WO2014103608A1 - HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン - Google Patents

HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン Download PDF

Info

Publication number
WO2014103608A1
WO2014103608A1 PCT/JP2013/082094 JP2013082094W WO2014103608A1 WO 2014103608 A1 WO2014103608 A1 WO 2014103608A1 JP 2013082094 W JP2013082094 W JP 2013082094W WO 2014103608 A1 WO2014103608 A1 WO 2014103608A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gly
hpv
peptide
chimeric protein
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/082094
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏 米村
正士 坂口
孝 今村
清一郎 森
忠仁 神田
Original Assignee
一般財団法人化学及血清療法研究所
国立感染症研究所長が代表する日本国
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 一般財団法人化学及血清療法研究所, 国立感染症研究所長が代表する日本国 filed Critical 一般財団法人化学及血清療法研究所
Priority to JP2014554267A priority Critical patent/JPWO2014103608A1/ja
Priority to US14/654,910 priority patent/US20150344529A1/en
Priority to KR1020157020040A priority patent/KR20150099601A/ko
Priority to EP13868570.6A priority patent/EP2940133A4/en
Publication of WO2014103608A1 publication Critical patent/WO2014103608A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine comprising a chimeric protein of a peptide derived from human papillomavirus (HPV) and a human hepatitis B virus surface protein (HBs protein) as an active ingredient.
  • HPV human papillomavirus
  • HBs protein human hepatitis B virus surface protein
  • HPV Human papillomavirus
  • HPV Human papillomavirus
  • HPV has an icosahedral structure with a diameter of 50-55 nm, in which the viral genome is covered with an outer protein (capsid protein), but there is no envelope covering the capsid.
  • capsid protein outer protein
  • the genome size varies depending on the type, it is about 8,000 bases, in which early proteins (E1, E2, E4, E5, E6 and E7) and late proteins (L1 and L2) are encoded.
  • E1, E2, E4, E5, E6 and E7 and late proteins L1 and L2 form capsids of HPV particles, and L2 plays an auxiliary role in capsid formation.
  • HPV The host range of HPV is strict and does not infect non-human animals.
  • HPV is a persistent infection in the skin and mucous membranes caused by contact infection, including cervical cancer (squamous cell carcinoma, adenocarcinoma) and its precursor lesions [cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 and 3], warts Raise.
  • cervical cancer squamous cell carcinoma, adenocarcinoma
  • CIN cervical intraepithelial neoplasia
  • HPV infection is involved in 13% (530,000) of malignant tumors in women worldwide, and 300 million people are considered to be HPV carriers (see Non-Patent Document 4).
  • HPV HPV genome replicates and distributes to daughter cells when HPV-infected cells divide. When latently infected cells begin to differentiate into epidermal formation, viral growth occurs at the end of differentiation.
  • HPV is rarely isolated as a viral particle, and only genomic DNA has been cloned. So far, HPV has been classified into over 100 genotypes based on the homology of the base sequence of the capsid protein (L1) gene. HPV has different infection sites and diseases depending on its genotype, and is broadly divided into those detected in skin lesions (epithelial type) and those detected in mucosal lesions (mucosal type).
  • High-risk HPV includes 16, ⁇ ⁇ 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58 detected from cervical cancer, perianal cancer, and penile cancer , 59, 66, 68, 73, and 82 types
  • the low-risk type HPV includes types 6 and 11 (see Non-Patent Literature 1, Non-Patent Literature 2 and Non-Patent Literature 3).
  • first-generation vaccines which are genes in which a gene encoding L1 protein is expressed in yeast or insect cells to produce VLP, and an adjuvant is added thereto (see Non-Patent Document 6). All are approved for cancers caused by specific genotypes, and only preventive effects on a few types other than Gardasil types 6, 11, 16 and 18 and Cervarix® other than types 16 and 18 (Non-patent literature new 12). Therefore, in order to more efficiently suppress the onset of cancer induced after the inhibition of HPV infection, the development of vaccines that work effectively against all types of HPV infection is required (Non-Patent Documents 5 and 6). reference).
  • HBs protein has been demonstrated to be highly effective and safe as a vaccine, such as being used as an active ingredient of yeast-derived recombinant precipitated hepatitis B vaccine (see Non-Patent Document 7).
  • VLPs composed of chimeric proteins of foreign peptides and HBs proteins affect the stability of the VLP, the expression efficiency from the cells, the structural changes in the expressed ones, etc., depending on the type and length of the foreign peptide inserted. (See Patent Document 4), and usefulness as a vaccine is not necessarily guaranteed.
  • the object of the present invention is to provide a peptide consisting of 20 amino acid sequences in a specific region of a protein called L2 (hereinafter also referred to as “L2 protein”), which is one of the capsid constituents of HPV, and N of HBs protein. It is an object of the present invention to provide a vaccine for preventing human papillomavirus infection and / or hepatitis B, which comprises a chimeric protein obtained by adding to the terminal side or C-terminal side or inserting it into the HBs protein.
  • L2 protein a protein obtained by adding to the terminal side or C-terminal side or inserting it into the HBs protein.
  • a peptide comprising the amino acid sequence at positions 56-75 of the HPV16 type L2 protein (SEQ ID NO: 4; Gly-Gly-Leu-Gly- Obtained by adding Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu) to the N-terminus or C-terminus of the HBs protein
  • VLP virus-like particles
  • an antibody produced by a chimeric protein added to the C-terminal side induces an antibody against the peptide early, binds strongly to both HBs protein and the peptide, and the antibody is derived from various HPV types.
  • the antibody produced by the chimeric protein inserted into HBs induces an antibody that recognizes two amino acid sequences (N-terminal and C-terminal epitopes) in the peptide.
  • the present invention has been completed.
  • a chimeric protein of a peptide containing the 7 to 20 amino acid sequence of the specific region of the HPV L2 protein and the HBs protein, a DNA fragment comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of the chimeric protein, and the DNA fragment An expression vector (including a viral vector), a host having the expression vector, a vaccine for preventing HPV infection and / or hepatitis B using the chimeric protein and the DNA fragment, and A manufacturing method is provided.
  • the expression vector having the chimeric protein and the DNA encoding the chimeric protein of the present invention can be effectively used for the prevention and treatment of hepatitis B and / or HPV infection. Therefore, the present invention is as follows.
  • HPV-L2 peptide is (1) 20 amino acids Peptide consisting of the core sequence region, (2) Peptide in the core sequence region having 6 amino acids Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, or (3) N-terminal side
  • the core sequence region is Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (X1aa , X2aa, X3aa, X4aa, X5aa and X6aa are arbitrary amino acids) (SEQ ID NO: 3), the chimeric protein according to [1] or [2].
  • X4aa is Ser, Thr or Ala
  • X5aa is Ile or Val
  • (6) X6aa is Leu or Ile
  • the core sequence region is Gly-Gly- It is an amino acid sequence consisting of Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 4), [1] Or the chimeric protein according to [2].
  • [6] The chimeric protein according to any one of [1] to [5], wherein the chimeric protein comprises 1 to 11 HPV-L2 peptides.
  • [7] The peptide according to any one of [1] to [6], wherein the peptide is added or inserted into at least one of the N-terminal amino acids of the HBs protein, positions 127 to 128 of SEQ ID NO: 2, or the C-terminal amino acid.
  • Chimeric protein [8] The chimeric protein according to [7], wherein the peptide is inserted at positions 127 to 128 of SEQ ID NO: 2 of the HBs protein.
  • [9] The chimeric protein according to [7], wherein the peptide is added to the C-terminal amino acid of the HBs protein.
  • [12] A DNA fragment encoding the chimeric protein according to any one of [1] to [11].
  • [14] A chimeric protein production host transformed with the expression vector.
  • a vaccine for HPV infection and / or hepatitis B comprising the chimeric protein according to any one of [1] to [11] as an active ingredient.
  • a DNA vaccine for HPV infection and / or hepatitis B comprising the expression vector according to [13] as an active ingredient.
  • a chimeric protein of a peptide and an HBs protein has an antibody-producing ability of both the peptide and the HBs protein, and thus can be a suitable material for a preventive agent for HPV infection and / or hepatitis B.
  • the peptide when the peptide is added to the C-terminal side of the HBs protein, not only the expression level in the host is increased, but also the immunity of the peptide is enhanced (early antibody induction).
  • it is useful for enhancing the productivity and improving the quality of the vaccine in that antibodies against at least two amino acid sequences in the peptide can be induced.
  • N-terminal 6 amino acid sequences of the above peptides are well conserved among HPV strains and are effective for many HPV types.
  • antibodies induced by the chimeric protein of the present invention react with many types of HPV. Therefore, according to the present invention, unlike a conventional type-specific vaccine, it is possible to provide a vaccine having a wider spectrum.
  • FIG. 1 is a drawing showing the results of measuring the concentration of a chimeric protein in the culture supernatant of a transformed cell by sandwich ELISA using an anti-HBs monoclonal antibody.
  • FIG. 2 is a drawing showing the reactivity of HPV-L2 peptide derived from the same genotype as that of mouse serum (pooled serum) immunized with the chimeric protein.
  • FIG. 3 is a drawing showing the reactivity of HPV-L2 peptide derived from the same genotype as mouse serum (serum by individual) immunized with the chimeric protein.
  • FIG. 4 shows the reactivity of mouse sera immunized with the chimeric protein (pool serum) with HPV-L2 peptides derived from different genotypes.
  • FIG. 5 is a drawing showing the measurement results of HBs antibody titer in mouse serum (pooled serum) immunized with the chimeric protein.
  • FIG. 6 is a drawing showing the results of epitope analysis of mouse serum (pooled serum) immunized with the chimeric protein.
  • FIG. 7 shows the reactivity of mouse sera immunized with the chimeric protein (pooled serum) with HPV-virus-like particles (VLP) derived from different genotypes.
  • FIG. 8-1 is a drawing showing the results of evaluating the neutralizing ability of mouse sera immunized with the chimeric protein (pooled sera) against HPV16-pseudovirus (PsV) derived from different genotypes.
  • FIG. 5 is a drawing showing the measurement results of HBs antibody titer in mouse serum (pooled serum) immunized with the chimeric protein.
  • FIG. 6 is a drawing showing the results of epitope analysis of mouse serum (pooled serum) imm
  • FIG. 8-2 is a graph showing the results of evaluating the neutralizing ability of mouse sera immunized with the chimeric protein (pooled sera) against HPV18-pseudovirus (PsV) derived from different genotypes.
  • FIG. 8-3 is a graph showing the results of evaluating the neutralizing ability of mouse sera immunized with the chimeric protein (pooled sera) against HPV35-pseudovirus (PsV) derived from different genotypes.
  • a feature of the present invention is that a HPV L2 protein-derived peptide and a hepatitis B virus surface protein (HBs protein) chimera protein, which are very well preserved among HPV groups, are used to prevent HPV infection and / or hepatitis B. It is to make it an active ingredient of a vaccine.
  • HBs protein hepatitis B virus surface protein
  • HPV is difficult to recover as virus particles, and the genotype has been determined based on the homology of the base sequence of the capsid (L1) gene. More than 100 genotypes have been isolated so far. ing. For example, HPV types 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 are high-risk HPV groups. Types 6 and 11 are classified into low-risk HPV groups.
  • the HPV L2 protein has a region consisting of amino acid sequences that are very well conserved among high-risk HPV groups (hereinafter sometimes referred to as “core sequence region”), and low-risk HPV Similar core sequence regions exist in groups.
  • HPV-L2 peptide A peptide derived from the HPV L2 protein comprising the core sequence region (hereinafter sometimes referred to as “HPV-L2 peptide”) is used in the present invention.
  • HPV16, 31 and 35 types have 20 to 57 amino acids
  • HPV39, 45, 51, 52, 56, 58, 66 and 6 types have 55 to 74th 20 amino acids and HPV73 types.
  • the 20th amino acid at positions 57-76 and the 20th amino acid at positions 54-73 in HPV type 11 are mentioned.
  • sequence of these 20 amino acids is Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa, and X6aa are arbitrary amino acids) (SEQ ID NO: 3).
  • the aforementioned arbitrary amino acid is a site where mutation is observed between the types of HPV strains, (1) X1aa is Thr or Ser, (2) X2aa is Ser, Thr or Ala, (3) X3aa is Thr or Ser, (4) X4aa is Ser, Thr or Ala, (5) X5aa is Ile or Val, and (6) X6aa is Leu or Ile Selected from.
  • the HPV-L2 peptide used in the present invention includes, in addition to the peptide consisting of the 20 amino acid core sequence region, the N-terminal side and / or the C-terminal side of the peptide consisting of 6 amino acids and the peptide consisting of 6 amino acids. It includes peptides in various core sequence regions to which amino acids derived from HPV L2 protein are added.
  • peptides having an amino acid derived from HPV-L2 protein added to the N-terminal side and / or C-terminal side of the core sequence region can also be used in the present invention, and HPV-L2 peptide includes these peptides.
