JP4769247B2

JP4769247B2 - ヒトパピローマウイルス１６型に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａワクチン株に関するコドン最適化されたＨＰＶ１６Ｌ１

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Publication number: JP4769247B2
Application number: JP2007516066A
Authority: JP
Inventors: ナルデッリ，デニス
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Current assignee: Indian Immunologicals Ltd
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Filing date: 2005-06-20
Publication date: 2011-09-07
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Description

本発明は、配列番号１に提供される、抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードする新規な核酸配列（ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ）に関するものであり、前記配列は、原核微生物にトランスフォーメーションされて、結果として生じた原核微生物の免疫原性改善を目的とされた場合に、リコンビナントプラスミドベクターの安定性を最適にするための少なくとも一つの改変されたコドンを有する。本発明は、ＨＰＶ１６（ヒトパピローマウイルス）主要キャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフォーメーションされて、対応するタンパク質を発現している、原核微生物の弱毒化株にも関するものである。さらに、本発明は、パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの処置のための、原核微生物に基づくワクチンを製造する工程を開示する。

背景技術および従来技術の参照
子宮頚ガンは、全世界で女性におけるガンの死因の第２位であり、これらの腫瘍の事実上全てがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のサブセットの感染に起因しうる。このＨＰＶのうち、ＨＰＶ１６が最も高頻度に見い出される（6, 41）。したがって、これらのＨＰＶに対する有効なワクチンは、本ガンおよびその前駆病変の発生率に、ならびにこれらのウイルスに起因しうるあまり一般的ではない腫瘍に劇的な影響を有すると予想されよう。その有力な候補は、予防用ＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）サブユニットワクチン（(35)および(24)により総説されている）である。概念の証明（proof of principle）のための有効性臨床試験は、ＨＰＶ１６ＶＬＰをワクチン接種された女性が、このウイルス型による性器粘膜感染に対して高度に防御されたことを示した（19）。しかし、予測されたターゲット集団が小児期ワクチンのターゲット集団よりも年齢が高いであろうワクチンについて、多回注射の必要性は、広範囲に及ぶ実用化への実質的な障壁となりうる。これは、全世界の子宮頚ガン症例を４分の３よりも大きく占める開発途上世界で特にあてはまる（6）。弱毒化されているが、なお侵入性であるリコンビナント弱毒化Salmonella株が、病原体特異的防御エピトープを粘膜関連リンパ組織に送達するために粘膜ワクチンベクターとして広く使用されてきた。この経路を介して、担体および外来抗原に対する粘膜免疫応答と全身免疫応答との両方を得ることができる（(11, 22, 36)に総説されている）。ＶＬＰに自己集合するＨＰＶ１６主要キャプシドタンパク質Ｌ１を発現しているそのSalmonellaを用いたマウスの経鼻ワクチン接種は、その弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimurium株がＰｈｏＰ^ｃ表現型を示すならば、血清および性器分泌物中に抗ＨＰＶ１６コンフォメーション抗体および中和抗体を誘導することを本発明者らは示した（3, 4, 31）。しかし、本来のＰｈｏＰ^ｃ株でさえも、高い抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価を誘導するには２回の経鼻免疫処置が必要であり、一方で経口免疫は無効であった（31）。抗生物質による選択の不在下で、Ｌ１をコードするプラスミドの高い不安定性と共に、低レベルのＬ１発現が観察されたことにより、Ｌ１タンパク質またはＬ１遺伝子のいずれかが細菌に有毒でありうることが強く示唆された。ウイルスＬ１遺伝子がSalmonellaにおいて発現するために高度に都合の悪いコドン使用頻度を示すことから、Salmonellaでの翻訳のために最適化されたコドンを有する、Ｌ１タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列（以下Ｌ１Ｓと呼ぶ）を本明細書において設計して試験した。

当該ＶＬＰに基づき、臨床試験で現在試験されたＨＰＶワクチンは、耐容性良好であり、高度に免疫原性であり、かつＨＰＶ１６に誘導される子宮頚部上皮内ガンの発現を予防できることが証明された（[Schiller, 2004 #1431]および[Lowy, 2003 #1397]によって総説されている）。しかし、これらの高価なワクチンは、有効であるには多回筋肉内投与を必要として、大部分の子宮頚ガンが発達途上国で発生することから、当該ワクチンは最も必要とする人々には利用できないと思われる。このように、世界中で適用性を有するその他の戦略を開発することが非常に重要である。生きた弱毒化Salmonella株は、外来抗原を発現でき、経口ワクチン接種後に同種および異種抗原に対する粘膜免疫応答および全身免疫応答を誘発できることから、これらの株は有効な抗原デリバリーシステムでありうる（[Schodel, 1992 #245; Curtiss, 1994 #466; Levine, 1997 #1416]に総説されている。本研究では、女性に試験できるように、ＨＰＶ１６に対する、Salmonellaに基づくワクチンをさらに最適化した。まず、プラスミド維持のために使用されたアンピシリン選択マーカーを、より高い生体安全性成績を与えられた、ヒトでの使用にさらに許容されるカナマイシン耐性遺伝子に置換した（１９９４年にＦＤＡが認可（政府、1994 #1522））。次に、ヒトにおいて安全であると示された三つのSalmonella enterica serovar Typhiワクチン株、すなわちＴｙ２１ａ[Germanier, 1975 #103]（実際に認可された腸チフスワクチン）、ならびにＴｙ８００[Hohmann, 1996 #596]およびＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ[Tacket, 1997 #643（二つの高度に免疫原性の候補腸チフスワクチン）においてこの新しいプラスミドを試験した。マウスの鼻腔内免疫処置モデル[Galen, 1997 #661]を使用して、これらの３株により誘発された、同種および異種抗原に対する免疫応答を比較した。この新しいリコンビナント株の経鼻免疫処置または経口免疫処置のいずれかの後で、抗ＨＶＰ１６ＹＬＰ体液性応答が大きく増加したことをデータは示している。興味深いことに、これは、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでのＬ１の発現増加とではなく、Ｌ１Ｓ発現プラスミドの顕著な安定性と関連した。さらに、弱毒化がヒトでの使用に適切な、その他のSalmonella enterica serovar Typhimurium株で示されたように、免疫原性はＰｈｏＰｃに限定されなかった。

明細書において参照された表の詳細
表１および１Ａは、本研究に使用したSalmonella株を表す。
表２は、経鼻または経口免疫処置の２週間後の、Ｌ１またはＬ１ＳをコードするプラスミドをもつSalmonella ＰｈｏＰ^ｃの回収を表す。
表２Ａは、経口免疫処置の２週間後の、アンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子をもつ、Salmonella ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓをコードするプラスミドの回収を表す。
表３は、経鼻免疫処置の１週間後のｋａｎＬ１ＳプラスミドをもつSalmonella enterica serovar Typhiの回収を表す。

発明の目的
本発明の主目的は、抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードする、配列番号１に提供される新規な核酸配列（ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ）を提供することであり、ここで、前記配列は、原核微生物にトランスフォーメーションされて、結果として生じた原核微生物の免疫原性改善を目的とされた場合に、リコンビナントプラスミドベクターの安定性を最適にするための少なくとも一つの改変されたコドンを有する。

