CN101115766B - 用于抗人乳头瘤病毒型16的salmonella疫苗菌株的密码子经优化的hpv16l1 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如在SEQ ID NO：1中提供的编码抗原HPV16L1蛋白的一种新核酸序列(HPV16L1S)，其中所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高该所得原核微生物的免疫原性，本发明进一步涉及构建包含SEQ ID NO：1的重组载体pFS14nsdHPV16L1和pFS14nsdHPV16kan L1S，其中前者带有氨卞青霉素和后者带有卡那霉素作为选择标记。本发明还涉及用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒株。另外，本发明公开一种基于原核微生物生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的疫苗的方法。

Description

用于抗人乳头瘤病毒型16的SALMONELLA疫苗菌株的密码子经优化的HPV16L1
技术领域
本发明涉及如在SEQ ID NO：1中提供的编码抗原HPV16L1蛋白的新核酸序列(HPV16 L1S)，其中该所述序列具有至少一个经修饰的密码子以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性。本发明还涉及用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒株。另外，本发明公开一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关癌变危险的基于原核微生物的疫苗的方法。
背景技术
宫颈癌是全世界妇女癌症死亡的第二主要原因，且实际上所有这些肿瘤可归因于人乳头瘤病毒(HPVs)亚型的感染，其中，发现HPV16是最常见的(6，41)。因此期待抗这些HPVs的有效疫苗，以对此癌症和其前期病变发病率，以及归因于这些病毒的少见肿瘤具有明显效果。首位候选的是预防疾病的亚单位HPV病毒样颗粒(sub-unit HPV virus-like particle)(VLP)疫苗(在(35)和(24)中评论)。原理功效试验的证据显示用HPV16 VLPs接种的妇女受到高度保护以防通过此病毒型的生殖器黏膜感染(19)。然而，其预期目标人群将会比儿童期疫苗的预期目标人群年长的疫苗的多次注射的要求可能表现在广泛实行上的实质性的障碍。在发展中国家这尤其正确，这些发展中国家占有大于四分之三的全世界宫颈癌病例(6)。已将经减毒但仍有侵入性的重组减毒Salmonella菌株广泛用作黏膜疫苗载体以将病原体特异保护的抗原决定部位递送至黏膜相关性淋巴样组织中。通过此途径，抗该载体和外源抗原的黏膜和系统免疫应答均可以获得(在(11，22，36)中评论)。我们已示出：如果经减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株表现出PhoPc表型，则用表达该HPV16主要衣壳蛋白L1(在VLPs中自组装)的Salmonella的小鼠的鼻接种，在血清和生殖分泌物中诱导出抗-HPV16的构象与中和抗体(3，4，31)。然而，即使用原始PhoPc株，也需要双鼻免疫以诱导高抗-HPV16VLP抗体效价，而口免疫是无效的(31)。在缺乏抗生素选择时低水平L1表达和L1编码的质粒的高不稳定性的观察结果强烈表明L1蛋白或L1基因对细菌可能是有毒的。由于该病毒L1基因用于在Salmonella中表达时表现非常不利的密码子选择，我们在此设计并测试用于在Salmonella中翻译的具有经优化的密码子的编码L 1蛋白的合成核苷酸序列(在此以后标记为L1S)。
基于这样的VLPs且在目前在临床试验中测试的该HPV疫苗已证明是良好耐受性的、高免疫原性的及能够防止HPV16诱导的宫颈上皮内瘤变的发展(由[Schiller，2004#1431]和[Lowy，2003#1397]评论)。然而，这些昂贵的疫苗要求多次肌肉用药以生效，且由于多数宫颈癌发生在发展中国家，这些疫苗对于最需要它们的人来说似乎是难以得到的。因此非常需要开发其它具有全世界适应性的策略。活减毒Salmonella菌株可能是有效的抗原递送系统，由于它们在口接种之后能够表达外源抗原并引起抗同源和异源抗原的黏膜及系统免疫应答(在[
Figure GSB00000763405700021
1992#245；Curtiss，1994#466；Levine，1997#1416]中评论)。在本研究中，我们已进一步优化了抗HPV16的基于Salmonella的疫苗以便能够在妇女中测试它。我们已首先用卡那霉素抗性基因替换了用于质粒维持的氨苄霉素选择标记，已知其更高的生物安全记录的该卡那霉素抗性基因对于在人类中的使用是更加可接受的(FDA在1994[Administration，1994#1522]中批准)。然后，我们已在三个已显示在人类中是安全的Salmonella enterica血清变型Typhi疫苗株，即：目前已得到许可的伤寒症疫苗Ty21a[Germanier，1975#103]，以及两个高免疫原性的伤寒症疫苗候选Ty800[Hohmann，1996#596]和CVD908htrA[Tacket，1997#643]中测试了该新质粒。使用小鼠的鼻内免疫模型[Galen，1997#661]，比较由此三菌株引起的抗同源和异源抗原的免疫应答。我们的数据显示在用该新重组菌株鼻或口免疫之后抗-HVP 16YLP的体液反应大大增加。引起关注的是，这与增加的L1表达无关，而与在体外和体内L1S-表达质粒的显著的稳定性有关。另外，如在其它其减毒适于人类使用的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株所显示的那样，免疫原性不限于PhoPc。
附图说明
图1显示密码子经优化的HPV16 L1S可读框(SEQ ID NO：1)。在给出的L1S的核苷酸序列中，加下划线的为经修饰的密码子和用粗体的为经修饰的核苷酸。
