neutrófilos, NK, macrófagos y DC, y células inmunitarias adaptativas (B): células T CD4 y CD8. Las barras horizontales representan los porcentajes medios. Las diferencias significativas entre los ratones sacrificados en diferentes puntos de tiempo y los no sometidos previamente a experimentación se indican siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett * p< 0,05.

Figura 4. Perfil de respuesta inmunitaria innata y adaptativa en vejiga sana después de una única dosis de Ty21a. A grupos de cuatro a 10 ratones se les expuso por vía ives a 200.000 células MB49-luc en el día 0 y se les trató con PBS, o 1/10 de BCG o Ty21a en los días 1, 8, 15 y 22. Se sacrificaron los ratones en diferentes puntos de tiempo, 24 h después de cada tratamiento o siete días más tarde. Se procesaron y recuperaron las células de cáncer de vejiga y se realizaron tinciones por citometría de flujo. Se excluyeron las células muertas con el kit Aqua Dead. Se representa el porcentaje de células inmunitarias innatas: NK, neutrófilos, macrófagos y DC, y células inmunitarias adaptativas: células T CD4 y CD8 en cada punto de tiempo como parte de un todo. La suma del porcentaje de todas las poblaciones de células se indica debajo de cada gráfico circular. Las diferencias significativas se indican siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett * p< 0,05.

Figura 5. Porcentaje de MB49 de poblaciones de células apoptóticas y necróticas. Se infectó la línea celular MB49 con diferentes MOI de Ty21a y, 24 h o 72 h más tarde, se recuperaron las células y se tiñeron para detectar anexina V y 7AAD, y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestra un gráfico representativo (A). Los datos se representan como el porcentaje de cada población de células: células apoptóticas tempranas, células apoptóticas tardías y células necróticas; tres réplicas por tratamiento, representado por la media y el EEM (B). Las diferencias significativas entre las células de tratamiento y de control se muestran mediante *** p< 0,001 o **** p< 0,0001 siguiendo una Anova bilateral.

Figura 6. Concentración de citocinas inflamatorias secretadas por células MB49. Se infectó la línea celular MB49 con diferentes MOI de Ty21a y, 24 h más tarde, se analizaron los sobrenadantes celulares para determinar la secreción de citocinas inflamatorias usando un kit de inflamación murina para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IFN-y, MCP-1, IL-10 e IL-6. Se detectaron dos citocinas, MCP-1 e IL-6. Cada barra corresponde a la concentración de citocina del tratamiento correspondiente; tres réplicas por tratamiento, representada por la media y el EEM. Las diferencias significativas entre cada tratamiento y control (MOI 0) se muestran mediante * p< 0,05, *** p< 0,001 y **** p< 0,0001 siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

Figura 7. Concentración de citocinas inflamatorias secretadas por líneas celulares uroteliales humanas. Se infectaron ambas líneas celulares uroteliales humanas, RT4 (A) y RT112 (B), con diferentes MOI de Ty21a y, 24 h más tarde, se analizaron los sobrenadantes celulares para determinar la secreción de citocinas inflamatorias usando un kit de inflamación para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IFN-y, MCP-1, IL-10 e IL-6, o un kit de inflamación humana para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1 p e IL-8. Cada barra corresponde a la concentración de citocina del tratamiento correspondiente; tres réplicas por tratamiento, representada por la media y el EEM. Las diferencias significativas entre cada tratamiento y control (MOI 0) se muestran mediante * p< 0,05, *** p< 0,001 y **** p< 0,0001 siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

Descripción detallada de la invención

Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en las pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Las publicaciones y solicitudes comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a tal publicación en virtud de la invención anterior. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece el contenido del presente documento. Tal como se usa en el presente documento, se proporcionan las siguientes definiciones con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención.

El término “comprender” o “que comprende” se usa generalmente en el sentido de incluir/que incluye, es decir, permitiendo la presencia de una o más características o componentes. De manera adicional, el término “que comprende” también abarca el término “que consiste”.

Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Tal como se usa en el presente documento, “al menos uno” significa “uno o más”.

Sorprendentemente, los solicitantes de la presente invención han demostrado que una composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo (o viable) de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi es útil en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga.

Preferiblemente, el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga no invasivo del músculo.

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención se administra localmente en la vejiga, lo más preferiblemente mediante instilación tal como mediante instilación intravesical (ives).

La composición farmacéutica puede administrarse localmente en la vejiga varias veces. Después de la administración inicial (primera administración), la composición farmacéutica de la invención puede volver a administrarse cada 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas o 24 semanas, pero preferiblemente cada 1-2 semanas. Por ejemplo, el paciente puede tratarse cada 1 semana, recibiendo un máximo de 6 instilaciones, dependiendo de la composición farmacéutica.

Generalmente, el tratamiento con una composición farmacéutica de la invención consiste en reducir o limitar la recidiva y/o progresión del cáncer de vejiga.

Tal como se usa en el presente documento, “cepa de Salmonella atenuada” se refiere a un mutante de Salmonella, es decir, diferente del tipo natural, que sustancialmente no infecta/persiste en los tejidos y es sustancialmente incapaz de revertir a la virulencia completa cuando se administra a una dosis farmacéuticamente eficaz. Preferiblemente, el mutante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi de la invención son no recombinantes. El término “no recombinante” se refiere al hecho de que estas cepas no contienen genes de otros géneros u otras especies y/o no expresan proteínas recombinantes. Esto contrasta con lo que se conoce a partir de la técnica anterior y, en particular, a partir de los siguientes documentos de patente: documento US2007/0298012 (I. King y L.-M. Zheng); documento WO2009/098246 (Aeterna Zentaris GmbH); documento WO2006/076678 (Univ. John Hopkins); documento US 6.962.696 (D. Bermudes et al.); documento WO98/15631 (Fond. pour le perfectionnement et la recherche en gynecologie-obstétrique); documento WO2008/091375 (Gob. de los EE.UU.) y documento WO2005/123762 (Indian Immunologicals Ltd). Las cepas descritas en las patentes/solicitudes de patente anteriormente mencionadas son todas cepas recombinantes en el sentido de que contienen genes de otros géneros u otras especies y/o expresan proteínas recombinantes y se usan cepas de Salmonella como portador que selecciona como diana el tumor. Habitualmente, los genes de otros géneros u otras especies que están contenidos en las cepas descritas en la técnica anterior codifican para proteínas recombinantes dirigidas a células tumorales o cancerosas.