  • the total number of amino acids of the HPV-L2 peptide is 70 or less.
  • HPV-L2 peptide consisting of the core sequence region having the common epitope can be used in the present invention, but is 50-100%, 70-100% or 80-100% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It is preferable to use a peptide consisting of 20 amino acids. More preferably, an amino acid substitution product of the HPV-L2 peptide represented by the above formula (SEQ ID NO: 3) is used.
  • Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 4) HPV-L2 peptide consisting of an amino acid sequence.
  • the HPV-L2 peptide is derived from the above 6 amino acids or the HPV-L2 protein on the N-terminal side and / or C-terminal side of the 6 amino acids as long as the following conditions (maintenance of antigen activity and particle morphology) are satisfied.
  • These include those in which an amino acid derived from HPV-L2 protein is further added to the N-terminal side or C-terminal side of the core sequence region consisting of 7 to 19 amino acids and 20 amino acids.
  • HPV-L2 peptide variants obtained by adding or inserting cysteine (Cys) to the HPV-L2 peptide are also an embodiment of the present invention.
  • cysteine (Cys) is added or inserted into the N-terminal side, C-terminal side, and / or inside of the peptide in order to enhance the immunization ability of the peptide itself (WO (2010/044464 A1 and WO 2011).
  • M2 peptide in which a cysteine residue is inserted into a peptide consisting of 23 amino acids from 2 to 24 in the M2 amino acid sequence of influenza virus type A has a higher immunogenicity (from twice the unmodified M2 peptide). 20 times) (see WO (2011/024748 A1).
  • 1 to several HPV-L2 peptides are also used in the HPV-L2 peptide of the present invention under the condition that a common epitope between HPV groups is preserved. These amino acids may be substituted or added to Cys.
  • the 6 amino acids on the N-terminal side have exactly the same sequence between the HPV groups, so it is preferable to add or insert Cys at a site other than the amino acid sequence.
  • Cys may be collectively referred to simply as HPV-L2 peptide.
  • the addition or insertion site of the HPV-L2 peptide to the HBs protein may be any site as long as the immunogenicity against the HPV-L2 peptide and the HBs protein is maintained.
  • the chimeric protein of HPV-L2 peptide and HBs protein forms a particle, and the HPV-L2 peptide is located on the surface of the particle.
  • Such candidates include the N-terminal side, the C-terminal side of the HBs protein, and specific sites (positions 127 to 128 in SEQ ID NO: 2) inside the HBs protein.
  • the HPV-L2 peptide is added to the C-terminal side of the HBs protein and / or inserted into a specific site inside the HBs protein (positions 127 to 128 in SEQ ID NO: 2).
  • an antibody against the peptide By adding the peptide to the C-terminal side of the HBs protein, an antibody against the peptide can be induced at an early stage, and a high antibody titer against HBs can be maintained (Example 1 and Example 7).
  • insertion into specific sites within the HBs protein positions 127-128 of SEQ ID NO: 2) reduces antibody induction against HBs, but recognizes two amino acid sequences (two epitopes) in the peptide.
  • the antibody is induced. This means that antibodies with a broader spectrum are induced against various HPV strains (Example 8).
  • the HPV-L2 peptide is added to the C-terminal side of the HBs protein and inserted into a specific site (positions 127 to 128 in SEQ ID NO: 2) inside the HBs protein. It is preferable to do this.
  • the same effect is obtained by immunizing a mixture of a chimeric protein in which the HPV-L2 peptide is added to the C-terminal side of the HBs protein and a chimeric protein in which the peptide is inserted into a specific site (positions 127 to 128 in SEQ ID NO: 2) inside the HBs protein. It is obtained by using it as a raw material. In this case, higher antibody titer induction is expected for HBs proteins. What is necessary is just to adjust suitably the mixing ratio of both chimeric protein for obtaining the optimal effect by a normal method.
  • the peptide When a foreign peptide is added to the N-terminal side of the HBs protein, the peptide is preferably 20 to 70 amino acids. If it is larger than this size, particle formation may be affected, and if it is smaller than this size, the activity as an antigen may be reduced. Therefore, in the present invention, HPV-L2 peptide can be linked and used as long as antigen activity and particle morphology are maintained. In the case of the HPV-L2 peptide (20 amino acids) consisting of the core sequence region, 2 to 3 can be linked and used.
  • the present invention uses a peptide consisting of 21 to 70 amino acids in total length, in which an HPVHPL2 protein-derived amino acid is added to the N-terminal side or C-terminal side of the HPV-L2 peptide consisting of the core sequence region.
  • an HPVHPL2 protein-derived amino acid is added to the N-terminal side or C-terminal side of the HPV-L2 peptide consisting of the core sequence region.
  • the number of amino acids is 21 to 35, two HPV-L2 peptides can be linked.
  • HPV-L2 peptides In the case of a peptide consisting of 6 to 19 amino acids having a common epitope sequence (Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly) in the core sequence region and the common epitope sequence, the total number of amino acids is 20 to 70. Thus, 2 to 11 HPV-L2 peptides can be linked and used depending on the peptide size.
  • the size of the added or inserted peptide is within the range of up to 70 amino acids, other peptides may be added or inserted in addition to the HPV-L2 peptide.
  • other peptides may be added or inserted in addition to the HPV-L2 peptide.
  • a trivalent vaccine effective for HPV infection, hepatitis B and influenza can be obtained.
  • the chimeric protein of the HPV-L2 peptide of the present invention and the HBs protein can be obtained by the following method.
  • a gene encoding an HBs protein that serves as a matrix of a chimeric protein is prepared.
  • the base sequence of the HBs gene has been disclosed in many patent documents, non-patent documents, and databases (see, for example, Non-patent document 10 and Non-patent document 11). It can be easily obtained by using a general gene recombination technique described by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).
  • the HBs antigen to be used may be any of Large, middle and small.
  • a DNA fragment encoding a chimeric protein of HPV-L2 peptide and HBs protein (hereinafter also referred to as “chimeric protein DNA fragment”) is prepared by a method using PCR or DNA synthesis.
  • a chimeric protein DNA fragment with the HPV-L2 peptide added to the N-terminal side or C-terminal side of the HBs protein by the PCR method, the base sequence encoding the HPV-L2 peptide and a part of the HBs gene
  • a primer consisting of a base sequence and the other primer of the HBs gene (which comes to the N-terminal side determines the primer direction) are used.
  • the same operation is performed when preparing a chimeric protein DNA fragment in which the HPV-L2 peptide is added to the inside of the HBs protein.
  • PCR primers designed based on the base sequence encoding the HPV-L2 peptide and the base sequence of the HBs gene can be easily obtained by requesting a DNA synthesis contracting organization (for example, QIAGEN).
  • a DNA synthesis contracting organization for example, QIAGEN.
  • the 'KOZAK sequence Kozak M, J. Mol. Biol., 196, 947 (1987)
  • the 5' and 3 'terminal sequences of appropriate restriction enzyme recognition sites are located on the 5' side. Added.
  • a DNA fragment amplified by PCR is cloned into a cloning vector such as pUC119 (Takara Bio), pBlueScript (Agilent Technology), or pCRII-TOPO (Invitrogen), and then a DNA sequencer (ABI Prism 377 Applied Biosystems).
  • the base sequence is determined by the company.
  • the target chimeric protein DNA fragment is confirmed by comparing the result of the obtained base sequence with the designed primer sequence for PCR and the base sequence of the existing HBs gene.
  • the chimeric protein DNA fragment of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host to express the chimeric protein DNA fragment.
  • an expression vector a plasmid, a viral vector, or the like can be used.
  • the promoter contained in the expression vector can be selected from promoters such as Lac, tac, pho5, adh, early SV40, late SV40, and ⁇ -actin depending on the combination with the microorganism or animal cell used as the host.
  • bacteria, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like are commonly used, and may be selected according to the purpose of use. A known method may be used when transforming a host cell.
  • a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using lipofectin-based liposomes, a protoplast polyethylene glycol fusion method, an electroporation method, and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used.
  • the target chimeric protein gene that is, the HBs protein is obtained by cleaving the recombinant baculovirus vector (see Preparation Examples) distributed from the National Institute of Infectious Diseases (Dr. Kanda and Dr. Mori) with a restriction enzyme.
  • each chimeric protein DNA fragment was incorporated into an expression plasmid pCAGG-S1 (Sal) .dhfr.neo (see WO2003 / 004641) for animal cells, and the expression plasmid was transformed into Chinese hamster ovary (CHO) cells by a modified calcium phosphate method. Conversion processing was performed.
  • the transformed cells expressing the chimeric protein of the present invention are screened by the following two-step method. First, select / proliferate the transformed cells by culturing them for a period of time in a medium containing 10-1,000 nmol L methotrexate (MTX) and 100-1,000 ⁇ g / mL geneticin (Geneticin G418 sulfate). To select transformed cells. Next, the cells in which the chimeric protein is expressed are selected in the resulting transformed cells. Specifically, the chimeric protein of the present invention is confirmed by performing ELISA, WB, etc. on the culture supernatant or cell disruption using an antibody that specifically binds to HPV-L2 peptide or HBs protein.
  • MTX 10-1,000 nmol L methotrexate
  • Geneticin G418 sulfate 100-1,000 ⁇ g / mL geneticin
  • the conditions used when culturing ordinary cells may be used. That is, T7m medium, Ex-cell SP2 / 0 medium, YMM-01B medium, YMM-01C medium, OptiCHO medium, Ex-cell 302 medium, etc., or a medium in which some of these are mixed is used. To this, fetal bovine serum, calcium, magnesium, amino acids, vitamins, etc. may be added. The culture temperature is 32 ° C to 38 ° C, and the culture period is 2 to 20 days. In the step of producing a pharmaceutical product, it is preferable to maintain the chimeric protein-expressing cells in a serum-free medium. *
  • Purification of the chimeric protein of the present invention can be accomplished by methods commonly used in protein chemistry, such as centrifugation, salting-out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography. This is achieved by appropriately combining a method, an affinity chromatography method, a hydrophobic chromatography method, a hydroxyapatite chromatography method and the like.
  • the amount of the obtained chimeric protein is measured using a BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc), a protein assay kit (Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) and the like.
  • the chimeric protein of the present invention may be one in which the HPV-L2 peptide and the HBs protein are individually expressed or chemically synthesized and then chemically combined.
  • HPV-L2 peptide and the HBs protein are individually expressed or chemically synthesized and then chemically combined.
  • An expression plasmid can be introduced into a host as described above to obtain the desired peptide or protein.
  • a method of bonding using a crosslinker is exemplified.
  • the amino group, thiol group (SH group), sugar chain aldehyde group, etc. present in the protein or peptide can be used for binding, but the functional group used is not limited.
  • a method of chemically binding using a bond utilizing interaction between biomolecules such as biotin and avidin is also exemplified.
  • Evaluation of the chimeric protein of the present invention as a vaccine is performed by immunizing a small animal such as a chicken, mouse, rat, guinea pig, dog, or monkey with an antigen, and then collecting blood from the immunized animal in the in vitro system. And measuring the antibody titer against the chimeric protein of the present invention and the neutralizing antibody titer against HPV and hepatitis B virus in the serum, and in the in vivo system, the immunized animal is treated with pseudo-HPV. And then observing the life and death of immunized animals, disease states, and the like. In general, ELISA, PHA, plaque assay, etc. are commonly used for antibody measurement in an in vitro system.
  • neutralizing antibody against hepatitis B virus is measured by measuring HBs antibody, and neutralizing antibody against HPV is virus-like particle (VLP) or infectious pseudovirus (Buck C). B, etc., by measuring the binding ability with Efficientffiintracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.).
  • VLP virus-like particle
  • Buck C infectious pseudovirus
  • Immunization methods for example, administration sites such as subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, nasal, oral, sublingual, and immunization periods
  • Immunization techniques are used.
  • Antigens used for immunization are those that can be used against humans, such as adjuvants such as aluminum hydroxide gel, aluminum phosphate gel, CpG oligonucleotide, MDP, QS21, MPL + TDM emulsion, in order to enhance their immunity. Any adjuvant may be added, if any.
  • various additives that are acceptable for pharmaceutical use may be added.