图2显示在PhoPc L1和PhoPc L1S重组菌株中HPV16L1的表达。
图3显示L1和L1S-质粒在体外的稳定性。
图4显示在用PhoPc L1S鼻和口接种后，抗-HPV16VLP系统的(A)和阴道的(B)抗体效价。
图5显示在用％4989L1S、x4990 L1S、PhoP″L1S和AroAL1S鼻或口接种后，抗-HPV16VLP系统的IgG效价。
图6为在用PhoPc kan L1S、Phop-kan L1S和ΔAro A kanL1S口接种后，血清抗-HPV16VLP抗体效价的比较。
图7显示在不同Salmonella enterica血清变型Typhi菌株中kan L1S质粒在体外的稳定性。
图8是在用Ty21a kan L1S、Ty800kan L1S和CVD908htrAkan L1S鼻接种后，血清抗-HPV16VLP抗体效价的比较。
图9是HPV16VLP和鞭毛蛋白-特异CD4+T细胞增值的比较。
图10显示在用Ty21a kan L1S鼻接种的小鼠的血清和阴道分泌物中HPV16-中和与抗-HPV16VLP抗体。
图11显示在仅用Ty21a kan L1S的或在初始时用经纯化的VLPs的鼻接种的小鼠的血清和阴道分泌物中HPV16中和与抗-HPV16VLP抗体。
在说明书中涉及的表的详细说明
表1&1A涉及在本研究中使用的Salmonella菌株。
表2涉及在鼻或口免疫后两周，携带L1-或L1S-编码质粒的Salmonella PhoPc的回收。
表2A涉及在口免疫后两周，携带氨苄青霉素e或卡那霉素抗性基因的Salmonella PhoPc L1S-编码质粒的回收。
表3涉及在鼻免疫后一周，携带kan L1S质粒的不同Salmonella enterica血清变型Typhi的回收。
发明目的
本发明的主要目的是提供如在SEQ ID NO：1中提供的编码抗原HPV16L1蛋白的新核酸序列(HPV16L1S)，其中，所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性时。
本发明的另一目的是构建包含SEQ ID NO：1的重组载体pFS14nsdHPV16L1S和pFS14nsd-kan3HPV16L1S，其中前者携带氨苄青霉素且后者携带卡那霉素作为选择标记。
本发明的又一目的是提供用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒株。
本发明的再一目的是提供一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关癌变危险的基于原核微生物的疫苗的方法。
发明内容
因此，本发明提供如在SEQ ID NO：1中提供的新核酸序列(HPV16L1S)，基于编码抗原HPV16L1蛋白的人乳头瘤病毒型16(HPV 16)，其中所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以当在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性，优选该菌株属于Salmonella种。本发明进一步涉及构建包含SEQ ID NO：1的重组载体pFS14nsdHPV16L1S和pFS14nsd-kan3HPV16L1S，其中前者携带氨苄青霉素且后者携带卡那霉素作为选择标记。本发明进一步提供用包含SEQ ID NO：1的pFS14nsdHPV16L1S和pFS14nsd-kan3HPV16L1S转化的属于Salmonella种的减毒株。此外，本发明公开一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的基于Salmonella的疫苗的方法。
具体实施方式
抗HPV感染和相关病变的基于Salmonella的疫苗的开发，具有用单次口接种诱导长效系统和黏膜免疫的理论优势，将对全世界实行具有非常大的价值。然而，尽管我们已在小鼠中显示了此策略的可行性(31)，但在将基于Salmonella的疫苗能够安全地用于在妇女中测试之前还必须应对几个缺点。这些缺点包括需要特殊的Salmonella表型(PhoPc，(3，4))和免疫的鼻途径以有效诱导中和抗体反应，以及L1-编码质粒没有抗生素选择时不稳定(31，4)或在用半致死互补系统使其稳定时弱表达(3)的观察结果。在这里，我们报导通过使用用于HPV16L1衣壳基因(HPV16L1S)表达的密码子优化策略解决了这些问题的大多数。的确，当用鼻或口途径递送不同减毒的细菌时，在Salmonella中合成的L1S基因稳定表达并带来更高免疫原性。
在哺乳动物细胞中天然乳头瘤病毒衣壳基因的表达是有限的，但是造成的HPV DNA疫苗的免疫原性缺乏可以通过密码子优化解除(20，23和42)。对于其它DNA疫苗已认识到密码子选择对免疫原性的影响(1，12，32和38)，其中较高的异源基因表达导致较高的免疫原性。对于在Salmonella中的翻译，由于原始HPV 16衣壳基因的密码子选择也不是最理想的，我们期望密码子优化的L1S基因的表达将产生更高的VLP表达及由此更高的重组Salmonella的免疫原性。令我们惊讶的是，不同减毒的L1S重组Salmonella的较高的免疫原性与在这些细菌中产生的较高量的L1/VLPs不相关。事实上，此对立是正确的，与原始L 1序列的表达(VLP量在20和60μg/1011CFU之间，(4))相比，当表达L1S基因时(范围从AroA L1S菌株的3μg/1011CFU至χ4989L1S的23μg/1011CFU)，产生较少量的HPV16VLPs。这与用经优化的人HPV16L1基因在哺乳动物细胞中获得的＞104的L1表达增加形成对比(20)。然而，我们应该注意，我们不能排除当Salmonella入侵其中代谢作用约束(metabolicconstraints)不同的小鼠组织时，在细菌中VLPs的表达量可能变化。不幸地，我们不能测量VLP在体内表达，因为回收的细菌数量相对低(103-104CFU/器官)和获得的VLP表达低(＜lfg/细菌)。