本発明の別の目的は、配列番号１を内部に有するリコンビナントベクターｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６Ｌ１、ｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６ｋａｎＬ１ＳおよびｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＨｉｎＳ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓを構築することであり、ここで、前者はアンピシリンを、後者はカナマイシンを選択マーカーとしてもつ。

本発明のなお別の目的は、ＨＰＶ１６（ヒトパピローマウイルス）主要キャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフォーメーションされて、対応するタンパク質を発現している原核微生物の弱毒化株を提供する。

本発明のもう一つの目的は、パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの処置のための、原核微生物に基づくワクチンを製造する工程を提供することである。

発明の概要
したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に基づく、抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードする、配列番号１に提供される新規な核酸配列（ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ）を提供し、ここで、前記配列は、原核微生物にトランスフォーメーションされて、結果として生じた原核微生物の免疫原性改善を目的とされた場合に、リコンビナントプラスミドベクターの安定性を最適にするための少なくとも一つの改変されたコドンを有し、好ましくは、その株はSalmonella speciesに属する。本発明は、配列番号１を内部に有するリコンビナントベクターｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６Ｌ１、ｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６ｋａｎＬ１ＳおよびｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＨｉｎＳ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓを構築することにさらに関するものであり、前者ベクターはアンピシリンを、後者ベクターはカナマイシンを選択マーカーとしてもつ。本発明は、配列番号１を内部に有するｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６Ｌ１、ｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６ｋａｎＬ１ＳおよびｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＨｉｎＳ−ＨＰＶ１６Ｌ１ＳでトランスフォーメーションされたSalmonella speciesに属する弱毒化株をさらに提供する。さらに、本発明は、パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの処置のための、Salmonellaに基づくワクチンを製造するための工程を開示する。

本発明の詳細な説明
ＨＰＶ感染および関連する病変に対する、Salmonellaに基づくワクチンの開発は、単回経口ワクチン接種で長期持続する全身免疫および粘膜免疫を誘導する理論的な利点を有して、全世界での実用化に大きな価値があるであろう。しかし、そのような戦略がマウスにおいて実行可能であることを示したにもかかわらず（31）、Salmonellaに基づくワクチンが女性において安全に試験できるまでには、いくつかの障害に取り組まねばならなかった。これらの障害には、中和抗体応答を効果的に誘導するために特定のSalmonella表現型（ＰｈｏＰ^ｃ、(3, 4)）および経鼻経路の免疫処置の必要性、ならびにＬ１をコードするプラスミドが抗生物質による選択なしでは不安定であった(31, 4)か、または半致死相補性系で安定化した場合にあまり発現されなかった（(3)という観察が含まれた。本明細書において、ＨＰＶ１６Ｌ１キャプシド遺伝子（ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ）の発現のためにコドン最適化戦略を使用することによって、これら問題の大部分が解決されることを報告する。実際に、合成Ｌ１Ｓ遺伝子の発現は、Salmonellaにおいて安定であり、異なって弱毒化された細菌が経鼻または経口経路のいずれかにより送達された場合に、より高い免疫原性を招く。

ネイティブなパピローマウイルスキャプシド遺伝子の発現は、哺乳動物細胞に限定されるが、結果として生じた、ＨＰＶのＤＮＡワクチンの免疫原性欠如は、コドン最適化により軽減することができるであろう（20, 23および42）。免疫原性に及ぼすコドン使用頻度の影響は、他のＤＮＡワクチンについて認識されてきたが、これらのＤＮＡワクチンでは、異種遺伝子のより高い発現がより高い免疫原性を招いた（1, 12, 32および38）。本来のＨＰＶ１６キャプシド遺伝子のコドン使用頻度がSalmonellaでの翻訳についても最適以下であるので、コドン最適化されたＬ１Ｓ遺伝子の発現がより高いＶＬＰ発現と、結果としてリコンビナントSalmonellaのより高い免疫原性とを招くであろうと予測した。驚くことに、異なって弱毒化されたＬ１ＳリコンビナントSalmonellaのより高い免疫原性は、これらの細菌において産生されたより高い量のＬ１／ＶＬＰとは相関しない。実際に、その逆が真実であり、Ｌ１Ｓ遺伝子が発現した場合に、本来のＬ１配列の発現（２０から６０μg/１０^１１CFUのＶＬＰ量, (4)）に比較して低い量のＨＰＶ１６ＶＬＰが産生した（ＡｒｏＡＬ１Ｓ株についての約３μg/１０^１１CFUからχ４９８９Ｌ１Ｓ株についての２３μg/１０^１１CFUの範囲）。これは、ヒトに対して最適化されたＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を有する哺乳動物細胞で得られたＬ１発現での＞１０^４倍の増加と対照的である（20）。しかし、Salmonellaが代謝制約の異なるマウス組織に侵入している場合に、その細菌に発現したＶＬＰの量が変動しうることを排除できないことに留意すべきである。残念ながら、相対的に低い数の細菌（１０^３〜１０^４CFU／器官）しか回収されず、低いＶＬＰの発現（＜１fg/細菌）しか実現されないとすると、ＶＬＰのｉｎｖｉｖｏ発現を測定できない。

コドン最適化されたＬ１Ｓ配列の発現に関連した別の顕著な特性は、抗生物質による選択の不在下でＬ１Ｓ発現プラスミドのｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ安定性の改善である。これは、細菌がもつＶＬＰ抗原のより長期間の維持を招くことから、より高い免疫原性のリコンビナントSalmonellaに寄与することができる。このような説明は、粘膜関連リンパ組織での抗原のより長期間の維持がSalmonellaワクチン株によって誘発される免疫応答の根底にある主要なメカニズムである（34）という考えと一致し、粘膜リンパ組織を感作する初回量の抗原が効果的な免疫応答を誘導するための決定的に重要なポイントであるというもう一方の示唆と対照をなす（8, 10）。異なるアプローチが、細菌担体でのプラスミド安定性を改善するために使用されてきた（(13, 25)に総説されている）。これらのアプローチには、ｉｎｖｉｖｏ誘導性プロモーターの使用または平衡致死プラスミドの安定化系が含まれるが、知るところによると、異種抗原のコドン最適化は、プラスミド安定化を誘導すると以前に報告されていない。

興味深いことに、プラスミドが安定であること、およびより低いＶＬＰ発現は、Ｌ１Ｓを発現している細菌のｉｎｖｉｔｒｏ成長速度がより速いことと関連した。翻訳系における包囲は、細菌の最大成長速度を提供するように最適化されて、これは異なるｔＲＮＡとそれらの同族コドンとの間の妥当なバランスによって実現されると仮定される（5）。異種Ｌ１遺伝子のコドン使用頻度を最適化することは、内因性細菌タンパク質の翻訳を可能にすることによって、成長速度を増大するあまりＶ１／ＶＬＰの発現を損なうｔＲＮＡプールが放出されたことを、本発明者らの観察は示唆している。この増大したｉｎｖｉｔｒｏ成長速度は、増大した侵入および／または細菌のｉｎｖｉｖｏ残留と相関しなかった。よって、Ｌ１Ｓの発現がSalmonellaワクチン株の安全性に影響しうるとは予測されない。ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓの免疫原性は実際に改善して、現在第ＩＩＩ相臨床試験中の有力なプロトタイプ予防用サブユニットワクチンである精製ＨＰＶ１６ＶＬＰで誘導された免疫原性に十分匹敵する（(24)に総説されている）。ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓの単回経鼻免疫処置は、ＨＰＶ１６の精製ＶＬＰ１μgの経皮注射３回または粘膜アジュバントであるコレラ毒素と共のＶＬＰ５μg用量の経鼻／エーロゾル免疫３回に類似した血清および膣の抗ＨＶＰ１６ＶＬＰＩｇＧ力価を誘導し、それは、粘膜プロトコールについて膣洗浄液中に特異的ＩｇＡの誘導を含んだ（2, 29）。リコンビナントSalmonellaを用いた経鼻ワクチン接種が低用量で高度に有効であり得るものであり、肺炎を併発しないことが示されたが（28）、ヒトにそのような免疫処置経路を使用することについて依然として安全性の懸念が存在する。本明細書で、ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓを用いた単回経口ワクチン接種として使用できる、より安全な経口経路が免疫原性であり、ＶＬＰ特異的力価が経鼻免疫処置後よりも低いものの、アジュバントなしでＶＬＰ５μgの経鼻／エーロゾル３回投与後に誘導される力価に類似していることを報告する（2）。