  • Such additives include stabilizers (arginine, polysorbate 80, macrogol 4000, etc.), excipients (mannitol, sorbitol, sucrose, and lactose), buffers (sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate) And sodium chloride), isotonic agents (such as sodium chloride), preservatives (such as thimerosal, phenoxyethanol), and inactivating agents (such as formalin and ⁇ -propiolactone).
  • stabilizers arginine, polysorbate 80, macrogol 4000, etc.
  • excipients mannitol, sorbitol, sucrose, and lactose
  • buffers sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate
  • isotonic agents such as sodium chloride
  • preservatives such as thimerosal, phenoxyethanol
  • inactivating agents such as formalin and ⁇ -propiolactone
  • the chimeric protein of the present invention thus obtained has the ability to produce antibodies effective in preventing the growth of HPV infection and hepatitis B, and is used as a material for preventive agents for HPV infection and hepatitis B, or HPV and hepatitis B. It can be used as a material for constructing a virus detection system (for example, a detection system based on antibody measurement methods such as ELISA, Western blot, and dot blot).
  • a virus detection system for example, a detection system based on antibody measurement methods such as ELISA, Western blot, and dot blot.
  • a DNA vaccine can be obtained by using an expression vector that can express a chimeric protein when the DNA fragment encoding the chimeric protein is administered in vivo.
  • an expression vector include a plasmid derived from E. coli.
  • the plasmid contains a strong promoter in eukaryotes such as cytomegalovirus IE (immediate-early) promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter and the like. Is done.
  • a live vaccine can be obtained by introducing the DNA fragment into a virus or a bacterium.
  • expression vectors examples include viruses (vaccinia virus vectors, herpes virus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, measles virus vectors, etc.), bacteria (Salmonella vectors, etc.), protozoa (malaria protozoan vectors, etc.) and the like.
  • viruses vaccinia virus vectors, herpes virus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, measles virus vectors, etc.
  • bacteria Salmonella vectors, etc.
  • protozoa malaria protozoan vectors, etc.
  • a vaccinia virus vector LC16m8 strain
  • the live attenuated vaccine can simplify the purification process of the vaccine material, leading to a reduction in production cost.
  • Recombinant vaccinia virus in which HBs protein is incorporated expresses particles composed only of HBs protein (Vaccineacc1987 Mar; 5 (1): 65-70). Therefore, the recombinant vaccinia virus (LC16m8 strain) into which the chimeric protein DNA fragment of the present invention has been incorporated is predicted to form particles in the same manner, and the live attenuated vaccine retaining the strong immunogenicity of the HPV-L2 peptide It is expected to be
  • the vaccine containing the chimeric protein of the present invention as an active ingredient may be used alone as a bivalent vaccine for preventing HPV infection and hepatitis B, and other viruses (for example, influenza virus, hepatitis A, etc.) Combined with at least one vaccine selected from the group consisting of vaccines against viruses, Japanese encephalitis virus, etc., bacteria (eg, Haemophilus influenzae, tetanus, diphtheria, etc.) and protozoa (eg, malaria) infections
  • viruses for example, influenza virus, hepatitis A, etc.
  • it can be used as a multivalent mixed vaccine.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to
  • Primer NF 5'-gtcgacATGGGTGGGTTAGGAATTGGAACAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGAGAACACAACATCAGGATT (SEQ ID NO: 18)
  • Primer R 5'-ctgcagTTAAATGTATACCCAAAGAC (SEQ ID NO: 19)
  • Primer F 5'-gtcgacATGGAGAACACAACATCAGG (SEQ ID NO: 20) Primer 127R; 5'-TCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCA (SEQ ID NO: 21) Primer 127F; 5'-CAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGCTCAAGGAACCTCTATGT (SEQ ID NO: 22)
  • Equal amounts of each amplified fragment were mixed, and PCR amplification was performed again with primer F and primer R to obtain a gene fragment of about 750 bp with each fragment connected.
  • This gene is digested with the restriction enzyme Sal I-Pst I and introduced into the restriction enzyme Sal I-Pst I digested fragment of the baculovirus expression plasmid pFastBac1 to the inside of the HBs protein (between positions 127-128 of SEQ ID NO: 2).
  • PFB1 having a DNA fragment encoding a chimeric protein into which HPV-L2 peptide (56th to 75th amino acids of SEQ ID NO: 1) is inserted (hereinafter also referred to as “56 / 75-127-position introduced chimera”) -HBsS56 / 75-127 was constructed.
  • a band having a target size of about 750 bp was confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • This band was digested with the restriction enzyme Sal I-Pst I, introduced into the restriction enzyme Sal I-Pst I digested fragment of the baculovirus expression plasmid pFastBac1, and the HPV-L2 peptide (56 to Construction of expression plasmid pFB1-HBsS56 / 75-N having a DNA fragment encoding a chimeric protein (hereinafter also referred to as “56 / 75-C-end introduced chimera”) to which 20th amino acid at position 75 was added .
  • This band is digested with the restriction enzyme Sal I-Pst I, introduced into the restriction enzyme Sal I-Pst I digested fragment of the baculovirus expression plasmid pFastBac1, and the HBs expression plasmid pFB1-HBsS having the DNA fragment encoding the HBs protein is obtained. It was constructed.
  • the expression plasmids (1) to (4) described in the preparation examples are digested with restriction enzymes Sal I and Xho I, and a DNA fragment encoding a chimeric protein of HPV-L2 peptide and HBs protein and DNA encoding HBs protein Fragments were extracted by agarose electrophoresis.
  • the DNA fragments obtained from (1) to (4) are respectively 56 / 75-N-terminal introduced chimeric DNA fragment, 56 / 75-127-position introduced chimeric DNA fragment, 56 / 75-C-terminal introduced chimeric DNA fragment, and HBsDNA. It is called a fragment.
  • each of the above DNA fragments and an expression plasmid for animal cells pCAGG-S1 (Sal) .dhfr.neo digested in advance with restriction enzyme Sal I and terminally dephosphorylated by treatment with calf small intestine-derived alkaline phosphatase Ligation High (Toyobo) ligated and circularized, 56 / 75-N end introduced chimeric animal cell expression plasmid (pCAGG.HBs56 / 75-N.dhfr.neo), 56 / 75-127 position introduced chimeric animal cell expression plasmid ( pCAGG.HBs56 / 75-127.dhfr.neo), 56 / 75-C-terminally introduced chimeric animal cell expression plasmid (pCAGG.HBs56 / 75-C.dhfr.neo) and HBs animal cell expression plasmid (pCAGG.HBs56 / 75 -N
  • CHO K1 FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968
  • a modified calcium phosphate method C. Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2752p, 1987.
  • the medium was washed with PBS ( ⁇ ), and the medium was changed to a serum-free medium (T7m: Ex-cell SP2 / 0; YMM-01B three-type mixed medium (custom medium manufactured by SAFC)).
  • T7m Ex-cell SP2 / 0; YMM-01B three-type mixed medium (custom medium manufactured by SAFC)
  • concentration of the expressed protein in the culture supernatant was quantified by sandwich ELISA using an anti-HBs monoclonal antibody.
  • the expression level of the chimera introduced with 56 / 75-C end was the highest, followed by chimera introduced with positions 56 / 75-127 and chimera introduced with 56 / 75-N end.
  • the expression level of the 56 / 75-C-terminally introduced chimera was more than twice that of the non-introduced HBs protein as a control (FIG. 1).
  • ⁇ Purification of chimeric protein from cell culture supernatant >> CHO K1 cells expressing the three chimeric proteins and the HBs protein obtained in Example 2 were expanded using a selective medium. After expansion, after washing with PBS ( ⁇ ), the medium was replaced with a serum-free medium (T7m; Ex-cell SP2 / 0; YMM-01B, 3 types mixed medium), and cultured at 37 ° C. for 10 days or more. After clarification of the culture solution by centrifugation, the culture supernatant was concentrated with a cartridge type UF (Vivacel 100; Sartorius) having an exclusion limit of 1,000 kDa in the presence of benzonase (Merck).
  • a cartridge type UF Vivacel 100; Sartorius
  • the band containing the chimeric protein or HBs protein was extracted, deglycosylated with a UF cartridge with an exclusion limit of 300 kDa, and buffer exchanged with PBS (-) .
  • the obtained chimeric protein and HBs protein both formed virus-like particles (VPL).
  • ⁇ Immune of chimeric protein to mice 50 ⁇ g / ml of each immunogen was prepared by adding aluminum adjuvant to the chimeric protein and HBs protein obtained in Example 3, and each 0.1 ml was intramuscularly injected into the thigh of female Balb / c mice (10 per group). One by one). Antiserum obtained by collecting blood at 4 weeks after inoculation (primary immune serum) and antiserum obtained by collecting blood at 8 weeks after inoculating the same immunogen in the same manner as described above at 4 weeks from the first inoculation. (Secondary immune serum) was obtained.
  • a non-administered group and a group administered with an immunogen in which an aluminum adjuvant was added to a conjugate of a synthetic peptide in which Cys was added to the N-terminus of the HPV-L2-derived sequence (SEQ ID NO: 4) and KLH were used.
  • the plate was blocked with a blocking solution (PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20) at room temperature for 2 hours to obtain an antigen-immobilized plate.
  • a blocking solution PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20
  • Each serum diluted 1: 100 with a blocking solution was reacted with the immobilized peptide at room temperature for 2 hours.
  • PBST PBS containing 0.05% Tween20
  • HRP horseradish peroxidase
  • sc-2031 horseradish peroxidase -labeled anti-mouse IgG antibody
  • Example 4 ⁇ Reactivity of HPV-L2 peptides derived from different genotypes and antisera> Using the individual primary immune sera obtained in Example 4 or these pool antisera (equal amounts of individual antisera mixed in equal amounts), the same method as in Example 5 was used to derive from different genotypes. The ability to bind to the HPV-L2 peptide in the common region was evaluated (HPV18, HPV59 and HPV68 have the same sequence as HPV type 16). A synthetic peptide represented by the following amino acid sequence was used. In the following amino acid sequences, * indicates the same amino acid as HPV16 type.
  • HBs antibody titer in antiserum The antibody titer against the HBs protein was measured for the pooled antiserum obtained by mixing equal amounts of the primary immune sera for each individual obtained in Example 4. The pool antiserum was diluted 10 times with PBS (-) (10, 100, 1,000 times), and hepatitis B surface antibody kit E test “TOSOH” II (HBsAb; Tosoh Corporation) The antibody titer was measured with an automatic enzyme immunoassay device AIA-360.
  • any of the chimeric protein immunization groups antibodies reacting with the HBs protein were detected.
  • the 56 / 75-N-end-introduced chimeric immunity group and the 56 / 75-C-end-introduced chimera immunity group obtained the same high antibody titer as the HBs protein-only immunization group, Then, the increase in antibody titer was suppressed to about 1/10 (FIG. 5).
  • the plate was blocked with a blocking solution (5% skim milk, PBS containing 0.1% Tween 20) at room temperature for 2 hours to obtain an antigen-immobilized plate.
  • a blocking solution 5% skim milk, PBS containing 0.1% Tween 20
  • Each serum serially diluted from 1: 100 to 1: 2500 with a blocking solution was reacted with the immobilized peptide at room temperature for 2 hours.
  • PBST PBS containing 0.1% Tween20
  • HRP horseradish peroxidase
  • sc-2031 horseradish peroxidase -labeled anti-mouse IgG antibody
  • a substrate solution (0.1 mg trisodium citrate, pH 4.8 containing 2 mg / ml o-phenylenediamine and 0.0065% hydrogen peroxide solution) was added and reacted at room temperature for 10 minutes. The absorbance at 450 nm was measured.
  • HPV16-L2-14 / 27 14-SATQLYKTCKQAGT (SEQ ID NO: 24) HPV16-L2-53 / 73 53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTGYI (SEQ ID NO: 25) HPV16-L2-53 / 70 53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTAAA (SEQ ID NO: 26) HPV16-L2-53 / 67 53-VFFGGLGIGTGSGTGAAAAAA (SEQ ID NO: 27) HPV16-L2-53 / 64 53-VFFGGLGIGTGSAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 28) HPV16-L2-55 / 75 55-FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID NO: 29) HPV16-L2-58 / 75 58-AAALGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID NO: 30) HPV16-L2-60 / 75 60-AAAAAAGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID NO: 31) HPV16
  • each immunization group has a high antibody titer.
  • the amino acid sequences of the N-terminal side and the C-terminal side of the core sequence region (20 amino acids) were induced, and in the 56 / 75-N terminal chimeric immunity group and 56 / 75-C terminal chimeric immunity group, the C terminal amino acid sequence (C terminal epitope) It was shown that antibodies recognizing) were induced (FIG. 6).
  • VLP HPV16, 18, 31, 33, 35, 51, 52, or 58 L1 and L2 expression plasmids were transfected into 293FT cells (Invitrogen). Two days later, the cells were dissolved in Lysis Buffer (PBS containing 0.35% Brij58, 0.9 mM CaCl 2 , 10 mM MgCl 2 , 1 ⁇ l Benzonase) and incubated overnight at 37 ° C. After adding 5M NaCl to a final concentration of 0.8M and allowing to stand in ice for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 10,000g, 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • Lysis Buffer PBS containing 0.35% Brij58, 0.9 mM CaCl 2 , 10 mM MgCl 2 , 1 ⁇ l Benzonase
  • the supernatant was layered on 27%, 33%, and 39% iodixanol (adjusted with 0.8M NaCl in PBS), and ultracentrifuged at 50,000 rpm, 16 ° C. for 3.5 hours. After ultracentrifugation, the fraction containing VLP was collected.
  • the chimeric protein of the present invention can be used as a material for preventive drugs against human papillomavirus (HPV) infection and hepatitis B.
  • HPV human papillomavirus

