CN104043120A - 乙型肝炎疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物组合物，其包含：i)HBsAg、该抗原的片段、该抗原的变体，或者其至少两种的混合物，ii)HBcAg1-X、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体，或者其至少两种的混合物，其中X是149-183的整数，iii)CpG-ODN，该寡聚核苷酸为全硫代修饰，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基序，其长度为21个碱基。本发明还涉及该组合物用于治疗HBV感染和HBV介导的疾病中的用途，以及治疗HBV感染和HBV介导的疾病的方法。

Description

乙型肝炎疫苗
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎疫苗。特别地，本发明涉及一种乙型肝炎疫苗，其包含乙肝表面抗原、乙肝核心抗原和具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围的严重公共卫生问题之一。HBV感染是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要原因(FattovichG.J Hepatol 2008；48：335-352)。临床治疗慢性HBV感染的常用药物主要有核苷类似物和干扰素。核苷类似物无法完全清除肝细胞内的cccDNA，且长期使用易导致耐药突变株的出现以及停药后反弹(Kwon H，Lok AS.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2011；8：275-284.)。干扰素不适合用于无症状的HBV携带者，在慢性HBV患者中，使用半年后HBeAg血清学转换发生率仅33％，而且干扰素副作用较大也限制其应用(Tang SX，YuGL.Lancet 1990；335(8684)：302)。
目前广泛应用的乙肝蛋白疫苗通过诱导体液免疫，产生保护性抗体，达到预防的目的。大量的研究发现保护性抗体仅能够消除胞外病毒颗粒，而清除胞内感染的病毒则主要依赖特异性的细胞免疫反应，辅助性T细胞、CD4+T细胞产生的IFN-γ等Th1型细胞因子，尤其是病毒特异性的杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)来清除(Chin R，Lacamini S.Rev Med Viorl.2003：13(4)：255-72)。细胞免疫反应的强弱直接决定着乙肝的预后。因此，理想的治疗性乙肝疫苗需要同时诱导特异性的体液免疫和细胞免疫，突破乙肝的免疫耐受。
目前国内大多数乙肝治疗性疫苗的研发思路围绕着HBsAg，通过克服免疫耐受，产生抗HBsAg的抗体达到免疫清除的效果，如闻玉梅的HBsAg-免疫球蛋白复合物(Xu D Z，Zhao K，et al.PLoSONE，2008，3：e2565)，张宜俊的高剂量乙肝表面抗原疫苗(曾滢，张宜俊等，广东医学，2003年24卷07期，740-706页)等均采用此思路，从其最新的临床数据来看，这两个疫苗的治疗效果还不明朗。
研究表明，慢性乙肝感染患者的抗HBsAg的抗体亚型以IgG4为主，而乙肝感染治愈的患者的抗HBsAg的抗体亚型为IgG1≥IgG4，说明在乙肝感染的清除过程中Th1型抗体亚型IgG1发挥着重要的作用，评价Th1型抗体亚型是否高于或者等于Th2型抗体亚型可能提示乙肝治疗的效果(S.Rath，et al.Clin.exp.Immunol.(1988)72，164-167)。同时，乙肝感染患者的抗HBcAg抗体亚型为IgG1＞IgG3＞IgG4，而乙肝感染治愈的患者的抗HBcAg亚型发生转变，为IgG3＞IgG1＞IgG4，说明抗HBcAg特别是抗HBcAg的抗体亚型的转变可能与乙肝的治疗息息相关(Chien-FuHuang，et al.Cellular & Molecular Immunology.2006；3(2)：97-106.)。
此外，还有研究表明，慢性乙肝病毒携带者和慢性乙肝患者的树突状细胞(pDC)表面受体TLR9表达下调，从而导致机体对乙肝表面抗原的免疫耐受，不能产生乙肝表面抗体或对乙肝表面抗原的细胞免疫(Q.Xieet al.Microbes and Infection 11(2009)515-523)。
专利US4547367利用HBcAg颗粒治疗/预防HBV感染和HBV介导的疾病，HBcAg颗粒免疫黑猩猩可保护黑猩猩免于感染HBV。而且HBcAg颗粒联合HBsAg颗粒免疫乙肝携带者母亲生产的新生儿，产生高滴度的抗HBsAg和抗HBcAg抗体，且在18个月的监测中均未见HBV感染。但是该专利并无明确提出抗HBcAg抗体亚型转变的证据，且无治疗HBV感染和HBV介导的疾病的直接证据。
专利WO2007/031334，保护了乙肝治疗性疫苗组分，其包含HBsAg、HBcAg和一种皂苷佐剂，而CpG-ODN可作为共用佐剂使用，但是，该乙肝治疗性疫苗在临床中需要联合核苷类似物进行联合治疗才能突破乙肝的免疫耐受，且e抗原转阴仅25％。
发明内容
本发明涉及一种药物组合物，其包含：i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，iii)CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)和iv)可药用载体。特别地，本发明的药物组合物用作预防性或治疗性疫苗。在某些实施方案中，所述药物组合物由上述组分i)--iv)组成。
在本发明的一些实施方案中，所述HBsAg具有SEQ ID NO：1所示序列。
在本发明的另一些实施方案中，所述HBcAg具有SEQ ID NO：2所示序列。
在本发明的又一些实施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接。特别地，所述CpG-ODN为硫代寡聚脱氧核苷酸，优选地为全硫代寡聚脱氧核苷酸。
在本发明的又一些实施方案中，所述CpG-ODN包含两个或更多的5’-NTCGTT-3’基序。
在本发明的又一些实施方案中，所述CpG-ODN长度为15～35个核苷酸，优选20～25个核苷酸。
在本发明的又一些实施方案中，所述CpG-ODN具有选自下列的序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’(SEQ ID NO：3)、5’-TCGTTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3’(SEQ ID NO：4)、5’-TCG TCGTCG TCG TCG TCG TCG-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TCC ATG ACG TTCCTG ACG TT-3’(SEQ ID NO：6)，优选地所述CpG-ODN具有序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’。
在本发明的又一些实施方案中，所述药物组合物中的组分i)，ii)以及iii)之间的相对重量比范围是1∶0.2～5∶1～50，优选为1∶1～5∶2～15。
本发明还涉及一种乙型肝炎疫苗，其包含：i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，iii)CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)以及iv)可药用载体。
本发明还涉及一种药盒，其包含根据本发明的药物组合物或乙型肝炎疫苗以及其使用说明。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病之药物中的用途，优选地所述HBV感染和/或HBV介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)之药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中使抗HBcAg抗体发生亚型转变之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中实现乙肝表面抗原Th1/Th2免疫应答平衡(例如，大致相当地诱导Th1和Th2型免疫应答)之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含：i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，和iii)CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)，其用于在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病、用于在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)、用于在对象中使抗HBcAg抗体发生亚型转变和/或用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中使抗HBcAg抗体发生亚型转变的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及在对象中实现乙肝表面抗原Th1/Th2免疫应答平衡(例如，大致相当地诱导Th1和Th2型免疫应答)的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物不包含皂苷佐剂。
附图说明
图1显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在增强小鼠对乙肝表面抗原特异性总IgG免疫应答的图。