Una “dosis farmacéuticamente eficaz” se refiere a un compuesto o material químico que, cuando se administra a un organismo humano o animal, induce un efecto farmacológico y/o fisiológico detectable. En la presente invención, una dosis farmacéuticamente eficaz de un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi inducen una remisión eficiente del tumor o cáncer y/o una limitación de la recidiva/progresión del tumor o cáncer. Normalmente, la composición farmacéutica de la invención puede reducir significativamente el tamaño o volumen del tumor en el 2% o más, el 3% o más, el 4% o más, el 5% o más, tal como en el 10% o más, tal como en el 20% o más, tal como en el 30% o más, tal como en el 50% o más, tal como en el 90% o más, tal como en el 95% o más, o reducir significativamente el estadio histológico de un tumor recurrente (por ejemplo, desde un estadio bajo hasta uno alto), en comparación con un control adecuado.

La dosis farmacéuticamente eficaz del mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi puede determinarla un experto en la técnica y puede basarse en el estado clínico del paciente, así como la potencia de la composición farmacéutica, el uso y tipo de adyuvante o formulación, la vía y pauta de administración, el estado inmunitario del receptor, el peso corporal, etc. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi de al menos aproximadamente 1x108 unidades formadoras de colonias y 1x108 células bacterianas, lo más preferiblemente 1x109 unidades formadoras de colonias y 1x109 células bacterianas, incluso más preferiblemente 2x109 unidades formadoras de colonias y 5x109 células bacterianas, en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Las cepas de Salmonella atenuadas se han usado durante años hasta la fecha en modelos murinos para tratamientos del cáncer, debido a su capacidad única para seleccionar como diana específicamente células tumorales: estas bacterias son anaerobias facultativas que pueden crecer en áreas tumorales hipóxicas o necróticas dando como resultado la remisión tumoral en ratones (revisado en (Wall, Srikanth y McCormick, 2010)). Sin embargo, esto no se tradujo en pacientes con cáncer, en los que la inyección intravenosa de Salmonella enterica serovar Typhimirium atenuada no demostró una colonización tumoral preferencial y/o inducción de la posterior remisión tumoral (Toso et al., 2002). A diferencia de esta publicación y de la técnica anterior existente, el mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi de la invención no crece(n) en el tejido de cáncer de la vejiga, tal como se muestra en el ejemplo 2. Como consecuencia, el mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi de la invención no persiste(n) en el tejido tumoral o canceroso a diferencia de lo que se conoce a partir de la técnica anterior.

La cepa de Salmonella enterica serovar Typhi de la invención se selecciona del grupo que consiste en Ty21a, CVD 908-htrA, CVD 909, Ty800, M01ZH09, x9639, %9640 y %8444.

Se hace referencia a estas cepas en la siguiente bibliografía: Levine MM, Tacket CO, Sztein MB. Host-Salmonella interaction: human trials. Microbes Infect 2001; 3:1271-9; Levine MM. Typhoid fever vaccines. En: Plotkin SA, Mortimer EA, eds. Vaccines, 2a ed. Filadelfia: W.B. Saunders, 1994:597-633; Crump JA, Luby SP, Mintz ED. The global burden of typhoid fever. Bull World Health Organ 2004; 82:346-53; Levine m M, Galen JE, Tacket CO, Barry EM, Pasetti MF, Sztein MB. Attenuated strains of Salmonella enterica serovar Typhi as live oral vaccines against typhoid fever. En: Levine MM, Kaper JB, Rappuoli R, Liu M, Good M, eds. New generation vaccines, 3a ed. Nueva York: Marcel Dekker, 2004:479-86; Shi H, Santander J, Brenneman KE, Wanda SY, Wang S, Senechal P, Sun W, Roland KL, Curtiss R. Live recombinant Salmonella Typhi vaccines constructed to investigate the role of rpoS in eliciting immunity to a heterologous antigen. PLoS One. 18 de junio de 2010;5(6)).

Preferiblemente, la cepa de Salmonella enterica serovar Typhi no recombinante es Ty21a. Ty21a se encuentra habitualmente en forma de una vacuna oral que se sabe que es segura (Begier, Burwen, Haber, Ball, & Vaccine Adverse Event Reporting System Working, 2004; Engels, Falagas, Lau y Bennish, 1998) y bastante sensible a los antibióticos si se produjera una infección generalizada. Previamente, se ha demostrado que la inmunización oral de Ty21a humana induce células T CD8 específicas, que secretan citocinas inflamatorias tales como IFN-y, TNF-a e IL-2. En ratones, se ha demostrado que otras cepas de Salmonella Typhi atenuadas inducen una respuesta inmunitaria de tipo Th1.

A diferencia de esta publicación y de la técnica anterior existente, el mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi de la invención i) no se transforman con genes a partir de otros géneros u otras especies, ii) no expresan una o más proteína(s) o antígeno(s) heterólogo(s) y/o iii) no actúan como portadores de vacuna.

Haciendo referencia a los ejemplos, los solicitantes han realizado una comparación simultánea de la capacidad de los tratamientos con Ty21a y BCG por vía ives para provocar la remisión de los tumores MB49-luc ortotópicos murinos establecidos, lo que sugirió una mejor eficacia de Ty21a, ya que se mantuvo una remisión tumoral eficiente con dosis 100 veces más bajas.

