CN111728955A - 一种用于乙肝治疗的纳米颗粒及其制备方法和治疗性疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于乙肝治疗的纳米颗粒及其制备方法和治疗性疫苗。所述纳米颗粒包含HBsAg或HBcAg蛋白、免疫佐剂CpG、阳离子聚合物和阴离子聚合物。本发明提供了同时包裹HBsAg和免疫佐剂的纳米颗粒，以及同时包裹HBcAg和免疫佐剂的纳米颗粒，其形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好、粒径均一、包封率高、无明显粘连、破损、坍塌等现象，通过采用CpG免疫佐剂，同时纳米颗粒粒径小，具有更强的免疫活性；所述两种纳米颗粒混合联用可以打破免疫耐受、激活免疫反应、有效清除HBV，实现慢性乙肝的治愈。
Description
技术领域
本发明涉及治疗性疫苗技术领域，更具体地，涉及一种用于乙肝治疗的纳米颗粒及其制备方法和治疗性疫苗。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界上最常见的慢性病毒感染，全世界大约20亿人感染了乙型肝炎病毒，其中有3.5亿人成为慢性乙肝携带者。在慢性乙肝感染过程中，会引起肝脏低程度的炎症，同时伴随短暂的高程度的炎症发生和肝纤维化的激活，从而引发肝纤维化和肝硬化的发生，最终导致代偿性肝脏疾病和肝细胞癌的发生。慢性乙肝感染在全球多个地区流行，西太平洋和非洲的情况尤为严重。早在2010年的全球疾病负担研究中，HBV感染已经是世界上最重要的公共卫生问题之一，是引起死亡的第十大疾病，全球每年大约有78万人死于HBV感染。尽管现在的HBV预防疫苗，可以安全有效地阻断HBV传播，早在2015时，WHO估计全球仍有2.6亿乙肝病毒携带者，相当于全球人口的3.5％。这些人大多都是在HBV疫苗问世前出生的，所以慢性HBV感染仍然是严重的公共健康问题。
现在临床上主要有两类药物治疗慢性乙肝：一种是IFN-a，一方面它可以激活干扰素刺激基因，产生抗病毒蛋白，在病毒复制的各个阶段，发挥抗病毒作用；另一方面，IFN-α具有免疫调节作用，通过促进NK细胞、CD8+T细胞的胞毒作用等细胞介导的免疫反应，直接发挥抗病毒作用。另一种是核苷类似物，主要是通过抑制HBV RNA逆转录形成HBV DNA，发挥抗病毒作用。但是这两类药物又有明显的缺陷性：干扰素虽然可以完全清除HBV，但是它会引起流感样症状、骨髓抑制、抑郁、疲劳等副作用，很多病人不能承受这些严重的副作用，从而限制了IFN-a在临床上的应用。核苷类似物，它只能够抑制HBV DNA的复制，不能清除HBV，而且核苷类似物需要病人长期服用。长期服用核苷类似物，一方面会使病毒发生变异，产生耐药性；另一方面，会使病人产生严重的经济负担。
目前研究中的乙肝治疗性疫苗，主要有乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗、乙肝表面抗原-乙肝表面抗体复合物疫苗、乙肝表面抗原-乙肝核心抗原疫苗、乙肝表面抗原表位疫苗和乙肝DNA疫苗等，这些研究中的疫苗都是使用铝佐剂、皂苷等传统佐剂，它们可以激活一定的体液免疫，却不能有效地激活细胞免疫。然而细胞免疫对于HBV的清除发挥十分重要的作用，因此这些目前研究中的乙肝治疗性疫苗，在临床试验中都没有达到理想的治疗效果。专利CN 105288613 A公开了一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗，其免疫活性依然有待提高，且纳米颗粒的粒径较大，在抗原呈递方面还有待提高；另外其制备过程复杂，且过程中使用有机溶剂，容易带来安全问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于乙肝治疗的纳米颗粒。
本发明的另一目的在于提供所述的用于乙肝治疗的纳米颗粒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种新型乙肝治疗性纳米疫苗。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种乙肝治疗性纳米颗粒，包含HBsAg或HBcAg蛋白、免疫佐剂CpG、阳离子聚合物和阴离子聚合物。
本发明首先分别提供两种包含HBcAg和CpG的纳米颗粒或包含HBsAg和CpG的纳米颗。乙肝表面抗原(HBsAg)是位于乙肝病毒外膜上的一种蛋白，是一个广泛认可的具有免疫原性的HBV抗原，宿主中和抗体的重要作用位点，也是疫苗设计的关键靶点，已经作为抗原用于乙肝预防性疫苗中。乙肝核心抗原是位于乙肝病毒核心中的一种蛋白，能引起显著的T细胞和B细胞应答，具有佐剂作用。CpG ODN是一种细菌来源的非甲基化的核苷酸序列，可以与抗原呈递细胞(APCs)中的Toll样受体结合，促进APC细胞的成熟和活化，进而增强免疫反应。本发明两种包含HBcAg和CpG的纳米颗粒和包含HBsAg和CpG的纳米颗粒，其粒径在50～200nm，更容易被抗原呈递细胞(APCs)捕获并向T细胞呈递抗原，促使T细胞和B细胞成熟活化，增强免疫效果。本发明设计了同时包裹HBsAg和免疫佐剂的纳米颗粒，以及同时包裹HBcAg和免疫佐剂的纳米颗粒，将这两种纳米颗粒共同使用，作为HBV治疗性纳米疫苗，可以打破免疫耐受、激活免疫反应、清除HBV，实现慢性乙肝的治愈。
具体地，所述纳米颗粒为核壳结构，核为HBsAg或HBcAg蛋白与免疫佐剂，壳为阳离子聚合物和阴离子聚合物。优选地，所述HBsAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述HBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述免疫佐剂为CpG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述阳离子聚合物为PEI(聚醚酰亚胺)、聚赖氨酸或壳聚糖中的一种或多种。
进一步优选地，所述阳离子聚合物为壳聚糖。
优选地，所述阴离子聚合物为肝素、TPP(硫胺素焦磷酸)或透明质酸中的一种或多种。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为50～200nm，例如50～70nm、70～90nm、90～111nm、110～130nm、130～150nm、150～170nm或170nm～200nm。
优选地，所述纳米颗粒的Zeta电位为+18至+30mV，例如+18至+20mV、+20至+22mV、+22至+24mV、+24至+26mV、+26至+28mV或+28至+30mV。
优选地，所述HBsAg或HBcAg蛋白的包封率为60％～90％，例如60％～65％，65％～70％，70％～75％、75％～80％、80％～85％或85％～90％。
优选地，所述免疫佐剂的包封率为65％～95％，例如65％～70％，70％～75％、75％～80％、80％～85％、85％～90％或90％～95％。
优选地，制备纳米颗粒时，所述HBsAg或HBcAg蛋白：免疫佐剂：阳离子聚合物：阴离子聚合物的质量比为1～3:10～15:40～50:25～35。