与密码子优化的L1S序列的表达相关的另一值得注意的特征是：在不存在抗生素选择时，L1S-表达质粒在体外和体内的稳定性提高。由于其带来由该细菌携带的该VLP抗原的较长的持久性，这可能有助于重组Salmonella的较高的免疫原性。此解释与以下的观点一致：在黏膜相关性淋巴样组织中较长的抗原持久性是成为由Salmonella疫苗菌株引起的免疫应答的基础的关键机理(34)，且与其它的已接触抗原黏膜淋巴样组织的抗原起始量是用于诱导有效免疫应答的关键点的提议(8，10)形成对比。已使用不同的途径来提高质粒在细菌载体中的稳定性(在(13，25)中评论)。它们包括使用体内可诱导的启动子或平衡的致死质粒稳定化系统，但是，据我们所知以前没有报道过优化异源抗原的密码子来诱导质粒稳定性。
引起关注的是，该质粒的稳定性和较低的VLP表达与L1S表达细菌在体外较迅速的生长速率相关。采取将在翻译系统中的该投入(inve stment)优化以提供最大的细菌生长速率，并且这通过在不同tRNA和它们的关连密码子之间充分的平衡来实现(5)。我们的观察结果表明优化该异源L1基因的密码子选择，释放出允许翻译内生的细菌蛋白的tRNA池，由此，提高损害L1/VLP表达的生长速率。此在体外提高的生长速率与在体内细菌的增强入侵和/或持续不相关，由此，我们不能预见L1S表达可能影响Salmonella疫苗菌株的安全性。该PhoPc L1S在小鼠中的免疫原性的确提高了，并且与用经纯化的HPV16VLPs诱导的免疫原性相比良好，其是目前在三期临床试验中最主要的原型预防亚基(prototype prophylacticsub-unit)疫苗(在(24)中评论)。用PhoPc L1S的单次鼻免疫诱导出，与用1μg经纯化的HPV16VLPs三次皮下注射，或用与黏膜佐剂霍乱毒素共同使用的5μg VLP剂量的三次鼻/气雾免疫诱导出的那些类似的血清和阴道抗-HVP16 VLPs IgG效价，包括诱导用于黏膜方法的在阴道清洗液中的特异IgA(2，29)。虽然我们已示出用重组Salmonella的鼻接种在低剂量时可以是高效的，并且没有伴随的肺炎(28)，但是在用此途径在人类中免疫时仍存在安全上的忧虑。在此，我们报道可以将较安全的口服进入用作用免疫原性的PhoPc L1S的单次口接种，虽然该VLP-特异效价比下面的鼻免疫低，但是它们与在三次不含佐剂的鼻/气雾5μg VLP用药之后诱导的效价类似(2)。
在人类中测试基于HPV16Salmonella疫苗的最主要的限制之一是，该包含单一减毒突变的PhoPc菌株的已报道的可逆性(PhoQ24(27))以及此表型在小鼠中诱导有效抗-VLP反应的必要性(3，4)。
在此，我们显示其它S.typhimurium菌株(χ4989，PhoP″和aroA)能够在鼻接种后在小鼠中诱导抗-VLP反应，这些菌株的减毒突变已在S.typhi中测试并显示在人类中是安全的(χ4632(30，39)，Ty800(15)和CVD908-htrA(40))。然而，该效价比通过PhoPc菌株诱导的效价低一或两个数量级，这与我们以前的发现一致(3，4)。该PhoQ24的表达(3)是否可以增强该新L1S重组菌株的免疫原性还有待测试。虽然口免疫比鼻免疫效果低，但是该AroAL1S的免疫原性较少受口服进入的影响。由于包含Aro缺失的S.typhi菌株(CVD908htrA)具有在人类中的最好的安全和免疫原性记录(在(13，21和33)中评论)，此结果是非常鼓舞人心的。此重组CVD908htrA L1S菌株可代表用于预防HPV16感染和相关病变的最好的候选口服活疫苗以在人类志愿者中测试。
许多年以来，产生具有全世界适用性的抗宫颈癌的预防疫苗一直是我们的主要目标。在此，我们报道在基于Salmonella的疫苗的开发上的决定性的改进，即，可接受的选择标记和安全疫苗菌株的鉴定，现在这将允许在妇女中测试此疫苗。重组细菌疫苗的开发经常需要使用选择性标记。不幸地，我们使用天冬氨酸6-半醛脱氢酶平衡致死载体-宿主系统[Curtiss，1990#59]以稳定L1S在PhoPc中的表达的尝试没有诱导出任何VLP-特异免疫应答(数据未示出)。因此我们已选出了抗生素选择标记即，卡那霉素，其具有确定的生物安全记录且其使用已由FDA批准[Administration，1994#1522]。该卡那霉素选择性标记将不会给微生物带来任何试验室以外的可选择的优势并且该表型在自然界中已非常普遍。事实上，对卡那霉素的普遍的细菌抗性已限制了此抗生素在人类医药中的使用和酶的高底物特异性保证抗现代抗生素治疗的抵抗或阻碍的发展的缺乏。引起关注的是，虽然此卡那霉素抗性基因的存在进一步提高了在体内该L 1S表达质粒在Phopc中的稳定性，但是用包含该kan L1S质粒的三个减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium口免疫诱导的免疫应答，与用包含氨苄青霉素L1S质粒的细菌获得的免疫应答类似[Baud，2004#1439]。
除在人类中作为重组疫苗测试的Salmonella enterica血清变型Typhimurium  PhoP-菌株之外[Angelakopoulos，2000#1194]，该基于Salmonella的疫苗是首先被开发作为抗伤寒疫苗的经减毒的Salmonella enterica血清变型Typhi菌株(在[Levine，2001#1428]中评论)。两种候选伤寒疫苗：Ty800[Hohmann，1996#596]和CVD908htrA[Tacket，1997#643]以与Typhimurium菌株(PhoP-and AroA)同样方式包含减毒作用(分别为PhoPQ和aro)，在此将其选作用于HPV16VLP的潜在的疫苗载体。此外我们还测试了已经得到许可的疫苗Ty21a。三个重组菌株的体外分析显示了相似的VLP表达水平和相对的质粒不稳定性，就此方面来说，该kan L1S质粒在Typhi菌株中不如其在Typhimurium菌株中稳定，但是它比在PhoPc中的amp质粒稳定[Baud，2004#1439]。当使用脲酶编码质粒时，同样观察到质粒在Typhi中不稳定，但在Typhimurium中则不然[Angelakopoulos，2000#1194]。