Se han llevado a cabo estudios previos para intentar reemplazar la terapia con BCG para el cáncer de vejiga. Usando un agonista de TLR-9, CpG, diferentes estudios han demostrado la capacidad para provocar la remisión de tumores MB-49 tanto s.c. (Hegele et al., 2004; Loskog et al., 2005) como de vejiga (Hegele et al., 2005; Mangsbo et al., 2008; Ninalga, Loskog, Klevenfeldt, Essand y Totterman, 2005). Sin embargo, únicamente Mangsbo et al. (Mangsbo et al., 2008) demostraron que esta terapia era superior a BCG. Los estudios que examinaron el efecto de otras cepas bacterianas usaban probióticos. La instilación ives tanto de Lactobacillus casei termoinactivadas (Takahashi et al., 2001) o como de Lactobacillus rhamnosus GG vivas (Seow et al., 2010) dio como resultado una remisión del tumor de vejiga similar a BCG. Los presentes datos muestran que, en vejigas sanas tratadas con Ty21a, pudo observarse una infiltración transitoria de neutrófilos y macrófagos. Además, aumentó la frecuencia de células T CD4 una semana después de la instilación. Durante el tratamiento con BCG por vía ives de los pacientes, la principal población de células inmunitarias presente en la vejiga fueron neutrófilos, que corresponden al 75% de las células presentes en la orina, seguidos por macrófagos y células NK (De Boer et al., 1991). En ratones, en puntos de tiempo tempranos, BCG indujo una inflamación aguda de la vejiga con una infiltración importante de neutrófilos, y para el día 21 a 28, hubo un aumento sustancial de macrófagos (Saban et al., 2007). Además, en estos ratones hubo una formación de edema en la vejiga, y los niveles de inflamación se mantuvieron durante hasta tres semanas tras la interrupción de la terapia, a diferencia de las presentes observaciones con Ty21a. Dado que las bacterias no persistían en las vejigas y la infiltración de células inflamatorias fue transitoria, los solicitantes han demostrado que Ty21a induce menos acontecimientos adversos que BCG, que persiste en la vejiga e induce una respuesta inflamatoria importante, responsable de gran parte de los acontecimientos adversos que padecen los pacientes (Alexandroff, Jackson, O'Donnell y James, 1999). Además, Ty21a no pudo infectar líneas celulares uroteliales ni murinas ni humanas, lo que sugiere que en seres humanos puede ser incapaz de infectar células uroteliales, reduciendo los riesgos de propagación y mejorando la seguridad.

El portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable particular empleado en las composiciones farmacéuticas de la invención es convencional en la técnica. Los ejemplos de diluyentes incluyen: tampones para tamponar contra el ácido gástrico en el estómago, tales como tampón citrato (pH 7,0) que contiene sacarosa, tampón bicarbonato (pH 7,0) solo (Black et al., 1990; Levine, Ferreccio, Black, Tacket y Germanier, 1989) o tampón bicarbonato (pH 7,0) que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine et al., 1988). Los ejemplos de portadores incluyen: proteínas, por ejemplo, las que se encuentran en la leche desnatada; azúcares, por ejemplo, sacarosa; o polivinilpirrolidona.

Por ejemplo, la composición farmacéutica Vivotif® (vacuna oral antitifoidea de Ty21a vivas) comprende la cepa Ty21a que se hace crecer en fermentadores en condiciones controladas en medio que contiene un digesto de extracto de levadura, un digesto ácido de caseína, dextrosa y galactosa. Luego se recogen las bacterias mediante centrifugación, se mezclan con un estabilizador que contiene sacarosa, ácido ascórbico y aminoácidos, y se liofilizan. Se mezclan las bacterias liofilizadas con lactosa y estearato de magnesio y se llenan en cápsulas de gelatina que se recubren con una disolución orgánica para hacerlas resistentes a la disolución en el ácido estomacal.

En la tabla 1 se muestra el contenido de una cápsula con recubrimiento entérico de Vivotif® (vacuna oral antitifoidea de Ty21a vivas) *.

Tabla 1

En el caso en el que va a administrarse la cepa de Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a mediante instilación ives, entonces la cápsula de la vacuna oral Vivotif para Ty21a se reconstituye, por ejemplo, en tampón, preferiblemente PBS, lo más preferiblemente PBS estéril.

De manera alternativa o adicional, las composiciones de la invención descritas en el presente documento pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos, productos terapéuticos o agentes, ya sea simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden administrarse en asociación con radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia, o una combinación de las mismas.

También se describe un método para inducir la apoptosis en una célula cancerosa, comprendiendo dicho método administrar una composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi.

Normalmente, la composición farmacéutica de la invención puede aumentar específicamente la apoptosis en células cancerosas a una concentración dada. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden aumentar la tasa de apoptosis en células cancerosas en el 2% o más, tal como en el 5% o más, tal como en el 10% o más, tal como en el 25% o más, tal como en el 50% o más, tal como en el 75% o más, tal como en el 100%, en comparación con un control adecuado.

La invención también se refiere al uso de un muíante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga, caracterizado porque dichos mutantes no recombinantes atenuados viable o no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi no persisten en el tejido tumoral o canceroso. Preferiblemente, el mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o el mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi se seleccionan del grupo que consiste en Ty21a, CVD 908-htrA, CVD 909, Ty800, M01ZH09, x9639, %9640 y x8444.

También se describe un método para fomentar la secreción de citocinas inflamatorias por parte de líneas celulares de cáncer humano, que pueden participar en la respuesta inmunitaria antitumoral y en la remisión tumoral en seres humanos, comprendiendo dicho método administrar una composición farmacéutica que comprende un mutante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi.

De manera alternativa o adicional, también resultará evidente que la composición farmacéutica de la invención puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, productos terapéuticos o agentes, ya sea simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, los otros tratamientos, productos terapéuticos o agentes pueden ser adecuados para tratar el cáncer de vejiga.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Ratones y cultivo celular

Se usaron ratones C57BL/6 WT hembra de ocho a diez semanas de edad (Charles River, L'Arbresle, Francia) siguiendo las directivas éticas de las autoridades veterinarias suizas. La línea celular MB49 (proporcionada amablemente por el Prof. A. Loskog, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia) es un carcinoma de células transicionales inducido por carcinógenos derivado de un ratón C57Bl/6 macho (Summerhayes y Franks, 1979). Las líneas celulares uroteliales humanas RT4 (Rigby y Franks, 1970) y RT112 (Masters et al., 1986) fueron proporcionadas amablemente por el Prof. Thalmann, Berna, Suiza. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medios DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementados con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina y Hepes (10 mM) (todos de Invitrogen, Life Technologies, Zug, Suiza). Las células MB49 se infectaron con Lenti-luc para generar células MB49-luc, tal como se describe en (Decrausaz et al., 2011). Se midió la expresión de luciferasa después de la adición de D-luciferina (concentración final de 0,15 mg/ml, Promega, Dübendorf, Suiza) usando un luminómetro Fluostar Omega (BMG Labtech, Offenburg, Alemania).