进一步优选地，所述HBsAg或HBcAg蛋白：免疫佐剂：阳离子聚合物：阴离子聚合物的质量比为1:1.2:45:30
本发明还提供所述的乙肝治疗性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.提供包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；
S2.使包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过第1通道、第2通道、第3通道和第4通道到达混合区域中，进行混合，得混合液；
S3.将混合液过滤，浓缩，即得纳米颗粒。
优选地，所述包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.4～0.6mg/mL：0.1～0.5mg/mL：5～20μg/mL：5～20μg/mL。
进一步优选地，所述包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.45mg/mL：0.3mg/mL：10μg/mL：12μg/mL。
优选地，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在通道中都以匀速流动。
优选地，包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液在通道中的流速相同。
进一步优选地，所述流速为1～20mL/min，例如1～5mL/min、5～10mL/min10～15mL/min或15～20mL/min。
在rAAV-1.3HBV建立的慢性乙肝小鼠模型中，本发明制备的这两种纳米颗粒联合使用，共同经足底皮下注射后，能产生强烈的免疫效果，可以打破免疫耐受，产生高滴度的乙肝表面抗体(HBsAb)，引起特异的针对HBsAg的细胞毒T淋巴细胞反应，有效清除血液和肝脏中的HBV，具有非常显著的协同增效。因此，本发明还提供一种免疫原性组合物，包含上述两种用于乙肝治疗的纳米颗粒。即上述包含HBsAg的纳米颗粒和包含HBcAg蛋白的纳米颗粒。
优选地，还包含药学上可接受的辅料。
进一步优选地，所述免疫原性组合物为疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了同时包裹HBsAg和免疫佐剂的纳米颗粒，以及同时包裹HBcAg和免疫佐剂的纳米颗粒，其形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好、粒径均一、包封率高、无明显粘连、破损、坍塌等现象，通过采用CpG免疫佐剂，同时纳米颗粒粒径小，具有更强的免疫活性；且纳米颗粒制备过程简单，不涉及有机溶剂，更安全环保，易于产业化。在rAAV-1.3HBV建立的慢性乙肝小鼠模型中，本发明制备的这两种纳米颗粒混合联用，共同经足底皮下注射后，能产生强烈的免疫效果，可以打破免疫耐受，产生高滴度的乙肝表面抗体(HBsAb)，引起特异的针对HBsAg的细胞毒T淋巴细胞反应，有效清除血液和肝脏中的HBV，效果显著优于单独使用其中一种纳米颗粒及游离HBsAg+HBcAg+CpG的免疫效果。
附图说明
图1为本发明chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒制备的示意图。
图2为本发明chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒制备的示意图。
图3为本发明chitosan-CpG-heparin纳米颗粒制备的示意图。
图4为本发明实施实例1中chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒的透射电镜图。
图5为本发明实施实例1中chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒的透射电镜图。
图6为本发明实施实例1中chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图7为本发明实施实例1中chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图8为本发明实施实例1中chitosan-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图9为本发明实施实例2中chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图10为本发明实施实例2中chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图11为本发明实施实例3中chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图12为本发明实施实例3中chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒的粒径分布图。
图13为免疫后血清中HBsAg的浓度。
图14为末次免疫2周后血清中HBsAb的浓度。
图15为末次免疫2周后血清中IFN-γ滴度。
图16为末次免疫2周后产生HBsAb的脾细胞的数目。
图17为末次免疫2周后血清中HBV DNA的拷贝数。
图18为末次免疫2周后肝脏中HBV DNA的拷贝数。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所用的HBsAg蛋白是通过基因工程的方法，由毕赤酵母表达系统产生，再经纯化获得，序列为HBV外膜上的小S蛋白(Genebank Accession:AAK38523.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所用的HBcAg蛋白是通过基因工程的方法，由大肠杆菌表达系统表达产生，再经纯化获得的，序列为HBV核心蛋白(Genebank Accession:ATB54883.1)N段149个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明所用的CpG ODN是CpG ODN1826属于B类CpG ODN，是通过人工合成的方法制备，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例1纳米颗粒的制备方法
一、方法
1、溶液配制
(1)将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积分数为1％的乙酸，过夜搅拌，滤纸过滤后，得到浓度0.45mg/mL的壳聚糖(chitosan)溶液。
(2)将肝素分散于灭菌的蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为0.3mg/mL肝素(heparin)溶液。
(3)将HBsAg抗原溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为10μg/mL的HBsAg抗原溶液。