在小鼠中鼻滴给予高剂量的经减毒的Salmonellaenterica血清变型Typhi引起一系列免疫应答，这与在口服给予减毒株的志愿者中观察到的免疫应答类似(在[Pasetti，2003#1404]中评论)。这支持用此小动物模型来预临床评估活Salmonella疫苗候选物的免疫原性和功效。我们首先使用此模型来研究该kan L1S质粒的体内稳定性。在免疫后一周从肺中回收相对高数量的细菌，反映在深度麻醉下用鼻接种可实现优异的肺靶向[Balmelli，1998#930；Londono-Arcila，2002#1526]，然而，与之前的研究一致，在此后的时间点几乎没有细菌从脾回收[Pasetti，2000#1494；Lee，2000#1530；Pickett，2000#1158]。虽然在回收的所有Ty21a细菌中发现该kan L1S质粒，但是其仅存在于极少数CVD908htrA和Ty800细菌中。据我们所知，以前没有报道过在鼻鼠科动物模型中用重组Ty800的试验，而以前在Ty21a[Gentschev，2004#1531]和CVD908htrA[Londono-Arcila，2002#1526]中均观察到质粒稳定性。在CVD908htrA中该kan L1S独特的不稳定性可能与在我们的质粒中存在组成型启动子而不是在其它重组CVD908htrA菌株常用的体内可诱导nirB启动子有关[Wang，2001#1533；Londono-Arcila，2002#1526；Ruiz-Perez，2002#1532]。在CVD908htrA和Ty800中该kan L1S的不稳定性可能与这些细菌抗HVP16 VLPs的低免疫原性有关。我们的数据清楚的显示在鼻鼠科动物模型中只有该重组Ty21a kan L1S能够诱导强抗-HPV16VLP抗体和VLP-特异CD4+T细胞反应。相反，CVD908htrA和Ty800均比Ty21a诱导出更强的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白抗体，以及鞭毛蛋白-特异CD4+T细胞反应(对于Ty800)。此发现与先前的研究一致，其中，将CVD 908htrA和/或Ty800与Ty21a在鼻鼠科动物模型[Wang，2001#1533]或人类中进行了比较。
本发明的实施方案涉及通过修饰它们的密码子合成基于HPV(Human Papilloma Virus)例如HPV 16、HPV 18、45、31等主要衣壳蛋白的新核酸序列，用于当转入原核微生物时，优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物免疫原性。该原核微生物优选选自由Salmonella sps、Escherichia coli、ShigellaYersinia、Lactobacillus、Mycobacteria或Listeria组成的组中，优选Salmonella sps。进一步，该Salmonella sps减毒株选自由Salmonella enterica血清变型Typhimurium、Salmonellatyphi、Salmonella typhimurium或Salmonella enterica血清变形dublin组成的组中。另外，该Salmonella菌株优选选自由Salmonella enterica血清变型Typhimurium PhoPC(CS022)、Salmonella enterica血清变型Typhimurium PhoP-(CS015)、Salmonella enterica血清变型Typhimuriumχ4989(ΔcyaΔcrp-cdt和ΔaroA(SL7207))、Salmonella enterica血清变型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800组成的组中。.
本发明的另一实施方案涉及用于提高原核微生物对人乳头瘤病毒型16(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步骤：
a.通过修饰密码子选择合成如在SEQ ID NO：1中所示的编码抗原HPV16 L1蛋白的新核酸，
b.通过替换在质粒载体pFS14nsdHPV16L1或pFS14nsdHPV16 kan L1中的原始HPV16L1基因构建包含如在SEQ ID No：1中所示的核酸序列的重组质粒载体，
c.将来自步骤(b)的该重组质粒载体引入经减毒的微生物以获得重组接种物，
d.在小鼠中给予重组接种物。
另一实施方案涉及用编码HPV(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的经密码子修饰的核酸转化的原核微生物减毒株，其中至少一个密码子是经修饰的。该HPV主要衣壳蛋白选自由引起肛殖癌的HPV菌株组成的组中(其中该HPV主要衣壳蛋白选择由HPV16、HPV18、HPV31和HPV45组成的组中)。该上述菌株包含新核酸序列SEQ ID NO：1。
本发明的又一实施方案涉及一种新核酸，其具有一个或更多经修饰的密码子，用于优化在Salmonella菌株中的重组质粒载体的稳定性，以提高所得Salmonella菌株的免疫原性。优选地，在本发明中在HPV16L1序列中已改变来自506个原始密码子中的163个。
而本发明的又一实施方案提供含有如SEQ ID NO：1中所示的DNA序列的重组质粒载体，其中该所述重组质粒载体为pFS14nsdHPV16L1S或pFS14nsd-kan3HPV16L1S。
本发明的另一实施方案涉及抗HPV16的基于Salmonella的疫苗的给药模型，该模型可能选自由口、内鼻、阴道或直肠组成的组中。
本发明另一实施方案提供原核微生物减毒株在制备用于预防或治疗处理乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的药物中的用途。
现在非限制性地参考附图通过实施例来描述本发明优选的实施方案。
实施例
实施例1
质粒构建和所用的细菌菌株