BCG y Ty21a

Se instiló por vía ives BCG (oncoTICE®, Essex Chemie SA, Luzern, Suiza) o Ty21a (Vivotif®, Crucell, Berna, Suiza) mediante cateterismo usando Introcan 24G/3/4 (Braun, Melsungen, Alemania) en ratones anestesiados (tal como se describe a continuación). Se obtuvieron las bacterias termoinactivadas después de una incubación en baño de agua durante 30 minutos a 85°C y luego se sembraron en placa con el fin de confirmar la inactivación. Se confirmó la dosis de cada bacteria instilada, así como la determinación de la inactivación de bacterias, mediante siembra en placas de LB-agar (BD Difco, Basilea, Suiza) para Ty21a o placas de M7H11 (Remel, Kansas, USA) enriquecidas con OADC (BD, Basilea, Suiza) para BCG. Las cápsulas de Ty21a contenían al menos 2 x 109 bacterias viables y 5 50 x 109 bacterias muertas. Cada vial de BCG contenía 2-8 x 108 bacterias. Se incubaron las placas de LB-agar durante 48 h a 37°C, mientras que las placas de M7H11 se incubaron durante 4 semanas a 37°C, en un recipiente cerrado que se humidificó una vez a la semana. Se sometieron a prueba las colonias que crecieron en placas de LB-agar con los factores 1, 9, 12 del grupo D1 de antisuero de Salmonella O de una prueba de aglutinación (BD Difco). Exposición de ratones a células tumorales y tratamiento ives

Se realizó el modelo ortotópico murino de la siguiente manera: se anestesiaron profundamente los ratones (anestesia i.p. con una mezcla de Rompun al 10% (Bayer, Provet AG, Lyssach, Suiza) y Ketanarcon al 10% (Streuli Pharma, Uznach, Suiza) en PBS (100 pl por 10 g de peso corporal)) y se les realizó un cateterismo usando Introcan 24G/3/4 (Braun, Melsungen, Alemania), y se instilaron 200.000 células MB49-luc en la vejiga (día 1), después del tratamiento previo con etanol al 22% durante 15 minutos. Se monitorizó el crecimiento tumoral mediante bioluminiscencia 15 minutos después de la inyección i.p. de D-luciferina (Promega, 150 pg/g de peso corporal) en el sistema de obtención de imágenes Xenogen (Xenogen/Caliper Life Science, proporcionado amablemente por la instalación de obtención de imágenes celulares (CIF), UNIL, Lausanne, Suiza). En los experimentos del ensayo de remisión tumoral, los tratamientos se realizaron en los días 2, 9, 16 y 23 siguiendo la pauta publicada por (Mangsbo et al., 2008).

Supervivencia bacteriana

El ensayo de supervivencia bacteriana in vivo se realizó mediante instilación ives en ratones, que se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo mediante inhalación de CO², con el fin de recuperar los bazos, los BLN y las vejigas. Se homogeneizaron los órganos en una disolución de sacarosa y luego se sembraron en LB o M7H11 dependiendo del tratamiento recibido (Ty21a o BCG, respectivamente).

Para el ensayo de supervivencia bacteriana in vitro, se infectaron las líneas celulares con Ty21a a diferentes MOI durante 1,5 h a 37°C, luego se añadió gentamicina 50 pg/ml durante 1 h a 37°C, con el fin de inactivar las bacterias extracelulares. Se mantuvo el cultivo celular en gentamicina 15 pg/ml (Gibco, Zug, Suiza). En diferentes puntos de tiempo, se lisaron las células con Triton-X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y se recogieron para la siembra en placas de LB-agar.

Preparación de suspensiones de células murinas

Se sacrificaron los ratones mediante inhalación de CO²y se recogieron los BLN y las vejigas, y se obtuvieron suspensiones de célula única tal como se describió previamente (Revaz, Debonneville, Bobst y Nardelli-Haefliger, 2008). En resumen, se obtuvieron suspensiones de células de los BLN mediante disociación mecánica. Se trituraron las vejigas y se digirieron por etapas con termolisina 0,5 mg/ml (Roche, Basilea, Suiza) y colagenasa/dispasa 1 mg/ml (Roche). Todas las suspensiones de células se resuspendieron en medio DMEM complementado con FCS al 10%.

Marcaje y análisis por citometría de flujo

Se tiñeron las células de los BLN y de la vejiga usando los siguientes anticuerpos monoclonales anti-IgG de ratón: PE-anti-CDllc (HL3, BD Biosciences, Basilea, Suiza), PE/TXRD-anti-CD8 (53-6.7, Southern Biotech, Birmingham, EE.UU.), eF450-anti-CD4 (GK15, eBiosciences, Viena, Austria), FITC-anti-IA/IE (M5/114,15,2), PerCp/Cy5.5-anti-CD3 (17A2), PE/Cy7-anti-GR1 (RB6-8C5), APC-anti-CD11b (M1/70), AF700-anti-NK1.1 (PK136), APC/Cy7-anti-F4/80 (BM8), todos de Biolegend (Londres, Reino Unido). Se tiñeron las células muertas con un kit de tinción de células Aqua Dead Fixable Live/Dead (Invitrogen, Life Technologies, Zug, Suiza). Se adquirieron las células usando un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter, Nyon, Suiza) y se analizaron con el software FlowJo 9.6.1 (Tree Star, Ashland, EE.UU.).

Análisis de citocinas

Se recuperaron los sobrenadantes de células uroteliales infectadas y se almacenaron a -80°C hasta su análisis. Se analizaron las líneas celulares humanas usando el kit de inflamación humana BD Cytometric Bead Array (CBA) para la detección y cuantificación de las siguientes citocinas: IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1 p e IL-8, siguiendo el protocolo del fabricante. Se usó el kit de inflamación murina b D CBA para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IFN-y, MCP-1, IL-10 e IL-6 para la línea celular MB49, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego se analizaron las muestras con el sistema BD FACSArray Bioanalyzer.

Apoptosis de células tumorales

Se infectaron las células MB49 con diferentes MOI de Ty21a vivas o termoinactivadas. 24 h y 72 h tras la infección, se recuperaron las células y se tiñeron con los marcadores anexina V y 7-AAD usando el kit de detección de apoptosis PE-anexina V (BD), siguiendo el protocolo del fabricante. Se adquirieron las células usando un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter) y se analizaron con el software FlowJo 9.6.1 (Tree Star).