ヒトにおいてSalmonellaに基づくＨＰＶ１６ワクチンを試験するための主な制限の一つは、単一の弱毒化突然変異（ＰｈｏＱ２４(27)）を内部に有するＰｈｏＰ^ｃ株の報告された可逆性およびマウスにおいて効果的な抗ＶＬＰ応答を誘導するためのこの表現型の必要性であった（3, 4）。

弱毒化突然変異がS. typhiで試験されたその他のS. typhimurium株（χ４９８９、ＰｈｏＰ”およびａｒｏＡ）、およびヒトにおいて安全であることが示されたS. typhimurium株（χ４６３２(30, 39)、Ｔｙ８００(15)およびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ(40)）は、経鼻ワクチン接種後にマウスに抗ＶＬＰ応答を誘導できることを本明細書において示す。しかし、その力価は、ＰｈｏＰ^ｃ株により誘導される力価よりも１または２オーダー低く、これは、本発明者らの以前の結果と一致している（3, 4）。ＰｈｏＱ２４の発現（3）が新しいＬ１Ｓリコンビナント株の免疫原性を増強できるかどうかは、まだ試験されていない。経口免疫処置は経鼻免疫処置よりも有効ではなかったが、ＡｅｒｏＡＬ１Ｓの免疫原性は経口経路によりあまり影響されなかった。Ａｒｏ欠失（ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ）を内部に有するS. typhiワクチン株がヒトにおいて安全性および免疫原性の最高記録を有することから、この結果は大いに勇気づけるものである（(13, 21および33)に総説されている）。このように、リコンビナントＣＶＤ９０８ｈｔｒＡＬ１Ｓ株は、ＨＰＶ１６感染および関連病変の予防についてヒト志願者に試験する、最高の候補経口生ワクチンとなりうる。

全世界で適応性を有する、子宮頚ガンに対する予防ワクチンの発生は、長年の我々の大きな目標であった。本明細書において、Salmonellaに基づくワクチンの開発における最終的な改良、すなわち許容される選択マーカーおよびおよび安全なワクチン株の同定を報告し、この改良は、女性における当該ワクチンの試験を今や可能にするであろう。リコンビナント細菌ワクチンの開発は、選択マーカーの使用を通常必要とする。不幸にも、ＰｈｏＰ^ｃにおけるＬ１Ｓ発現を安定化するためにアスパラギン酸β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ平衡致死ベクター−宿主系を使用するという試み[Curtiss, 1990 #59]は、ＶＬＰ特異的免疫応答の誘導に全く失敗した（データは示さず）。したがって、確立された生体安全性の成績を有し、使用がＦＤＡにより認可された抗生物質選択マーカー、すなわちカナマイシンを選択した[政府、1994 #1522]。カナマイシン選択マーカーは、その生物に研究室外で選択上の利点を全く与えないであろうし、この表現型は自然界ですでに極めて遍在性である。実際に、カナマイシンに対する細菌の耐性が広範囲であることが、ヒトの医療への本抗生物質の使用を限定し、その酵素の高い基質特異性は、耐性の発現も、最新抗生物質療法に対する妨害もないことを正当化する。興味深いことに、カナマイシン耐性遺伝子の存在は、ＰｈｏＰ^ｃにおけるＬ１Ｓ発現プラスミドのｉｎｖｉｖｏ安定性をさらに改善したが、ｋａｎＬ１Ｓプラスミドを内部に有する三つの弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimuriumの経口免疫処置により誘導された免疫応答は、アンピシリンＬ１Ｓプラスミドを内部に有する細菌で得られた免疫応答と同様であった[Baud, 2004 #1439]。

ヒトにおいてリコンビナントワクチンとして試験されたSalmonella enterica serovar Typhimurium ＰｈｏＰ−株[Angelakopoulos, 2000 #1194]を例外として、これらのSalmonellaに基づくワクチンは、腸チフスに対するワクチンとして最初に開発された弱毒化Salmonella enterica serovar Typhi株である（[Levine, 2001 #1428]に総説されている）。候補腸チフスワクチンの二つ、すなわちＴｙ８００[Hohmann, 1996 #596]およびＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ[Tacket, 1997 #643]は、Typhimurium株（ＰｈｏＰ−およびＡｒｏＡ）と同経路(それぞれＰｈｏＰＱおよびａｒｏ)に弱毒化を有し、本明細書においてＨＰＶ１６ＶＬＰについての潜在的なワクチン担体として選択された。さらに、認可ワクチンＴｙ２１ａも試験した。三つのリコンビナント株のｉｎｖｉｔｒｏ分析は、ＶＬＰの類似の発現レベルと、ｋａｎＬ１ＳプラスミドがTyphimurium株中よりもTyphi株中で安定性が低いが、ＰｈｏＰｃ中のａｍｐプラスミドよりも安定であるという意味での、プラスミドの相対的な不安定性とを明らかにした[Baud, 2004 #1439]。プラスミドをコードするウレアーゼが使用された場合に、TyphimuriumではなくTyphi中でプラスミドが不安定であることも観察された[Angelakopoulos, 2000 #1194]。高用量でマウスに鼻腔内投与された弱毒化Salmonella enterica serovar Typhiは、弱毒化株を経口的に与えられた志願者で観察された免疫応答と同様の一連の免疫応答を誘発する（[Pasetti, 2003 #1404]に総説されている）。これは、Salmonella生ワクチン候補の免疫原性および効力を前臨床的に評価するためにこの小動物モデルを使用することを支持している。ｋａｎＬ１Ｓプラスミドのｉｎｖｉｖｏ安定性を研究するために最初に本モデルを使用した。比較的高い数の細菌が免疫処置の１週間後に肺から回収されたが、これは、深い麻酔下の経鼻ワクチン接種で実現された肺への優れたターゲティングを反映しており[Balmelli, 1998 #930; Londono-Arcila, 2002 #1526]、一方で、以前の研究[Pasetti, 2000 #1494; Lee, 2000 #1530; Pickett, 2000 #1158]と一致してこの遅い時点では脾臓からほとんど全く細菌が回収されなかった。ｋａｎＬ１Ｓプラスミドは回収された全てのＴｙ２１ａ細菌から見い出されたが、ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ細菌およびＴｙ８００細菌の少数にしかこのプラスミドは存在していなかった。知る限りでは、マウス経鼻モデルにおけるリコンビナントＴｙ８００を用いた実験は以前に報告されていなかったが、Ｔｙ２１ａ[Gentschev, 2004 #1531]およびＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ[Londono-Arcila, 2002 #1526]の両方でプラスミド安定性が以前に観察されていた。ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡにおいてｋａｎＬ１Ｓが特に不安定であることは、その他のリコンビナントＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ株に一般に使用されたｉｎｖｉｖｏ誘導性ｎｉｒＢプロモーターの代わりに、我々のプラスミドに構成性プロモーターが存在することに関係しうる[Wang, 2001 #1533; Londono-Arcila, 2002 #1526; Ruiz-Perez, 2002 #1532]。ＣＶＣ９０８ｈｔｒＡおよびＴｙ８００におけるｋａｎＬ１Ｓの不安定性は、ＨＶＰ１６ＶＬＰに対するこれらの細菌の低免疫原性と関係しているおそれがある。我々のデータは、リコンビナントＴｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓだけが、マウス経鼻様式で高い抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体およびＶＬＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導できることを明らかに示す。対照的に、ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡおよびＴｙ８００の両方が、Ｔｙ２１ａよりもより高い抗ＬＰＳ抗体および抗フラジェリン抗体、ならびにフラジェリン特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答（Ｔｙ８００に関する）を誘導した。この結果は、マウス経鼻モデル[Wang, 2001 #1533またはヒトにおいてＣＶＤ９０８ｈｔｒＡおよび／またはＴｙ８００とＴｙ２１ａとが比較された以前の研究と一致している。