该L1S基因由瑞士Buchs的Microsynth合成。可读框在5′以Nco I限制性位点和在3′以Hind III限制性位点为侧翼(flanked)。将该L1S Nco I-Hind III片断插入，替换在质粒pFS14nsdHPV16-L1(31)中的原始L1 Nco I-Hind III片断。将该所得质粒，pFS14nsd HPV16-L1S通过电穿孔(37)引入经减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株PhoPc，(CS022(27))和PhoP″(CS015(26))，两者都是来自的美国波士顿的JohnMekalanos的赠品，x4989{Acya Acrp，(4))，x4990(Acya Acrp-cdd，(4))和AaroA(SL7207(16))，是来自Irene Corthesy-Theulaz，Lausanne，CH的赠品。
HPV16L1和VLP分析
如先前所述(15，31)，使用抗-HPV16L1mAb，CAMVIR-1(Anawa)通过蛋白质印迹分析L1在Salmonella溶菌产物中的表达。将数据归一化为如通过培养物的OD600测量的在细菌中的含量。使用识别在HPV16VLPs、H16E 70和H16V5上的构象性抗原决定部位的两种单克隆抗体，通过如先前所述的夹心酶联免疫吸附测定法(sandwich ELISA)(4)测量该HPV16VLP含量(9，20)。小鼠的免疫，该免疫应答的分析及S.typhimurium的回收
在所有试验中使用来自法国Iffa Credo的六周龄雌性BALB/c小鼠。在如前所述(17，31)麻醉下，胃灌(108～9CFU)或鼻滴(106～7CFU)服用二十μL的细菌接种物。按照早期报道(17，31)进行血液和阴道清洗液(vaginal washes)取样以及通过酶联免疫吸附测定法测定抗-HPV16 VLP抗体效价。如前所述(31)，测定在来自安乐死的小鼠的器官中的Salmonella enterica血清变型Typhimurium的回收。
设计用于在Salmonella中翻译的具有经优化的密码子的HPV16L1核苷酸序列
考虑用于翻译在Salmonella enterica血清变型Typhimurium中的主要内源蛋白的密码子(7，14)，以设计经优化的L1可读框(orf)。将来自原始HPV16 L1序列的506个密码子(HPV16114/B(18))中的163个，修饰为在Salmonella中最经常使用的密码子(见图1-SEQ ID NO：1)。这包括所有在Salmonella中极少发现的原始L1序列(136)的密码子和一些(27/72)不经常使用的密码子。然后，通过新L1S可读框在质粒pFS14nsd-HPV16L1(31)中替换该L1可读框，产生pFS14nsd-HPV16L1S。将该新质粒首先引入经减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株PhoPc(27)以产生此后称为PhoPc L1S的重组菌株。随后生产四个其它的L1S重组减毒Salmonella菌株(见下文)，表1总结了不同的菌株和在此研究中使用的缩写。
HPV16L1和VLP的表达
通过蛋白质印迹比较L1蛋白在PhoPc L1和PhoPc L1S的指数培养物的溶菌产物中的表达(见图2A)。令人惊讶地，在细菌培养物中L1的表达没有随新L1S序列而提高反而降低2倍(图2B)。当通过夹心酶联免疫吸附测定法比较在两个重组菌株中生产的VLPs量时，该发现得到确认(见图2C)。当用单克隆接种50ml LB后比较达到对数中期的时间时，注意到两个菌株在生长速率上的显著不同(对于PhoPc L1S大约7小时，对于PhoPc L1大约15小时)。这可能表明关于该相应关连tRNAs的L1经优化的密码子选择使生长速率最大化而没有伴随L1S翻译的增加。
L1S编码质粒在体外和体内的稳定性
发明人先前已报道：在体内缺乏抗生素选择时，在Salmonella中通过质粒分离，该原始L1-编码质粒迅速丢失(4，31)。首次比较该L1S-和L1-编码质粒在体外的稳定性。为此目的，在缺乏抗生素选择的情况下，在四个连续O/N培养期间，比较仍旧含有L1-或L1S-编码质粒的细菌的百分比(见图3)。正如所期待的，该L1-编码质粒迅速丢失。相反，在缺乏抗生素选择时，在约50代时间后，在大多数细菌中回收到该L1S-编码质粒。在小鼠的鼻或口免疫后，进一步在体内研究L1S-编码质粒的稳定性(见表2)。与原始L1-编码质粒相反(4)，该L1S编码质粒在接近感染位点/入口的器官中完全稳定至少两个周。然而，在更远的器官，例如脾中观察到L1S质粒的一些不稳定性，其中约10％的细菌仍包含L1S质粒但是无一检测到包含L1质粒。我们还应该注意到没有包含L1S的细菌的侵入力或持续性更高的证据，尽管观察到在体外这些细菌高速的生长能力。在用PhoPc L1S鼻或口接种后产生抗-HPVI6VLP的系统的和黏膜的抗体
最终目的是测试该HPV16L1S基因的表达是否会提高在Salmonella enterica血清变型Typhimurium中的HPV 16VLP抗原的免疫原性。因此，我们用PhoPc L1S菌株通过鼻或口途径使成组的雌性BALB/c小鼠免疫。在图4中示出在单次免疫后的4至6、8和24周在小鼠的血清和阴道分泌物中测量的抗-VLP的抗体效价。单次鼻接种在血清中诱导出高且长持久的抗-HPV16VLP的IgG效价，以及在阴道清洗液中的特异IgG和IgA效价。这些抗体效价与在用原始PhoPc L1菌株双鼻接种后诱导的效价类似，但主要的提高是它们比用原始PhoPc L1菌株单鼻接种获得的效价高一到两个数量级(4，31)。引起关注的是，用PhoPc L1S的口接种同样是高免疫原性的，虽然比鼻接种低，而即使用原始PhoPc菌株两次口接种也是无效的(31)。两次鼻或三次口剂量的PhoPc L1S(数据未示出)的给予没有提高免疫应答。
在用表达该HPV16L1S基因的不同减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株鼻或口接种后产生的抗-HPV16VLP的系统抗体