Análisis estadístico

Se realizaron los análisis estadísticos usando Prism 6.00 para Windows (GraphPad software, California, EE.UU.) tal como se indica en el texto o en las leyendas de las figuras.

Ejemplo 2: Resultados

El tratamiento ives con Ty21a aumenta la supervivencia de los ratones en un modelo ortotópico de cáncer de vejiga Se evaluó el potencial de Ty21a administrada por vía ives para provocar la remisión de los tumores de vejiga en el modelo de cáncer de vejiga ortotópico usando células MB49. Este modelo de ratón se asemeja al cáncer de vejiga superficial humano en cuanto a los marcadores de superficie celular, la sensibilidad a la apoptosis y el perfil inmunológico (Chen, Zhang, Cao, Hessner y See, 2009) y se ha usado habitualmente para entender y/o evaluar la inmunoterapia ives con BCG (Loskog et al., 2005). Para garantizar la monitorización del tumor de vejiga, los inventores transdujeron células MB49 con vector lentiviral que expresa luciferasa (luc) para generar células MB49luc. En la presente configuración, se obtuvo una ocupación tumoral próxima al 100% con un tratamiento previo con etanol al 22% antes de la instilación ives de 200.000 células MB49-luc (para un experimento representativo en el día 8 véase la figura 1A). A tres grupos de 10 ratones se les instiló por vía ives 200.000 células MB49-luc en el día 0 y se les trató con BCG o Ty21a en los días 1, 8, 15 y 22 o se dejaron sin tratar, siguiendo la pauta habitual de los tratamientos con BCG en este modelo (Arnold, de Boer, O'Donnell, Bohle y Brandau, 2004; Mangsbo et al., 2008). Las dosis de bacterias consistían en 1/10 de la cápsula reconstituida de la vacuna oral Vivotif para Ty21a (al menos 2 x 109 UFC/cápsula) o vial de Oncotice para BCG (2-8 x 108 UFC/vial). Se muestran los porcentajes de ratones que sobreviven en función del tiempo (figura 1B) para cada grupo. Los presentes datos muestran que tanto Ty21a como BCG pudieron provocar significativamente la remisión de los tumores en comparación con los ratones sin tratar. Ty21a condujo a la remisión de 7 de cada 10 ratones (p=0,01 en comparación con los ratones sin tratar, usando una prueba de rangos logarítmicos ajustada), mientras que BCG condujo a la remisión de 6 de cada 10 ratones (p=0,01). Se observó que los tumores continuaban creciendo durante aproximadamente dos semanas después del primer tratamiento, pero en el momento de la cuarta instilación, la mayoría de los ratones presentaban la remisión completa de tumores. Además, se evaluaron los efectos de dosis bacterianas reducidas (figura 1C). Cinco grupos de ratones que se les había instilado por vía ives en el día 0 con 200.000 células MB49-luc recibieron 1/100 ó 1/1000 del inóculo de Ty21a o BCG por vía ives en los días 1, 8, 15 y 22 o se dejaron sin tratar. Ambas dosis de Ty21a (1/100 y 1/1000) indujeron la remisión tumoral (con la remisión de 17/20 ratones y 7/10 ratones, respectivamente), siendo ambas significativamente diferentes de los controles (p=0,0002 y p=0,002, respectivamente). Por el contrario, únicamente el inóculo de BCG a 1/100 fue significativamente diferente de los controles (p=0,0054), conduciendo a la remisión tumoral de 7 de cada 10 ratones. Una milésima parte del vial de BCG indujo la remisión tumoral en 5 de cada 10 ratones, lo que no fue significativamente diferente de los controles (p=0,024). En conjunto, estos resultados sugieren que Ty21a es más eficiente en provocar la remisión de tumores de vejiga MB49 ortotópicos que BCG ya que seguía siendo eficaz a dosis más bajas.

Las bacterias Ty21a no persisten en vejiga sana ni en tumores

En primer lugar, se investigó si Ty21a puede infectar y/o sobrevivir en la vejiga de ratones. Se instiló por vía ives Ty21a (media ± EEM 7,9 ± 0,16 log¹⁰UFC/ratones) en diferentes grupos de 4 ratones y se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo (figura 2A). Los resultados muestran que Ty21a no puede persistir en la vejiga durante más de 24 h. Además, 6 horas tras la instilación, hubo una disminución considerable de bacterias en la vejiga (100 veces menos que las instiladas), lo más probablemente debido a la micción. También se determinó la invasión a los ganglios linfáticos que drenan la vejiga (BLN) y al bazo; sin embargo, no se recuperaron bacterias a partir de estos órganos, lo que demuestra la ausencia de colonización e invasión por parte de Ty21a. Puesto que otra cepa de Salmonella enterica Typhi mostró un nicho preferencial en tumores murinos después de la inyección intratumoral (Vendrell et al., 2011), se examinó si Ty21a administrada por vía ives puede colonizar tumores de manera preferencial. Se instiló a diferentes grupos de 4 ratones con 200.000 células MB49-luc por vía ives y, 24 h más tarde, se les instiló con Ty21a (media ± EEM 8,19 ± 0,27 log¹⁰UFC/ratones), dos grupos recibieron una segunda dosis una semana más tarde, y uno de estos recibió una tercera dosis una semana más tarde. Se sacrificaron los ratones en diferentes puntos de tiempo y se determinaron las UFC/órgano (figura 2B). Los datos muestran que las bacterias pueden detectarse hasta el día 5 en tumores de vejiga, sin embargo, 24 h después de la instilación, el número de bacterias vivas disminuyó considerablemente (hasta 100.000 veces). Una semana después de la instilación, no se detectó ninguna bacteria en los tumores de vejiga, e incluso después de la re-exposición bacteriana, no aumentó la persistencia. Por tanto, parecía que Ty21a permanecía más tiempo en la vejiga en presencia de tumor, aunque en baja cantidad, y de nuevo no se detectaron bacterias en los BLN ni en el bazo.