图2显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在增强小鼠产生保护性抗体免疫应答的图。
图3显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th2免疫应答的图。
图4显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th1免疫应答的图。
图5显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平促进乙肝表面抗原Th1/Th2免疫应答平衡的图。
图6显示本发明组合物产生的抗HBcAg抗体亚型为IgG2a＞IgG1的图。
图7显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在细胞免疫方面促进HBsAg CTL表位特异性Th1细胞分化抑制Th2细胞增殖的图。
图8显示本发明组合物中HBcAg与HBsAg+CpG联用在产生抗原特异性IgG抗体水平上具有协同作用的图。
图9显示本发明组合物中HBcAg与HBsAg+CpG联用相比HBsAg+CpG在细胞免疫水平具有促进HBsAg特异性的Th1细胞分化的能力。
图10显示本发明组合物在产生抗原特异性IgG免疫应答上突破HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的图。
图11显示本发明组合物在产生中和抗体免疫应答上突破HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的图。
图12显示本发明组合物突破HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受，产生高滴度抗HBcAg的特异性IgG抗体的图。
图13显示本发明组合物在HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠中产生的抗HBcAg抗体亚型为IgG2a＞IgG1的图。
图14显示本发明组合物与传统疫苗组分相比更具有清除HBV转基因小鼠中HBsAg抗原的能力。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明的一个目的是克服现有技术中已知的用于治疗乙型肝炎感染的药物的缺陷。
特别地，本发明的一个目的是提供一种药物组合物，该组合物可以在慢性HBV感染患者中产生强烈的免疫应答，促进抗HBsAg-IgG2a抗体亚型的分化，使IgG2a和IgG1趋近平衡；诱导抗HBcAg抗体亚型发生转变和/或突破HBV感染患者的免疫耐受。
本发明的另一目的是提供了该组合物用于治疗HBV感染和/或HBV介导疾病的用途，以及治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病的方法。
为实现上述目的，本发明提供了药物组合物，其包含：
i)HBsAg、该抗原的片段、该抗原的变体，或者其至少两种的混合物，
ii)HBcAg、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体，或者其至少两种的混合物，
iii)CpG-ODN，该寡聚核苷酸为全硫代修饰，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基序，长度为20～25个碱基。该寡聚核苷酸优选自以下碱基序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’、5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3’、5’-TCG TCG TCGTCG TCG TCG TCG-3’或5’-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3’。更优选为5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’。
本发明的组合物实现了出乎意料的技术效果。与现有的市售乙肝预防疫苗相比，在小鼠体内试验中可以介导更强的免疫应答，包括抗HBsAg抗体、抗HBcAg抗体，抗adr血清型的中和抗体，特别是介导Th1细胞免疫应答，产生与病毒清除相关的细胞因子IFN-γ，促进抗HBs-IgG2a抗体亚型的分化和成熟，抗HBcAg抗体亚型转变，实现体液免疫和细胞免疫的平衡。
现有技术中(参见专利CN101492672)已公开了组合物HBsAg+CpG，而本发明人出人意料地发现根据本发明的药物组合物(HBcAg、HBsAg和CpG ODN的组合)可产生显著优于HBsAg+CpG组合物的抗HBsAg特异性抗体，表现出出人意料的协同作用。
更加出人意料地，在转基因小鼠体内实验表明，根据本发明的组合物可以突破转基因小鼠的免疫耐受，产生高滴度的抗HBsAg抗体、抗HBcAg抗体、中和抗体，介导Th1细胞免疫应答，促进IgG2a抗体亚型的分化和成熟。同时通过对其血清中乙肝表面抗原表达水平的检测显示，根据本发明的组合物多次免疫可以显著清除转基因小鼠体内的乙肝病毒，使其乙肝病毒表达水平下降。
另外，在BALB/c小鼠和模型小鼠上均能介导强抗HBcAg的免疫应答，并且实现了抗HBcAg抗体亚型转变，即表现出的抗HBcAg抗体亚型关系为IgG2a抗体水平高于IgG1，与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。这一鼓舞人心的结果表明根据本发明的组合物可用作乙肝治疗性疫苗，从而解决长期以来困扰人们的这一难题。
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文中使用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物，并且无具体的最少氨基酸数目限制。因此其同样包括肽、寡肽、二聚体、三聚体、低聚体、颗粒等。再者，术语“多肽”不仅包括在核糖体中翻译后得到的纯氨基酸聚合物，还包括经过翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化、硫代等)获得的多肽。
本文使用的术语“抗原性片段”是指天然或合成多肽的片段，其保留了所述天然或合成多肽的抗原特性，即能够引发针对所述天然或合成多肽的免疫应答。
本文中使用的术语“乙肝表面抗原(HBsAg、HBs)”旨在涵盖天然HBsAg、HBsAg抗原性片段、HBsAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然HBsAg为含有226个氨基酸的天然HBsAg多肽。更特别地，所述HBsAg为来源于现今已知HBV标准基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBsAg多肽。在某些实施方案中，所述HBsAg具有SEQID NO：1所示的序列。
本文中使用的术语“HBsAg抗原性片段”旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然HBsAg中少于226个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然HBsAg的抗原性。
本文中使用的术语“HBsAg功能性变体”旨在表示下述多肽，即该多肽相对于天然HBsAg或HBsAg片段有至多30个、至多25个、至多20个、至多15个、至多10个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、至多1个氨基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然HBsAg的功能(例如抗原性)。
本文中使用的术语“乙肝核心抗原(HBcAg、HBc)”旨在涵盖天然HBcAg、HBcAg抗原性片段、HBcAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然HBcAg为含有183个氨基酸的天然HBcAg多肽。更特别地，所述天然HBcAg为来源于现今已知HBV标准基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBcAg。在一些实施方案中，所述HBcAg选自HBcAg1-x多肽，其表示天然HBcAg的1-X位氨基酸的片段，特别地，X为149至183。