发明人先前已示出用表达原始L 1编码质粒的不同减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株鼻接种小鼠仅诱导出低或没有抗-HPV16VLPs抗体(4)。已知用表达L1S编码质粒的PhoPc菌株观察到高免疫原性，我们进一步将此质粒引入包括％4989、^4990、PhoP″和AroA的不同菌株(准确的减毒作用物，缩写和参考文献见表1)。在图5中示出在用这些新重组菌株单次鼻或口接种后7周在小鼠中测量的该抗-HVP16 VLP IgG效价。与我们先前的观察相反，在单次鼻接种后所有该新重组菌株诱导出一致的抗-HPV16VLP体液反应，虽然其效价比用PhoPc L1S菌株获得的效价低约一个数量级(见图4)。如所预期的，口免疫的免疫原性较低，但AroA L1S菌株除外，其在两种途径接种后诱导出类似的抗-HPV16 VLP IgG效价。
实施例2
质粒构建和所用的细菌菌株
在质粒pFS14nsd HPV16-L1S中，如下用卡那霉素抗性编码序列替换氨苄青霉素抗性编码序列。用pET-9a(Novagen)质粒DNA作为模板通过PCR产生含有卡那霉素编码序列和启动子的SacII-XbaI片断。所用的引物是位于从卡那霉素第一个ATG上游54个核苷酸处且含有SacII限制性位点(加下划线)的25-mer引物：5’-GGGCCGCGGTGGTCATGAACAATAA-3’，和含有XbaI限制性位点(加下划线)的28-mer引物：5’-GGGTCTAGAAGCTGTCAAACATGAGAAT-3’。用Expand高保真PCR(Expand High Fidelity PCR)(Roche MolecularBiochemicals)通过反向PCR产生含有整个pFS14nsdHPV16-L1S质粒序列，但没有氨苄青霉素抗性基因的另一SacII-XbaI大片段，用以下引物：位于从氨苄青霉素的ATG上游92个核苷酸处且含有SacII位点(加下划线)的28-mer引物5’-GGGCCGCGGTTTGTAGAAACGCAAAAAG-3，和含有XbaI位点(加下划线)及氨苄青霉素的终止密码子(粗体)的28-mer引物5’-GGGTCTAGATCC
Figure GSB00000763405700161
CTGTCAGACCAAG-3’。将该两个SacII-XbaI片断连接在一起以产生质粒pFS14nsd-kan3-HPV16-L1S。通过电穿孔[1990b#242]将该新质粒引入经减毒的Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株PhoPc(CS022[Miller，1990#181])、PhoP-(CS015[Miller，1989#178])、和ΔaroA(SL7207[Hoiseth，1981#123])，及引入该经减毒的Salmonella enterica血清变型TyphiTy800[Hohmann，1996#596]CVD908htrA[Tacket，1997#643]和Ty21a([Germanier，1975#103]，Berna  biotech，Switzerland)。
HPV16L1和VLP分析
使用抗-HPV16L1mAb，CAMVIR-1(Anawa)通过如先前所述[Nardellihaefliger，1997#742]的蛋白质印迹分析L1在Salmonella lysates中的表达。将数据归一化为在细菌中的含量。使用识别在HPV16VLPs、H16E70或H161A和H16V5上的构象性抗原决定部位的两种单克隆抗体[Christensen，1996#1053]，通过如先前所述的夹心酶联免疫吸附测定法测量该HPV16VLP的含量[Benyacoub，1999#1050]。
小鼠的免疫，抗-HPV16VLP抗体的分析及Salmonella回收
在所有试验中使用来自法国Iffa Credo的六周龄雌性，BALB/c小鼠。在如先前所述的麻醉下[Hopkins，1995#381；Nardellihaefliger，1997#742]，胃灌(109CFU)或鼻滴(107-9CFU)服用20μl的细菌接种物。按照早期报道[Hopkins，1995#381；Nardellihaefliger，1997#742]进行血液和阴道清洗液取样以及通过酶联免疫吸附测定法测定抗-HPV16VLP抗体效价。按照先前的描述[Nardellihaefliger，1997#742]，测定在来自安乐死的小鼠的器官中的Salmonella enterica血清变型Typhimurium或Typhi的回收。
中和分析
按照在[Pastrana DV，2004#1429]中的详细描述，用分泌的碱性磷酸酶(SEAP)HPV16假病毒进行中和分析。简要地，用两倍连续血清稀释物将稀释2000倍的optiprep纯化的SEAP HPV16假病毒在冰上培育1小时，用该假病毒-抗体混合物感染293T细胞3天。使用Great ESCAPE SEAP Chemiluminescence Kit(BDClontech)测定在10μl澄清的细胞上清夜中的SEAP含量。将中和效价定义为引起SEAP活性(100％SEAP活性在50至100相对光照单位的范围)至少50％降低的最高血清稀释的倒数。
增殖分析
通过如先前所述[Balmelli，2002#1357]的机械解离分离脾细胞。依照制造商的用法说明书用抗-CD4+-涂覆的微珠(Miltenyi Biotec，Galdbach，德国)通过磁性抗体细胞分选(MACS)来纯化CD4+T细胞。用单独的或具有刀豆球蛋白A(2.5μg/ml)的培养基作为阴性和阳性对照，以及用HPV16VLPs(2μg/ml，GMP制备)和鞭毛蛋白(10μg/ml，纯化自Ty21a)，将来自天然或经免疫的小鼠的CD4+T细胞培育三天，然后在一夜内将0.5μCurie的3H胸腺嘧啶核苷加入并以每分钟计数(cpm)测量参入。
在卡那霉素抗性PhoPc菌株中HPV16L1S的表达及质粒稳定性
通过由卡那霉素选择性基因替换在重组载体pFSnsdHPV16L1S中的氨苄青霉素抗性基因构建表达HPV16 L1S的卡那霉素抗性质粒。使用反向PCR方法来扩增该氨苄青霉素抗性基因序列两侧的该整个质粒，并将该所得片断与卡那霉素抗性编码序列连接(详见材料和方法)。该所得质粒标记为pFS14nsd-kan3HPV16L1S，并在PhoPc中电穿孔以产生PhoPc-kanL1S(缩写和在本研究中使用的菌株的参考文献见表1A)。如所期望的，在该新菌株中HPV16VLPs的体外表达与在氨苄青霉素抗性菌株PhoPc-L1S(约10μgVLPs/1011CFU，[Baud，2004#1439])中测量的表达类似。在两菌株间同样观察到类似的生长速率，用约7小时来达到对数中期，且质粒稳定性非常高，在不存在抗生素时，四个连续过夜培养后几乎100％的细菌仍包含该质粒。与该氨苄青霉素质粒相比，该kan L1S质粒的稳定性在体内增加，在所有检测的器官中，在口免疫和此后两周所有细菌包含该kan L1S质粒(见表2A)。
用携带kan L1S编码质粒的PhoPc、PhoP-和AroA口免疫后的抗-HPV16VLPs体液反应
进一步将该kan L1S质粒引入两个经减毒的Salmonellaenterica血清变型Typhimurium菌株：PhoP-和AroA(见表1A)，已表明其在Salmonella enterica血清变型Typhi疫苗菌株中的减毒突变在人类中是安全的。用三个重组Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株通过口服进入三个5至10个小鼠的组免疫一次，并在免疫后6周比较在血清和阴道清洗液中的HPV16VLPs特异抗体反应(见图6)。引起关注的是，通过AroA kan L1S菌株诱导的该抗-VLP抗体效价似乎与通过PhoPc kan L1S和通过前面的PhoPc L1S菌株诱导的效价同样高[Baud，2004#1439]。这些抗体效价在至少四个月内是稳定的(数据未示出)。相反，正如以前对于Phop-L1S所报道，通过PhoP-kan L1S诱导的该抗-VLPs抗体效价较低，[Baud，2004#1439]。同样在用PhoPc和Aroa kan L1S免疫的小鼠的阴道分泌物中诱导出HPV16VLP特异IgG和IgA，但是在用PhoP-kan L1S免疫后没有检测到。在使用口免疫的小鼠模型中获得的这些数据表明包含Δaro缺失的重组Salmonellaenterica血清变型Typhi可能比包含ΔPhoP/phoQ缺失的那些的免疫原性更高。
在三个Salmonella enterica血清变型Typhi疫苗菌株中kan L1S质粒的表达和稳定性
我们将该kan L1S质粒引入对于我们可以得到的三个Salmonella enterica血清变型Typhi疫苗菌株，即，Ty800(ΔPhoP/phoQ，[Hohmann，1996#596])、CVD908-htrA(ΔaroC，ΔaroD，htraA，[Tacket，1997#643])和Ty21a[Germanier，1975#103](已获得许可的typhoid疫苗菌株)(缩写和参考文献见表1A)。在此三菌株中VLPs的体外表达类似(20至30μg VLP/1011CFU)。首先在体外检测在不存在抗生素下在此三疫苗菌株中该kan L1S质粒的稳定性(见图7)。与以前用Salmonella enterica血清变型Typhimurium菌株的结果相反，在该疫苗菌株中观察到较低的kan L 1S质粒稳定性。在第二个过夜后发生质粒的缓慢丢失，但是在五个连续过夜后，在Ty21a kan L1S、Ty800kan L1S和CVD908-htrA kan L1S A中该质粒仍然分别在9、7和18％的细菌中保留。在人类中Salmonella enterica血清变型Typhi疫苗菌株仅进行有限的循环(rounds)或复制并且，它们在小鼠中通过口服进入是非侵入性的。如通过重组CVD908htrA显示，如果通过鼻途径以高的剂量服用该细菌，可以短期感染小鼠[Pickett，2000#1158][Pasetti，2000#1494]。由此在用109CFU的CVD908-htrA kan L1S和Ty21a kan L1S或107CFU的Ty800kan L1S鼻内免疫后一周，我们检测了从小鼠的肺和脾回收的Salmonella中kan L1S质粒稳定性。后面的菌株只能以低的剂量给药，因为否则其对于小鼠是致死的，与在小鼠中用猪胃黏蛋白腹膜内注射这样的PhoPQ缺失细菌后的先前发现一致[Baker，1997#659]。引起关注的是，在Ty21a kan L1S免疫后从肺回收的所有细菌都包含该kan L1S，而在Ty800kan L1S和CVD908-htrA kan L1S免疫后极少(分别为7.9和0.8％)包含该kan L1S质粒(见表3)。这表明在鼻鼠科动物模型中该kan L1S质粒在Ty21a中比在其它测试的Salmonella enterica血清变形Typhi疫苗菌株中更稳定。
在鼻内鼠科动物模型中，通过表达HPV16VLPs的Salmonellaenterica血清变型Typhi疫苗菌株诱导的体液的和细胞的免疫应答
在两个每月一次的间隔鼻内用药后(对于CVD908-htra和Ty21a为109CFU，及对于Ty800重组菌株为107CFU)，在多组5至10个雌性BALB/c小鼠中，评价三个重组Salmonella enterica血清变型Typhi菌株的免疫原性。在血清中测量八周抗该异源HPV16VLP抗原以及抗两个同源抗原LPS和鞭毛蛋白的IgG效价(见图8)。引起关注的是，仅在用Ty21a kan L1S的两次免疫后诱导出高抗-VLP IgG效价，而由两种其它菌株诱导出低或几乎不能检测的效价。相反，Ty800kan L1S和CVD908htra kan L1S诱导出比Ty21kan L1S(在第8周时p＜0.01)高的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白IgG效价，这表明前两个重组菌株已成功地感染小鼠并诱导出抗同源抗原的体液反应。
T辅助应答(T helper responses)参与产生和维持高抗体效价，因此同样检测了抗鞭毛蛋白和HPV16VLPs的细胞免疫应答。在免疫八周后，将该小鼠杀死并用从脾纯化CD4+T细胞测量抗原特异增殖(见图9)。仅在用Ty21a kan L1S(p＜0.001)两次鼻内接种后显著地诱导出CD4+T细胞的HPV16VLP刺激，这与抗-HPV16VLPs效价的诱导一致。相反，仅在用Ty800kanL1S(p＜0.001)接种后检测出CD4+T细胞的显著的鞭毛蛋白特异刺激。