Esto contrasta con BCG (Biot et al., 2012) y los presentes datos en la figura 2C en que pueden persistir en tumores de vejiga durante al menos una semana. Además, también se detectaron bacterias BCG en BLN de la vejiga cinco días después de la instilación en tres de cada cuatro ratones. En conjunto, estos resultados demuestran que Ty21a puede ser más segura ya que persiste de manera compatible sólo durante menos de 48 horas en los tumores de vejiga en comparación con al menos 7 días para BCG y no invadió órganos más profundos.

Ty21a induce de manera transitoria células inflamatorias locales en la mucosa de la vejiga

Para evaluar la seguridad de Ty21a administrada por vía ives, se examinaron las células inflamatorias/inmunitarias que se atraen a la vejiga. Se sacrificaron los ratones que recibieron 1/10 de cápsula de Ty21a por vía ives en diferentes puntos de tiempo, y se tiñeron las células de la vejiga y se analizaron mediante citometría de flujo (véase la figura 1 complementaria para la estrategia de selección). Se analizó la infiltración de neutrófilos, macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK) y células dendríticas (DC) (figura 3A). Se observó una infiltración robusta de neutrófilos 24 h después de la instilación con Ty21a (% de media ± EEM de 3,46 ± 1,42 frente a 0,16 ± 0,02 en ratones no sometidos previamente a experimentación, p< 0,05 siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). Esta fuerte infiltración fue transitoria, con un rápido retorno a los niveles de control después de 72 h. También se observó un aumento significativo de cinco veces en los macrófagos 24 h después del tratamiento ives (1,00 ± 0,33 frente a 0,21 ± 0,03 en ratones no sometidos previamente a experimentación, p< 0,05), que disminuyó lentamente a las 72 h. En cuanto a las células NK y DC, hubo un aumento ligero, pero no significativo 24 h después del tratamiento. Las células T CD4 también aumentaron significativamente siete días después de la instilación (1,22 ± 0,21 frente a 0,48 ± 0,11 en ratones no sometidos previamente a experimentación, p< 0,05), mientras que las células T CD8 no se vieron afectadas (figura 3B). Esto sugiere que Ty21a induce sólo de manera transitoria una respuesta inflamatoria local en la vejiga.

Instilaciones ives repetidas de BCG o Ty21a vivas dan como resultado una infiltración diferencial de células linfáticas hacia los tumores de vejiga

Se examinó adicionalmente la infiltración de tumores leucocíticos tras dosis ives repetidas de BCG, Ty21a o PBS como control. Los ratones instilados por vía ives con células tumorales MB49 en el día 0 recibieron por vía ives bacterias o PBS en los días 1, 8 y 15 y se sacrificaron 24 h o siete días después de cada dosis. Veinticuatro horas después de la primera dosis, Ty21a indujo una infiltración robusta de células linfoides (el 11,36% en comparación con el 2,19%, p< 0,05, siguiendo una Anova unilateral, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett), mientras que BCG indujo una infiltración ligera pero no significativa (6,26%). Sin embargo, siete días más tarde, aumentó significativamente la infiltración inducida por BCG (el 11,76% en comparación con el 5,89% en ratones tratados con PBS, p< 0,05), mientras que la infiltración con Ty21a no fue diferente de los ratones que portan tumor tratados con PBS. Cabe destacar que, con el tiempo, apareció una infiltración tumoral significativa de células linfoides en los ratones que portan tumor tratados con PBS (p< 0,05 en el día 8 y p< 0,01 en el día 16, en comparación con el día 2), que se correlacionaba con el crecimiento tumoral. En este contexto, la infiltración tumoral de células linfoides no se vio muy afectada por el 2° tratamiento bacteriano, excepto por una mayor infiltración inducida por BCG en el día 15 (aunque no significativa). De nuevo, se observó una tendencia hacia una infiltración de células linfoides inducida por bacterias 24 h después de la 3a dosis. Los presentes datos sugieren que Ty21a inducen una alta infiltración de células inflamatorias 24 h después de cada tratamiento, con una lenta disminución con el tiempo. Por el contrario, parece que BCG inducen mayores infiltraciones siete días después de cada dosis. Esto sugiere que Ty21a pueden ser menos inflamatorias a largo plazo, quizás reduciendo los acontecimientos adversos relacionados con la inflamación, en comparación con BCG que inducen una inflamación sostenida.

Ty21a inducen la apoptosis de células MB49

Para aclarar los mecanismos para la remisión tumoral mediada por Ty21a, se investigó la capacidad de estas bacterias para infectar células MB49 in vitro. Este no resultó ser el caso (datos no mostrado), confirmando de ese modo los resultados obtenidos en la vejiga (figura 2B). A continuación, se razonó que posiblemente Ty21a puede no infectar células murinas, sino sólo células humanas, ya que es un patógeno restringido a seres humanos. Sin embargo, la infección de líneas celulares de tumores de vejiga humanos, RT4 y RT112, con Ty21a a una multiplicidad de infección (MOI) de hasta 6000 no mostró ninguna invasión ni supervivencia. A diferencia de Ty21a, se ha notificado bien que BCG infecta líneas celulares de tumores tanto murinos como humanos. A continuación se examinó si Ty21a puede tener un efecto directo sobre la supervivencia/apoptosis de células tumorales. Se “infectaron” (este término se usará para la adición de bacterias siguiendo el protocolo de infección) células MB49 con diferentes MOI, y 24 h o 72 h más tarde, se recuperaron las células y se tiñeron para detectar anexina V y 7AAD, y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células apoptóticas tempranas sólo serían positivas para anexina V, ya que la integridad de la membrana está asegurada, sin embargo las células apoptóticas tardías también serían permeables a 7AAD. Además, se discriminarían las células necróticas como positivas únicas para 7AAD (véase la figura 6A para un esquema representativo). Los presentes datos muestran que Ty21a pudo inducir la apoptosis 24 h después de la “infección”, estando aproximadamente el 5% de las células en apoptosis o necrosis temprana y el 20% en apoptosis tardía después de la “infección” con alta MOI de Ty21a (MOI 3000) (p< 0,0001 en comparación con MOI 0). Estos resultados sugieren que Ty21a puede desencadenar la apoptosis y necrosis de células tumorales, en el plazo de 24 h después del contacto bacteriano.

