JP6916115B2 - HPVL2ペプチド/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症用ワクチン - Google Patents
HPVL2ペプチド/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症用ワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP6916115B2 JP6916115B2 JP2017561596A JP2017561596A JP6916115B2 JP 6916115 B2 JP6916115 B2 JP 6916115B2 JP 2017561596 A JP2017561596 A JP 2017561596A JP 2017561596 A JP2017561596 A JP 2017561596A JP 6916115 B2 JP6916115 B2 JP 6916115B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gly
- amino acid
- ile
- thr
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 105
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 105
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 99
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 51
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 title claims description 34
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 85
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 69
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 59
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 22
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 229940124897 Gardasil Drugs 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 229940124957 Cervarix Drugs 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 2
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N 0.000 description 1
- NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hexadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000722343 Human papillomavirus types Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710163801 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- -1 etc.) Substances 0.000 description 1
- 229940102767 gardasil 9 Drugs 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229960002985 medroxyprogesterone acetate Drugs 0.000 description 1
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- TZBAVQKIEKDGFH-UHFFFAOYSA-N n-[2-(diethylamino)ethyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2SC(C(=O)NCC[NH+](CC)CC)=CC2=C1 TZBAVQKIEKDGFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000002023 papillomaviral effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 230000036555 skin type Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
[1]B型肝炎ウイルス表面タンパク質(HBsタンパク質)のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記(1)から(5)の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質を有効成分として含有するヒトパピローマウイルス(HPV)感染症用ワクチン;
(1)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
(2)配列番号3の配列において1〜5個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
(3)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(配列番号6)なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
(4)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が3個連結されたアミノ酸配列、及び
(5)前記(4)の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のN末側若しくはC末側に1〜5個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[2]前記(2)及び(5)のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[1]に記載のHPV感染症用ワクチン。
[3]前記HBsタンパク質が、下記(1)又は(2)のアミノ酸配列である、[1]又は[2]に記載のHPV感染症用ワクチン;
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号1で示される配列と90%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[4]HPV感染症の予防薬である、[1]から[3]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチン。
[5]HPV感染症の治療薬である、[1]から[3]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチン。
[6]B型肝炎ウイルス表面タンパク質(HBsタンパク質)のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記(1)から(5)の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質;
(1)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
(2)配列番号3の配列において1〜5個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