在仅用Ty21a kan L1S或在初始时用皮下VLP用药免疫的小鼠的血清或生殖分泌物中诱导HPV16-中和效价。
在第0和4周，额外组的5个雌性BALB/c小鼠接受了两次Ty21kan L1S(ca.109CFU)的鼻用药，在8周时进行血液和阴道分泌物的取样。在血清和阴道分泌物两者中，通过酶联免疫吸附测定法和SEAP HPV16假病毒中和分析分别测定抗-HPV16VLP和HPV16-中和抗体效价(见图10A)。如先前所报道的，在用重组Salmonella enterica血清变型typhimurium L1S菌株免疫后，该HPV16-中和效价比该抗-VLP酶联免疫吸附测定法效价稍低[Baud，2004#1439]。此外，我们在此示出在阴道分泌物中诱导出抗-HPV16VLP IgGs和IgAs，并且那些分泌物含有HPV16-中和抗体(见图10-B)。我们还研究了用1μg经纯化的VLPs的皮下(s.c.)引发，对通过用Ty21a kan L1S的次优免疫(即单次109CFU鼻用药)诱导的免疫应答的影响。数据显示(图11)用1μg VLPs的皮下引发的确导致在血清中抗-VLP IgG效价的显著增长，伴随单一Ty21a kan L1S(p＜0.01，与没有VLP引发相比)的鼻增长。相反，在诱导出的抗-VLP阴道IgG中没有统计学上的差别，而当将VLP和Ty21a kan L1S都给药时，仅诱导出抗-VLP阴道IgA。中和效价有待测定。
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表1：在本研究中使用的Salmonella菌株
  菌株(减毒作用物(attenuations))   用于电穿孔的质粒   缩写   参考文献
  CS022(PhoPc，pho-42)   PhoPc   (26)
  “   pFS14nsd-HPV16L1   PhoPc L1   (31)
  “   pFS 14nsd-HPV16L1S   PhoPc L1S   本工作
  χ4989(ΔcyaΔcrp)   (4)
  “   pFS14nsd-HPV16L1   χ4989L1   (4)
  “   pFS 14nsd-HPV16L1S   χ4989L1S   本工作
  χ4990(Δcya Δcrp-cdt)   (4)
  “   pFS 14nsd-HPV16L1   χ4990L1   (4)
  “   pFS14nsd-HPV16L1S   χ4990L1S   本工作
  CS015(PhoP-，ΔphoPQ)   (26)
  “   pFS14nsd-HPV16L1   PhoP-L1   (4)
  “   pFS14nsd-HPV16L1S   PhoP-L1S   本工作
  SL7207(ΔaroA)   (16)
  “   pFS14nsd-HPV16L1   AroA L1   本工作
  “   pFS14nsd-HPV16L1S   AroA L1S   本工作
表1A：在本研究中使用的Salmonella菌株
Figure GSB00000763405700301
表2：在鼻或口免疫两周后携带L1-或L1S-编码质粒的Salmonella PhoPc的回收
Figure GSB00000763405700311
a CFU/器官±SEM的平均值(log10)；b 取自[Benyacoub，1999#1050]的在用PhoPc L1鼻免疫后的数据；c不可检测
表2A：在口免疫两周后携带氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因的Salmonella PhoPc L1S-编码质粒的回收
Figure GSB00000763405700312
a CFU/器官±SEM的平均值(log10)
b取自Baud等人2004的数据
表3：在鼻免疫一周后携带kan L1S质粒的不同Salmonellaenterica血清变型Typhi的回收
aCFU/器官±SEM的平均值(log10)
ND没有检测到(＜1.3CFU/器官)

Claims (11)

1.一种编码抗原HPV16L1蛋白的核酸，所述核酸的核酸序列如附图1所示。
2.一种重组质粒载体，其含有根据权利要求1所述的核酸。
3.根据权利要求2所述的重组质粒载体，其中所述重组质粒载体是pFS14nsd-HPV16L1S或pFS14nsd-kan3HPV16L1S。
4.一种原核微生物，其含有根据权利要求2所述的重组质粒载体。
5.根据权利要求4所述的原核微生物，其中该原核微生物是Salmonella sps。
6.一种生产用作疫苗的重组微生物的方法，其包括：
a.合成如在附图1中所示的编码抗原HPV16L1蛋白的核酸，
b.通过替换在质粒载体pFS14nsdHPV16L1或pFS14nsdHPV16kanL1中存在的原始HPV16L1基因，构建包含如在附图1中所示的核酸的重组质粒载体，和
c.将该重组质粒载体引入原核微生物以获得重组微生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该重组质粒载体的引入通过电穿孔进行。
8.根据权利要求6所述的方法，其中该重组质粒是pFS14nsdHPV16L1S或pFS14nsd-kan3HPV16L1S。
9.根据权利要求6所述的方法，其中该原核微生物是Salmonella sps。
10.根据权利要求4所述的原核微生物的减毒株，在制备用于乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的预防或治疗处理的药物中的用途。
11.一种含有重组原核微生物的疫苗，该重组原核微生物含有编码HPV，即人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白且表达该相应蛋白的根据权利要求1所述的核酸。
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