(4)将HBcAg溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为浓度为10μg/mL的HBcAg溶液。
(5)将CpG溶解于蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为12μg/mL的CpG溶液。
2、快速纳米络合(FNC)
(1)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图1)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBsAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为10mL/min，可获得溶液A。
(2)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图2)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBcAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为10mL/min，可获得溶液B。
(3)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图3)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：纯水溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为5mL/min，可获得溶液C。
3、将溶液A、B或者C用300KD的超滤管，4℃6000g/min超滤浓缩10min，可获得性纳米疫苗或纳米佐剂。
二、表征、测试
(1)经透射电镜观察，上述制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin(如图4所示)和chitosan-HBcAg-CpG-heparin(如图5)这两种纳米疫苗形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好、无明显粘连、破损、坍塌等现象。
(2)经动态光散射和Zeta电位分析，chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为89.8nm(如图6)，粒径分布窄，Zeta电位为+24.5mv，chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为77.4nm(如图7)，粒径分布窄，Zeta电位为+22.9mv。chitosan-CpG-heparin纳米颗粒粒径为72.5nm(如图8)，粒径分布窄，Zeta电位为+25.3。
(3)chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBsAg和CpG包封率的计算。
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBsAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBsAg的含量，计算颗粒中HBsAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃6000g离心20min，取上清记录体积后，用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒检测上清中游离CpG的含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBsAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBsAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBsAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方法制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中，HBsAg的包封率为85.1％，CpG的包封率为84.8％。
(4)chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBcAg和CpG包封率的计算。
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBcAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBcAg的含量，计算颗粒中HBcAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃6000g离心20min，取上清记录体积后，采用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒，检测上清中CpG含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBcAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBcAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBcAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒，HBcAg的包封率是88.6％，CpG的包封率是84.9％。
(5)chitosan-CpG-heparin纳米颗粒中CpG包封率的计算。
取本实施方式制备的chitosan-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃6000g离心20min，取上清记录体积后，采用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒，检测上清中CpG含量，计算颗粒中CpG的包封率。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方式制备的chitosan-CpG-heparin纳米颗粒，CpG的包封率是92.6％。
实施例2纳米颗粒的制备方法
一、方法
1、溶液配制
(1)将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积分数为1％的乙酸，过夜搅拌，滤纸过滤后，得到浓度0.45mg/mL的壳聚糖(chitosan)溶液。
(2)将肝素分散于灭菌的蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为0.3mg/mL肝素(heparin)溶液。