在另一些实施方案中，所述HBcAg选自具有下述序列的多肽：SEQ ID NO：2的1-149位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-150位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-151位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-152位氨基酸、SEQID NO：2的1-153位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-154位氨基酸、SEQ IDNO：2的1-155位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-156位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-157位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-158位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-159位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-160位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-161位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-162位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-163位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-164位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-165位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-166位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-167位氨基酸、SEQID NO：2的1-168位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-169位氨基酸、SEQ IDNO：2的1-170位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-171位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-172位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-173位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-174位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-175位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-176位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-177位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-178位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-179位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-180位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-181位氨基酸、SEQ ID NO：2的1-182位氨基酸和SEQID NO：2的1-183位氨基酸。在某些实施方案中，所述HBcAg具有SEQ IDNO：2所示的序列。
本文中使用的术语“HBcAg抗原性片段”旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然HBcAg中少于183个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然HBcAg的抗原性。
本文中使用的术语“HBcAg功能性变体”旨在表示下述多肽，即该多肽相对于天然HBcAg或HBcAg片段有至多30个、至多25个、至多20个、至多15个、至多10个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、至多1个氨基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然HBcAg的功能(例如抗原性)。
优选地，在本发明中，HBcAg以及HBsAg在根据本发明的组合物中都以颗粒形式存在。
本文使用的术语“药物组合物”、“组合药物”和“药物组合”可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用赋形剂或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如HBsAg、HBcAg和CpG-ODN)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。
本文使用的术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”或“CpG-ODN”是指短的单链合成DNA分子，其含有一个或更多个“CpG”单元，其中C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，p表示磷酸二酯键。特别地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸是非甲基化的。在一些实施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接或硫代磷酸酯骨架。也就是说，在一些实施方案中，所述CpG-ODN为硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸(即硫代寡聚脱氧核苷酸)。优选地，所述CpG-ODN中所有核苷酸间连接均为硫代磷酸酯连接，即所述CpG-ODN为全硫代寡聚脱氧核苷酸。在另一些实施方案中，所述CpG-ODN包含两个或更多的5’-NTCGTT-3’基序。在又一些实施方案中，所述CpG-ODN长度为15～35个核苷酸，优选20～25个核苷酸。特别地，所述CpG-ODN具有选自下列的序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’(SEQID NO：3)、5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3’(SEQ IDNO：4)、5’-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3’(SEQ ID NO：6)，更特别地所述CpG-ODN具有序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
本文使用的术语“HBV介导的疾病”旨在表示乙肝病毒(HBV)所导致、诱发、加重、提高其发生风险和/或与其有关的疾病，例如乙型肝炎病毒携带者、乙型肝炎、肝硬化、肝腹水、肝癌等。
本文使用的术语“抗HBcAg抗体亚型转变”旨在表示施用本发明的药物组合物后，对象中抗HBcAg抗体亚型关系转变为与乙肝治愈患者中的抗体亚型关系一致，即与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。特别地，在小鼠中，抗HBcAg抗体亚型由IgG1＞IgG2a转变为IgG2a＞IgG2b＞IgG1或者IgG2b＞IgG2a＞IgG1，例如IgG2a＞IgG1，在人中，抗HBc抗体亚型由IgG1＞IgG3＞IgG4转变为IgG3＞IgG1＞IgG4。
本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
本发明组合物的另一个实施方案，其包含i)HBsAg或该抗原的变体，ii)HBcAg1-183，和iii)含有21个碱基的硫代寡聚核苷酸CpG-ODN，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基序。
在一些实施方案中，本发明药物组合物中组分i)，ii)以及iii)之间的相对重量比范围是1∶0.2～5∶1～50，优选为1∶1～5∶2～15，更优选1∶1∶2。
在另一些实施方案中，本发明组合物还可包含另外的添加剂，如药物载体或添加剂，尤其是当它以药物制剂形式存在时。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物不包含皂苷佐剂。
优选的药物载体尤其是水，缓冲水溶液，优选等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用药物载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
实施例
实施例1.乙肝表面抗原(HBsAg)与乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用增强乙肝表面抗原特异性总IgG的免疫应答。
为了检测HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物的乙肝表面抗原特异性总IgG免疫应答，本发明人分别将HBsAg、HBcAg与CpG-ODN，HBsAg与Al(OH)3佐剂混匀，用其免疫小鼠，通过测定血清中HBsAg特异性IgG水平，并进行统计学分析，来评价相对于HBsAg与Al(OH)3联用，HBsAg、HBcAg与CpG-ODN联用对HBsAg特异性总IgG免疫应答的作用。