本発明の態様は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、４５３１などのＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）の主要キャプシドタンパク質のコドンを改変することによる、それらのタンパク質に基づく新規な核酸配列の合成に関するものである。この改変は、原核微生物にトランスフォーメーションされて、結果として生じた原核微生物の免疫原性改善を目的とされたた場合に、リコンビナントプラスミドベクターの安定性を最適にするためのものである。この原核微生物は、Salmonella sps、Escherichia coli、Shigella、Yersinia、Lactobacillus、Mycobacteria、またはListeriaからなる群より、好ましくはSalmonella sps.より好ましくは選択される。さらに、Salmonella spsの弱毒化株は、Salmonella enterica serovar Typhimurium、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Salmonella enterica serovar dublinまたはSalmonella enterica serovar enteritltidisからなる群より選択される。そのうえ、このSalmonella株は、Salmonella enterica serovar Typhimurium ＰｈｏＰ^ｃ（ＣＳ０２２）、Salmonella enterica serovar Typhimurium ＰｈｏＰ⁻（ＣＳ０１５）、Salmonella enterica serovar Typhimurium χ^４９８９（ΔｃｙａΔｃｒｐ−ｃｄｔおよびΔａｒｏＡ（ＳＬ７２０７））；ならびにSalmonella enterica serovar Typhi、Ｔｙ２１ａ、ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ、およびＴｙ８００からなる群より好ましくは選択される。

本発明のなお別の態様は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に対する原核微生物の免疫原性を改善するための方法に関するものであり、その方法は以下の工程を含む：
ａ．コドン使用頻度を改変することにより、抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードする配列番号１に示された新規な核酸を合成すること、
ｂ．プラスミドベクターｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６Ｌ１、ｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６ｋａｎＬ１ＳまたはｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＨｉｎＳ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ中の本来のＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を置換することにより、配列番号１に示す核酸配列を有するリコンビナントプラスミドベクターを構築すること、
ｃ．段階（ｂ）からのリコンビナントプラスミドベクターを弱毒化微生物に導入してリコンビナント接種材料を得ること、
ｄ．マウスにリコンビナント接種材料を投与すること。

別の態様は、ＨＰＶ(ヒトパピローマウイルス)主要キャプシドタンパク質をコードする、コドン改変された核酸でトランスフォーメーションされて、対応するタンパク質を発現している原核微生物の弱毒化株に関するものであり、この核酸において少なくとも一つのコドンが改変されている。ＨＰＶ主要キャプシドタンパク質は、肛門性器ガンを生じるＨＰＶ株の群より選択される（ここで、ＨＰＶ主要キャプシドタンパク質は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ４５からなる群より選択される）。上記株は、新規な核酸配列である配列番号１を内部に有する。

本発明のなお別の態様は、Salmonella株におけるリコンビナントプラスミドベクターの安定性を最適にするための、一つまたは複数の改変されたコドンを有する新規な核酸に関するものであり、その改変されたコドンは、結果として生じたSalmonella株の免疫原性を改善するためのものである。好ましくは、本発明においてＨＰＶ１６Ｌ１配列中の本来のコドン５０６個のうち１６３個が変更されている。

本発明のなお別の態様は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含むリコンビナントプラスミドベクターを提供し、ここで、前記リコンビナントプラスミドベクターは、ｐＦＳ１４ｎｓｄ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ、ｐＦＳｎｓｄ−ＨＰＶ１６ｋａｎＬ１ＳまたはｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＨｉｎＳ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓのいずれかである。

本発明の別の態様は、Salmonellaに基づくＨＰＶ１６ワクチンの投与様式に関するものであり、その投与様式は、経口、鼻腔内、膣内、または直腸内からなる群より選択することができる。

本発明のもう一つの態様は、パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの予防的または治療的処置のための薬剤の調製への、原核微生物の弱毒化株の使用を提供する。

例として、および添付の図面の参照に限定せずに、本発明の好ましい態様を以下に説明する。本発明の態様

実施例
実施例１
プラスミドの構築および使用した細菌株
Ｌ１Ｓ遺伝子をＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Buchs, Switzerland）により合成した。そのオープンリーディングフレームには５’にＮｃｏＩ制限部位が、３’にＨｉｎｄＩＩＩが隣接した。Ｌ１ＳＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、プラスミドｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６−Ｌ１の本来のＬ１ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント代わりに挿入した（31）。結果として生じたプラスミドｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６−Ｌ１Ｓを弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimurium株であるＰｈｏＰ^ｃ（ＣＳ０２２(27)）およびＰｈｏＰ”（ＣＳ０１５(26)）（共にJohn Mekalanos, Boston, USAから親切に分与いただいた）、ｘ^４９８９（Acya Acrp,(4)）、ｘ４９９０（Acya Acrp-cdt, (4)）およびＡａｒｏＡ（ＳＬ７２０７(16)）（Irene Corthesy-Theulaz, Lausanne, CHから親切に分与いただいた）にエレクトロポレーション（37）により導入した。

ＨＰＶ１６Ｌ１およびＶＬＰの分析
抗ＨＰＶ１６Ｌ１ｍＡｂであるＣＡＭＶＩＲ−１（Anawa）を用いて、以前に記載されたように１５（31）ウエスタンブロットによりSalmonella溶解液中のＬ１の発現を分析した。培養物のＣＤ６００により測定された細菌含量に対してデータを基準化した。ＨＰＶ１６ＶＬＰ上のコンフォメーションエピトープを認識する二つのモノクローナル抗体Ｈ１６Ｅ７０およびＨ１６Ｖ５を使用して、以前に記載された（4）サンドイッチＥＬＩＳＡによりＨＰＶ１６ＶＬＰの含量を測定した、（9）。２０。