(3)将HBsAg抗原溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为10μg/mL的HBsAg抗原溶液。
(4)将HBcAg溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为浓度为10μg/mL的HBcAg溶液。
(5)将CpG溶解于蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为12μg/mL的CpG溶液。
2、快速纳米络合(FNC)
(1)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图1)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBsAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为15mL/min，可获得溶液A。
(2)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图2)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBcAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为15mL/min，可获得溶液B。
3、将溶液A或B用300KD的超滤管，4℃6000g/min超滤浓缩10min，可获得性纳米疫苗。
二、表征、测试
(1)经动态光散射和Zeta电位分析，chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为71.1nm(如图9)，粒径分布窄，Zeta电位为+18.5mv，chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为53.4nm(如图10)，粒径分布窄，Zeta电位为+21.9mv。
(2)chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBsAg和CpG包封率的计算
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBsAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBsAg的含量，计算颗粒中HBsAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒检测上清中游离CpG的含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBsAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBsAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBsAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方法制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中，HBsAg的包封率为75.1％，CpG的包封率为78.8％。
(3)chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBcAg和CpG包封率的计算
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBcAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBcAg的含量，计算颗粒中HBcAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒，检测上清中CpG含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBcAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBcAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBcAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒，HBcAg的包封率是75.6％，CpG的包封率是72.6％。
实施例3纳米颗粒的制备方法
一、方法
1、溶液配制
(1)将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积分数为1％的乙酸，过夜搅拌，滤纸过滤后，得到浓度0.45mg/mL的壳聚糖(chitosan)溶液。
(2)将肝素分散于灭菌的蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为0.3mg/mL肝素(heparin)溶液。
(3)将HBsAg抗原溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为10μg/mL的HBsAg抗原溶液。
(4)将HBcAg溶解于蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为浓度为10μg/mL的HBcAg溶液。
(5)将CpG溶解于蒸馏水中，磁力搅拌下，搅拌5min，0.22μm滤膜过滤后，得到浓度为12μg/mL的CpG溶液。
2、快速纳米络合(FNC)
(1)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图1)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBsAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为5mL/min，可获得溶液A。
(2)利用快速纳米络合(FNC)的方法(如图2)，通道1：壳聚糖溶液；通道2：肝素溶液；通道3：含HBcAg抗原溶液；通道4：含佐剂CpG的溶液，各个通道中溶液体积均为5mL，注射泵的流速为5mL/min，可获得溶液B。
3、将溶液A或B用300KD的超滤管，4℃12000rpm/min超滤浓缩10min，可获得性纳米疫苗。
二、表征、测试
(1)经动态光散射和Zeta电位分析，chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为177.2nm(如图11)，粒径分布窄，Zeta电位为+25.5mv，chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒粒径为120.2nm(如图12)，粒径分布窄，Zeta电位为+26.3mv。
(2)chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBsAg和CpG包封率的计算