Abstract

　HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、 （２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質；及び該キメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。本発明のキメラタンパク質を含有するワクチンは、宿主における発現量が増加し、免疫能力が増強しており（早期の抗体誘導）、多くのHPV型に有効な広いスペクトルを持ったワクチンである。

Description

HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン
　本願発明は、ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus：HPV）由来のペプチドとヒトＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分とするワクチンに関する。
　ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus：HPV）は、パピローマウイルス科に属する小型の環状二本鎖DNAウイルスで、ヒト乳頭腫ウイルスとも呼ばれる。HPVは、ウイルスゲノムが外郭タンパク質（カプシドタンパク質：Capsid protein）で覆われた直径 50-55nmの正二十面体構造を取るが、カプシドを覆うエンベロープは存在しない。ゲノムサイズは種類により異なるが約8,000塩基ほどで、この中に初期タンパク質（E1, E2, E4, E5, E6及びE7）と後期タンパク質（L1及びL2）がコードされている。L1とL2でHPV粒子のカプシドが形成され、L2はカプシド形成に補助的に働いている。
　HPVの宿主域は厳格でヒト以外の動物に感染しない。HPVは、接触感染により皮膚や粘膜に潜伏持続感染し、子宮頸がん（扁平上皮がん、腺がん）及びその前駆病変[cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 及び3]、尖圭コンジローマ等を惹き起こす。日本では、年間19000人が子宮頸がんを発症し、5600人が死亡している（非特許文献５参照)。WHOによる推定では、世界の女性の悪性腫瘍の13％（53万人）にHPVの感染が関わっており、3億人がHPVのキャリアーであるとみられている（非特許文献４参照）。
　ウイルス増殖に関する研究では、HPV感染細胞の分裂時にHPVゲノムは複製し、娘細胞に分配される。潜伏感染細胞が表皮形成の分化を始めると、分化終盤でウイルス増殖が起こる。しかしながら、HPVは、ウイルス粒子として分離されることは珍しく、ゲノムDNAのみがクローニングされている。これまでにHPVはカプシドタンパク質（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて、100種類以上の遺伝子型に分類されている。HPVは、その遺伝子型により感染部位や発症する病気が異なり、皮膚病変に検出されるもの（上皮型）と粘膜病変に検出されるもの（粘膜型）に大別され、更に、粘膜型のHPVは、種々の癌に検出される高リスク型と良性の尖形コンジローマ等の原因となる低リスク型に分類される。高リスク型HPVには、子宮頸がん、肛門周囲がん及び陰茎がんなどから検出される16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82型が含まれ、低リスク型HPVには、6及び11型等が含まれる（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
　HPV感染予防ワクチンに関しては、2006年6月に米国メルク社により開発されたHPV6, 11, 16, 18型のウイルス様粒子（VLP）を混合したワクチン「商品名Gardasil（登録商標）（ガーダシル）」がアメリカ食品医薬品局（FDA）により承認され、2007年5月に英国グラクソ・スミスクライン社により開発されたHPV16, 18型のVLPを混合したワクチン「商品名Cervarix（サーバリクス）」が、オーストラリアの医薬品審査当局（TGA）により承認された。日本では、2009年10月にCervarix、2011年7月にGardasilが承認されている。
　これらは第一世代ワクチンと呼ばれ、L1タンパク質をコードする遺伝子を酵母菌や昆虫細胞に発現させ、VLPを作らせ、これにアジュバントを加えたものである（非特許文献６参照）。いずれも特定の遺伝子型により引き起こされる癌に対して承認されたものであり、Gardasilなら6、11、16及び18型、Cervarix なら16及び18型以外では、ごく一部の型に対する予防効果しか認定されていない（非特許文献新１２）。したがって、HPV感染阻止、その後に誘発される癌の発症をより効率良く抑制するために、あらゆる種類の型のHPV感染に有効に働くワクチンの開発が求められる（非特許文献５及び非特許文献６参照）。
　かかる試みの一つとして、神田らの報告がある。彼らは、HPV16型のL2の64-81位及び108-120位のアミノ酸配列中に高リスク型HPVに共通の中和エピトープが存在すること、及びHPV16型のL2由来のペプチドを16型HPVのL1に挿入したキメラ蛋白の集合体であるVLPは、HPV16型、18型、31型、33型、35型、52型及び6型の感染を阻害することを明らかにした（特許文献１及び特許文献２参照）。更に、18-38位、56-75位及び96-115位の各L2ペプチドをL1に挿入したキメラタンパク質からなるVLPについても同様の報告を行っている（非特許文献１３参照）。一方で、挿入ペプチドの長さが、エピトープ部分の抗原としての提示に影響することも報告している（特許文献１）。
　HPVのL1以外に、種々の粒子形成能を有するタンパク質に外来ペプチドを付加又は挿入して得られるキメラタンパク質の粒子形成やワクチンとしての有用性に関する研究が報告されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の表面タンパク質（HBsタンパク質）のN末又はC末にHPV16型のL2の一部からなるペプチド（N末より50－220アミノ酸領域及び100－220アミノ酸領域）を付加したキメラ蛋白質をマウスに免疫し、ELISAでL2及びHBsに対する抗体の上昇があることを確認している（特許文献７参照）。その他、HBsタンパク質の親水性領域やHBsAg-Sの外側ループ内の露出部位に外来遺伝子を挿入して得られるキメラタンパク質（特許文献３及び特許文献４参照）、及びHBsタンパク質のN末側に外来ペプチドを結合させたキメラタンパク質のVLP形成に関する報告がある（特許文献５及び特許文献６参照）。
　HBsタンパク質は、酵母由来の組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンの有効成分として使用されるなど、ワクチンとしての効果や安全性が高いことが実証されている（非特許文献７参照）。しかしながら、外来ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質からなるVLPは、挿入される外来ペプチドの種類や長さの違いにより、VLPの安定性、細胞からの発現効率、発現されたものの構造変化等に影響を及ぼすこともあり（特許文献４参照）、必ずしも、ワクチンとしての有用性が担保されるものではない。
WO2005/097987号公報 特開2007-45746号公報 特開平8-198897号公報 特表2004-504067号公報 特開2011-115042号公報 特開2007-209343号公報 WO2010/001409号公報
ウイルス第56巻第2号，pp219-230, 2006 医学のあゆみVol.224 No9:669-680, 2008 Munoz, N. et al.: New Engl J Med, 348, 518-527, 2003. Monitoring of Cancer Incidence in Japan MCIJ2007 March 2012 ウイルス第58巻第2号, pp155-164，2008 産科と婦人科 73（2）:217-225，2006 国立感染症研究所　Ｂ型肝炎ワクチンに関するファクトシート（平成２２年７月７日版） Kawana. K, et al.: Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999（L2の106-121） Ivonne Rubio et al. : Potent anti-HPV immune responses induced by tandem repeats of the HPV16 L2 (20-38) peptide displayed on bacterial thioredoxin. Vaccine, 27, 1949-1956, 2009 Fujiyama, A. et al.: Nuc. Acid Res., 11(13), 4601-4610, 1983 Christophe, M. et al.: Emer. Inf. Dis., 14(11), 1777-1780, 2008 日本耳鼻咽喉科学会会報 Vol. 115 No. 2, 73-84, 2012 Kondo, K et al.: Journal of Medical Virology 80:841-846 (2008)
　本願発明の目的は、HPVのカプシド構成要素の一つでL2と呼ばれるタンパク質（以下、「L2タンパク質」と称することもある）の特定領域の20個のアミノ酸配列からなるペプチドを、HBsタンパク質のN末側又はC末側に付加又はHBsタンパク質内部に挿入して得られるキメラタンパク質を有効成分とする、ヒトパピローマウイルス感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチンを提供することにある。
　本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、HPV16型のL2タンパク質の56-75位のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号４；Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu）を、HBsタンパク質のN末側又はC末側に付加して得られるキメラタンパク質、及びHBsタンパク質内部に挿入して得られるキメラタンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)を形成し、HBsタンパク質及び該ペプチドに対する（中和）抗体を誘導することを発見した。特にC末側に付加したキメラタンパク質により産生された抗体は、該ペプチドに対する抗体を早期に誘導すること、HBsタンパク質及び該ペプチドの両方に強く結合すること、且つ該抗体は、多種のHPV型由来のL2ペプチドと結合すること、また、HBs内部に挿入されたキメラタンパク質により産生された抗体は、該ペプチド内の２箇所のアミノ酸配列（Ｎ末側及びＣ末側エピトープ）を認識する抗体を誘導することを見出し、本願発明を完成するに至った。
　本願発明に従えば、HPV L2タンパク質の特定領域の7～20個のアミノ酸配列を含むペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質、該キメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断片、該DNA断片が組み込まれた発現ベクター（ウイルスベクターを含む）、該発現ベクターを有する宿主、該キメラタンパク質及び該DNA断片を用いたHPV感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチン、並びに該ワクチンの製造方法が提供される。
　本願発明のキメラタンパク質及び該キメラタンパク質をコードするDNAを有する発現ベクターは、Ｂ型肝炎及び／又はHPV感染症の予防や治療に有効に利用され得るものである。したがって、本願発明は、以下の通りである。
〔１〕ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、（２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質。
〔２〕HPV-L2ペプチドが、コア配列領域からなる、〔１〕に記載のキメラタンパク質。
〔３〕前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号３）で示される配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔４〕前記コア配列領域が、下記（１）～（６）から選択されるアミノ酸を有する配列である、〔３〕に記載のキメラタンパク質。
（１）X1aaが、Thr又はSerである、
（２）X2aaが、Ser, Thr又はAlaである、
（３）X3aaが、Thr又はSerである、
（４）X4aaが、Ser, Thr又はAlaである
（５）X5aaが、Ile又はValである、及び
（６）X6aaが、Leu又はIleである
〔５〕前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）からなるアミノ酸配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔６〕前記キメラタンパク質が、１～11個のHPV-L2ペプチドを含む、〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔７〕前記ペプチドが、HBsタンパク質のN末端アミノ酸、配列番号２の127-128位、又はC末端アミノ酸の少なくとも一箇所に付加又は挿入された、〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔８〕前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔９〕前記ペプチドが、HBsタンパク質のC末端アミノ酸に付加された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔１０〕前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入及びC末端アミノ酸に付加された、〔７〕に記載のキメラタンパク質。
〔１１〕ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、20アミノ酸からなり、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）なるアミノ酸配列に対する相同性が50-100%、70-100%又は80-100％である、前記キメラタンパク質。
〔１２〕〔１〕ないし〔１１〕のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
〔１３〕前記DNA断片にコードされるキメラタンパク質を発現することができる発現ベクター。
〔１４〕前記発現ベクターで形質転換したキメラタンパク質産生宿主。
〔１５〕〔１〕ないし〔１１〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
〔１６〕〔８〕に記載のキメラタンパク質及び〔９〕に記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
〔１７〕〔１３〕に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用DNAワクチン。
〔１８〕下記（１）ないし（５）の工程を含む、ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチンの製造方法；
（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるHPV-L2ペプチド、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のHPV-L2ペプチド、または、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片を調製する工程、
（２）前記（１）のDNA断片を有する発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（３）前記（２）により得られる形質転換宿主をGeneticin及びMTXの存在下で培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
（４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
（５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤を添加して、ワクチンとする工程。
　本願発明の態様の一つであるGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-LeuからなるペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質は、該ペプチドとHBsタンパク質の両方の抗体産生能を有するので、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎の予防薬の好適な材料となり得る。特に、該ペプチドをHBsタンパク質のC末側に付加させた場合、宿主における発現量の増加だけでなく、該ペプチドの免疫能力の増強（早期の抗体誘導）が認められ、また、HBsタンパク質の内部に挿入した場合、該ペプチド内の少なくとも２箇所のアミノ酸配列に対する抗体を誘導することができる点において、ワクチンの生産性を高め、品質を向上させるのに有用である。
　また、上記ペプチドのN末側６個のアミノ酸配列は、HPVの株間でよく保存されており、多くのHPV型に有効である。事実、実施例に示されるように、本願発明のキメラタンパク質により誘導される抗体は多くの型のHPVと反応する。したがって、本願発明に従えば、従来の型特異的なワクチンとは異なり、より広いスペクトルを持ったワクチンの提供が可能となる。
図１は、抗HBsモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAにより、形質転換細胞の培養上清中のキメラタンパク質濃度を測定した結果を示す図面である。 図２は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と同じ遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。 図３は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（個体別血清）と同じ遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。 図４は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と異なる遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドとの反応性を示す図面である。 図５は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）中のHBs抗体価の測定結果を示す図面である。 図６は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）のエピトープ解析を行った結果を示す図面である。 図７は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）と異なる遺伝子型由来のHPV-ウイルス様粒子（VLP）との反応性を示す図面である。 図８-1は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV16-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。 図８-2は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV18-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。 図８-3は、キメラタンパク質で免疫したマウス血清（プール血清）の異なる遺伝子型由来のHPV35-偽ウイルス（PsV）に対する中和能を評価した結果を示す図面である。
　本願発明の特徴は、HPV群間で極めてよく保存されたHPVのL2タンパク質由来のペプチドとＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎を予防するためのワクチンの有効成分とすることにある。
　前述したように、HPVはウイルス粒子として回収することが難しく、カプシド（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて遺伝子型が決定されており、これまでに100種類以上の遺伝子型が分離されている。例えば、HPVの16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82型が高リスク型のHPV群に、HPVの6及び11型が低リスク型のHPV群に分類される。HPVのL2タンパク質には、高リスク型のHPV群間で極めてよく保存されたアミノ酸配列からなる領域（以下、「コア配列領域」と称することもある）が存在しており、低リスク型のHPV群においても同様のコア配列領域が存在する。該コア配列領域からなるHPV L2タンパク質由来のペプチド（以下、「HPV-L2ペプチド」と称することもある）が本願発明に使用される。このようなコア配列領域として、HPV16，31及び35型では56～75番目の20アミノ酸、HPV39，45，51，52，56，58，66及び6型では55～74番目の20アミノ酸、HPV73型では57～76番目の20アミノ酸、及びHPV11型では54～73番目の20アミノ酸が挙げられる。これらの20アミノ酸の配列は、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）なる式で表示できる（配列番号３）。前記の任意のアミノ酸は、HPV株の型間で変異が認められる部位であり、
（１）X1aaはThr又はSer、
（２）X2aaはSer, Thr又はAla、
（３）X3aaはThr又はSer、
（４）X4aaはSer, Thr又はAla、
（５）X5aaはIle又はVal、及び
（６）X6aaはLeu又はIle
から選択される。
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるHPV-L2ペプチドを、動物に免疫して得られた抗体は、一部に変異を有するコア配列領域のペプチドとも反応することから、HPV株の型間で全く変異が見られないN末側から6個のアミノ酸配列（Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly）に共通のエピトープが存在することは容易に推認される（実施例６参照）。したがって、本願発明に用いられるHPV-L2ペプチドは、20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチドに加えて、該6アミノ酸からなるペプチド及び該6アミノ酸からなるペプチドのN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された種々のコア配列領域内のペプチドを包含する。
　さらに、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加されたペプチドも本願発明に使用することが可能であり、HPV-L2ペプチドはこれらのペプチドを包含する。好ましくは、該HPV-L2ペプチドのアミノ酸の総数は70個以下である。
　該共通エピトープを有するコア配列領域からなるHPV-L2ペプチドは、いずれも本願発明に使用できるが、配列番号４のアミノ酸配列に対して50-100%、70-100%又は80-100%の相同性を有する、20アミノ酸からなるペプチドを用いるのが好ましい。更に好ましくは、上記の式（配列番号３）で示されるHPV-L2ペプチドのアミノ酸置換体が用いられる。最も好ましくは、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるHPV-L2ペプチドである。
　また、HPV-L2ペプチドは、後述の条件（抗原活性及び粒子形態の維持）を満たすものであれば、上記6アミノ酸又は該6アミノ酸のN末側及び／又はC末側にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された7～19アミノ酸、及び20アミノ酸からなるコア配列領域のN末側又はC末側に更にHPV-L2タンパク質由来のアミノ酸が付加されたものも包含する。
　上記のアミノ酸置換体とは別に、HPV-L2ペプチドにシステイン(Cys)を付加又は挿入したHPV-L2ペプチド改変体も本願発明の一態様である。一般に、ペプチド単独で動物を免疫した場合は強い免疫効果を得ることは難しいので、キャリア（例えば、KLH）と結合させ、更にはアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）を添加し使用する。あるいは、ペプチド自体の免疫付与能力を高めるために該ペプチドのN末側、C末側、及び／又は内部にシステイン（Cys）を付加又は挿入することが行われる（WO 2010/044464 A1及びWO 2011/024748 A1参照）。例えば、インフルエンザウイルスA型のM2のアミノ酸配列のうち、2～24番目の23アミノ酸から成るペプチドにシステイン残基を挿入したM2ペプチドは、未修飾のM2ペプチドよりも高い免疫原性（2倍から20倍）を有することが報告されている（WO 2011/024748 A1参照）。Cysへの置換やCysの付加により同様の効果が期待される場合は、本願発明のHPV-L2ペプチドにおいてもHPV群間の共通エピトープが保存される条件下でHPV-L2ペプチドの１～数個のアミノ酸をCysに置換又は付加しても良い。具体的には、HPV-L2ペプチドは、N末側6個のアミノ酸はHPV群間で全く同じ配列を有するので、該アミノ酸配列以外の部位にCysを付加又は挿入するのが好ましい。以下、改変、未改変の区別が不要な場合は、これらを総合して、単に、HPV-L2ペプチドと称することもある。
　HPV-L2ペプチドのHBsタンパク質への付加又は挿入部位は、HPV-L2ペプチド及びHBsタンパク質に対する免疫原性が維持されるのであれば、いずれの部位であっても良い。好ましくは、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質が粒子を形成し、且つ、HPV-L2ペプチドが該粒子の表面に位置することが好ましい。かかる候補として、HBsタンパク質のN末端側、C末端側、及びHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）が挙げられる。好ましくは、HPV-L2ペプチドは、HBsタンパク質のC末端側に付加及び／又はHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入される。
　HBsタンパク質のC末端側に該ペプチドを付加することにより、該ペプチドに対する抗体を早期に誘導することができ、HBsに対する高い抗体価も維持できる（実施例１及び実施例７）。また、HBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入することにより、HBsに対する抗体誘導は低下するものの、該ペプチド内の２箇所のアミノ酸配列（２つのエピトープ）を認識する抗体が誘導される。これは、種々のHPV株に対して、よりスペクトルの広い抗体が誘導されることを意味する（実施例８）。したがって、より効果的にHPVに対する抗体を誘導するためには、HPV-L2ペプチドをHBsタンパク質のC末端側に付加し、且つHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入するのが好ましい。同様の効果は、HPV-L2ペプチドをHBsタンパク質のC末端側に付加したキメラタンパク質と該ペプチドをHBsタンパク質内部の特定部位（配列番号２の127-128位）に挿入したキメラタンパク質の混合物を免疫原とすることにより得られる。この場合、HBsタンパク質に対して、より高い抗体価の誘導が期待される。最適な効果を得るための両キメラタンパク質の混合比は、通常の方法により適宜調節すれば良い。
　外来ペプチドをHBsタンパク質のN末端側に付加する場合、該ペプチドは20～70個のアミノ酸であることが好ましい。このサイズより大きいと粒子形成に影響を与える可能性があり、このサイズより小さいと抗原としての活性が低下する可能性がある。したがって、本願発明では抗原活性及び粒子形態が維持されるのであれば、HPV-L2ペプチドを連結して用いることができる。コア配列領域からなるHPV-L2ペプチド（20アミノ酸）の場合、2～3個を連結して用いることができる。
　前述したように、本願発明にはコア配列領域からなるHPV-L2ペプチドのN末側又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された、全長21～70個のアミノ酸からなるペプチドを使用することができるが、アミノ酸の数が21～35個の場合、該HPV-L2ペプチドを２個連結することができる。
　また、コア配列領域内の共通エピトープ配列（Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly）及び該共通エピトープ配列を有する6～19アミノ酸からなるペプチドの場合、アミノ酸の総数が20～70個となるようにペプチドサイズに応じて2～11個のHPV-L2ペプチドを連結して用いることができる。
　また、付加または挿入ペプチドのサイズが70アミノ酸までの範囲内ならば、HPV-L2ペプチドに加えて、他のペプチドを付加又は挿入しても良い。例えば、前述のM2ペプチドを付加又は挿入することにより、HPV感染症、Ｂ型肝炎及びインフルエンザに有効な三価ワクチンとすることができる。
　本願発明のHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質は以下の方法により、取得することができる。まず、キメラタンパク質の母体となるHBsタンパク質をコードする遺伝子（HBs遺伝子）が作製される。HBs遺伝子の塩基配列は、これまでに多くの特許文献、非特許文献及びデーターベース（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）に開示されているので、該HBs遺伝子の塩基配列に基づいてSambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）を利用して容易に取得することができる。また、使用するHBs抗原は、Large、middle及びsmallのいずれを使用しても良い。
　次に、PCR法やDNA合成を用いた方法により、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片（以下、「キメラタンパク質DNA断片」と称することもある）が調製される。例えば、PCR法により、HBsタンパク質のN末側又はC末側にHPV-L2ペプチドを付加したキメラタンパク質DNA断片を調製するときは、HPV-L2ペプチドをコードする塩基配列及びHBs遺伝子の一部の塩基配列からなるプライマーとHBs遺伝子のもう一方のプライマー（どちらがN末側にくるかで、プライマーの方向が決定される）が用いられる。HBsタンパク質の内部にHPV-L2ペプチドを付加したキメラタンパク質DNA断片を調整する場合も同様の操作が行われる。
　HPV-L2ペプチドをコードする塩基配列及びHBs遺伝子の塩基配列に基づき設計されるPCR用プライマーは、DNA合成受託機関（例えば、QIAGEN 社）などに依頼すれば容易に入手可能である。このとき、目的に応じて5'側に KOZAK 配列（Kozak M, J.Mol.Biol., 196, 947 (1987)）や5'及び3'末側に適切な制限酵素認識部位の塩基配列が付加される。PCRにより増幅したDNA断片は、クローニングベクター、例えば、pUC119（タカラバイオ社）、pBlueScript（アジレント・テクノロジー社）、又はpCRII-TOPO（Invitrogen社）等にクローニングし、DNAシークエンサー（ABI Prism 377　アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列の決定が行われる。目的のキメラタンパク質DNA断片の確認は、得られた塩基配列の結果と、設計されたPCR用プライマー配列及び既存のHBs遺伝子の塩基配列とを比較することにより行われる。
　こうして得られた本願発明のキメラタンパク質DNA断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入することによって、キメラタンパク質DNA断片の発現が行なわれる。発現ベクターとしては、プラスミドやウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、Lac、tac、pho5、adh、SV40初期、SV40後期、及びβアクチンなどのプロモーターから選択することができる。宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが常用されるが、使用目的にあわせて選択すればよい。宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すれば良い。
　本願発明では、国立感染症研究所（神田博士及び森博士）から分与された組換えバキュロウイルスベクター（調製例参照）を制限酵素で切断することにより、目的のキメラタンパク質遺伝子、すなわち、HBsタンパク質のN末端、C末端及び内部（配列番号２の127-128位の間）のいずれかにHPV-L2ペプチド（配列番号１の56～75番目の20アミノ酸）が付加又は挿入されたキメラタンパク質DNA断片を取得した。次いで、各キメラタンパク質DNA断片を動物細胞用発現プラスミドpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo（WO2003/004641参照）に組み込み、該発現プラスミドをリン酸カルシウム法変法によりチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の形質転換処理を行った。
　本願発明のキメラタンパク質を発現している形質転換細胞は、以下の２段階の方法でスクリーニングされる。まず、形質転換処理を行った細胞を10～1,000 nmolのLメトトレキサート（MTX）と100～1,000 μg/mLのジェネティシン（Geneticin G418 sulfate）を含む培地で一定期間培養して生存する細胞を選択／増殖させることにより形質転換細胞を選択する。ついで、得られた形質転換細胞中にキメラタンパク質が発現している該細胞が選択される。具体的には、本発明のキメラタンパク質は、培養上清や細胞破砕物につき、HPV-L2ペプチド又はHBsタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてELISAやWB等を行うことにより確認される。
　形質転換細胞の培養には、通常の細胞を培養するときに用いられる条件を用いれば良い。すなわち、T7m培地、Ex-cell SP2/0培地、YMM-01B培地、YMM-01C培地、OptiCHO培地、Ex-cell 302培地等、あるいはこれらのいくつかを混合した培地が使用される。これに、ウシ胎児血清、カルシウム、マグネシウム、アミノ酸、ビタミン等を添加することもある。培養温度は32℃～38℃、培養期間は2～20日間である。医薬品を製造する段階では、キメラタンパク質発現細胞を無血清培地で維持するのが好ましい。　
　本願発明のキメラタンパク質の精製は、タンパク質化学において通常使用される方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などを適宜組み合わせることにより達成される。得られたキメラタンパク質の量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、プロテインアッセイキット（日本バイオ・ラッド株式会社）などを用いて測定される。
　本発明のキメラタンパク質は、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質を個別に発現させるか化学合成した後、それらを化学的に結合させたものであっても構わない。個別に発現させる際には、化学合成したDNA配列やプラスミドに挿入されたDNA配列を鋳型として、公知の遺伝子増幅方法で増幅させ、上記の方法でそれぞれの発現プラスミドを構築することが可能である。発現プラスミドは上記のように宿主に導入して、目的のペプチドやタンパク質を入手することが可能である。
　化学的に結合させる場合にはクロスリンカーを用いて結合させる方法が例示される。その場合、タンパク質やペプチドに存在するアミノ基、チオール基（SH基）、糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。さらにビオチンやアビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合すること方法も例示される。
　本願発明のキメラタンパク質のワクチンとしての評価は、抗原を小動物、例えば、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、又はサルなどに免疫した後、in vitroの系においては、免疫動物から採血後、血清を分離し、当該血清中の本発明のキメラタンパク質に対する抗体力価やHPV及びＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫動物に擬似HPVを投与し、その後免疫動物の生死、病状等を観察することにより行われる。一般にin vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。より具体的には、B型肝炎ウイルスに対する中和抗体はHBs抗体を測定することにより、また、HPVに対する中和抗体は、ウイルス様粒子（Virus like particle：VLP）や感染性偽ウイルス（Buck C B等、Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.）との結合能を測定することにより行われる。
　免疫方法（例えば、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経口、及び舌下等の投与部位、及び免疫期間等）は、ワクチン等の免疫原性を調べる時に常用される一般的な免疫手法が用いられる。免疫に用いる抗原には、その免疫能を高めるためにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、CpGオリゴヌクレオチド、MDP、QS21、MPL+TDMエマルジョン等、ヒトに対して使用できるものであればいずれのアジュバントを添加しても良い。更に抗原の安定性や形状維持のために医薬品の用途として許容できる種々の添加剤を加えることもある。このような添加剤として、安定化剤（アルギニン、ポリソルベート80、マクロゴール4000など）、賦型剤（マンニトール、ソルビトール、ショ糖、及び乳糖）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウムなど）、保存剤（チメロサール、フェノキシエタノールなど）、不活化剤（ホルマリン、β－プロピオラクトンなど）等が挙げられる。
　こうして得られる本発明のキメラタンパク質は、HPV感染及びＢ型肝炎の増殖阻止に有効な抗体産生能を有するものであり、HPV感染及びＢ型肝炎の予防薬の材料として、あるいはHPV及びB型肝炎ウイルスの検出系（例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、及びドットブロット法等の抗体測定法による検出系）を構築するための材料として使用することができる。
　また、キメラタンパク質をコードするDNA断片が、生体内に投与されたときに該キメラタンパク質を発現できる発現ベクターを用いてDNAワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして大腸菌由来のプラスミドが挙げられる。該プラスミドには哺乳類の細胞内で遺伝子を発現させるため、その上流に真核生物における強力なプロモーター、例えば、サイトメガロウイルスのIE(immediate-early)プロモーター、β-actinプロモーター、CAGプロモーター等が配される。また、該DNA断片をウイルスや細菌などに導入すれば、生ワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして、ウイルス（ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻しんウイルスベクター等）、細菌（サルモネラベクター等）、原虫（マラリア原虫ベクター等）等が挙げられる。例えば、本発明のキメラタンパク質をコードするDNA断片が組み込まれたワクシニアウイルスベクター（LC16m8株）を用いた場合、弱毒生ワクチンとしての機能だけでなく、痘瘡ワクチンとしての効果が期待できる。弱毒生ワクチンは、ワクチン材料の精製工程が簡略化でき、製造コストの低減に繋がる。HBsタンパク質が組み込まれた組換えワクシニアウイルスは、HBsタンパク質のみで構成された粒子を発現する（Vaccine 1987 Mar;5(1):65-70）。したがって、本願発明のキメラタンパク質DNA断片が組み込まれた組換えワクシニアウイルス（LC16m8株）は、同様に粒子を形成することが予測され、HPV-L2ペプチドの強い免疫原性が保持された弱毒生ワクチンとなることが期待される。
　また、本願発明のキメラタンパク質を有効成分とするワクチンは、単独でHPV感染及びＢ型肝炎を予防するための二価ワクチンとして使用してもよく、他のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス等）、細菌（例えば、ヘモフィルスインフルエンザ菌、破傷風菌、ジフテリア菌等）及び原虫（例えば、マラリア等）感染症に対するワクチンよりなる群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることにより多価混合ワクチンとして使用することもできる。
　以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
　（調製例）
《HPV L2 56/75－HBsキメラ遺伝子の構築～バキュロウイルス発現プラスミド構築》
　HPV16型のカプシドL2のアミノ酸番号56から75の20アミノ酸をHBsのN末、アミノ酸番号127と128の間、C末に導入する3種のキメラタンパク質をコードする遺伝子及び対照のHBs遺伝子を構築し、バキュロウイルス発現プラスミドに導入した。
（１）N末導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nの構築
　HBs酵母発現プラスミドpYG100L（T. Imamura, et al., J. Virol. , 61, 3543-3549p, 1987）をテンプレートに以下のPrimer NF、Primer Rを用いてPCRにより増幅した。
Primer NF；5'-gtcgacATGGGTGGGTTAGGAATTGGAACAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGAGAACACAACATCAGGATT（配列番号18）
Primer R；5'-ctgcagTTAAATGTATACCCAAAGAC（配列番号19）
　アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約750bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1 (Invitrogen)の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質のN末端にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56～75番目の20アミノ酸）が付加されたキメラタンパク質（以下、「56/75-N末導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有する発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nを構築した。
（２）HBs アミノ酸127-128位導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-127の構築
　先述のpYG100Lをテンプレートに、以下に記したPrimer F及びPrimer 127RでPCR増幅した断片、及びPrimer 127Fと先述のPrimer RでPCR増幅した断片を得た。Primer F、Primer 127R、Primer 127Fの配列を以下に示した。
Primer F；
5'-gtcgacATGGAGAACACAACATCAGG（配列番号20）
Primer 127R；
5'-TCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCA（配列番号21）
Primer 127F；
5'-CAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGCTCAAGGAACCTCTATGT（配列番号22）
　それぞれ増幅した断片を等量混合し、プライマーFとプライマーRで再度PCR増幅することでそれぞれの断片を接続した約750 bpの遺伝子断片を得た。この遺伝子を制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質の内部（配列番号２の127-128位の間）にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56～75番目の20アミノ酸）が挿入されたキメラタンパク質（以下、「56/75-127位導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有するpFB1-HBsS56/75-127を構築した。
（３）C末導入キメラ遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nの構築
　先述のpYG100Lをテンプレートに、先述のPrimer Fと以下に示したPrimer CRを用いてPCR増幅した。
Primer CR；
5'-ctgcagTTACAATGGAATATACCCAGTGCGTCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAATGTATACCCAAAGACAAA（配列番号23）
　アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約750 bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質のC末端にHPV-L2ペプチド（配列番号１の56～75番目の20アミノ酸）が付加されたキメラタンパク質（以下、「56/75-C末導入キメラ」と称することもある）をコードするDNA断片を有する発現プラスミドpFB1-HBsS56/75-Nを構築した。
（４）HBs遺伝子の構築とバキュロウイルス発現プラスミドpFB1-HBsSの構築
　対照のHBs遺伝子に関しても遺伝子両端に制限酵素認識部位を導入する目的で、先述のpYG100Lをテンプレートに、Primer FとPrimer Rを用いてPCR増幅した。アガロースゲル電気泳動で目的サイズの約690 bpのバンドを確認した。このバンドを制限酵素Sal I-Pst Iで消化し、バキュロウイルス発現プラスミドpFastBac1の制限酵素Sal I-Pst I消化断片に導入し、HBsタンパク質をコードするDNA断片を有する、HBs発現プラスミドpFB1-HBsSを構築した。
《動物細胞発現プラスミドの構築》
　調製例に記載の（１）～（４）の発現プラスミドを制限酵素Sal I、Xho Iで消化し、HPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片及びHBsタンパク質をコードするDNA断片をアガロース電気泳動にて抽出した。（１）～（４）から得られたDNA断片をそれぞれ56/75-N末導入キメラDNA断片、56/75-127位導入キメラDNA断片、56/75-C末導入キメラDNA断片、及びHBsDNA断片と称する。
　次いで、上記の各DNA断片と、予め制限酵素 Sal Iで消化し、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ処理により末端脱リン酸化した動物細胞用発現プラスミドpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo（WO2003/004641）をLigation High（東洋紡）で連結環状化し、56/75-N末導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-N.dhfr.neo）、56/75-127位導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-127.dhfr.neo）、56/75-C末導入キメラ動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-C.dhfr.neo）及びHBs動物細胞発現プラスミド（pCAGG.HBs56/75-N.dhfr. neo）を構築した。
《チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いたキメラ遺伝子の発現》
　実施例１で得た4種の動物細胞発現プラスミドをそれぞれ制限酵素Pvu Iで消化し線状化した。この線状化したプラスミドを用いて、CHO K1（FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968）をリン酸カルシウム法変法（C. Chen et al. , Mol. Cell. Biol. , 7, 2745- 2752p, 1987）で形質転換処理した。形質転換処理後、100、200、500 nmol/Lメトトレキサート（MTX）と500 μg/mLのジェネティシンを含む透析ウシ胎児血清、及びカルシウム、マグネシウム添加したYMM-01C培地（核酸不含MEMアルファ培地にアミノ酸、ビタミンを強化し、カルシウム、マグネシウムを含まない自家調製培地；以下、「選択培地」と称する）で形質転換体を選択した。
得られた形質転換体を、0.25%トリプシンを用いて細胞剥離し、先述の選択培地を用いて細胞の拡張を行った。拡張後、PBS(-)で洗浄し、無血清培地（T7m:Ex-cell SP2/0;YMM-01B 3種混合培地（SAFC社製特注培地））に培地交換した。37℃で11日間培養後、培養上清中の発現タンパク質の濃度を抗HBsモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAで定量した。その結果、56/75-C末導入キメラの発現量が最も多く、次いで56/75-127位導入キメラ、56/75-N末導入キメラの順であった。56/75-C末導入キメラの発現量は、対照とした未導入HBsタンパク質の2倍以上であった（図１）。
《細胞培養上清からキメラタンパク質の精製》
　実施例２により得られた3種のキメラタンパク質及びHBsタンパク質を発現するCHO K1細胞を選択培地を用いて拡張した。拡張後、PBS(-)で洗浄後、無血清培地（T7m；Ex-cell SP2/0；YMM-01B 3種混合培地）に培地交換し、37℃、10日間以上培養した。培養液を遠心分離で清澄化した後、ベンゾナーゼ（Merck社製）共存下、排除限界1,000 kDaのカートリッジ式UF（ビバセル100；ザルトリウス製）で培養上清を濃縮した。濃縮後、PBS(-)にバッファ置換を実施し、塩化セシウムを1.2 g/Lの密度となるように添加した後、4℃、23,000×gで超遠心分離を行った。キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300ｋDaのUFカートリッジ（ビバスピン；ザルトリウス社製）による脱塩、PBS(-)へのバッファ置換後、60%、50%、40%、20%ショ糖を含むPBS(-)を重層した遠心管にキメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むPBS(-)を加えた不連続密度勾配ショ糖の超遠心分離を行った。4℃、120,000×gの遠心条件で分離を行った後、キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300 kDaのUFカートリッジで脱糖、PBS(-)へのバッファ交換を行った。得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質は、いずれもウイルス様粒子(VPL)を形成していた。
《キメラタンパク質のマウスへの免疫》
　実施例３で得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質にアルミニウムアジュバントを加えて50μg/mlの各免疫原を調製し、各0.1 mlをメスBalb/cマウスの大腿部に筋注した（各群10匹ずつ）。接種後、4週目で採血して得た抗血清（１次免疫血清）及び初回接種から４週目に同免疫原を上記と同様に接種後、８週目で採血して得た抗血清（２次免疫血清）を得た。対照として、非投与群、及びHPV-L2由来配列（配列番号4）のN末端にCysを付加させた合成ペプチドとKLHとのコンジュゲートにアルミニウムアジュバントを添加した免疫原を投与した群を用いた。
《同遺伝子型由来HPV-L2ペプチドと抗血清の反応性》
　実施例４で得られた個体別の１次免疫血清又はこれらのプール抗血清（個体別の抗血清を等量ずつ混合）を用いて、ELISAにより、同遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドに対する抗体産生能を評価した。より具体的には、96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したHPVの16型のL2タンパク質（配列番号１）の56～75番目の20アミノ配列からなる合成ペプチド（配列番号４）(1.0 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（1% BSA、0.05% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100に希釈した各血清を、固相化したペプチドと室温で2時間反応させた。PBST（0.05% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG抗体（Santa Cruz: sc-2031）を加え、室温で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（TMB＋（DAKO社製））を加え、室温で10分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、56/75-C末導入キメラ免疫群では早期に抗体が誘導され、このプール血清は、KLHコンジュゲート免疫群より5倍程度高い抗体価を示した（図２）。また、個体別の抗血清で得られた抗体価の平均値を用いてｔ検定による検証を行った結果、両者間に有意差が認められた(p<0.05)（図３）。また、56/75-127位導入キメラ免疫群及び56/75-N末導入キメラ免疫群の抗血清中にも該合成ペプチドと結合する抗体が確認された。
《異なる遺伝子型由来のHPV-L2ペプチドと抗血清の反応性》
　実施例４で得られた個体別の１次免疫血清又はこれらのプール抗血清（個体別の抗血清を等量ずつ混合）を用いて、実施例５と同様の方法により、異なる遺伝子型由来の共通領域のHPV-L2ペプチドに対する結合能を評価した（HPV18型、HPV59型及びHPV68型は、HPVの16型と同じ配列を有する）。以下のアミノ酸配列で示される合成ペプチドを使用した。なお、以下のアミノ酸配列において、*印はHPV16型と同じアミノ酸であることを示す。
高リスク型
　HPV16-L2-56/75　56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL　　                 （配列番号4）
　HPV31-L2-56/75　56-******S**********V** （2アミノ酸置換）（配列番号5）
　HPV33-L2-55/74　55-**********S******V*I （3アミノ酸置換）（配列番号6）
　HPV35-L2-56/75　56-******S*******S**V** （3アミノ酸置換）（配列番号7）
　HPV39-L2-55/74　55-********T*********** （1アミノ酸置換）（配列番号8）
　HPV45-L2-55/74　55-**********S******V** （2アミノ酸置換）（配列番号9）
　HPV51-L2-55/74　55-**********S********* （1アミノ酸置換）（配列番号10）
　HPV52-L2-55/74　55-********A*S***A**V** （4アミノ酸置換）（配列番号11）
　HPV56-L2-55/74　55-********T*S***A**V** （4アミノ酸置換）（配列番号12）
　HPV58-L2-55/74　55-*****************V** （1アミノ酸置換）（配列番号13）
　HPV66-L2-55/74　55-**********S***A**V** （3アミノ酸置換）（配列番号14）
　HPV73-L2-57/76　57-******S***S******V** （3アミノ酸置換）（配列番号15）
　計12種
低リスク型
　HPV6-L2-55/74 　55-*****************V** （1アミノ酸置換）（配列番号16）
　HPV11-L2-54/73　54-********A*S***A***** （3アミノ酸置換）（配列番号17）
　計2種
　キメラタンパク質免疫群の抗血清は、いずれも上記の全ての合成ペプチドと反応することが確認された。特に56/75-C末導入キメラ免疫群では、他の群と比べ高い抗体価を示した（図４）。
《抗血清中のHBs抗体価の測定》
　実施例４で得られた個体別の１次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、HBsタンパク質に対する抗体価を測定した。該プール抗血清をPBS(-)で10倍段階希釈して（10、100、1,000倍）、B型肝炎ウイルス表面抗体キットEテスト「TOSOH」II（HBsAb；東ソー株式会社）を用いて、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA-360にて抗体価を測定した。
　いずれのキメラタンパク質免疫群においても、HBsタンパク質に反応する抗体が検出された。56/75-N末導入キメラ免疫群及び56/75-C末導入キメラ免疫群は、HBsタンパク質単独免疫群と同様の高い抗体価が得られたが、56/75-127位導入キメラ免疫群では抗体価上昇が約1/10に抑えられていた（図５）。
《抗血清のエピトープ解析》
　実施例４で得られた個体別の２次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下のアミノ酸配列で示される合成ペプチドを用いたELISAにより、HPV-L2ペプチドに対する結合能を評価した。具体的には、HPV16 L2のアミノ酸53から75の配列に、欠失、あるいはアラニン置換をもつ変異ペプチドを、N末端に付加したシステインを介してBSAに結合させたものを抗原として用いた。96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したBSA結合ペプチド(500 ng/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（5% スキムミルク、0.1% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100から1:2500まで段階希釈した各血清を、固相化したペプチドと室温で2時間反応させた。PBST（0.1% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG抗体（Santa Cruz: sc-2031）を加え、室温で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（2mg/mlのo-フェニレンジアミン、及び、0.0065%の過酸化水素水を含む0.1Mクエン酸3ナトリウム、pH4.8）を加え、室温で10分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。
HPV16-L2-14/27　14-SATQLYKTCKQAGT　　　　　　　(配列番号24)
HPV16-L2-53/73　53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTGYI　　(配列番号25)
HPV16-L2-53/70　53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTAAA　　(配列番号26)
HPV16-L2-53/67　53-VFFGGLGIGTGSGTGAAAAAA　　(配列番号27)
HPV16-L2-53/64　53-VFFGGLGIGTGSAAAAAAAAA　　(配列番号28)
HPV16-L2-55/75　55-FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPL　　(配列番号29)
HPV16-L2-58/75　58-AAALGIGTGSGTGGRTGYIPL　　(配列番号30)
HPV16-L2-60/75　60-AAAAAAGTGSGTGGRTGYIPL　　(配列番号31)
HPV16-L2-64/75　64-AAAAAAAAASGTGGRTGYIPL　　(配列番号32)
　その結果、いずれの免疫群も高い抗体価を有し、56/75-127位導入キメラ免疫群では、コア配列領域（20アミノ酸）のN末側及びC末側の２箇所のアミノ酸配列（N末側及びC末側エピトープ）を認識する抗体が誘導され、56/75-N末導入キメラ免疫群及び56/75-C末導入キメラ免疫群では、C末側のアミノ酸配列（C末側エピトープ）を認識する抗体が誘導されることが示された（図６）。
《異なる遺伝子型由来のHPV-ウイルス様粒子（VLP）と抗血清の反応性》
　実施例４で得られた個体別の２次免疫血清（56/75-127位導入キメラ免疫群）を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-VLPに対する結合能を評価した。
（１）VLPの作製
　HPV16、18、31、33、35、51、52、または58のL1、及び、L2発現プラスミドを293FT細胞（Invitrogen）にトランスフェクションした。2日後、細胞をLysis Buffer（0.35% Brij58、0.9mM CaCl2、10mM MgCl2、1μl Benzonaseを含むPBS）に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。終濃度0.8Mになるように5M NaClを加え氷中に10分間静置した後、10,000g、4℃、10分間遠心し、上清を回収した。上清を、27%、33%、39%のiodixanol (0.8M NaCl in PBSで調整)の上に重層し、50,000rpm、16℃、3.5時間超遠心した。超遠心後、VLPを含むフラクションを回収した。
（２）ELISA
　96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したVLP(100 ng/well)を加え、4℃で一晩静置した。ブロッキング溶液（5% スキムミルク、0.1% Tween20を含むPBS）で室温、2時間ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:20から1:20000まで段階希釈した各血清を、固相化したVLPと室温で2時間反応させた。その後、ペプチドを抗原とするELISAと同様の方法で、VLPに結合した抗体を検出した。その結果、全てのHPV-VLPと結合し、HPVに対して広いスペクトルを有することが示された（図７）。
《異なる遺伝子型由来のHPV-偽ウイルス（PsV）と抗血清の反応性》
　実施例４で得られた個体別の２次免疫血清（56/75-127位導入キメラ免疫群）を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-PsVに対する中和能を評価した。
（１）PsVの作製
　HPV16、18、または35のL1、及び、L2発現プラスミドと分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)発現プラスミドを混合し、293FT細胞にトランスフェクションした。2日後に、VLPと同様の方法でPsVを精製した。
（２）中和試験
　細胞培養用培地(10%FBSを含むフェノールレッド不含DMEM)で希釈したPsVと、1:12.5から1:400まで同培地で段階希釈した各血清を等量ずつ混和し、4℃で1時間反応させた。その後、予め96ウェルプレートに準備した293FT細胞（1 × 104個/well）に感染させた。3日後に、培養上清中のSEAP活性を、Great EscAPe SEAP Assay Kit (Clontech)とプレートリーダー（ARVO MX, PerkinElmer）を用いて測定した。その結果、いずれの偽ウイルスに対しても明確な中和活性が認められた（図８-1～図８-3）。
　本願発明のキメラタンパク質は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症及びＢ型肝炎に対する予防薬の材料に利用され得る。

Claims (18)

  1. 　ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、（１）20アミノ酸のコア配列領域からなるペプチド、
    （２）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のペプチド、または（３）コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるペプチドである、前記キメラタンパク質。
  2. 　HPV-L2ペプチドが、コア配列領域からなる、請求項１に記載のキメラタンパク質。
  3. 　前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）（配列番号３）で示される配列である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
  4. 　前記コア配列領域が、下記（１）～（６）から選択されるアミノ酸を有する配列である、請求項３に記載のキメラタンパク質。
    （１）X1aaが、Thr又はSerである、
    （２）X2aaが、Ser, Thr又はAlaである、
    （３）X3aaが、Thr又はSerである、
    （４）X4aaが、Ser, Thr又はAlaである
    （５）X5aaが、Ile又はValである、及び
    （６）X6aaが、Leu又はIleである
  5. 　前記コア配列領域が、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）からなるアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
  6. 　前記キメラタンパク質が、１～11個のHPV-L2ペプチドを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  7. 　前記ペプチドが、HBsタンパク質のN末端アミノ酸、配列番号２の127-128位、又はC末端アミノ酸の少なくとも一箇所に付加又は挿入された、請求項１ないし６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  8. 　前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
  9. 　前記ペプチドが、HBsタンパク質のC末端アミノ酸に付加された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
  10. 　前記ペプチドが、HBsタンパク質の配列番号２の127-128位に挿入及びC末端アミノ酸に付加された、請求項７に記載のキメラタンパク質。
  11. 　ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質であって、HPV-L2ペプチドが、20アミノ酸からなり、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号４）なるアミノ酸配列に対する相同性が50-100%、70-100%又は80-100％である、前記キメラタンパク質。
  12. 　請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
  13. 　前記DNA断片にコードされるキメラタンパク質を発現することができる発現ベクター。
  14. 　前記発現ベクターで形質転換したキメラタンパク質産生宿主。
  15. 　請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
  16. 　請求項８に記載のキメラタンパク質及び請求項９に記載のキメラタンパク質を有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン。
  17. 　請求項１３に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症及び／又はＢ型肝炎用DNAワクチン。
  18. 　下記（１）ないし（５）の工程を含む、ヒトパピローマウイルス（HPV）L2タンパク質由来のペプチド（HPV-L2ペプチド）とＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）とのキメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチンの製造方法；
    （１）20アミノ酸のコア配列領域からなるHPV-L2ペプチド、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる6アミノ酸を有するコア配列領域内のHPV-L2ペプチド、または、コア配列領域のN末側及び／又はC末側にHPV L2タンパク質由来のアミノ酸が付加された70個以下のアミノ酸からなるHPV-L2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片を調製する工程、
    （２）前記（１）のDNA断片を有する発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
    （３）前記（２）により得られる形質転換宿主をGeneticin及びMTXの存在下で培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
    （４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
    （５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤を添加して、ワクチンとする工程。
PCT/JP2013/082094 2012-12-25 2013-11-28 HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン WO2014103608A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014554267A JPWO2014103608A1 (ja) 2012-12-25 2013-11-28 ＨＰＶ／ＨＢｓキメラタンパク質を有効成分とするＨＰＶ感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン
US14/654,910 US20150344529A1 (en) 2012-12-25 2013-11-28 Vaccine for hpv infection and/or hepatitis b comprising hpv/hbs chimeric protein as active ingredient
KR1020157020040A KR20150099601A (ko) 2012-12-25 2013-11-28 HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신
EP13868570.6A EP2940133A4 (en) 2012-12-25 2013-11-28 VACCINE AGAINST HPV AND / OR HEPATITIS B INFECTION CONTAINING CHIMERIC HPV / HBS PROTEIN AS AN ACTIVE INGREDIENT

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-280850 2012-12-25
JP2012280850 2012-12-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014103608A1 true WO2014103608A1 (ja) 2014-07-03

Family

ID=51020702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/082094 WO2014103608A1 (ja) 2012-12-25 2013-11-28 HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20150344529A1 (ja)
EP (1) EP2940133A4 (ja)
JP (1) JPWO2014103608A1 (ja)
KR (1) KR20150099601A (ja)
WO (1) WO2014103608A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017122583A1 (ja) * 2016-01-14 2017-07-20 一般財団法人化学及血清療法研究所 ＨＰＶＬ２ペプチド／ＨＢｓキメラタンパク質を有効成分とするＨＰＶ感染症用ワクチン
JP2020536489A (ja) * 2017-08-16 2020-12-17 オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｈｐｖワクチン

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
TWI827732B (zh) * 2018-12-24 2024-01-01 大陸商遠大賽威信生命科學（南京）有限公司 用於治療b型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08198897A (ja) 1985-05-02 1996-08-06 Inst Pasteur ＨＢｓ抗原の免疫原特性を有し、ＨＢｓ抗原により担持されたエピトープに対して外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子の産生法
JP2000249704A (ja) * 1998-12-28 2000-09-14 Sekisui Chem Co Ltd ウイルス抗原の調製法
WO2003004641A1 (fr) 2001-07-06 2003-01-16 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique
JP2004504067A (ja) 2000-07-31 2004-02-12 ザ・クラウン・イン・ザ・ライト・オヴ・ザ・クイーンズランド・デパートメント・オヴ・ヘルス 改良されたウイルス様粒子
WO2005097987A1 (ja) 2004-04-09 2005-10-20 Japan Health Sciences Foundation 粘膜指向性ヒトパピローマウイルス群の感染予防ワクチン抗原
JP2007045746A (ja) 2005-08-10 2007-02-22 Japan Health Science Foundation 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原
JP2007209343A (ja) 1991-11-16 2007-08-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa マラリア原虫由来のＣＳおよびＨＢｓＡｇ間のハイブリッド蛋白質
WO2009001867A1 (ja) * 2007-06-26 2008-12-31 Japan Health Sciences Foundation 高リスク群ヒトパピローマウイルスに対する交差性中和抗体を誘導するワクチン抗原
WO2010001409A2 (en) 2008-06-09 2010-01-07 Bharat Biotech International Limited Vaccine composition useful for hpv and hepatitis b infections and a method for preparing the same
WO2010044464A1 (ja) 2008-10-16 2010-04-22 財団法人化学及血清療法研究所 改変アミロイドβペプチド
WO2011024748A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 一般財団法人化学及血清療法研究所 インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン
JP2011115042A (ja) 2008-03-13 2011-06-16 Hamamatsu Univ School Of Medicine ＨＢｓペプチド融合体
JP2012530505A (ja) * 2009-06-25 2012-12-06 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）タンパク質構築物及びｈｐｖ疾患の予防におけるそれらの使用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY158325A (en) * 2007-11-02 2016-09-30 Univ Johns Hopkins Multitype peptide compositions and methods for treatment or prevention of human papillpmavirus infection

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08198897A (ja) 1985-05-02 1996-08-06 Inst Pasteur ＨＢｓ抗原の免疫原特性を有し、ＨＢｓ抗原により担持されたエピトープに対して外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子の産生法
JP2007209343A (ja) 1991-11-16 2007-08-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa マラリア原虫由来のＣＳおよびＨＢｓＡｇ間のハイブリッド蛋白質
JP2000249704A (ja) * 1998-12-28 2000-09-14 Sekisui Chem Co Ltd ウイルス抗原の調製法
JP2004504067A (ja) 2000-07-31 2004-02-12 ザ・クラウン・イン・ザ・ライト・オヴ・ザ・クイーンズランド・デパートメント・オヴ・ヘルス 改良されたウイルス様粒子
WO2003004641A1 (fr) 2001-07-06 2003-01-16 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique
WO2005097987A1 (ja) 2004-04-09 2005-10-20 Japan Health Sciences Foundation 粘膜指向性ヒトパピローマウイルス群の感染予防ワクチン抗原
JP2007045746A (ja) 2005-08-10 2007-02-22 Japan Health Science Foundation 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原
WO2009001867A1 (ja) * 2007-06-26 2008-12-31 Japan Health Sciences Foundation 高リスク群ヒトパピローマウイルスに対する交差性中和抗体を誘導するワクチン抗原
JP2011115042A (ja) 2008-03-13 2011-06-16 Hamamatsu Univ School Of Medicine ＨＢｓペプチド融合体
WO2010001409A2 (en) 2008-06-09 2010-01-07 Bharat Biotech International Limited Vaccine composition useful for hpv and hepatitis b infections and a method for preparing the same
WO2010044464A1 (ja) 2008-10-16 2010-04-22 財団法人化学及血清療法研究所 改変アミロイドβペプチド
JP2012530505A (ja) * 2009-06-25 2012-12-06 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）タンパク質構築物及びｈｐｖ疾患の予防におけるそれらの使用
WO2011024748A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 一般財団法人化学及血清療法研究所 インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"fact sheet on the hepatitis B vaccine", 7 July 2010
BUCK CB: "Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors", J VIROL, vol. 78, 2004, pages 751 - 757, XP002395982, DOI: doi:10.1128/JVI.78.2.751-757.2004
C. CHEN ET AL., MOL. CELL. BIOL., vol. 7, 1987, pages 2745 - 2752
CHRISTOPHE, M. ET AL., EMER. INF. DIS., vol. 14, no. 11, 2008, pages 1777 - 1780
FT KAO ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 60, 1968, pages 1275 - 1281
FUJIYAMA, A. ET AL., NUC ACID RES., vol. 11, no. 13, 1983, pages 4601 - 4610
IGAKU-NO-AYUMI, vol. 224, no. 9, 2008, pages 669 - 680
IVONNE RUBIO ET AL.: "Potent anti-HPV immune responses induced by tandem repeats of the HPV16 L2 (20-38) peptide displayed on bacterial thioredoxin", VACCINE, vol. 27, 2009, pages 1949 - 1956
K. KONDO ET AL.: "Modification of Human Papillomavirus-Like Particle Vaccine by Insertion of the Cross-Reactive L2-Epitopes", JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY, vol. 80, 2008, pages 841 - 846, XP008126685 *
KAWANA. K ET AL.: "Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6", J. VIROLOGY., vol. 73, 1999, pages 6188 - 6190
KONDO, K ET AL., JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY, vol. 80, 2008, pages 841 - 846
KOZAK M, J.MOL.BIOL., vol. 196, 1987, pages 947
MONITORING OF CANCER INCIDENCE IN JAPAN MCIJ2007, March 2012 (2012-03-01)
MUNOZ, N. ET AL., NEW ENGL J MED, vol. 348, 2003, pages 518 - 527
NIPPON JIBIINKOKA GAKKAI KAIHO, vol. 115, no. 2, 2012, pages 73 - 84
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SANKA-TO-FUJINKA, vol. 73, no. 2, 2006, pages 217 - 225
See also references of EP2940133A4
T. IMAMURA ET AL., J. VIROL., vol. 61, 1987, pages 3543 - 3549
VACCINE, vol. 5, no. 1, March 1987 (1987-03-01), pages 65 - 70
VIRUS, vol. 56, no. 2, 2006, pages 219 - 230
VIRUS, vol. 58, no. 2, 2008, pages 155 - 164

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017122583A1 (ja) * 2016-01-14 2017-07-20 一般財団法人化学及血清療法研究所 ＨＰＶＬ２ペプチド／ＨＢｓキメラタンパク質を有効成分とするＨＰＶ感染症用ワクチン
JPWO2017122583A1 (ja) * 2016-01-14 2018-11-08 一般財団法人化学及血清療法研究所 ＨＰＶＬ２ペプチド／ＨＢｓキメラタンパク質を有効成分とするＨＰＶ感染症用ワクチン
JP2020536489A (ja) * 2017-08-16 2020-12-17 オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｈｐｖワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
EP2940133A1 (en) 2015-11-04
EP2940133A4 (en) 2016-07-06
JPWO2014103608A1 (ja) 2017-01-12
KR20150099601A (ko) 2015-08-31
US20150344529A1 (en) 2015-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014103608A1 (ja) HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はＢ型肝炎用ワクチン
RU2360001C2 (ru) Оптимизированная экспрессия l1 hpv45 в дрожжах
US9566323B2 (en) Vaccine for cervical cancer
EP2288380B1 (en) Vaccine composition useful for hpv and hepatitis b infections and a method for preparing the same
CA2861021A1 (en) Immunogenic hpv l2-containing vlps and related compositions and methods
WO2021013073A1 (zh) 嵌合的乳头瘤病毒l1蛋白
JP6863966B2 (ja) 標的ポリペプチドを提示するためのポリペプチド担体及びその使用
RU2494106C2 (ru) Гены, кодирующие главный капсидный белок l1 вируса папилломы человека, и их применение
JP4825958B2 (ja) 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原
JP4563582B2 (ja) ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子を使用するタンパク質送達系
US7112330B1 (en) Method for producing yeast expressed HPV types 6 and 16 capsid proteins
CN114174319A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒52型l1蛋白
Buonamassa et al. Yeast coexpression of human papillomavirus types 6 and 16 capsid proteins
US20050118139A1 (en) Vaccine using papilloma virus e proteins delivered by viral vector
KR101178056B1 (ko) 자궁경부암 백신
WO2021013071A1 (zh) 人乳头瘤病毒多价免疫原性组合物
JP6916115B2 (ja) ＨＰＶＬ２ペプチド／ＨＢｓキメラタンパク質を有効成分とするＨＰＶ感染症用ワクチン
RU2546242C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18
RU2676160C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11
CN114127097A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒56型l1蛋白
CN114174320A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒18型l1蛋白
CN114127096A (zh) 嵌合的人乳头瘤病毒31型l1蛋白
RU2546243C1 (ru) Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения
JP4945730B2 (ja) 粘膜指向性ヒトパピローマウイルス群の感染予防ワクチン抗原
RU2546240C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13868570

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014554267

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14654910

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013868570

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157020040

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A