本实施例中使用BALB/c小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例所使用的HBsAg抗原购买自Prospec公司(批号：1111PHADW22，序列如SEQ ID NO：1所示)，为毕赤酵母表达的adw2亚型，纯度95％以上，4℃冰箱中保存备用。本实施例使用的HBcAg(序列如SEQ ID NO：2所示)抗原为发明人制备，为大肠杆菌表达的天然乙肝核心蛋白，纯化制备工艺参见李计来，徐静等在《中国生物制品学杂志》2011，第24卷第1121-1125页中的报道，具体步骤如下：收集菌体后用10mM磷酸钠缓冲液重悬，超声破碎，离心收集上清，加入饱和硫酸铵，使其终浓度为33％，充分混匀后4℃过夜；次日，离心，沉淀用10mM磷酸钠缓冲液重悬，放入透析袋，在10mM磷酸钠缓冲液中4℃透析24h；透析后的溶液经羟基磷灰石柱层析，收集蛋白峰，浓缩，经Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析，收集目的蛋白峰；4℃冰箱中保存备用。本实施例所用的CpG-ODN序列为5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’，参照CN200810004736.0专利所述的固相亚磷酰胺三酯法化学合成方法制备，由3’端开始，1)脱保护基：先用三氯乙酸脱去连接在CpG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；2)活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体与CpG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；3)连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基；4)氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸；5)封闭：缩合反应后为了防止连在CpG上的未参与反应的5’羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基；经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就连到CpG的核苷酸上；重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基、纯化、定量等合成后处理即可得到符合的CpG-ODN；-20℃冰箱中保存备用。
HBsAg和HBcAg用PBS(Invitrogen公司)稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。Al(OH)3佐剂购自天坛生物。对BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组10只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg。HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天采血并分离出血清，按照常规方法用2％脱脂奶对该血清以1∶30稀释倍数起始，再进行3倍系列稀释，用于检测抗原特异性IgG总抗体。
具体抗原特异性IgG总抗体的检测步骤如下：用HBsAg包被96孔酶标板(购自Nunc公司)，每孔25ng，4℃过夜；洗板2次后用5％脱脂奶37℃封闭1小时；洗板2次后加入上述3倍系列稀释的待检血清，37℃作用1小时；洗板3次后加入1∶30000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(购自美国SIGMA公司)，每孔50μl，37℃作用40分钟；洗板3次后用TMB(购自美国Thermo公司)显色，每孔100μl，显色15分钟；2M硫酸终止反应，每孔100μl，用酶标仪测定450nm处吸光值OD450nm(以OD630nm校正)，并确定终点滴度。结果显示在图1中。
由图1可见，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组的免疫应答显著增强，HBsAg特异性抗体滴度可达4.0个对数值，与HBsAg+Al(OH)3组比较，具有显著性差异(P＜0.001)，特异性抗体滴度(效价)可增加3倍左右。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗相比于Al(OH)3佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原特异性总IgG的免疫应答。
实施例2.乙肝表面抗原(HBsAg)与乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用增强乙肝表面抗原保护性抗体水平。
检测乙型肝炎病毒表面抗体的作用是监测乙肝疫苗的接种是否成功。乙肝疫苗刺激免疫系统产生相当于中和抗体的乙型肝炎病毒表面抗体，其效价与疫苗的保护力直接相关，所述抗体的产生对防止HBV感染具有显著效果。因此，本发明人选用了国际通用的ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)来检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBsAg)的浓度，并进行统计学分析，从而评价HBsAg+HBcAg+CpG-ODN的组合相对于HBsAg+Al(OH)3联用对增强保护性抗体水平的保护力效果。
本实施例中使用BALB/c小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例中所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al(OH)3佐剂如实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组10只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天采血并分离出血清。将血清进行原倍混血或个血用PBS溶液稀释(对于250＜IU＜1000，500倍稀释个血送样，IU＞1000，5000倍稀释个血送样)送至东南大学第二附属医院进行检测，用ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(ABBOTT公司ARCHITECT系统检测)，结果显示在图2中。
由图2可见，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组可显著增强保护性抗体水平，特异性保护抗体滴度可达4.3个对数值，与HBsAg+Al(OH)3组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，特异性保护抗体滴度(效价)可增加5倍左右。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗比Al(OH)3佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原保护性抗体水平，增强疫苗保护力。
实施例3.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th2免疫应答。
根据实施例1所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠Th2类免疫应答的影响，不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG1(购自美国SouthernBiotech公司)，稀释倍数为1∶20000。结果显示在图3中。
抗原特异性免疫应答分为Th1和Th2两种类型，其中Th2类应答与高水平的抗原特异性IgG1抗体滴度相对应。Al(OH)3是一种极强的Th2类疫苗佐剂，能够抑制Th1类免疫应答，表现为免疫后诱生高水平的特异性IgG1抗体。在本实施例中，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生的IgG1抗体水平比HBsAg+Al(OH)3组显著更高(P＜0.001)，HBsAg特异性IgG1抗体滴度(效价)可增加接近10倍。上述结果表明，本发明组合物能产生比Al(OH)3佐剂组还强的HBsAg特异性IgG1抗体，增强乙肝表面抗原Th2免疫应答。
实施例4.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th1免疫应答。
根据实施例1所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠Th1类免疫应答的影响，不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG2a(购自美国SouthernBiotech公司)，稀释倍数为1∶6000。结果显示在图4中。
实施例3中提到，Al(OH)3是一种极强的Th2类疫苗佐剂，能够抑制Th1类免疫应答，表现为免疫后诱生极低水平的特异性IgG2a抗体。在本实施例中，Al(OH)3作为HBsAg佐剂诱生的特异性IgG2a抗体滴度仅为2.17个对数值。用本发明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物免疫时，产生的HBsAg特异性IgG2a抗体滴度增加2个对数值左右，即100倍。上述结果表明，本发明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用极强地刺激针对乙肝表面抗原的Th1免疫应答。
实施例5.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用在体液免疫水平促进乙肝表面抗原Th1/Th2免疫应答平衡。