(3)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(配列番号6)なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
(4)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が3個連結されたアミノ酸配列、及び
(5)前記(4)の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のN末側若しくはC末側に1〜5個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[7]前記(2)及び(5)のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[6]に記載のキメラタンパク質。
[8]前記HBsタンパク質が、下記(1)又は(2)のアミノ酸配列である、[6]又は[7]に記載のキメラタンパク質;
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号1で示される配列と90%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[9][6]から[8]の何れかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
[10][9]に記載のDNA断片が組み込まれた発現ベクター。
[11][10]に記載の発現ベクターで形質転換されたキメラタンパク質産生宿主。
[12][10]に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症用DNAワクチン。
[13]下記(1)〜(5)の工程を含む、[1]から[3]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチンの製造方法;
(1)[9]に記載のDNA断片を調製する工程、
(2)[10]に記載の発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
(3)前記(2)により得られる形質転換宿主を培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
(4)前記(3)により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
(5)前記(4)により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤から選択される添加剤を添加して、ワクチンとする工程。
[14]外来ペプチドの免疫原性を向上させる方法であって、下記(1)又は(2)のアミノ酸配列からなるB型肝炎ウイルス表面タンパク質(HBsタンパク質)の142位と143位の間に、任意の感染症に対する中和エピトープを含む外来ペプチドが挿入されたキメラタンパク質を免疫抗原として用いる、前記方法;
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号1で示される配列と90%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[15]前記外来ペプチドが、20個のアミノ酸又は20±n個のアミノ酸(nは、1〜5の整数)である、[14]に記載の方法。
[16]前記外来ペプチドが、下記(1)〜(5)の何れかである、[14]に記載の方法;
(1)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
(2)配列番号4の配列において1〜5個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
(3)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(配列番号6)なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
(4)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が3個連結されたアミノ酸配列、及び
(5)前記(4)の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のN末側若しくはC末側に1〜5個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[17]前記(2)及び(5)のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[16]に記載の方法。
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるペプチドが挿入されたキメラタンパク質は、HBV免疫保有マウスにおいてHPVL2ペプチドに対する抗体を誘導することから、HBV抗体陽性の対象にも有効なHPV感染症用ワクチンの好適な材料となり得る。
(1)X1aaはThr又はSer、
(2)X2aaはSer, Thr又はAla、
(3)X3aaはThr又はSer、
(4)X4aaはSer, Thr又はAla、
(5)X5aaはIle又はVal、及び
(6)X6aaはLeu又はIle
から選択される。
HBsタンパク質のアミノ酸配列(配列番号1)の各部位に、HPVL2タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)の56-75位に相当する配列(配列番号3)、56-66位に相当する配列(配列番号4)及び56-65位に相当する配列(配列番号5)を挿入したDNA断片を全合成(オペロン社製)した(表1)。表1の「−」は未実施を意味する。
実施例1で得られた動物細胞発現プラスミドをそれぞれ制限酵素Pvu Iで消化し線状化した。この線状化したプラスミドを用いて、CHO K1(FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968)をリポフェクチン法(LF2000 インビトロジェン)で形質転換処理した。形質転換処理後、薬剤または栄養枯渇により形質転換体を選択した。
得られた形質転換体を、0.25%トリプシンを用いて細胞剥離し、先述の選択培地を用いて細胞の拡張を行った。拡張後、PBS(-)で洗浄し、無血清培地に培地交換した。37℃で14日間培養後、培養上清中のキメラタンパク質の濃度をHPVL2タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAで定量した。その結果、発現量はHBsタンパク質の142/143位の間にHPVL2の56-75配列(20アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質(HBs/HPVL2 142-20:配列番号7)が約24 μg/mL、HBsタンパク質の127/128位の間にHPVL2の56-75配列(20アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質(HBs/HPVL2 127-20:配列番号8)が約9μg/mL及びHBsタンパク質の142/143位の間にHPVL2の56-66配列(11アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質(HBs/HPVL2 142-11:配列番号9)が約3μg/mLであった。他のキメラタンパク質については、HBsタンパク質の終始コドン直後に挿入したキメラタンパク質(HBs/HPVL2 C-20及びHBs/HPVL2 C-11)を除き、発現量が低いか、検出されなかった。