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBsAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBsAg的含量，计算颗粒中HBsAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒检测上清中游离CpG的含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBsAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBsAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBsAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方法制备的chitosan-HBsAg-CpG-heparin纳米颗粒中，HBsAg的包封率为62.7％，CpG的包封率为68.4％。
(3)chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒中抗原HBcAg和CpG包封率的计算
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用HBcAg Elisa试剂盒，检测上清中游离HBcAg的含量，计算颗粒中HBcAg的包封率。
取本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒溶液，4℃ 6000g离心20min，取上清记录体积后，采用Quant-iT OliGreen ssDNA试剂盒，检测上清中CpG含量，计算颗粒中CpG的包封率。
HBcAg包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的HBcAg蛋白总量；w1为上清中游离的HBcAg蛋白总量。
CpG包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG总量；w1为上清中游离的CpG总量。
本实施方式制备的chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米颗粒，HBcAg的包封率是65.6％，CpG的包封率是68.2％。
实施例4
本实施例与实施例1不同的是：可将通道1中壳聚糖溶液改为PEI、聚赖氨酸等聚阳离子聚合物，其他与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1不同的是：可将通道2中肝素溶液为改为TPP、透明质酸等聚阴离子聚合物，其他与具体实施方式1或2相同。
实施例6
本实施例与实施例1不同的是：可将通道4中CpG ODN1826改为CpG ODN2006等A类CpG ODN、CpG ODN2216等B类CpG ODN和CpG ODN2395等C类CpG ODN，其他与具体实施方式1-3相同。
实施例7纳米颗粒疫苗免疫效果评价
一、免疫试验设置
采用实施例1中制备得到的chitosan-HBsAg-CpG-heparin、chitosan-HBcAg-CpG-Heparin和chitosan-CpG-heparin进行下述免疫试验。
将HBV小鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组5只。采用足底注射的注射方式。A组接种PBS(Non-trerat)，B组接种chitosan-Heparin(eNP)，C组接种Alum-HBsAg-HBcAg(Alum-S-C)，D组接种HBsAg-HBcAg-CpG(S-C-G)，E组接种chitosan-HBsAg-CpG–heparin和chitosan-CpG–heparin(NPS+NPG)，F组接种chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-Heparin(NPS+NPC)。A、B、C、D、E、F组每只小鼠接种100μL相应的制剂。C、D、E、F组中每只小鼠接种HBsAg抗原量均为2μg，接种HBcAg抗原量均为2μg。D、E、F组中每只小鼠接种CpG的量为3.9μg。每两周免疫一次，免疫3次。
其中，Alum-HBsAg-HBcAg：是将1体积的Alum和1体积的HBsAg，HBcAg的混合溶液，混合后得到的，其中HBsAg和HBcAg的质量比为1:1。
HBsAg-HBcAg-CpG：是将HBsAg、HBcAg和CpG溶液，按照质量比1:1:1.95，混合后得到的。
二、疫苗免疫效果评价
1、小鼠血清中HBsAg检测
免疫后，每两周眼眶采血，Elisa定量检测血清中HBsAg的浓度。
(1)将采集的血清稀释5倍，加入到HBsAg试剂盒中的96孔板中，同时将标准品也加入到96孔板中，同时加入阴性对照和阳性样品对照。
(2)将96孔板，置于37℃中孵育1h。
(3)除空白孔外，每孔加入50μL的酶标试剂，置于37℃孵育30min。
(4)将板洗5次，每孔加显色剂A、B液各50μL，37℃避光下显色30min。
(5)每孔加入终止液50μL，450nm处检测OD值。
(6)根据标准品的OD值，建立标准曲线，计算各组HBsAg的浓度。
结果显示，一免两周后，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗组血清中HBsAg的浓度开始降低，低于Alum-HBsAg-HBcAg免疫组以及其它对照组。二免两周后，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗组血清中HBsAg的浓度继续降低，明显低于Alum-HBsAg-HBcAg免疫组以及其它对照组。三免两周后，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗组的HBsAg含量几乎检测不到，而Alum-HBsAg-HBcAg免疫组以及其它对照组中HBsAg浓度仍维持较高的浓度(图13)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫后，能够显著降低HBV小鼠血清中HBsAg的含量。
2、HBV小鼠血清中HBsAb检测
Elisa定量检测血清中的HBsAb浓度。三免疫四周后，眼眶采血，Elisa定量检测血清中HBsAb的浓度。
(1)将采集的血清稀释20倍，加入到HBsAb试剂盒中的96孔板中，同时将标准品也加入到96孔板中，同时加入阴性对照和阳性样品对照。
(2)将96孔板，置于37℃中孵育1h。
(3)除空白孔外，每孔加入50μL的酶标试剂，置于37℃孵育30min。
(4)将板洗5次，每孔加显色剂A、B液各50μl，37℃避光下显色30min。
(5)每孔加入终止液50μL，450nm处检测OD值。
(6)根据标准品的OD值，建立标准曲线，计算各组HBsAb的浓度。