マウスの免疫処置、免疫応答の分析、およびS. typhimuriumの回収
ＩｆｆａＣｒｅｄｏ、フランスからの６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを全ての実験に使用した。以前に記載された（17, 31）、麻酔下で細菌接種材料２０JLLIを経口（１０^８〜９CFU）投与または鼻腔内（１０^６７CFU）投与した。血液および膣洗浄液の採取、ならびにＥＬＩＳＡによる抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の決定を、先に報告されたように実施した（17, 31）。以前に記載されたように、安楽死させたマウス由来の器官におけるSalmonella enterica serovar Typhimuriumの回収を決定した（31）。

Salmonellaにおける翻訳について最適化されたコドンを有するＨＰＶ１６Ｌ１のヌクレオチド配列の設計
最適化されたＬ１オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を設計するために、Salmonella enterica serovar. Typhimuriumの主要内因性タンパク質（７，１４）の翻訳に使用されるコドンを考慮した。本来のＨＰＶ１６Ｌ１配列（ＨＰＶ１６１１４／Ｂ(18)）のコドン５０６個のうち、１６３個をSalmonellaで最も頻繁に使用されているコドンに改変した（図１−配列番号１参照）。これには、Salmonellaにまれにしか見出されない本来のＬ１配列のコドンの全て（１３６個）およびあまり頻繁に使用されないコドンの一部（２７／７２個）が含まれた。次に、プラスミドｐＦＳ１４ｎｓｄ−ＨＰＶ１６Ｌ１(31)中のＬ１のｏｒｆを新しいＬ１Ｓのｏｒｆに置換して、ｐＦＳ１４ｎｓｄ−ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓを得た。この新しいプラスミドを弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimurium株ＰｈｏＰ^ｃ(27)にまず導入して、以後ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓと呼ばれるリコンビナント株を発生させた。その他のＬ１Ｓリコンビナント弱毒化Salmonellaの４株をその後産生させた（本明細書の以下を参照）。表１に、本研究に使用した種々の株および略語を要約する。

ＨＰＶ１６Ｌ１およびＶＬＰの発現
ＰｈｏＰ^ｃＬ１およびＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓの対数増殖期培養物の溶解液中でのＬ１タンパク質の発現をウエスタンブロットにより比較した（図２Ａ参照）。驚くことに、細菌培養物中のＬ１の発現は、新しいＬ１Ｓ配列では改善せず、むしろ２分の１に減少した（図２Ｂ）。二つのリコンビナント株で産生されたＶＬＰの量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより比較した場合、この結果が確認された（図２Ｃ参照）。ＬＢ５０mlにコロニー１個を接種した後の対数中期に達するまでの時間を比較した場合、二つの株の成長速度に著しい差が認められた(ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓについて約7時間およびＰｈｏＰ^ｃＬ１について約１５時間)。これは、対応する同族ｔＲＮＡに関するＬ１の最適化されたコドン使用頻度により、成長速度が最大になったが、Ｌ１Ｓの翻訳は同時に増加しなかったことを示唆しうる。

Ｌ１Ｓをコードするプラスミドのｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ安定性
本発明者は、抗生物質による選択の不在下ではSalmonellaにおけるＬ１をコードする本来のプラスミドはプラスミド分離によりｉｎｖｉｖｏで速やかに失われたと以前に報告した（４，３１）。Ｌ１ＳをコードするプラスミドおよびＬ１をコードするプラスミドの安定性をまずｉｎｖｉｔｒｏで比較した。このために、Ｌ１をコードするプラスミドまたはＬ１Ｓをコードするプラスミドをまだ内部に有する細菌の率を、抗生物質による選択の不在下で４回連続のＯ／Ｎ培養の間に比較した（図３参照）。予想通り、Ｌ１をコードするプラスミドは速やかに失われた。対照的に、Ｌ１Ｓをコードするプラスミドは、抗生物質による選択の不在下で約５０世代時間の後でも大部分の細菌から回収された。マウスに経鼻および経口免疫処置した後の、Ｌ１Ｓをコードするプラスミドの安定性をさらにｉｎｖｉｖｏで検討した（表２参照）。Ｌ１をコードする本来のプラスミド（4）とは対照的に、Ｌ１Ｓをコードするプラスミドは、感染／侵入部位に近い器官で少なくとも２週間完全に安定であった。しかし、脾臓などのさらに離れた器官ではＬ１Ｓプラスミドの不安定性が幾分観察された。脾臓ではこれらの細菌の約１０%がＬ１Ｓプラスミドをまだ内部に有したが、Ｌ１プラスミドを内部に有するものは全く検出されなかった。ｉｎｖｉｔｒｏで観察されたこれらの細菌のより速い成長能にかかわらず、Ｌ１Ｓを内部に有する細菌の侵入性または残留性がより高いという証拠がないことにも留意すべきである。

ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓの経鼻または経口ワクチン接種後の全身および粘膜の抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体産生
最終目標は、Salmonella enterica serovar TyphimuriumにおいてＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ遺伝子の発現がＨＰＶ１６ＶＬＰ抗原の免疫原性を改善するかどうかを試験することであった。したがって、ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓ株を用いて、経鼻または経口経路で雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を免疫処置した。単回免疫処置の４から６、８および２４週間後のマウスの血清および膣分泌物中から測定された抗ＶＬＰ抗体力価を図４に示す。単回経鼻ワクチン接種は、血清中に高い長期持続性の抗ＨＰＶ１６ＶＬＰＩｇＧ力価および膣洗浄液中に特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ力価を誘導した。これらの抗体力価は、本来のＰｈｏＰ^ｃＬ１株を２回経鼻ワクチン接種した後に誘導された力価と同様であるが、主な改善は、これらの力価が本来のＰｈｏＰ^ｃＬ１株を用いた単回経鼻ワクチン接種で実現された力価よりも１から２オーダー高いことである（4, 31）。興味深いことに、経鼻ワクチン接種よりも低いものの、ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓを用いた経口ワクチン接種も高度に免疫原性であった。一方で、本来のＰｈｏＰ^ｃ株を２回経口ワクチン接種しても無効であった（31）。ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓの２回経鼻投与または３回経口投与(データは示さず)により、免疫応答は増加しなかった。

異なって弱毒化された、ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ遺伝子を発現しているSalmonella enterica serovar Typhimurium株を用いた経鼻または経口ワクチン接種後の全身抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体
本発明者は、異なって弱毒化された、Ｌ１をコードする本来のプラスミドを発現しているSalmonella enterica serovar Typhimurium株をマウスに経鼻ワクチン接種することで、抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体が低くしか、または全く誘導されなかったことを以前に示した（4）。Ｌ１Ｓをコードするプラスミドを発現しているＰｈｏＰ^ｃ株で観察された高い免疫原性を考えて、％４９８９、Λ４９９０、ＰｈｏＰ”およびＡｒｏＡを含めた種々の株に本プラスミドをさらに導入した（正確な弱毒化、略語および参照については表１を参照されたい）。これらの新しいリコンビナント株を単回経鼻または経口ワクチン接種した７週間後にマウスにおいて測定された抗ＨＶＰ１６ＶＬＰＩｇＧ力価を図５に示す。我々の以前の観察とは対照的に、新しいリコンビナント株の全ては、単回経鼻ワクチン接種後に一貫した抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ体液性応答を誘導したが、これらの力価はＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓ株で実現された力価よりも約１オーダー低い（図４参照）。両経路のワクチン接種後に類似した抗ＨＰＶ１６ＶＬＰＩｇＧ力価を誘導したＡｒｏＡＬ１Ｓ株を除いて、予想通り、免疫原性は経口ワクチン接種の方が低かった。

実施例２
プラスミド構築および使用した細菌株
プラスミドｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６−Ｌ１Ｓ[Baud, 2004 #1439]において、アンピシリン耐性コード配列を以下のようにカナマイシン耐性コード配列に置換した。テンプレートとしてｐＥＴ−９ａ（Novagen）プラスミドＤＮＡを使用した。ＰＣＲにより、カナマイシンコード配列およびプロモーターを含むＳａｃＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを発生させた。使用したプライマーは、カナマイシンの最初のＡＴＧから５４ヌクレオチド上流に位置する、ＳａｃＩＩ制限部位（下線部）を含む２５塩基：

およびＸｂａＩ制限部位（下線部）を含む２８塩基：

であった。ｐＦＳ１４ｎｓｄＨＰＶ１６−Ｌ１Ｓプラスミド配列全体を含むが、アンピシリン耐性遺伝子を欠く、別の大きなＳａｃＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｅｄｅｌｉｔｙＰＣＲ（Roche Molecular Biochemicals）を用いた逆ＰＣＲにより、以下のプライマーを用いて発生させた：アンピシリンのＡＴＧから９２ヌクレオチド上流に位置する、ＳａｃＩＩ部位（下線部）を含む２８塩基

およびＸｂａＩ部位（下線部）およびアンピシリンの停止コドン（太字）を含む２８塩基。

これら二つのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを一緒に連結してプラスミドｐＦＳ１４ｎｓｄ−ｋａｎ^３−ＨＰＶ１６−Ｌ１Ｓを発生させた。この新しいプラスミドをエレクトロポレーション[Schodel, 1990b #242]により弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimurium株であるＰｈｏＰ^ｃ（ＣＳ０２２ [Miller, 1990 #181])およびＰｈｏＰ⁻（ＣＳ０１５ [Miller, 1989 #178])、およびΔａｒｏＡ（ＳＬ７２０７[Hoiseth, 1981 #123])に、ならびに弱毒化Salmonella enterica serovar Typhi Ｔｙ８００[Hohmann, 1996 #596]、ＣＶＤ９０８ｈｔｒＡ[Tacket, 1997 #643]、およびＴｙ２１ａ([Germanier, 1975 #103], Berna biotech, Switzerland)に導入した。

ＨＰＶ１６Ｌ１およびＶＬＰの分析
抗ＨＰＶ１６Ｌ１ｍＡｂであるＣＡＭＶＩＲ−１（Anawa）を使用して、以前に記載されたように[Nardellihaefliger, 1997 #742]ウエスタンブロットにより、Salmonella溶解液中のＬ１の発現を分析した。細菌中の含量に対してデータを基準化した。ＨＰＶ１６ＶＬＰ上のコンフォメーションエピトープを認識する二つのモノクローナル抗体であるＨ１６Ｅ７０またはＨ１６１Ａと、Ｈ１６Ｖ５とを使用して、以前に記載されたように[Benyacoub, 1999 #1050]、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＨＰＶ１６ＶＬＰの含量を測定した。

マウスの免疫処置、抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体の分析およびSalmonellaの回収
ＩｆｆａＣｒｅｄｏ、フランスからの６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを全ての実験に使用した。以前に記載されたように[Hopkins, 1995 #381; Nardellihaefliger, 1997 #742]、細菌接種材料２０μｌを麻酔下で経口（１０^９CFU）または鼻腔内（１０^７〜９CFU）投与した。先に報告されたように[Hopkins, 1995 #381; Nardellihaefliger, 1997 #742]、血液および膣洗浄液の採取ならびにＥＬＩＳＡによる抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の決定を行った。以前に記載されたように[Nardellihaefliger, 1997 #742]、安楽死させたマウスからの器官でのSalmonella enterica serovar TyphimuriumまたはSalmonella enterica serovar Typhiの回収を決定した。

中和アッセイ
[Pastrana DV, 2004 #1429]に詳細に記載されているように、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ＨＰＶ１６シュードウイルスを用いて中和アッセイを行った。簡潔には、ｏｐｔｉｐｒｅｐで精製して２０００倍に希釈したＳＥＡＰＨＰＶ１６シュードウイルスを血清で２倍系列希釈して、氷冷しながら１時間インキュベーションして、このシュードウイルス−抗体混合物を使用して２９３ＴＴ細胞に３日間感染させた。清澄にした細胞上清１０μl中のＳＥＡＰ含量をＧｒｅａｔＥＳＣＡＰＥＳＥＡＰ化学ルミネセンスキット（BD Clontech）を使用して決定した。ＳＥＡＰ活性に少なくとも５０%の現象を引き起こす最高の血清希釈倍率として中和力価を定義した(ＳＥＡＰ活性100%は５０から１００相対光単位の範囲)。

増殖アッセイ
以前に記載されたように[Balmelli, 2002 #1357]、機械的解離により脾臓細胞を単離した。製造業者の使用説明書により抗ＣＤ４^＋を被覆したマイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Galdbach, Germany）を用いた磁気抗体細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によりＣＤ４^＋Ｔ細胞を精製した。陰性および陽性対照として培地単独と共に、またはコンカナバリンＡ（2.5μg/ml）と共に、ならびにＨＰＶ１６ＶＬＰ（２μg/ml、ＧＭＰ調製物）およびフラジェリン（１０μg/ml、Ｔｙ２１ａから精製）と共に、ナイーブマウスまたは免疫処置されたマウス由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を３日間インキュベーションして、０．５μキュリーの３Ｈチミジンを一晩添加して、取込みをcpm単位で測定した。

カナマイシン耐性ＰｈｏＰ^ｃ株におけるＨＰＶ１６Ｌ１Ｓの発現およびプラスミド安定性
本来のｐＦＳｎｓｄＨＰＶ１６Ｌ１Ｓ[Baud, 2004 #1439]中のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン選択マーカーに置換することによって、ＨＰＶ１６Ｌ１Ｓを発現しているカナマイシン耐性プラスミドを構築した。逆ＰＣＲ戦略を使用して、アンピシリン耐性遺伝子配列に隣接するプラスミド全体を増幅させ、結果として得られたフラグメントを、カナマイシン耐性をコードする配列に連結した（詳細は材料および方法を参照）。結果として得られたプラスミドをｐＦＳｎｓｄ−ｋａｎＬ１Ｓと呼び、ＰｈｏＰ^ｃにエレクトロポレーションさせてＰｈｏＰ^ｃ−ｋａｎＬ１Ｓを得た（本研究で用いた株の略語および参照については表１Ａ参照）。予想通り、この新しい株におけるＨＰＶ１６ＶＬＰのｉｎｖｉｔｒｏ発現は、アンピシリン耐性株ＰｈｏＰ^ｃ−Ｌ１Ｓ（約１０μgＶＬＰ/１０^１１CFU, [Baud, 2004 #1439]）で測定された発現と同様であった。これら２株の間でもまた、同様の成長速度が観察され、対数増殖中期まで約７時間であり、プラスミド安定性は非常に高く、抗生物質の不在下で４晩連続して培養後にプラスミドをまだ内部に有する細菌はほとんど１００%であった。ｋａｎＬ１Ｓプラスミドの安定性は、アンピシリンプラスミドに比較してｉｎｖｉｖｏで増加して、全ての細菌が経口免疫処置の２週間後にｋａｎＬ１Ｓプラスミドを内部に有し、これは検査した全ての器官にあてはまった（表２Ａ参照）。