実施例2により得られた5種のキメラタンパク質及びHBsタンパク質のみを発現するCHO K1細胞を選択培地を用いて拡張した。拡張後、PBS(-)で洗浄後、無血清培地(T7m;Ex-cell SP2/0;YMM-01B 3種混合培地)に培地交換し、37℃、10日間以上培養した。培養液を遠心分離で清澄化した後、ベンゾナーゼ(Merck社製)共存下、排除限界1,000 kDaのカートリッジ式UF(ビバセル100;ザルトリウス製)で培養上清を濃縮した。濃縮後、PBS(-)にバッファ置換を実施し、塩化セシウムを1.2 g/Lの密度となるように添加した後、4℃、23,000×gで超遠心分離を行った。キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300kDaのUFカートリッジ(ビバスピン;ザルトリウス社製)による脱塩、PBS(-)へのバッファ置換後、60%、50%、40%、20%ショ糖を含むPBS(-)を重層した遠心管にキメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むPBS(-)を加えた不連続密度勾配ショ糖の超遠心分離を行った。4℃、120,000×gの遠心条件で分離を行った後、キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300 kDaのUFカートリッジで脱糖、PBS(-)へのバッファ交換を行った。得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質は、いずれもウイルス様粒子(VPL)を形成していた。
実施例3で得られたキメラタンパク質及び別途調製された酵母由来HBsタンパク質にアルミニウムアジュバントを加えて25 μg/mlの各免疫原を調製し、各0.2 mlをメスBalb/cマウスの尾根部皮下に接種した(各群10匹ずつ)。接種後、3週目で採血して得た抗血清(1次免疫血清)及び初回接種日から3週目に同免疫原を上記と同様に接種後、さらに初回接種日から6週目で採血し、抗血清(2次免疫血清)を得た。
実施例4で得られた個体別の1次免疫血清を用いて、ELISAにより、HPVL2ペプチドに対する抗体産生能を評価した。より具体的には、96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したHPV16型のL2タンパク質の56〜75番目の20アミノ配列からなる合成ペプチド(配列番号3)(1.0 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。1% BSAを含むブロッキング溶液で室温、1時間以上ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100に希釈した各血清を、固相化したペプチドと37℃で2時間反応させた。PBST(0.05% Tween20を含むPBS)で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ラット抗マウスIgG抗体(シグマ社製)を加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液(TMB:インビトロジェン社製)を加え、室温で30分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、HBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質で最も良好な抗体価の上昇が認められた(図1)。HBs/HPVL2 C-20キメラタンパク質では抗体価の上昇は認められたが、HBs/HPVL2 142-11キメラタンパク質及びHBs/HPVL2 C-11キメラタンパク質では抗体価の上昇は認められなかった(データ未記載)。
酵母由来HBsタンパク質にアルミアジュバントを加え、1 μg/mLとした免疫原を調製し、0.2 mLをメスBalb/cマウスの尾根部皮下に接種した。その5週間後に部分採血し、個々の血清中の抗HBs抗体価を市販キット「TOSOH」II(東ソー社)にて測定したところ、700 mIU/mL〜50,000 mIU/mLに上昇していることを確認した。
実施例6で得られた個体別の免疫血清を用いて、ELISAにより、HPVL2ペプチドに対する抗体産生能及びHBsタンパク質に対する抗体産生能を評価した。
96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈した酵母由来HBsタンパク質(2 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。1% BSAを含むブロッキング溶液で室温、1時間以上ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:1000に希釈した各血清を、固相化した酵母由来HBsタンパク質と室温で2時間反応させた。PBST(0.05% Tween20を含むPBS)で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ラット抗マウスIgG抗体(シグマ社)を加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液(TMB:インビトロジェン社製)を加え、室温で30分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、各キメラタンパク質は2回免疫後三週経過時点の血清において、酵母由来HBsタンパク質で免疫したマウス由来の血清と同等の抗HBs抗体価を示した(図2)。
実施例5に記載の方法により、HPVL2ペプチドに対する抗体価を測定した結果、HBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質の二回免疫後三週経過時点の血清において、HBs/HPVL 127-20キメラタンパク質よりも優位な抗体価上昇を認めた(図3)。HBs/HPVL2 C-20キメラタンパク質では抗体の誘導は認められなかった(データ未記載)。
実施例4で得られたHBs/HPVL2 142-20及びHBs/HPVL2 127-20キメラタンパク質で免疫した個体別の2次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-PsVに対する中和能を評価した。
(1)PsVの作製
HPV16、18、33、35、51、52または58のHPVL1、及び、HPVL2発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドを混合し、293FT細胞にトランスフェクションした。2日後に、細胞をLysis Buffer(0.35% Brij58、0.9mM CaCl2、10mM MgCl2、1μl Benzonaseを含むPBS)に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。終濃度0.8Mになるように5M NaClを加え氷中に10分間静置した後、10,000g、4℃、10分間遠心し、上清を回収した。上清を、27%、33%、39%のiodixanol (0.8M NaCl in PBSで調整)の上に重層し、50,000rpm、16℃、3.5時間超遠心した。超遠心後、PsVを含むフラクションを回収した。
(2)中和試験
細胞培養用培地(10%FBSを含むフェノールレッド不含DMEM)で希釈した上記調製のPsVと、1:12.5から1:400まで同培地で段階希釈した各プール抗血清を等量ずつ混和し、4℃で1時間反応させた。その後、予め96ウェルプレートに準備した293FT細胞(1 X 104個/well)に感染させた。3日後に、培養上清中のルシフェラーゼ活性を、ワングローアッセイキット (プロメガ社)と発光プレートリーダー(MicroLumat Plus LB96V、ベルトールドジャパン株式会社)を用いて測定した。その結果、いずれの偽ウイルスに対しても、未免疫マウス血清と比較して明確な中和活性が認められた(図4)。
(1)HBs/HPVL2 127-20の評価