Ty21a inducen la secreción de citocinas en líneas celulares tanto murinas como humanas

A continuación se investigó la capacidad de Ty21a para inducir la secreción de citocinas inflamatorias por parte de las células uroteliales, tal como se mostró previamente para BCG (revisado en (Alexandroff et al., 1999). Se “infectaron” líneas celulares uroteliales tanto murinas (MB49) como humanas (RT4 y RT112) con diferentes MOI de Ty21a y, 24 h más tarde, se analizaron los sobrenadantes celulares para determinar la secreción de citocinas inflamatorias usando un kit de inflamación murina (CBA) para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IFN-Y, MCP-1, IL-10 e IL-6, o un kit de inflamación humana para detectar y cuantificar las citocinas IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1 p e IL-8. Se calcularon las MOI teóricas según el intervalo de UFC descrito para las cápsulas de Ty21a, y se corrigieron después de eso sembrando bacterias en placas de LB, lo que explica las diferencias en la MOI real entre experimentos. Sólo se detectaron dos citocinas en el sobrenadante de células MB49, MCP-1 e IL-6 (figura 7). La citocina MCP-1 ya se había secretado por parte de células sin tratar a altos niveles, sin embargo su secreción aumentó significativamente (más de 10 veces) después de la infección con Ty21a a MOI 300 y 3000 (p< 0,0001 para todos los tratamientos en comparación con MOI 0). Por el contrario, IL-6 no se secretó por parte de células sin infectar, aumentando significativamente después de la infección con Ty21a a MOI 300 (p< 0,05 en comparación con MOI 0). Sin embargo, la respuesta más alta se obtuvo después de la infección con Ty21a a MOI 3000 (p< 0,0001 en comparación con MOI 0). Los presentes resultados sugieren que Ty21a puede inducir la secreción de citocinas por parte de células uroteliales murinas, que pueden participar en la remisión de tumores de vejiga. En las líneas celulares uroteliales humanas (RT4), se secretaron tanto IL-8 como IL-6 en el sobrenadante en ausencia de bacterias. La infección con Ty21a a MOI 200 ó 2000 dio como resultado una mayor secreción tanto de IL-8 como de IL-6 (p< 0,001 en comparación con MOI 0). TNF-a e IL-ip sólo se indujeron después de la “infección” con la mayor dosis de Ty21a (MOI 2000) (p< 0,0001 en comparación con MOI 0). Las células tumorales humanas RT112 secretaron cantidades más bajas de IL-8 e IL-6 que las células RT4 en ausencia de bacterias. Ambas citocinas aumentaron después de la infección con Ty21a a MOI de 600 ó 6000. Esto sugiere que Ty21a fomentan la secreción de diferentes citocinas inflamatorias por parte de líneas celulares de cáncer humano, que pueden participar en la respuesta inmunitaria antitumoral y en la remisión tumoral en seres humanos.

Bibliografía

Alexandroff, A. B., Jackson, A. M., O'Donnell, M. A. y James, K. (1999). BCG immunotherapy of bladder cancer: 20 years on. Lancet, 353(9165), 1689-1694. doi: 10.1016/S0140-6736(98)07422-4

Arnold, J., de Boer, E. C., O'Donnell, M. A., Bohle, A. y Brandau, S. (2004). Immunotherapy of experimental bladder cancer with recombinant BCG expressing interferon-gamma. Journal of immunotherapy, 27(2), 116-123.

Askeland, E. J., Newton, M. R., O'Donnell, M. A. y Luo, Y. (2012). Bladder Cancer Immunotherapy: BCG and Beyond. Adv Urol, 2012, 181987. doi: 10.1155/2012/181987

Begier, E. M., Burwen, D. R., Haber, P., Ball, R., & Vaccine Adverse Event Reporting System Working, G. (2004). Postmarketing safety surveillance for typhoid fever vaccines from the Vaccine Adverse Event Reporting System, de julio de 1990 a junio de 2002. Clin Infect Dis, 38(6), 771-779. doi: 10.1086/381548

Biot, C., Rentsch, C. A., Gsponer, J. R., Birkhauser, F. D., Jusforgues-Saklani, H., Lemaitre, F., ... Albert, M. L. (2012). Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med, 4(137), 137ra172. doi: 10.1126/scitranslmed.3003586

Black, R. E., Levine, M. M., Ferreccio, C., Clements, M. L., Lanata, C., Rooney, J. y Germanier, R. (1990). Efficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial. Chilean Typhoid Committee. Vaccine, 8(1), 81-84.

Chen, F., Zhang, G., Cao, Y., Hessner, M. J. y See, W. A. (2009). MB49 murine urothelial carcinoma: molecular and phenotypic comparison to human cell lines as a model of the direct tumor response to bacillus Calmette-Guerin. J Urol, 182(6), 2932-2937. doi: S0022-5347(09)02014-X [pii] 10.1016/j.juro.2009.08.018

Chorobik, P., Czaplicki, D., Ossysek, K. y Bereta, J. (2013). Salmonella and cancer: from pathogens to therapeutics. Acta Biochim Pol, 60(3), 285-297.

De Boer, E. C., De Jong, W. H., Van Der Meijden, A. P., Steerenberg, P. A., Witjes, J. A., Vegt, P. D., ... Ruitenberg, E. J. (1991). Presence of activated lymphocytes in the urine of patients with superficial bladder cancer after intravesical immunotherapy with bacillus Calmette-Guerin. Cancer Immunol Immunother, 33(6), 411-416.

Decrausaz, L., Goncalves, A. R., Domingos-Pereira, S., Pythoud, C., Stehle, J. C., Schiller, J., ... Nardelli-Haefliger, D. (2011). A novel mucosal orthotopic murine model of human papillomavirus-associated genital cancers. Int J Cancer, 128(9), 2105-2113. doi: 10.1002/ijc.25561

Engels, E. A., Falagas, M. E., Lau, J. y Bennish, M. L. (1998). Typhoid fever vaccines: a meta-analysis of studies on efficacy and toxicity. BMJ, 316(7125), 110-116.