ｋａｎＬ１ＳをコードするプラスミドをもつＰｈｏＰｃ、ＰｈｏＰ−およびＡｒｏＡを経口免疫処置後の抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ体液性応答
弱毒化Salmonella enterica serovar Typhimuriumの２株であるＰｈｏＰ⁻およびＡｒｏＡにｋａｎＬ１Ｓプラスミドをさらに導入した（表１Ａ参照）。Salmonella enterica serovar Typhiワクチン株におけるこれらの株の弱毒化突然変異は、ヒトにおいて安全であるとすでに示されている。リコンビナントSalmonella enterica serovar Typhimuriumの３株を経口経路によりマウス５〜１０匹の３群に１回免疫処置して、血清および膣洗浄液中のＨＰＶ１６ＶＬＰ特異的抗体応答を免疫処置の６週間後に比較する（図６参照）。興味深いことに、ＡｒｏＡｋａｎＬ１Ｓ株により誘導された抗ＶＬＰ抗体力価は、ＰｈｏＰ^ｃｋａｎＬ１Ｓ株および以前のＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓ株により誘導された力価と同様に高いと思われる[Baud, 2004 #1439]。これらの抗体力価は、少なくとも４か月間安定であった（データは示さず）。対照的に、ＰｈｏＰ⁻ｋａｎＬ１ｓにより誘導された抗ＶＬＰ抗体力価は、Ｐｈｏｐ⁻Ｌ１Ｓで以前に報告されたように[Baud, 2004 #1439]低い。ＰｈｏＰ^ｃおよびＡｒｏａｋａｎＬ１Ｓを免疫処置されたマウスの膣分泌物中にもＨＰＶ１６ＶＬＰ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡが誘導されたが、ＰｈｏＰ⁻ｋａｎＬ１Ｓの後には何も検出されなかった。経口免疫処置を使用してマウスモデルで得られたこれらのデータは、Δａｒｏ欠失を内部に有するリコンビナントSalmonella enterica serovar TyphiがΔＰｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失を内部に有する細菌よりも免疫原性が高くありうることを示唆している。

三つのSalmonella enterica serovar Typhiワクチン株におけるｋａｎＬ１Ｓプラスミドの発現および安定性
本発明者らに入手可能であった三つのSalmonella enterica serovar Typhiワクチン株、すなわちＴｙ８００（ΔＰｈｏＰ／ｐｈｏＱ, [Hohmann, 1996 #596]）、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ（ΔａｒｏＣ、ΔａｒｏＤ、ｈｔｒａＡ[Tacket, 1997 #643]）および認可された腸チフスワクチン株Ｔｙ２１ａ[Germanier, 1975 #103]にｋａｎＬ１Ｓプラスミドを導入した（略語および参照については表１Ａを参照されたい）。ＶＬＰのｉｎｖｉｔｒｏ発現は、これら３株で同様であった（２０から３０μg ＶＬＰ/１０^１１CFU）。抗生物質不在下でのこれら三つのワクチン株におけるｋａｎＬ１Ｓプラスミドの安定性を、まずｉｎｖｉｔｒｏで検討した（図７参照）。Salmonella enterica serovar Typhimurium株を用いた以前の結果とは対照的に、ワクチン株ではｋａｎＬ１Ｓが低安定性であることが観察された。２晩目の後でプラスミドの緩やかな喪失が起こったが、５晩連続の後で、Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１ＳおよびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡｋａｎＬ１Ｓで細菌のそれぞれ９、７および１８%にプラスミドは依然として保持されていた。Salmonella enterica serovar Typhiワクチン株は、ヒトにおいて限定された循環または複製だけを経るのであろう。そして、これらの株はマウスにおいて経口経路では侵入性ではない。リコンビナントＣＶＤ９０８ｈｔｒＡで示されたように[Pickett, 2000 #1158][Pasetti, 2000 #1494]、これらの細菌を経鼻経路により高用量で投与するならば、マウスを一過性に感染することができる。このように、１０^９CFUのＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡｋａｎＬ１ＳおよびＴｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓまたは１０^７CFUのＴｙ８００ｋａｎＬ１Ｓを鼻腔内免疫処置した１週間後のマウスの肺および脾臓から回収されたSalmonellaにおけるｋａｎＬ１Ｓプラスミドの安定性を検討した。この後者の株は、低用量で投与しなければならなかった。それは、ブタ胃ムチンと共にそのようなＰｈｏＰＱ欠失細菌をマウスに腹腔内注射した後の以前の結果と一致して[Baker, 1997 #659]、低用量で投与しないと、この株はマウスに致死的であったからである。興味深いことに、Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓを免疫処置後に肺から回収された全ての細菌がｋａｎＬ１Ｓを内部に有したが、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１ＳおよびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡｋａｎＬ１Ｓの免疫処置後に、少数（それぞれ７．９および０．８%）がｋａｎＬ１Ｓプラスミドを内部に有した（表３参照）。これは、経鼻マウスモデルにおいて、試験された他のSalmonella enterica serovan Typhiワクチン株よりもＴｙ２１ａ中の方がｋａｎＬ１Ｓプラスミドが安定であることを示している。

鼻腔内マウスモデルにおいてＨＰＶ１６ＶＬＰを発現しているSalmonella enterica serovar Typhiワクチン株により誘導された体液性および細胞性免疫応答
三つのリコンビナントSalmonella enterica serovar Typhi株の免疫原性を、５〜０匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群で１か月間隔を空けた鼻腔内の２回投与後に評価した（ＣＶＤ９０８−ｈｔｒａおよびＴｙ２１ａリコンビナント株について１０^９CFUならびにＴｙ８００リコンビナント株について１０^７CFU）。異種ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗原に対するＩｇＧ力価ならびに二つの同種抗原ＬＰＳおよびフラジェリンに対するＩｇＧ力価を８週間にわたり血清から測定した（図８参照）。興味深いことに、Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓの２回免疫処置後に初めて高い抗ＶＬＰＩｇＧ力価が誘導されたが、その他の２株により低いか、またはほとんど検出できない力価が誘導された。対照的に、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１ＳおよびＣＶＤ９０８ｈｔｒａｋａｎＬ１Ｓは、Ｔｙ２１ｋａｎＬ１Ｓよりも高い抗ＬＰＳＩｇＧおよび抗フラジェリンＩｇＧ力価を誘導した（８週間目でｐ＜０．０１）。これは、二つの前者リコンビナントカブがマウスにうまく感染して、同種抗原に対する体液性応答を誘導したことを示している。

高い抗体力価の発生および維持し関与するＴヘルパー応答、したがって、フラジェリンおよびＨＰＶ１６ＶＬＰに対する細胞性免疫応答も検討した。免疫処置の８週間後にマウスを屠殺して、脾臓から精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いて抗原特異的増殖を測定した（図９参照）。抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ力価の誘導に一致して、ＨＰＶ１６ＶＬＰによるＣＤ４^＋Ｔ細胞の刺激は、Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓを用いた鼻腔内ワクチン接種２回の後になって初めて有意に誘導された（ｐ＜０．００１）。対照的に、フラジェリン特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞の有意な刺激は、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１Ｓを用いたワクチン接触後にのみ測定された（ｐ＜０．００１）。

Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ単独を免疫処置されたマウスまたは皮下ＶＬＰ投与で感作されたマウスの血清および性器分泌物中でＨＰＶ１６中和力価は誘導される
０および４週間目に雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の追加の群に経鼻Ｔｙ２１ｋａｎＬ１Ｓ（約１０^９CFU）の２回の投与を受けさせ、血液および膣分泌物の採取を８週間目に行った。抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ中和抗体および抗ＨＰＶ中和抗体の力価を、血清および膣分泌物の両方でＥＬＩＳＡおよびＳＥＡＰＨＰＶ１６シュードビリン中和アッセイによりそれぞれ決定した（図１０参照）。リコンビナントSalmonella enterica serovar typhimurium Ｌ１Ｓ株を用いた免疫処置後に以前に報告されたように、ＨＰＶ１６中和力価は抗ＶＬＰＥＬＩＳＡ力価よりもやや低かった[Baud, 2004 #1439]。さらに、抗ＨＰＶ１６ＶＬＰＩｇＧおよびＩｇＡが膣分泌物中に誘導され、これらの分泌物がＨＰＶ１６中和抗体を含有することを本明細書に示す（図１０−Ｂ参照）。精製ＶＬＰ１μｇを用いた皮下（ｓ．ｃ．）感作がＴｙ２１ｋａｎＬ１Ｓを用いた最適以下の免疫処置（すなわち１０^９CFUの単回経鼻投与）により誘導される免疫応答に及ぼす効果も研究した。データ（図１１）は、実際にＶＬＰ１μgを用いたｓ．ｃ．感作の結果として、Ｔｙ２１ｋａｎＬ１Ｓを用いた単回経鼻追加免疫後に血清抗ＶＬＰＩｇＧ力価の有意な増加が生じたことを示している（ＶＬＰによる感作なしに比べてｐ＜０．０１）。対照的に、誘導された、膣の抗ＶＬＰＩｇＧに統計的な差はないが、ＶＬＰおよびＴｙ２１ｋａｎＬ１Ｓの両方が投与された場合にのみ、膣に抗ＶＬＰＩｇＡが誘導された。中和力価は今後決定。

コドン最適化されたＨＰＶ１６Ｌ１Ｓｏｒｆ（配列番号１）を示す図である。Ｌ１Ｓのヌクレオチド配列を、下線部の改変コドンおよび太字の改変ヌクレオチドと共に示す。ＰｈｏＰ^ｃＬ１およびＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓリコンビナント株におけるＨＰＶ１６Ｌ１の発現を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃＬ１およびＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓリコンビナント株におけるＨＰＶ１６Ｌ１の発現を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃＬ１およびＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓリコンビナント株におけるＨＰＶ１６Ｌ１の発現を示す図である。Ｌ１プラスミドおよびＬ１Ｓプラスミドのｉｎｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓを経鼻および経口ワクチン接種後の全身（Ａ）および膣（Ｂ）の抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃＬ１Ｓを経鼻および経口ワクチン接種後の全身（Ａ）および膣（Ｂ）の抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価を示す図である。％４９８９Ｌ１Ｓ、ｘ４９９０Ｌ１Ｓ、ＰｈｏＰ”Ｌ１ＳおよびＡｒｏＡＬ１Ｓを経鼻または経口ワクチン接種後の全身抗ＨＰＶ１６ＶＬＰＩｇＧ力価を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃｋａｎＬ１Ｓ、Ｐｈｏｐ⁻ｋａｎＬ１ＳおよびΔＡｒｏＡｋａｎＬ１Ｓを経口ワクチン接種後の血清抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の比較を示す図である。ＰｈｏＰ^ｃｋａｎＬ１Ｓ、Ｐｈｏｐ⁻ｋａｎＬ１ＳおよびΔＡｒｏＡｋａｎＬ１Ｓを経口ワクチン接種後の血清抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の比較を示す図である。 Salmonella enterica serovar Typhiの種々の株におけるｋａｎＬ１Ｓプラスミドのｉｎｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１ＳおよびＣＶＤ９０８ｈｔｒＡｋａｎＬ１Ｓを経鼻ワクチン接種後の血清抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の比較を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ、Ｔｙ８００ｋａｎＬ１ＳおよびＣＶＤ９０８ｈｔｒＡｋａｎＬ１Ｓを経鼻ワクチン接種後の血清抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体力価の比較を示す図である。ＨＰＶ１６ＶＬＰおよびフラジェリンに特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖の比較を示す図である。ＨＰＶ１６ＶＬＰおよびフラジェリンに特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖の比較を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓを経鼻ワクチン接種されたマウスの血清および膣分泌物中のＨＰＶ１６中和抗体および抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓを経鼻ワクチン接種されたマウスの血清および膣分泌物中のＨＰＶ１６中和抗体および抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ単独を経鼻ワクチン接種または精製ＶＬＰで感作されたマウスの血清および膣分泌物中のＨＰＶ１６中和抗体および抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体を示す図である。Ｔｙ２１ａｋａｎＬ１Ｓ単独を経鼻ワクチン接種または精製ＶＬＰで感作されたマウスの血清および膣分泌物中のＨＰＶ１６中和抗体および抗ＨＰＶ１６ＶＬＰ抗体を示す図である。

Claims

抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードし、野生型配列に比較して一つまたは複数の改変されたコドンを有する、配列番号１に示す核酸配列からなるＤＮＡであって、Salmonella spsに導入された場合に、該改変された配列が該改変された配列を内部に有するリコンビナントプラスミドベクターを安定化するＤＮＡ。
請求項１記載のＤＮＡを含むリコンビナントプラスミドベクター。
請求項２記載のリコンビナントプラスミドベクターを含むSalmonella sps。
Salmonella spsが、Salmonella enterica serovar typhi、Salmonella enterica serovar typhimurium、Salmonella enterica serovar dublinおよびSalmonella enterica serovar enteritidisからなる群より選択される、請求項３記載のSalmonella sps。
ワクチンとして使用するためのリコンビナントSalmonella spsを産生するための、下記：
ａ．抗原性ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質をコードする、配列番号１に示す核酸配列からなるＤＮＡを合成すること、
ｂ．配列番号１に示す核酸配列からなるＤＮＡを内部に有するリコンビナントプラスミドベクターを構築すること、および
ｃ． Salmonella spsに該リコンビナントプラスミドベクターを導入して、リコンビナントSalmonella spsを得ること
を含む方法。
リコンビナントプラスミドベクターの導入がエレクトロポレーションにより行われる、請求項５記載の方法。
パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの予防的または治療的処置のための薬剤を製造する方法であって、請求項３から４のいずれか一項記載のSalmonella spsの弱毒化株の使用を含む方法。
パピローマウイルス感染および関連するガンのリスクの予防的または治療的処置のための薬剤の調製への、請求項３から４のいずれか一項記載のSalmonella spsの弱毒化株の使用。
請求項１記載のＤＮＡを含み、リコンビナントSalmonella spsを含むワクチンであって、Salmonella spsに導入された場合に、該改変されたＤＮＡが、該改変されたＤＮＡを内部に有するリコンビナントプラスミドベクターを安定化するワクチン。