2匹のカニクイザルに対してHBsタンパク質に対する基礎免疫を誘導した後にHBs/HPVL2 127-20で免疫した。酵母由来HBsタンパク質にアルミアジュバントを加え、20 μg/mL、40 μg/mLとした免疫原を調製し、0.5 mLをカニクイザルの背部皮下に3週間隔を開けて2回投与した。2回目投与の2、3、4週間後に部分採血し、実施例7に記載のELISA法でHBs抗体価の測定を行ったところ、2匹のサルのいずれにおいてもHBs抗体価の上昇が確認された。
HBsタンパク質に対する基礎免疫を保有する4匹のカニクイザルに対してHBs/HPVL2 142-20を免疫した。はじめに、4匹の個々の血清中の抗HBs抗体価を実施例6と同様に市販キット「TOSOH」II(東ソー社)にて測定し、4匹の個体(No.5〜8)のHBs抗体価がそれぞれ、10,193 mIU/mL(No.5)、8,904 mIU/mL(No.6)、3,476 mIU/m(No.7)L、1346 mIU/mL(No.8)であることを確認し、いずれの個体もHBsタンパク質に対する基礎免疫を有していることを確認した。
本発明のHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質が、HPV感染の増殖阻止に有効な抗体産生能を有するものであるかを確認するため、実施例8で調製したHPV-偽ウイルス(PsV)を用いた経腟感染試験を行った。
実施例3で得られたHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質にアジュバント(アルミニウムアジュバントとCFA(2回目以降はIFA)アジュバントの2条件を設定)を加えて25 μg/mlの各免疫原を調製し、各0.2 mlを6〜8週齢のメスBalb/cマウスの尾根部皮下に投与した(各5匹)。3週間隔で3回投与後の免疫マウスを経腟感染試験に用いた。
上記(1)で得られた免疫マウス及びコントロールとして用いた未免疫マウスに酢酸メドロキシプロゲステロンを投与後、3日目に細胞採取用ブラシで膣内を擦過しその後ルシフェラーゼ発現プラスミドを含むHPV16型のPsVを経膣感染させた。その3日後に感染の有無をin vivoイメージアナライザー(IVIS Lumina XR, PerkinElmer社)で検出した。以下、免疫マウス及び未免疫マウスを単にマウスと称することもある。
Claims (11)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示される配列と90%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列であるB型肝炎ウイルス表面タンパク質(HBsタンパク質)のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記(1)から(5)の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質を有効成分として含有するヒトパピローマウイルス(HPV)感染症用ワクチン;
(1)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
(2)配列番号3の配列において1〜5個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
(3)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(配列番号6)なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer、Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer、Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
(4)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が3個連結されたアミノ酸配列、及び
(5)前記(4)の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のN末側若しくはC末側に1〜5個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。 - 前記(2)及び(5)のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、請求項1に記載のHPV感染症用ワクチン。
- HPV感染症の予防薬である、請求項1又は2に記載のHPV感染症用ワクチン。
- HPV感染症の治療薬である、請求項1から3の何れかに記載のHPV感染症用ワクチン。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1で示される配列と90%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列であるB型肝炎ウイルス表面タンパク質(HBsタンパク質)のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記(1)から(5)の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質;
(1)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
(2)配列番号3の配列において1〜5個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
(3)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(配列番号6)なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer、Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer、Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
(4)Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が3個連結されたアミノ酸配列、及び
(5)前記(4)の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のN末側若しくはC末側に1〜5個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。 - 前記(2)及び(5)のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、請求項5に記載のキメラタンパク質。
- 請求項5又は6に記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
- 請求項7に記載のDNA断片が組み込まれた発現ベクター。
- 請求項8に記載の発現ベクターで形質転換されたキメラタンパク質産生宿主。
- 請求項8に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症用DNAワクチン。
- 下記(1)〜(5)の工程を含む、請求項1又は2に記載のHPV感染症用ワクチンの製造方法;
(1)請求項7に記載のDNA断片を調製する工程、
(2)請求項8に記載の発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
(3)前記(2)により得られる形質転換宿主を培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
(4)前記(3)により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
(5)前記(4)により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤から選択される添加剤を添加して、ワクチンとする工程。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016004863 | 2016-01-14 | ||