结果显示，三免两周后，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫组血清中的HBsAb出现，而且chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫组中的HBsAb的浓度显著高于Alum-HBsAg-HBcAg免疫组，有极显著差异(P<0.01)(图14)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫后，能够打破免疫耐受，实现HBsAb的血清转换。
3、HBV小鼠血清中IFN-γ的检测。
Elisa定量检测血清中的IFN-γ浓度。
(1)三免两周后，将采集的小鼠血清稀释5倍，加入到IFN-γ试剂盒中的96孔板中，同时将标准品也加入到96孔板中，同时加入阴性对照和阳性样品对照。
(2)将96孔板，置于37℃中孵育1h。
(3)除空白孔外，每孔加入50μL的酶标试剂，置于37℃孵育30min。
(4)将板洗5次，每孔加显色剂A、B液各50μL，37℃避光下显色30min。
(5)每孔加入终止液50μL，450nm处检测OD值。
(6)根据标准品的OD值，建立标准曲线，计算各组IFN-γ的浓度。
结果显示，三免疫四周后，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin组血清中IFN-γ的浓度高于Alum-HBsAg组和其它对照组，有显著性差异(P<0.001)(图15)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫HBV小鼠后，可以在小鼠体内引起细胞免疫。
4、B淋巴细胞ELISPOT检测
(1)三免两周后，取各组小鼠脾脏，研磨后将所获得的细胞悬液，用40μm的细胞筛过滤。
(2)将细胞用1640完全培养基稀释成3×106个/mL。
(3)将HBsAg溶液稀释成50μg/mL，ELISPOT板中，每孔加入100μL稀释后的HBsAg溶液，4℃孵育12h，然后PBS洗三次。
(4)每孔加入100μL含10％FBS的1640培养基，室温静止30min，进行封闭。
(5)向包被后的ELISPOT培养板中，每孔加100μL细胞悬液，每组三个复孔。
(6)37℃培养箱中培养24h，PBS洗三次后，每孔加入100μg/mL的anti-IgG-biotin，室温孵育2h。
(7)PBS洗3次，每孔加入100μL 1:1000稀释的streptavidin-ALP，室温孵育1h。
(8)PBS洗三次，每孔加入100μL BCIP/NBT底物，避光孵育10min。
(9)用自来水冲洗，终止反应，ELISPOT板避光干燥后，用ELISPOT读板机读板。
结果显示，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫组，产生HBsAg抗原特异的抗体的B细胞的数目，明显多于Alum-HBsAg组，有极显著性差异(P<0.001)(图16)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗，可以打破免疫耐受，促进B细胞恢复产生IgG的能力，体液免疫恢复。
5、HBV小鼠血液中HBV DNA拷贝数的检测。
三免两周后，从各组免疫后的小鼠的血清中，提取基因组DNA。使用HBV DNA荧光定量检测试剂盒，检测血清中HBV DNA拷贝数。
结果显示，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫组，可以明显降低血清中HBV DNA拷贝数，在血清中几乎检测不到HBV DNA，而Alum-HBsAg-HBcAg组血清中仍存在大量的HBV DNA，有极显著差异(P<0.001)(图17)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗，可以显著抑制HBV的复制，减少血液中HBV DNA拷贝数。
6、HBV小鼠肝脏中HBV DNA拷贝数检测
三免两周后，从各组小鼠的肝脏中提取基因组DNA。使用HBV DNA荧光定量PCR试剂盒，检测肝脏中HBV DNA拷贝数。
结果显示，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗免疫组，可以显著降低肝脏中HBV DNA的拷贝数，肝脏中只存在极少量的HBV DNA，相比Alum-HBsAg-HBcAg组和其它对照组，有极显著差异(P<0.001)(图18)。实验结果表明，chitosan-HBsAg-CpG-heparin+chitosan-HBcAg-CpG-heparin纳米疫苗可以显著抑制HBV的复制，减少肝脏中HBV DNA拷贝数。
Claims (10)
1.一种用于乙肝治疗的纳米颗粒，其特征在于，包含HBsAg或HBcAg蛋白、免疫佐剂CpG、阳离子聚合物和阴离子聚合物。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为核壳结构，核为HBsAg或HBcAg蛋白与免疫佐剂，壳为阳离子聚合物和阴离子聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫佐剂CpG的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子聚合物为聚醚酰亚胺、聚赖氨酸或壳聚糖中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚合物为肝素、硫胺素焦磷酸或透明质酸中的一种或多种。
6.权利要求1～5任一所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提供包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；
S2.使包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过第1通道、第2通道、第3通道和第4通道到达混合区域中，进行混合，得混合液；
S3.将混合液过滤，浓缩，即得纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包含阳离子聚合物的溶液、包含阴离子聚合物的溶液、包含HBsAg或HBcAg蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.4～0.6mg/mL：0.1～0.5mg/mL：5～20μg/mL：5～20μg/mL。
8.一种免疫原性组合物，其特征在于，含有权利要求1所述两种用于乙肝治疗的纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的的免疫原性组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求8或9所述的的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物为疫苗。
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