根据实施例3和实施例4所述，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物不仅对小鼠产生较高水平的Th2类免疫应答，同时也产生极高水平的Th1类免疫应答。Th1促进CTL反应即所谓的细胞免疫倾向，而Th2则促进抗体产生即所谓的体液免疫倾向，而治疗性乙肝疫苗的一个目的是清除血清中HBsAg抗原，这需要产生有效的保护性抗体，主要是体液免疫发挥作用；另一个目的是杀伤感染HBV的靶细胞，即CTL反应，需要细胞免疫发挥作用，所以Th1和Th2免疫应答都非常重要。为了更直接地说明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物和HBsAg+Al(OH)3对照组产生的免疫应答偏向于T1或Th2应答方向，将分析抗原特异性IgG2a/IgG1滴度比值(Log10)，结果显示在图5中，若比值小于0说明免疫应答偏向于Th2，大于0说明免疫应答偏向于Th1，接近0说明免疫应答趋于平衡。分析结果表明，Al(OH)3作为HBsAg佐剂的对照组产生的免疫应答主要以IgG1为主，偏向于Th2应答；而HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生的特异性IgG1和IgG2a相当，使免疫应答趋于Th1/Th2平衡。
实施例6.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN联用产生的抗HBcAg抗体亚型IgG2a＞IgG1。
乙肝感染患者治愈人群的抗HBcAg抗体亚型为IgG3＞IgG1＞IgG4，其在小鼠中对应的抗体亚型关系为IgG2a＞IgG2b＞IgG1或者IgG2b＞IgG2a＞IgG1。根据实施例3和实施例4所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠抗HBcAg抗体亚型IgG2a和IgG1滴度，考察本组合物是否可促进小鼠抗HBcAg抗体亚型转变为IgG2a＞IgG1，不同之处在于检测时所使用的包被抗原为1μg/ml HBcAg。结果显示在图6中。图6结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生的抗HBcAg抗体亚型IgG2a＞IgG1，且具有显著性差异(P＜0.001)。说明该组合物可促进小鼠抗HBcAg抗体亚型转变为乙肝感染治愈患者的抗体亚型。
实施例7.乙肝表面抗原、乙肝核心抗原与CpG-ODN联用在细胞免疫方面显著促进HBsAg CTL表位特异性Th1细胞分化和抑制Th2细胞增殖。
为了阐明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物联用在细胞免疫方面的作用，本发明人分别将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和Al(OH)3佐剂混匀，免疫小鼠，通过ELISPOT实验检测免疫小鼠脾细胞经HBsAgCTL表位刺激后特异性分泌IFN-γ和IL-4的水平，并进行统计学分析，即可评价HBsAg HBcAg、与CpG-ODN联用相对于HBsAg与Al(OH)3联用的促抗原特异性Th1细胞分化作用。
本实施例中所使用的为BALB/c小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al(OH)3佐剂如实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组5只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取脾，按常规方法制备脾淋巴细胞，具体如下：无菌操作取脾脏：用无菌镊子及剪刀剪取脾脏，放于70μm尼龙网筛(购自BD公司)中，置于含有5ml预冷处理的2％FBS(购自GIBCO公司)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾脏，脾脏细胞通过筛目进入平皿中，得到细胞悬液，用巴氏吸管将悬液放入经40μm尼龙网筛过滤(购自BD公司)的50ml无菌离心管；300×g，4℃离心10分钟；弃去上清，加入5ml 1×破红剂(购自BD公司)重悬细胞，室温作用5分钟，以破碎红细胞；加入5ml 2％FBS-PBS终止破红反应；300×g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入2ml 2％FBS-PBS重悬细胞备用。用Mouse IFN-γ/IL-4ELISPOT试剂盒(BD公司)检测抗原特异性的IFN-γ和IL-4分泌，刺激物为HBsAg的肽库。试验完成后，用ImmunoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。
HBsAg肽库，由54个15氨基酸的多肽片段组成，涵盖整个HBsAg全长序列，每对相邻多肽有11个氨基酸的相互重叠，代表所有可能的HBsAg CTL表位。HBsAg肽库的肽段设计如序列SEQ ID NO：7～SEQ IDNO：60所示。所有肽段由Chinese Peptide Company合成，纯化，分装和冻干。
具体抗原特异性的IFN-γ和IL-4分泌的检测步骤如下：用PBS稀释Mouse IFN-γ/IL-4(1∶200稀释，BD公司)，100μl/孔加至ELISPOT板，4℃包被过夜；弃去包被抗体，用封闭液(含10％FBS RPMI-1640培养液)洗孔1次，加入封闭液200μl/孔，室温孵育2h；采用10％FBS-1640培养基稀释肽库至10μg/ml；采用10％FBS-1640培养基稀释ConA至20μg/ml作为阳性对照；弃去封闭液，将1×107细胞/ml的脾淋巴细胞悬液与配置好的肽库或ConA对照按100μl/孔分别加入96孔板中，一式两孔重复；于37℃5％CO2培养箱孵育24h；弃去细胞悬液，用去离子水洗板2次，3-5m/次，用PBST洗涤3次，200μl/孔，加入用10％FBS PBS稀释的Mouse IFN-γ/IL-4 ELISPOT detection Antibody(1∶250稀释，BD公司)，100μl/孔，室温孵育2h；弃去检测抗体，用PBST洗板4次，200μl/孔，加入用10％FBS PBS稀释Streptavidian-HRP(1∶100稀释，BD公司)，100μl/孔，室温孵育1h；弃去酶结合物，用PBST洗4次，再用PBS洗3次，加入AEC底物100μl/孔显色，肉眼观察斑点形成，加去离子水终止反应；在ImmunoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。结果显示在图7中。
Th1细胞主要抗原特异性分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β/等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成，Th2细胞主要抗原特异性分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。IFN-γ可诱导Th1细胞分化，但抑制Th2细胞增殖；IL-4诱导Th2细胞分化。本实施例中，用ELISPOT检测免疫小鼠的脾细胞的抗原特异性IFN-γ和IL-4的分泌水平，结果Al(OH)3作为HBsAg佐剂分泌HBsAg特异性IL-4水平高于IFN-γ，说明Al(OH)3佐剂主要刺激B细胞增殖产生抗体，而用本发明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物分泌HBsAg特异性IFN-γ水平远高于IL-4水平，说明本发明组合物主要参与HBsAg特异性细胞免疫，促进Th1细胞分化，达到Th1/Th2细胞增殖平衡，因此兼具有杀伤感染HBV的肝细胞和清除游离HBV病毒的潜能。
实施例8.HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用在产生抗原特异性IgG抗体水平上具有协同作用
为了考察HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用是否有协同作用，本发明人分别将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中HBsAg特异性总IgG，并进行统计学分析，即可评价HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用产生的抗原特异性IgG抗体水平上具有协同作用。
本实施例中所使用的为BALB/c小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al(OH)3佐剂如实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组10只小鼠。
HBsAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg和2μg CpG-ODN，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天采血并分离出血清，按照常规方法用2％脱脂奶对该血清以1∶30稀释倍数起始，再进行3倍系列稀释，用于检测抗原特异性IgG总抗体。
根据实施例1所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组和HBsAg+CpG-ODN组产生的HBsAg特异性抗体滴度。结果显示在图8中。
由图8可见，HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用相对于HBsAg+CpG-ODN组产生的HBsAg特异性IgG水平更高，特异性抗体滴度可达4.0个对数值，具有显著性差异(P＜0.01)，特异性抗体滴度(效价)可增加3倍左右。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在加入HBcAg后比HBsAg+CpG-ODN联用产生显著更高的HBsAg特异性IgG抗体水平，证明HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有协同作用。
实施例9.HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用比HBsAg+CpG-ODN在细胞免疫方面促进HBsAg特异性的Th1细胞分化。
实施例8中在体液免疫方面考察了HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有协同作用，本发明人还在细胞免疫方面分析了HBcAg、HBsAg和CpG-ODN联用是否促进HBsAg的Th1细胞分化，从而进一步验证HBcAg、HBsAg和CpG-ODN的协同作用。
分别将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg与CpG-ODN佐剂混匀，免疫小鼠，通过ELISPOT实验检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平，即可评价HBsAg与HBcAg、CpG-ODN联用相对于HBsAg+CpG-ODN联用对促进HBsAg的Th1细胞分化的趋势。
本实施例中所使用的为BALB/c小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组10只小鼠。HBsAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg和2μg CpG-ODN，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取脾，按常规方法制备脾淋巴细胞，用Moμse IFN-γ/IL-4 ELISPOT试剂盒(BD公司)检测IFN-γ和IL-4，刺激物为HBsAg的肽库(具体序列如实施例7所述)。实验完成后，用ImmunoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。
根据实施例7所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物和HBsAg+CpG-ODN组脾细胞HBsAg表位特异性IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果显示在图9中。
由图9可见，HBcAg与HBsAg+CpG-ODN联用相对于HBsAg+CpG-ODN组分泌的HBsAg特异性IFN-γ水平高，而HBsAg特异性IL-4水平低，表明本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物相比于HBsAg+CpG-ODN联用在细胞免疫方面更能促进HBsAg特异性的Th1细胞分化，说明HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有协同作用。
实施例10.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物突破HBV转基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)的免疫耐受。
为了验证HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用能否在HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上突破免疫耐受，本发明人分别将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和Al(OH)3佐剂混匀，免疫小鼠，测定血清中HBsAg特异性总IgG和保护性抗体IU水平，并进行统计学分析，从而评价HBsAg、HBcAg和CpG-ODN联用相对于HBsAg和Al(OH)3联用对突破免疫耐受的影响。
本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种：第一种为HBV转基因小鼠，血清型为adr血清型，雄性，10-12周，购自上海南方模式动物中心；第二种为B10.M小鼠，为组织相容性小鼠，具有免疫耐受，雄性，6-8周，购自The Jackson Laboratory；所使用的HBsAg、HBcAg和、CpG-ODN和Al(OH)3佐剂如实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组4只小鼠。
HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和10μg CpG-ODN。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫6次，按照实施例1中所述方法检测HBsAg特异性IgG总抗体，结果显示在图10中，按照实施例2中所述方法检测产生的HBsAg抗体，结果显示在图11中。
由图10可见，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物组可突破两种模型小鼠的免疫耐受，HBsAg特异性IgG抗体滴度可达4.0个对数值以上，与HBsAg+Al(OH)3组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，HBsAg特异性IgG抗体滴度(效价)可增加10-200倍；由图11可见，保护性抗体水平可达2.5个对数值以上，与HBsAg+Al(OH)3组比较，产生的保护性抗体水平高可增加5-20倍。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗比Al(OH)3佐剂乙肝疫苗在免疫耐受小鼠上能显著增强乙肝表面抗原特异性的总IgG和保护性抗体的免疫应答，更能有效的突破免疫耐受。
实施例11.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在HBV转基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)，产生高滴度抗HBcAg的特异性IgG抗体。
为了验证HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用能否在HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上，产生抗HBcAg的特异性IgG抗体，本发明人将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中HBcAg特异性总IgG水平。
本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种，如实施例10所述；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。每只小鼠经左后肢腓肠肌注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和10μg CpG-ODN。每只小鼠，注射体积为100μl，每组4只小鼠。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫6次，按照实施例1中所述方法检测HBcAg抗原特异性IgG总抗体，不同之处在于，包被抗原为1μgHBcAg抗原，结果显示在图12中。
由图12可见，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物可在两种模型小鼠上，产生高滴度的抗HBcAg特异性IgG抗体，在一免后二周抗体滴度即可达2.5个对数值以上，此后抗体滴度可达4.0个对数值以上。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生高滴度抗HBcAg的特异性IgG抗体。
实施例12.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在HBV转基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)中产生的抗HBcAg抗体亚型IgG2a＞IgG1。
为了验证HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用在HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上产生的抗HBcAg抗体亚型IgG2a＞IgG1，本发明人将HBsAg、HBcAg和CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中抗HBcAg抗体亚型IgG2a和IgG1滴度。
本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种，如实施例10所述；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。每只小鼠经左后肢腓肠肌注射1μg HBsAg、1μg HBcAg和10μg CpG-ODN。每只小鼠，注射体积为100μl，每组4只小鼠。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫6次，按照实施例6中所述方法检测抗HBcAg抗体亚型IgG2a和IgG1滴度，结果显示在图13中。
图13结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在HBV转基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)中产生在的抗HBcAg抗体亚型IgG2a＞IgG1，且具有显著性差异(P＜0.01)。
实施例13.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物有清除HBV转基因小鼠中HBsAg抗原的趋势。
对HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物突破HBV转基因小鼠免疫耐受，并产生抗原特异性抗体的小鼠进行分析，研究它们体内HBsAg表达量是否可以出现下降趋势，验证抗体对血清中HBsAg抗原的清除情况。
本实施例中所使用的为HBV转基因小鼠，血清型为adr血清型(从C57小鼠改造而来)，雄性，10-12周，购自上海南方模式动物中心；所使用的HBsAg、HBcAg、CpG-ODN和Al(OH)3佐剂如实施例1中所述。
HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。对小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为100μl，每组4只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg；HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μg HBsAg、1μgHBcAg和10μg CpG-ODN。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫6次，按照常规方法用2％脱脂奶对免疫前、五免二周和六免二周后的血清以1∶200稀释，用实施例1中所述HBsAg抗原作为标准品，用C57小鼠(购自上海斯莱克公司)血清按1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8ng/ml进行稀释作为起始浓度，再用2％脱脂奶进行1∶200稀释，然后将稀释的样品和标准品用HBsAg抗原检测试剂盒(上海科华公司)检测HBsAg抗原浓度。用测定的标准曲线计算免疫前、五免二周和六免二周后个鼠血清中含有的HBsAg抗原浓度，并计算五免二周、六免二周后HBsAg抗原浓度下降％。结果显示在图14中。
具体HBsAg抗原浓度的检测步骤如下：取出预包被抗HBsAg的反应板，加入75μl稀释的血清和阴、阳性对照于反应孔中；用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育1h；取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性、阳性对照孔中加入50μl酶结合物；微孔振荡器上震荡10s；用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30m；取出反应板，撕去封片，洗涤反应板5次；洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A、显色剂B各50μl，混匀；微孔振荡器上震荡10s；用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30m；在所有孔内加入50μl终止液，震荡反应5s，使之充分混匀。酶联仪测定OD450nm值(以OD630nm校正)。
由图14所示，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物组在HBV转基因小鼠上的HBsAg抗原浓度下降％高于HBsAg+Al(OH)3组，具有显著性差异(P＜0.05)。表明该组合物具有清除HBsAg抗原并使HBsAg抗原转阴的趋势，为慢性乙肝治疗性疫苗打下坚实的基础。
在本申请中，多个出版物在括号中被引用。由此，这些出版物的公开以整体通过引用并入本申请，以更完整的描述与本发明相关的技术的状态。
尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

Claims (14)

1.一种药物组合物，其包含：
i)乙肝表面抗原(HBsAg)，
ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，
iii)CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)，和
iv)可药用载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其用作预防性或治疗性疫苗。
3.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述HBsAg具有SEQ ID NO：1所示序列。
4.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述HBcAg具有SEQ ID NO：2所示序列。
5.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接，优选地所述CpG-ODN是全硫代寡聚脱氧核苷酸。
6.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述CpG-ODN包含两个或更多个5’-NTCGTT-3’基序。
7.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述CpG-ODN长度为15～35个核苷酸，优选20～25个核苷酸。
8.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述CpG-ODN具有选自下列的序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’(SEQID NO：3)、5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3’(SEQ IDNO：4)、5’-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TCC ATGACG TTC CTGACG TT-3’(SEQ ID NO：6)，优选地所述CpG-ODN具有序列：5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’(SEQ ID NO：3)。
9.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中组分i)，ii)以及iii)之间的相对重量比范围是1∶0.2～5∶1～50，优选为1∶1～5∶2～15。
10.一种药盒，其包含权利要求1-9任一项的药物组合物以及其使用说明。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病之药物中的用途，优选地所述HBV感染和/或HBV介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中产生针对HBV的免疫应答之药物中的用途。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中使抗HBc抗体发生亚型转变之药物中的用途。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之药物中的用途。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873969A (zh) * 2015-04-16 2015-09-02 江苏赛锘威生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗
CN107693788A (zh) * 2017-08-21 2018-02-16 南京赛威信生物医药有限公司 一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
CN111346223A (zh) * 2018-12-24 2020-06-30 南京远大赛威信生物医药有限公司 用于治疗乙型肝炎的药物制剂及其制备方法和用途
CN111728955A (zh) * 2020-06-19 2020-10-02 中山大学 一种用于乙肝治疗的纳米颗粒及其制备方法和治疗性疫苗
WO2021115409A1 (zh) 2019-12-13 2021-06-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 药物组合物及其用途
CN113058033A (zh) * 2019-12-16 2021-07-02 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 一种用于预防和治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
RU2815763C1 (ru) * 2019-12-13 2024-03-21 Гранд Теравак Лайф Сайенс (Наньцзин) Ко., Лтд. Композиция для иммуностимуляции и ее применение

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3023022A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
GB201721069D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
MX2022003658A (es) 2019-09-30 2022-04-25 Gilead Sciences Inc Vacunas contra el virus de la hepatitis b (vhb) y metodos para tratar el vhb.
CN114409802B (zh) * 2020-12-31 2023-10-20 中国科学院微生物研究所 禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用
CN114437185B (zh) * 2020-12-31 2023-06-27 中国科学院微生物研究所 冠状病毒三聚体亚单位疫苗及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007031334A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Vaccines comprising truncated hbc core protein plus saponin-based adjuvants
CN101492672A (zh) * 2008-01-23 2009-07-29 许洪林 具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用
CN101500601A (zh) * 2005-04-18 2009-08-05 诺华疫苗和诊断公司 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原
CN102462840A (zh) * 2010-11-09 2012-05-23 中国科学院微生物研究所 乙肝治疗性疫苗

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4547367A (en) 1983-12-20 1985-10-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatitis B core antigen vaccine
US6689363B1 (en) * 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
ES2374812T3 (es) * 2000-08-11 2012-02-22 Advanced Life Science Institute, Inc. Método para detectar o medir vhb.
CN101559224B (zh) * 2008-04-18 2012-07-11 北京生物制品研究所 脊髓灰质炎疫苗
CN101675994B (zh) * 2008-09-19 2012-07-25 齐鲁制药有限公司 治疗性疫苗制剂
WO2010120874A2 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
PE20161560A1 (es) 2009-09-03 2017-01-11 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de pcsk9
CU23740A1 (es) * 2009-09-29 2011-12-28 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método de obtención de una formulación de antígenos del virus de la hepatitis b

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101500601A (zh) * 2005-04-18 2009-08-05 诺华疫苗和诊断公司 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原
WO2007031334A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Vaccines comprising truncated hbc core protein plus saponin-based adjuvants
CN101492672A (zh) * 2008-01-23 2009-07-29 许洪林 具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用
CN102462840A (zh) * 2010-11-09 2012-05-23 中国科学院微生物研究所 乙肝治疗性疫苗

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873969A (zh) * 2015-04-16 2015-09-02 江苏赛锘威生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗
CN104873969B (zh) * 2015-04-16 2018-06-19 南京赛威信生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗
CN107693788A (zh) * 2017-08-21 2018-02-16 南京赛威信生物医药有限公司 一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
CN107693788B (zh) * 2017-08-21 2022-10-11 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
CN111346223A (zh) * 2018-12-24 2020-06-30 南京远大赛威信生物医药有限公司 用于治疗乙型肝炎的药物制剂及其制备方法和用途
WO2020134682A1 (zh) 2018-12-24 2020-07-02 南京远大赛威信生物医药有限公司 用于治疗乙型肝炎的药物制剂及其制备方法和用途
CN111420043A (zh) * 2018-12-24 2020-07-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 一种治疗乙型肝炎的药物组合物、其制备方法及用途
TWI827732B (zh) * 2018-12-24 2024-01-01 大陸商遠大賽威信生命科學（南京）有限公司 用於治療b型肝炎的藥物製劑及其製備方法和用途
CN112972670A (zh) * 2019-12-13 2021-06-18 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 免疫刺激组合物及其用途
WO2021115410A1 (zh) 2019-12-13 2021-06-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 免疫刺激组合物及其用途
WO2021115408A1 (zh) 2019-12-13 2021-06-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 药物组合物及其用途
CN112972671A (zh) * 2019-12-13 2021-06-18 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 药物组合物及其用途
CN112972672A (zh) * 2019-12-13 2021-06-18 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 药物组合物及其用途
WO2021115409A1 (zh) 2019-12-13 2021-06-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 药物组合物及其用途
CN112972670B (zh) * 2019-12-13 2023-12-19 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 免疫刺激组合物及其用途
RU2815763C1 (ru) * 2019-12-13 2024-03-21 Гранд Теравак Лайф Сайенс (Наньцзин) Ко., Лтд. Композиция для иммуностимуляции и ее применение
CN112972671B (zh) * 2019-12-13 2024-04-19 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 药物组合物及其用途
CN112972672B (zh) * 2019-12-13 2024-04-19 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 药物组合物及其用途
CN113058033A (zh) * 2019-12-16 2021-07-02 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 一种用于预防和治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
CN113058033B (zh) * 2019-12-16 2024-07-09 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 一种用于预防和治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
CN111728955A (zh) * 2020-06-19 2020-10-02 中山大学 一种用于乙肝治疗的纳米颗粒及其制备方法和治疗性疫苗

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