JP2016004863 | 2016-01-14 | ||
PCT/JP2017/000230 WO2017122583A1 (ja) | 2016-01-14 | 2017-01-06 | HPVL2ペプチド/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症用ワクチン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017122583A1 JPWO2017122583A1 (ja) | 2018-11-08 |
JP6916115B2 true JP6916115B2 (ja) | 2021-08-11 |
Family
ID=59310961
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017561596A Active JP6916115B2 (ja) | 2016-01-14 | 2017-01-06 | HPVL2ペプチド/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症用ワクチン |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6916115B2 (ja) |
TW (1) | TW201729837A (ja) |
WO (1) | WO2017122583A1 (ja) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AUPQ912000A0 (en) * | 2000-07-31 | 2000-08-24 | Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The | Improved virus like particles |
WO2014103608A1 (ja) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び/又はB型肝炎用ワクチン |
-
2017
- 2017-01-06 JP JP2017561596A patent/JP6916115B2/ja active Active
- 2017-01-06 WO PCT/JP2017/000230 patent/WO2017122583A1/ja active Application Filing
- 2017-01-11 TW TW106100830A patent/TW201729837A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017122583A1 (ja) | 2017-07-20 |
TW201729837A (zh) | 2017-09-01 |
JPWO2017122583A1 (ja) | 2018-11-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6470872B2 (ja) | 治療用hpv18ワクチン | |
RU2360001C2 (ru) | Оптимизированная экспрессия l1 hpv45 в дрожжах | |
JP4799789B2 (ja) | ヒト細胞中での発現用に最適化された合成ヒトパピローマウイルス遺伝子 | |
EP2802349B1 (en) | Immunogenic hpv l2-containing vlps and related compositions and methods | |
KR101181907B1 (ko) | 자궁경부암 백신 | |
EP2288380B1 (en) | Vaccine composition useful for hpv and hepatitis b infections and a method for preparing the same | |
WO2014103608A1 (ja) | HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び/又はB型肝炎用ワクチン | |
Bolhassani et al. | Different spectra of therapeutic vaccine development against HPV infections | |
Massa et al. | Antitumor activity of DNA vaccines based on the human papillomavirus-16 E7 protein genetically fused to a plant virus coat protein | |
JP2017528137A (ja) | 卓越した免疫学的特性を有する卓越したヒトパピローマウイルス抗原及びそれを含むワクチン | |
WO2022111021A1 (zh) | 一种c端改造的人乳头瘤病毒11型l1蛋白及其用途 | |
US10548973B2 (en) | Polypeptide carrier for presenting target polypeptide and uses thereof | |
JP4825958B2 (ja) | 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原 | |
JP6916115B2 (ja) | HPVL2ペプチド/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症用ワクチン | |
WO2022111020A1 (zh) | 一种c端改造的人乳头瘤病毒6型l1蛋白及其用途 | |
RU2546243C1 (ru) | Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения | |
RU2509570C2 (ru) | Вакцинная композиция, пригодная при инфекциях hpv и вирусом гепатита в, и способ ее получения | |
RU2681174C1 (ru) | Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина | |
US10329328B2 (en) | HPV-related fusion protein and applications thereof | |
WO2024102417A2 (en) | Bivalent virus-like particle compositions and methods of use | |
Cho et al. | Immunogenicity of a Trivalent Human Papillomavirus L1 DNA-Encapsidated |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20181017 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20181017 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191226 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201208 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210114 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210615 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210715 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6916115 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |