TWI827732B - 用於治療b型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種用於治療B型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途。該藥物製劑包含B型肝炎表面抗原溶液，進一步包含B型肝炎核心抗原溶液，更進一步包含寡去氧核苷酸溶液，所述藥物製劑不含糖，組成成分簡單，無鋁佐劑導致的不良反應，抗原穩定性好，在長期穩定性實驗中表現出良好的保存效果，可滿足疫苗的生產、儲存和使用需要，適合治療性B型肝炎疫苗的大規模生產使用。
Description
本申請要求2018年12月24日提交的名稱為“用於治療B型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途”，申請號為2018115804704的中國發明專利申請的優先權。
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種用於治療B型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途。
B型肝炎病毒（HBV）感染是世界範圍的嚴重公共衛生問題之一。HBV感染是導致慢性B型肝炎、肝硬化和肝細胞癌的重要原因（Fattovich G. J. Hepatol. 2008；48：335-352）。臨床治療慢性HBV感染的常用藥物主要有核苷類似物和干擾素。核苷類似物無法完全清除肝細胞內的cccDNA，且長期使用易導致耐藥突變株的出現以及停藥後反彈（Kwon H，Lok AS. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011；8：275-284）。干擾素不適合用於無症狀的HBV攜帶者，在慢性HBV患者中，使用半年後HBeAg血清學轉換發生率僅33%，而且干擾素副作用較大也限制其應用（Tang SX，Yu GL. Lancet 1990；335 (8684)：302）。
目前廣泛應用的B型肝炎蛋白疫苗通過誘導體液免疫，產生保護性中和抗體，達到預防的目的。大量的研究發現中和抗體僅能夠消除胞外病毒顆粒，而清除胞內感染的病毒則主要依賴特異性的細胞免疫反應，輔助性T細胞、CD4+T細胞產生的IFN-γ等Th1型細胞因數，尤其是病毒特異性的殺傷性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）來清除（ChinR，Lacamini S. Rev Med Viorl. 2003：13(4)：255-72）。細胞免疫反應的強弱直接決定著B型肝炎的預後。因此，理想的治療性B型肝炎疫苗需要同時誘導特異性的體液免疫和細胞免疫，突破B型肝炎的免疫耐受。
CN104043120B提供了一種治療性B型肝炎疫苗，其包括B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎核心抗原（HBcAg）、寡去氧核苷酸（CpG），可以突破B型肝炎的免疫耐受，用於病毒性B型肝炎，尤其是慢性B型肝炎的治療。
傳統的B型肝炎疫苗通常含有氫氧化鋁作為佐劑，鋁佐劑還能使抗原吸附在其上以減少抗原分子間的相互作用，從而增加抗原的穩定性。但是鋁佐劑也有一些不足之處。例如，接種含鋁佐劑的疫苗會導致一些不良反應，如紅斑、皮下結節、接觸性超敏、肉芽腫、肌筋膜炎等。使用CpG佐劑避免了氫氧化鋁佐劑的上述不良反應。同時實驗出人意料地發現，添加糖類，如蔗糖，並未起到對抗原的保護作用，反而降低了抗原的穩定性，因此如何進一步提高疫苗的抗原穩定性是需要解決的問題。
本發明的目的是在現有技術基礎上，進一步提供一種抗原穩定性更好的用於治療B型肝炎的藥物製劑，其在不含氫氧化鋁等鋁佐劑，且不含糖類的情況下，抗原穩定性好，適合治療性B型肝炎疫苗的規模化生產和應用。
為實現上述目的，本發明提供了一種用於治療B型肝炎的藥物製劑，所述藥物製劑含有B型肝炎表面抗原溶液，其中，B型肝炎表面抗原溶液含有B型肝炎表面抗原或其片段和聚山梨醇酯80。
優選地，所述B型肝炎表面抗原溶液還含有磷酸鹽緩衝劑。
優選地，所述藥物製劑還含有B型肝炎核心抗原溶液，其中，B型肝炎核心抗原溶液中含有B型肝炎核心抗原或其片段、磷酸鹽緩衝劑和聚山梨醇酯80。
更優選地，所述藥物製劑還含有寡去氧核苷酸溶液，其中，寡去氧核苷酸溶液中含有寡去氧核苷酸、磷酸鹽緩衝劑和聚山梨醇酯80。
優選地，所述磷酸鹽緩衝劑包含Na2
HPO4
和NaH2
PO4
；更優選地，所述磷酸鹽緩衝劑包含Na2
HPO4
、NaH2
PO4
和NaCl；進一步優選地，Na2
HPO4
、NaH2
PO4
和NaCl的重量比為2:2.4:6~18，優選為2:2.4:6~9，更優選為2:2.4:9。
優選地，所述聚山梨醇酯80的濃度為0.03%（0.03 g/100 ml）至0.1%（0.1 g/100 ml），優選為0.05%（0.05 g/100 ml）。
進一步優選地，所述藥物製劑不含糖，例如蔗糖。
優選地，所述B型肝炎表面抗原的胺基酸序列為SEQ ID NO.1；優選地，所述B型肝炎核心抗原的胺基酸序列為SEQ ID NO.2；優選地，所述寡去氧核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9中的一個或多個，優選為SEQ ID NO.3。
優選地，所述B型肝炎核心抗原片段由SEQ ID NO.2中的149~183個連續胺基酸，優選為152~183個連續胺基酸組成。
上述藥物製劑為注射劑，所述注射劑選自注射液、凍乾粉針或無菌分裝製劑。
本發明還提供了所述用於治療B型肝炎的藥物製劑的製備方法，其包括以下步驟：
1）將磷酸鹽緩衝劑加水溶解製成磷酸鹽緩衝溶液並調節pH值至7.0~7.4，優選為7.2；
2）將聚山梨醇酯80用步驟1）製得的磷酸鹽緩衝溶液稀釋，製得聚山梨醇酯80溶液；
3）將B型肝炎表面抗原原液加入步驟2）製得的聚山梨醇酯80溶液，製得B型肝炎表面抗原溶液；
4）將B型肝炎核心抗原原液加入步驟2）製得的聚山梨醇酯80溶液，製得B型肝炎核心抗原溶液；
5）將寡去氧核苷酸用步驟1）製得的磷酸鹽緩衝溶液溶解並稀釋為原液，加入步驟2）製得的聚山梨醇酯80溶液，製得寡去氧核苷酸溶液；
6）將步驟3）製得的B型肝炎表面抗原溶液、步驟4）製得的B型肝炎核心抗原溶液和步驟5）製得的寡去氧核苷酸溶液混合後即得所述藥物製劑。
本發明還提供了所述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑在製備用於治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的藥物中的用途。
其中，所述B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
本發明還提供了上述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑在製備用於在對象中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和細胞免疫應答的藥物中的用途。
本發明還提供了上述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑在製備用於使對象中抗B型肝炎核心抗體發生亞型轉變的藥物中的用途。
優選地，上述藥物為治療性疫苗。
本發明還提供了一種治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的上述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑給予有此需要的對象；優選地，所述B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
本發明還提供了一種在對象中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和細胞免疫應答的方法，所述方法包括將治療有效量的上述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑給予有此需要的對象。
本發明還提供了一種使對象中抗B型肝炎核心抗體發生亞型轉變的方法，所述方法包括將治療有效量的上述治療B型肝炎的藥物製劑或上述製備方法製備的藥物製劑給予有此需要的對象。
本發明人經過大量篩選和研究，確定了磷酸鹽緩衝液和聚山梨醇酯80作為組成成分能夠有效保持用於B型肝炎治療性疫苗的藥物製劑中的抗原穩定性，且出人意料的是，實驗證明在抗原溶液中添加糖類，如蔗糖，不僅沒有起到糖類對蛋白質的保護作用，反而會降低抗原的穩定性。因此，本發明提供的藥物製劑組成成分簡單，不含糖，無需使用鋁佐劑且抗原穩定性好，在長期穩定性實驗中表現出良好的保存效果，可滿足疫苗的生產、儲存和使用的需要，適合治療性B型肝炎疫苗的大規模生產和使用。
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。實施例 1 治療性 B 型肝炎疫苗製劑各組份的製備
1. HBsAg原液的製備：
HBsAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
HBsAg蛋白由HBsAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，優選為漢遜酵母。
具體製備步驟參考中國專利申請CN108330145A，HBsAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和矽膠吸附、柱層析和TFF等步驟純化，製備HBsAg原液。製備的HBsAg原液要求其純度大於95%，蛋白含量不低於200 μg/ml。宿主DNA殘留量、宿主蛋白殘留量和其它化學物質殘留量均符合藥典規定。
2. HBcAg原液的製備：
HBcAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
HBcAg蛋白由HBcAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，優選漢遜酵母。
具體製備步驟參考中國專利申請CN108047316A，HBcAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和硫酸銨、柱層析和TFF等步驟純化，製備HBcAg原液。製備的HBcAg原液要求其純度大於95%，蛋白含量不低於200 μg/ml。宿主DNA殘留量、宿主蛋白殘留量和其它化學物質殘留量均符合藥典規定。
3. 寡去氧核苷酸（CpG）的製備：
寡去氧核苷酸是合成製備的寡去氧核苷酸序列片段，其含有一個或多個CpG基序，優選含有18~25個核苷酸，為全硫代修飾的序列，包括：
TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO.3）、GTG CCA GCG TGC GCC ATG（SEQ ID NO.4）、TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT（SEQ ID NO.5）、TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A（SEQ ID NO.6）、TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T（SEQ ID NO.7）、TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG（SEQ ID NO.8）或TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT（SEQ ID NO.9）等，優選TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO.3）。
具體製備步驟參考中國專利CN104043120B的實施例1，經合成的CpG（SEQ ID NO.3）經凍乾製成粉末狀CpG原料藥，要求其純度大於90%，含水量小於15%，含量不小於70%。重金屬雜質、微生物限度檢查符合藥典規定。實施例 2 治療性 B 型肝炎疫苗製劑的製備
1. PBS緩衝溶液：Na2
HPO4
·12H2
O 2.0 g，NaH2
PO4
·2H2
O 2.4 g，NaCl 9 g，加水溶解並稀釋至1000 ml，用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值至7.20；
2. 0.5%聚山梨醇酯80（Tween 80）溶液：稱取Tween 80 5.0 g，用PBS緩衝溶液稀釋至1000 ml；
3. HBsAg溶液：取HBsAg原液（實施例1製得），加入0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%；
4. HBcAg溶液：取HBcAg原液（實施例1製得），加入0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%；
5. CpG溶液：取CpG（實施例1製得）用PBS緩衝溶液溶解稀釋後得CpG原液，加入0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%；
6. 將步驟3製得的HBsAg溶液、步驟4製得的HBcAg溶液和步驟5製得的CpG溶液混合後即得所述藥物製劑。實施例 3 治療性 B 型肝炎疫苗製劑處方的篩選試驗
在HBsAg、HBcAg和CpG三個組份中，HBsAg受各種因素影響最大，穩定性最差。因此，以HBsAg為指標篩選製劑處方。
HBsAg主要以病毒樣顆粒（以下簡稱VLP）形式存在，HPLC檢測主峰面積代表著製劑中VLP的數量。因此，主峰面積的減少代表著製劑中VLP形式的HBsAg量的減少。
1）緩衝系統的篩選
溶液配製：
0.5%聚山梨醇酯80（Tween 80）溶液由實施例2製得；
組胺酸緩衝溶液：組胺酸1.55 g，鹽酸組胺酸2.095 g，加水溶解並稀釋至1000 ml。
3. HBsAg溶液（PBS緩衝溶液）：取HBsAg原液，加入0.5%Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%。
4. HBsAg溶液（組胺酸緩衝溶液）：取HBsAg原液，經半透膜過夜透析，換液至組胺酸緩衝溶液中，加入0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%。
上述兩種HBsAg溶液在40℃下放置1個月後進行HPLC檢測，結果見表1。
表1 製劑緩衝系統篩選試驗結果
| 緩衝系統 | 0個月 主峰面積 | 1個月主峰面積 | |
| 2~8℃放置 | 40℃放置 | ||
| 組胺酸緩衝溶液 | 5456.3 | 5033.0 | 3470.5 |
| PBS緩衝溶液 | 10537.7 | 10164.6 | 9899.2 |
HPLC檢測結果顯示，以組胺酸緩衝溶液製備的HBsAg溶液在40℃下放置1個月後，主峰面積下降了36.4%，而PBS緩衝溶液製備的HBsAg溶液在40℃下放置1個月後，主峰面積僅下降了6.1%。因此，選擇PBS緩衝溶液作為製劑的緩衝系統。
2）PBS緩衝溶液的篩選
製劑配方使用PBS緩衝溶液，使用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值至7.0~7.4，優選為7.2。
在PBS緩衝溶液中，NaCl用於調節緩衝液的滲透壓，對HBsAg蛋白也有保護作用，因此進行試驗篩選合適的NaCl濃度，其中，PB為磷酸鹽緩衝對，即Na2
HPO4
·12H2
O和NaH2
PO4
·2H2
O。
溶液配製：將下列各組磷酸鹽緩衝劑（表2）分別加水溶解並稀釋至1000 ml，配製為PBS緩衝溶液。取HBsAg原液，經半透膜過夜透析，換液至下列各組PBS緩衝溶液中。
表2 PBS緩衝溶液的條件篩選
| 組份含量（g） | PB+0g/L NaCl | PB+3g/L NaCl | PB+6g/L NaCl | PB+9g/L NaCl | PB+18g/L NaCl |
| Na2 HPO4 ·12H2 O | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| NaH2 PO4 ·2H2 O | 2.4 | 2.4 | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
| NaCl | 0 | 3 | 6 | 9 | 18 |
上述五種HBsAg溶液在2~8℃、25℃和40℃下放置1個月後進行HPLC檢測，結果見圖1。
HPLC檢測結果顯示，當緩衝溶液中NaCl濃度在0~18g/L之間時，隨著NaCl濃度的增加，放置1個月後HBsAg溶液主峰面積的下降幅度逐漸減小。2~8℃放置1個月，五種HBsAg溶液主峰面積都沒有明顯下降；40℃放置1個月，五種HBsAg溶液主峰面積均有明顯下降，下降幅度在13.9%~25.4%之間，隨著NaCl濃度的增加，主峰面積的下降幅度逐漸減小；25℃放置1個月，NaCl濃度為0g/L和3g/L時主峰面積有明顯下降，下降幅度分別為14.8%和18.2%，NaCl濃度在6~18g/L之間時，主峰面積下降幅度不超過3.7%。因此選擇PB+6~18g/L NaCl作為製劑的緩衝液，優選6~9g/L，更進一步優選9g/L。
3）輔料篩選
溶液配製：
1. 50%蔗糖溶液：稱取蔗糖50 g，用PBS緩衝溶液稀釋至100 ml；
2. HBsAg溶液（Tween 80）：取HBsAg原液，加入0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋Tween 80的濃度至0.05%。
3. HBsAg溶液（蔗糖+Tween 80）：取HBsAg原液，加入50%蔗糖溶液和0.5% Tween 80溶液，用PBS緩衝溶液稀釋蔗糖溶液的濃度至5%、Tween 80的濃度至0.05%。
上述兩種HBsAg溶液在40℃下放置1個月後進行HPLC檢測，結果見表3。
表3 製劑輔料篩選試驗結果
| 製劑輔料 | 0個月 主峰面積 | 1個月主峰面積 | |
| 2~8℃放置 | 40℃放置 | ||
| 蔗糖+Tween 80 | 9938.6 | 9478.9 | 6801.3 |
| Tween 80 | 10537.7 | 10164.6 | 9899.2 |
HPLC檢測結果顯示，使用蔗糖+Tween 80製備的HBsAg製劑在40℃下放置1個月後，主峰面積下降了31.6%，而單獨使用Tween 80輔料製備的HBsAg製劑，在40℃下放置1個月後，主峰面積僅下降了6.1%。即蔗糖並未起到對抗原的保護作用，反而降低了抗原的穩定性。因此選擇Tween 80作為製劑的輔料，不僅具有良好的抗原穩定性，還可降低複雜成分潛在的不良反應風險。實施例 4 治療性 B 型肝炎疫苗製劑的穩定性實驗
實驗組設置如表4、表5、表6，製備方法同實施例2。
表4 HBsAg溶液中Tween 80濃度的篩選
表5 HBcAg溶液中Tween 80濃度的篩選
表6 CpG溶液中Tween 80濃度的篩選
| 組別 | HBsAg溶液 |
| 對照製劑 | 不含Tween 80 |
| 0.01%Tween 80處方 | 0.01% |
| 0.03%Tween 80處方 | 0.03% |
| 0.05%Tween 80處方 | 0.05% |
| 0.1%Tween 80處方 | 0.1% |
| 組別 | HBcAg溶液 |
| 對照製劑 | 不含Tween 80 |
| 0.01%Tween 80處方 | 0.01% |
| 0.03%Tween 80處方 | 0.03% |
| 0.05%Tween 80處方 | 0.05% |
| 0.1%Tween 80處方 | 0.1% |
| 組別 | CpG溶液 |
| 對照製劑 | 不含Tween 80 |
| 0.01%Tween 80處方 | 0.01% |
| 0.03%Tween 80處方 | 0.03% |
| 0.05%Tween 80處方 | 0.05% |
| 0.1%Tween 80處方 | 0.1% |
2. 穩定性實驗方案
表7 製劑穩定性研究設計
| 穩定性試驗條件 | 2~8℃ | 40℃ |
| 試驗週期 | 6個月 | 1個月 |
| 取樣時間點 | 0、1、2、3、6個月 | 0、7、15、30天 |
對各穩定性研究樣品，在規定的取樣時間點取樣，進行HPLC檢測。
3. 實驗結果
1）HBsAg製劑穩定性結果分析：
將不同處方的HBsAg溶液和HBsAg對照製劑在40℃下共同放置，分別於第7、15和30天取樣進行檢測。結果顯示（見圖2和圖3）：不添加Tween 80的HBsAg對照製劑的HPLC主峰面積下降最快，在40℃下放置30天，主峰面積下降了23.5%；其次是0.01% Tween 80處方的溶液，下降了15.9%；0.03%~0.1% Tween 80處方的溶液，三者之間下降幅度基本一致，下降了6%左右。
將不同處方的HBsAg溶液和HBsAg對照製劑於2~8℃下共同放置6個月的穩定性資料與在40℃下放置的結果一致。6個月時間點樣品相對於零點樣品，對照製劑（處方中不含Tween 80）和處方中含0.01%、0.03%、0.05%和0.1% Tween 80處方的溶液，其主峰面積分別下降了15.4%、15.8%、12.2%、6.5%和4.8%。說明Tween 80對HBsAg VLP有保護作用。
圖4顯示，HBsAg對照製劑在40℃下放置7天就有明顯的聚集峰出現，隨著放置時間的增加，其聚集峰面積逐漸增大。而0.05% Tween 80處方的製劑在40℃下放置30天都沒有明顯的聚集峰出現。說明Tween 80保護HBsAg VLP，使其一致地保持單一VLP狀態，免於聚集。同時，0.05% Tween 80處方與0.1% Tween 80處方效果相當，減少輔料添加量也能降低潛在的不良反應風險。
2）HBcAg製劑穩定性結果分析：
HBcAg同樣主要以VLP形式存在，HPLC檢測主峰面積代表著製劑中VLP的數量。因此，主峰面積的減少代表著製劑中VLP形式的HBcAg量的減少。
HPLC結果（見圖5和圖6）顯示HBcAg VLP比較穩定，在2~8℃下放置6個月和40℃放置30天，HPLC主峰面積沒有明顯變化。
3）CpG製劑穩定性結果分析：
對各穩定性研究樣品，在規定的取樣時間點取樣，進行純度和相對活性檢測。
其中純度使用RP-UPLC方法檢測，相對活性使用細胞法檢測，表徵CpG溶液與人TLR9受體的結合活性，結果以與參考品（由發明人製備的CpG原料，經過充分結構表徵和含量標定，作為參考品，其相對活性值定義為100%）的活性的百分比值表示。
純度結果和相對活性結果顯示（見表8和表9）：CpG溶液比較穩定，在2~8℃下放置6個月和40℃放置30天，純度和相對活性沒有明顯變化。
表8 CpG溶液在40℃下放置穩定性的研究結果
表9 CpG溶液在2~8℃下放置穩定性的研究結果
實施例 5 治療性 B 型肝炎疫苗製劑各組份獨立儲存的藥效驗證
| Tween 80含量（%） | CpG相對活性檢測（%） | CpG純度檢測（%） | ||||||
| 0d | 7d | 15d | 30d | 0d | 7d | 15d | 30d | |
| 0 | 99.0 | 104.2 | 98.9 | 93.3 | 94.83 | 95.11 | 95.85 | 95.33 |
| 0.01 | 104.4 | 103.7 | 100.5 | 96.1 | 94.84 | 95.09 | 95.36 | 95.4 |
| 0.03 | 104.9 | 100.9 | 106.6 | 85.2 | 95.25 | 95.03 | 95.16 | 95.31 |
| 0.05 | 103.1 | 105.9 | 105.4 | 93.5 | 95.25 | 95.97 | 95.51 | 95.37 |
| 0.1 | 103.9 | 103.7 | 98.8 | 96.1 | 96.07 | 95.95 | 95.27 | 95.28 |
| Tween 80含量（%） | CpG相對活性檢測（%） | CpG純度檢測（%） | ||||||
| 0個月 | 1個月 | 2個月 | 3個月 | 0個月 | 1個月 | 2個月 | 3個月 | |
| 0 | 99.0 | 102.6 | 93.7 | 99.3 | 94.83 | 95.08 | 94.76 | 94.5 |
| 0.01 | 104.4 | 103.3 | 93.5 | 96.5 | 94.84 | 94.92 | 94.71 | 94.08 |
| 0.03 | 104.9 | 99.3 | 98.6 | 97.2 | 95.25 | 94.96 | 94.72 | 94.4 |
| 0.05 | 103.1 | 101.7 | 98.8 | 103.9 | 95.25 | 94.94 | 94.78 | 94.44 |
| 0.1 | 103.9 | 96.5 | 84.0 | 107.2 | 96.07 | 94.97 | 94.68 | 94.52 |
1、實驗動物：C57BL/6小鼠，雌性，5周齡，80只，8只/組，上海靈暢生物科技有限公司。
2、實驗組設置：按照實施例2中步驟1-5所述製備方法分別製得HBsAg溶液、HBcAg溶液和CpG溶液，三種組份獨立儲存放置，在規定的取樣時間點取樣（見表10），取樣後按照實施例2中步驟6將HBsAg溶液、HBcAg溶液和CpG溶液三種組份混合，即得所述藥物製劑，其分別含有50 μg/ml的HBsAg、25 μg/ml的HBcAg和25 μg/ml的CpG，Tween 80的濃度為0.05%。對該藥物製劑進行藥效驗證。
表10 治療性B型肝炎疫苗各組份獨立儲存的藥效驗證
| 穩定性試驗條件 | 25℃ | 2~8℃ |
| 試驗週期 | 6個月 | 12個月 |
| 取樣時間點 | 0、1、2、3、6個月 | 0、3、6、9、12個月 |
3、動物免疫：第0天小鼠採用腿部肌肉注射方法進行免疫接種，共免疫1次，接種體積為200 μl/只，在免疫後第7天評價細胞免疫水平，在免疫後第28天評價體液免疫水平。
4、細胞免疫：
1）檢測步驟：免疫後第7天取脾，按常規方法製備脾淋巴細胞，具體如下：無菌操作取脾臟：用無菌鑷子及剪刀剪取脾臟，放於70 μm細胞濾網中，置於含有2 ml預冷處理的2％ FBS（購自GIBCO公司）-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾臟，脾臟細胞通過篩目進入平皿中，得到細胞懸液，用巴氏吸管將懸液放入經40 μm細胞濾網過濾（購自BD公司）的50 ml無菌離心管；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入2 ml 1×紅血球破壞劑（購自BD公司）重懸細胞，4℃避光靜置5分鐘，以破碎紅細胞；加入10ml 2％FBS-PBS終止紅血球破壞反應；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入5ml 2％FBS-PBS重懸細胞備用。分別使用刺激物HBsAg特異性肽庫PS4和HBcAg特異性肽庫PCP刺激脾細胞；按照試劑盒說明書，使用ELISPOT試劑盒（BD公司）檢測HBsAg和HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水平；使用ImmunoSPOT Series 3免疫斑點分析儀讀取ELISPOT試劑盒測出的斑點數（具體操作步驟參考中國專利申請CN104043120B的實施例7）。
其中，HBsAg特異性肽庫PS4參考中國專利申請CN104043120B的實施例7；HBcAg特異性肽庫PCP序列見SEQ ID NO.10~24。
2）評價指標：若無血清培養基孔斑點數≤5 SFC，樣品孔斑點數≥10 SFC，判定為陽性；若5 SFC＜無血清培養基孔斑點數≤10 SFC，樣品孔斑點數/無血清培養基孔斑點數≥2，判定為陽性；若無血清培養基孔斑點數＞10 SFC，樣品孔斑點數/無血清培養基孔斑點數≥3，判定為陽性。
5、體液免疫：
1）檢測步驟：免疫後第28天進行採血，分離血清（全血置於37℃恒溫培養箱放置40 min, 12000 rpm，4℃離心10 min；吸取上清，凍存於-20℃備用），按照試劑盒說明書，使用ELISA試劑盒（上海科華）檢測產生的HBsAb和HBcAb抗體陽轉率。檢測設空白對照、陰性對照和待測樣品，每種兩個平行孔，其中陰性對照為陰性小鼠血清；除空白對照外，各孔分別加入陰性對照或待測樣品，再加入酶結合物，混勻封板後37℃孵育30分鐘；使用洗滌液洗滌各孔，每孔加入顯色劑A液和顯色劑B液，混勻封板後37℃孵育15分鐘；每孔加入終止液混勻；使用酶標儀讀取450 nm波長處的各孔OD值。
2）評價指標：HBsAb的參考值截止值（cut-off value）（COV）=陰性對照平均OD值×2.1；樣本的OD值小於COV值，檢測結果為陰性；樣本的OD值大於或等於COV值，檢測結果為陽性。
HBcAb的參考值COV=陰性對照平均OD值×0.3；樣本的OD值小於COV值，檢測結果為陽性；樣本的OD值大於或等於COV值，檢測結果為陰性。
6、實驗結果：
1）25℃穩定性試驗條件：
表11 25℃穩定性試驗條件藥物製劑的藥效結果
結果分析：
細胞免疫水平檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖7和圖8，分析結果顯示，0-6個月的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，均高於70%，細胞免疫檢測合格。體液免疫水平檢測結果顯示：HBsAb陽轉率和HBcAb陽轉率均在62.5%以上，均高於50%，體液免疫檢測結果合格。
| 儲存時間/月 | 總只數 | 細胞免疫 | 體液免疫 | ||
| HBsAg 陽性率% | HBcAg 陽性率% | HBsAb 陽轉率% | HBcAb 陽轉率% | ||
| 0 | 8 | 100 | 100 | 100 | 62.5 |
| 1 | 8 | 100 | 100 | 62.5 | 100 |
| 2 | 8 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | 8 | 100 | 100 | 75 | 100 |
| 6 | 8 | 100 | 100 | 100 | 100 |
2）2~8℃穩定性試驗條件：
表12 2~8℃穩定性試驗條件藥物製劑的藥效結果
結果分析：
細胞免疫水平檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖9和圖10，分析結果顯示，0-12個月的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率高於87.5%，均高於70%，細胞免疫檢測合格。體液免疫水平檢測結果顯示：HBsAb陽轉率和HBcAb陽轉率均在62.5%以上，均高於50%，體液免疫檢測結果合格。實施例 6 治療性 B 型肝炎疫苗製劑各組份混合儲存的藥效驗證
| 儲存時間/月 | 總只數 | 細胞免疫 | 體液免疫 | ||
| HBsAg 陽性率% | HBcAg 陽性率% | HBsAb 陽轉率% | HBcAb 陽轉率% | ||
| 0 | 8 | 100 | 100 | 100 | 62.5 |
| 3 | 8 | 100 | 87.5 | 75 | 100 |
| 6 | 8 | 100 | 100 | 75 | 100 |
| 9 | 8 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | 8 | 100 | 100 | 75 | 100 |
1、實驗動物：C57BL/6小鼠，雌性，5周齡，64只，8只/組，上海靈暢生物科技有限公司。
2、實驗組設置：按照實施例2中的製備方法製得所述藥物製劑，其分別含有50 μg/ml的HBsAg、25 μg/ml的HBcAg溶液和200 μg/ml的CpG溶液，Tween 80的濃度為0.05%。儲存放置後在規定的取樣時間點取樣（見表13），進行藥效驗證。
表13 治療性B型肝炎疫苗各組份混合儲存的藥效驗證
| 穩定性試驗條件 | 25℃ | 2~8℃ |
| 試驗週期 | 3個月 | 6個月 |
| 取樣時間點 | 0、1、2、3個月 | 0、1、3、6個月 |
3、動物免疫：第0天小鼠採用腿部肌肉注射方法進行免疫接種，共免疫1次，接種體積為200μl/只，在免疫後第7天評價細胞免疫水平，在免疫後第28天評價體液免疫水平。
4、細胞免疫：檢測步驟及評價指標同實施例5。
5、體液免疫：檢測步驟及評價指標同實施例5。
6、實驗結果：
1）25℃穩定性試驗條件：
表14 25℃穩定性試驗條件下藥物製劑的藥效結果
結果分析：
細胞免疫水平檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖11和圖12，分析結果顯示，0-3個月的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率高於75%，均高於70%，細胞免疫檢測合格。體液免疫水平檢測結果顯示：HBsAb陽轉率和HBcAb陽轉率均在62.5%以上，均高於50%，體液免疫檢測結果合格。
| 儲存時間/月 | 總隻數 | 細胞免疫 | 體液免疫 | ||
| HBsAg 陽性率% | HBcAg 陽性率% | HBsAb 陽轉率% | HBcAb 陽轉率% | ||
| 0 | 8 | 100 | 100 | 62.5 | 100 |
| 1 | 8 | 100 | 75 | 75 | 100 |
| 2 | 8 | 100 | 75 | 75 | 75 |
| 3 | 8 | 100 | 75 | 75 | 100 |
2）2~8℃穩定性試驗條件：
表15 2~8℃穩定性試驗條件下藥物製劑的藥效結果
結果分析：
細胞免疫水平檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖13和圖14，分析結果顯示，0-6個月的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，均高於70%，細胞免疫檢測合格。體液免疫水平檢測結果顯示：HBsAb陽轉率和HBcAb陽轉率均在62.5%以上，均高於50%，體液免疫檢測結果合格。
| 儲存時間/月 | 總隻數 | 細胞免疫 | 體液免疫 | ||
| HBsAg 陽性率% | HBcAg 陽性率% | HBsAb 陽轉率% | HBcAb 陽轉率% | ||
| 0 | 8 | 100 | 100 | 62.5 | 100 |
| 1 | 8 | 100 | 100 | 62.5 | 100 |
| 3 | 8 | 100 | 100 | 75 | 100 |
| 6 | 8 | 100 | 100 | 75 | 100 |
綜上所述，本發明提供的用於治療B型肝炎的藥物製劑不含糖，在使用CpG佐劑避免氫氧化鋁佐劑造成的不良反應的同時，通過加入適量的聚山梨醇酯80和磷酸鹽緩衝劑，使得整個處方成分簡單，抗原穩定性好，在長期穩定性實驗中表現出良好的保存效果，滿足疫苗的生產、儲存和使用的需要，適合治療性B型肝炎疫苗的大規模生產使用，具有廣闊的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的申請專利範圍並不限於上文所作的詳細描述，所述修改和改變應歸屬於申請專利範圍。
無
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
圖1顯示了在不同濃度NaCl的PBS緩衝溶液內，HBsAg製劑在2~8℃、25℃和40℃下放置1個月的穩定性研究結果；
圖2顯示了HBsAg製劑在40℃下放置的穩定性研究結果；
圖3顯示了HBsAg製劑在2~8℃下放置的穩定性研究結果；
圖4顯示了HBsAg對照製劑和含0.05%的Tween 80的製劑在40℃下放置後的HPLC圖譜；
圖5顯示了HBcAg製劑在40℃下放置的穩定性研究結果；
圖6顯示了HBcAg製劑在2~8℃下放置的穩定性研究結果；
圖7顯示了各組份獨立儲存的藥物製劑在25℃下放置後HBsAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖8顯示了各組份獨立儲存的藥物製劑在25℃下放置後HBcAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖9顯示了各組份獨立儲存的藥物製劑在2~8℃下放置後HBsAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖10顯示了各組份獨立儲存的藥物製劑在2~8℃下放置後HBcAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖11顯示了各組份混合儲存的藥物製劑在25℃下放置後HBsAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖12顯示了各組份混合儲存的藥物製劑在25℃下放置後HBcAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖13顯示了各組份混合儲存的藥物製劑在2~8℃下放置後HBsAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平；
圖14顯示了各組份混合儲存的藥物製劑在2~8℃下放置後HBcAg抗原特異性IFN-γ的分泌水平。
無
Claims (21)
- 一種治療B型肝炎的藥物製劑，所述藥物製劑含有B型肝炎表面抗原溶液，其中，B型肝炎表面抗原溶液含有B型肝炎表面抗原或其片段和聚山梨醇酯80，所述聚山梨醇酯80的濃度為0.03g/100ml至0.1g/100ml；所述B型肝炎表面抗原溶液還含有磷酸鹽緩衝劑，所述磷酸鹽緩衝劑包含Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl，且Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl的重量比為2：2.4：6~18。
- 如請求項1所述的藥物製劑，所述藥物製劑還含有B型肝炎核心抗原溶液，其中，B型肝炎核心抗原溶液中含有B型肝炎核心抗原或其片段，磷酸鹽緩衝劑和聚山梨醇酯80。
- 如請求項1所述的藥物製劑，所述藥物製劑還含有寡去氧核苷酸溶液，其中，寡去氧核苷酸溶液中含有寡去氧核苷酸，磷酸鹽緩衝劑和聚山梨醇酯80。
- 如請求項1-3中任一項所述的藥物製劑，其中，Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl的重量比為2：2.4：6~9。
- 如請求項4所述的藥物製劑，其中，Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl的重量比為2：2.4：9。
- 如請求項1-3中任一項所述的藥物製劑，其中，所述聚山梨醇酯80的濃度為0.05g/100ml。
- 如請求項1-3中任一項所述的藥物製劑，其中，所述藥物製劑不含糖。
- 如請求項1-3中任一項所述的藥物製劑，其中所述B型肝炎表面抗原的胺基酸序列為SEQ ID NO.1。
- 如請求項2所述的藥物製劑，其中所述B型肝炎核心抗原的胺基酸序列為SEQ ID NO.2。
- 如請求項3所述的藥物製劑，其中所述寡去氧核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9中的一個或多個。
- 如請求項10所述的藥物製劑，其中所述寡去氧核苷酸的核苷酸序列為SEQ ID NO.3。
- 如請求項2所述的藥物製劑，其中，所述B型肝炎核心抗原片段由SEQ ID NO.2中的149~183個連續胺基酸組成。
- 如請求項2所述的藥物製劑，其中，所述B型肝炎核心抗原片段由SEQ ID NO.2中的152~183個連續胺基酸組成。
- 如請求項1-3中任一項所述的藥物製劑，其中，所述藥物製劑為注射劑，所述注射劑選自注射液、凍乾粉針或無菌分裝製劑。
- 一種如請求項1-14中任一項所述的藥物製劑的製備方法，其包括以下步驟：1)將磷酸鹽緩衝劑加水溶解製成磷酸鹽緩衝溶液並調節pH值至7.0~7.4；2)將聚山梨醇酯80用步驟1)製得的磷酸鹽緩衝溶液稀釋，製得聚山梨醇酯80溶液；3)將B型肝炎表面抗原原液加入步驟2)製得的聚山梨醇酯80溶液，製得B型肝炎表面抗原溶液； 4)將B型肝炎核心抗原原液加入步驟2)製得的聚山梨醇酯80溶液，製得B型肝炎核心抗原溶液；5)將寡去氧核苷酸用步驟1)製得的磷酸鹽緩衝溶液溶解並稀釋為原液，加入步驟2)製得的聚山梨醇酯80溶液，製得寡去氧核苷酸溶液；6)將步驟3)製得的B型肝炎表面抗原溶液、步驟4)製得的B型肝炎核心抗原溶液和步驟5)製得的寡去氧核苷酸溶液混合後即得所述藥物製劑。
- 如請求項15所述的製備方法，其中，步驟1)所製成的磷酸鹽緩衝溶液的pH值被調節至7.2。
- 一種如請求項1至14中任一項所述的治療B型肝炎的藥物製劑或如請求項15或16所述的製備方法所製備的藥物製劑在製備用於治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的藥物中的用途。
- 如請求項17所述的用途，其中，所述B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
- 一種如請求項1至14中任一項所述的治療B型肝炎的藥物製劑或如請求項15或16所述的製備方法所製備的藥物製劑在製備用於在對象中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和細胞免疫應答的藥物中的用途。
- 一種如請求項1至14中任一項所述的治療B型肝炎的藥物製劑或如請求項15或16所述的製備方法所製備的藥物製劑在製備用於使對象中B型肝炎核心抗體發生亞型轉變的藥物中的用途。
- 如請求項17至20中任一項所述的用途，其中所述藥物為治療性疫苗。
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