Hayashi, T., Crain, B., Corr, M., Chan, M., Cottam, H. B., Maj, R., ... Carson, D. A. (2010). Intravesical Toll-like receptor 7 agonist R-837: optimization of its formulation in an orthotopic mouse model of bladder cancer. Int J Urol, 17(5), 483-490. doi: IJU2503 [pii] 10.1111/j.1442-2042.2010.02503.x

Hegele, A., Dalpke, A., Barth, P., Varga, Z., Heeg, K., Hofmann, R. y Olbert, P. (2004). Antineoplastic effect of immunostimulatory DNA (CpG-ODN) in a murine C57-BL6/MB-49 transitional cell carcinoma model. Anticancer Res, 24(4), 2225-2230.

Hegele, A., Dalpke, A., Heeg, K., Barth, P., Varga, Z., Hofmann, R. y Olbert, P. (2005). Immunostimulatory CpG oligonucleotides reduce tumor burden after intravesical administration in an orthotopic murine bladder cancer model. Tumour Biol, 26(5), 274-280. doi: 10.1159/000087380

Kresowik, T. P. y Griffith, T. S. (2009). Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy for urothelial carcinoma of the bladder. Immunotherapy, 1(2), 281-288. doi: 10.2217/1750743X.1.2.281

Levine, M. M., Ferreccio, C., Black, R. E., Tacket, C. O. y Germanier, R. (1989). Progress in vaccines against typhoid fever. Rev Infect Dis, 11 Supl. 3, S552-567.

Levine, M. M., Kaper, J. B., Herrington, D., Ketley, J., Losonsky, G., Tacket, C. O., ... Cryz, S. (1988). Safety, immunogenicity, and efficacy of recombinant live oral cholera vaccines, CVD 103, and ^cV^d103-HgR. Lancet, 2(8609), 467-470.

Loskog, A., Ninalga, C., Hedlund, T., Alimohammadi, M., Malmstrom, P. y Totterman, T. (2005). Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim, 4, 384-393.

Mangsbo, S. M., Nanalga, C., Essand, M., Loskog, A. y Totterman, T. H. (2008). CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T cell immunity. J. Immunother., 31, 34-42.

Masters, J. R., Hepburn, P. J., Walker, L., Highman, W. J., Trejdosiewicz, L. K., Povey, S., ... Franks, L. M. (1986). Tissue culture model of transitional cell carcinoma: characterization of twenty-two human urothelial cell lines. Cancer Res, 46(7), 3630-3636.

Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M. y Totterman, T. H. (2005). CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother, 28(1), 20-27.

Revaz, V., Debonneville, A., Bobst, M. y Nardelli-Haefliger, D. (2008). Monitoring of vaccine-specific gamma interferon induction in genital mucosa of mice by real-time reverse-transcription-PCR. Clin. Vacc. Immunol., 5, 757 764.

Rigby, C. C. y Franks, L. M. (1970). A human tissue culture cell line from a transitional cell tumour of the urinary bladder: growth, chromosome pattern and ultrastructure. Br J Cancer, 24(4), 746-754.

Saban, M. R., Simpson, C., Davis, C., Wallis, G., Knowlton, N., Frank, M. B., ... Saban, R. (2007). Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BMC Immunol, 8, 6. doi: 10.1186/1471 -2172-8-6

Seow, S. W., Cai, S., Rahmat, J. N., Bay, B. H., Lee, Y. K., Chan, Y. H. y Mahendran, R. (2010). Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci, 101(3), 751-758. doi: CAS1426 [pii] 10.1111/j.1349-7006.2009.01426.x

Summerhayes, I. C. y Franks, L. M. (1979). Effects of donor age on neoplastic transformation of adult mouse bladder epithelium in vitro. J Natl Cancer Inst, 62, 1017-1023.

Takahashi, T., Kushiro, A., Nomoto, K., Uchida, K., Morotomi, M., Yokokura, T. y Akaza, H. (2001). Antitumor effects of the intravesical instillation of heat killed cells of the Lactobacillus casei strain Shirota on the murine orthotopic bladder tumor MBT-2. J Urol, 166(6), 2506-2511.

Toso, J. F., Gill, V. J., Hwu, P., Marincola, F. M., Restifo, N. P., Schwartzentruber, D. J., ... Rosenberg, S. A. (2002). Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol, 20(1), 142-152.

Vendrell, A., Gravisaco, M. J., Pasetti, M. F., Croci, M., Colombo, L., Rodriguez, C.,... Waldner, C. I. (2011). A novel Salmonella Typhi-based immunotherapy promotes tumor killing via an antitumor Th1-type cellular immune response and neutrophil activation in a mouse model of breast cancer. Vaccine, 29(4), 728-736. doi: 10.1016/j.vaccine.2010.11.017

Wall, D. M., Srikanth, C. V. y McCormick, B. A. (2010). Targeting tumors with salmonella Typhimurium-potential for therapy. Oncotarget, 1(8), 721-728.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición farmacéutica que comprende un muíante no recombinante atenuado vivo de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi y/o un mutante no recombinante atenuado no viable de la cepa de Salmonella entérica serovar typhi para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer de vejiga, caracterizada porque dichos mutantes no recombinantes atenuados vivo y/o no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi se seleccionan del grupo que consiste en Ty21a, CVD 908-htrA, CVD 909, Ty800, M01ZH09, %9639, %9640 y %8444 y en la que la administración de la composición farmacéutica es tópica.
2. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha composición farmacéutica se administra localmente en la vejiga.
3. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, caracterizada porque dicha composición farmacéutica se administra localmente en la vejiga mediante instilación.
4. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada porque dicha composición farmacéutica se administra localmente en la vejiga varias veces.
5. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga no invasivo del músculo.
6. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
7. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el tratamiento consiste en reducir la recidiva del cáncer de vejiga.
8. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la prevención consiste en reducir o limitar la recidiva y/o progresión del cáncer de vejiga.
9. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos mutantes no recombinantes atenuados vivo y/o no viable de la cepa de Salmonella enterica serovar typhi que no persisten en el tumor son Ty21a.
10. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9, caracterizada porque dicha composición farmacéutica es Vivotif®.
11. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica se administra en asociación con radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia, o una combinación de las mismas.
12. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, caracterizada porque Vivotif® se reconstituye en tampón cuando va a administrarse mediante instilación ives.
13. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, caracterizada porque el tampón es PBS estéril.
14. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, en la que dicha composición farmacéutica vuelve a administrarse, después de una primera administración, localmente en la vejiga cada 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas o 24 semanas.