CN1404875A - 一种乙型肝炎疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乙型肝炎疫苗，该疫苗的主要成分为基因工程乙型肝炎病毒表面抗原、胞壁酰二肽(MDP)、铝佐剂等。该乙型肝炎疫苗可用于成人、肾移植病人、肾透析病人等的免疫，以预防乙型肝炎病毒的感染，该乙型肝炎疫苗亦可用于慢性乙型肝炎患者的免疫治疗，该疫苗的免疫原性优于目前使用的铝佐剂乙型肝炎疫苗。
Description
技术领域：
本发明涉及一种乙型肝炎疫苗，特别是一种含有胞壁酰二肽的乙型肝炎疫苗。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝DNA病毒，具有双层壳结构，外壳含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、前S1蛋白(PreS1)和前S2蛋白(PreS2)，内核的表面为乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，内核内含双链环状DNA和DNA多聚酶(DNA-P)。
自1985年中国开展乙型肝炎疫苗接种工作以后，在免疫儿童中乙型肝炎病毒携带率已由10％左右降低为1％左右。北京、上海等地由于新生儿乙型肝炎疫苗接种率高，学龄前儿童的乙型肝炎病毒携带率已降低至0.5％以下。实践证明，如同其它疫苗可预防疾病一样，接种乙型肝炎疫苗及联合使用乙型肝炎免疫球蛋白是预防和控制乙型肝炎最有效的武器。接种乙型肝炎疫苗不仅可以预防乙型肝炎，而且可以预防与乙型肝炎病毒有关的肝癌，同时还可以预防丁型肝炎。
现有的乙型肝炎疫苗主要含有HbsAg和铝佐剂，如：目前中国大量使用的乙型肝炎疫苗中，每剂量含5μg、10μg酵母表达的HBsAg或10μg、20μg CHO细胞表达的HBsAg，以及0.5～1.0mg铝佐剂。这些疫苗能较好的诱导一定水平的体液免疫，但难于诱发高水平的体液免疫。
胞壁酰二肽(英文名Muramyl-dipeptide，简写为MDP)是一种免疫佐剂，主要用作疫苗的添加物，具有增强蛋白类抗原免疫原性的作用。
目前没有将HbsAg和胞壁酰二肽结合制成乙型肝炎疫苗的报道。
发明内容：
本发明提供一种新的乙型肝炎疫苗，该疫苗的组成除包括HbsAg和铝佐剂外，还包括胞壁酰二肽或其衍生物。
本发明的乙型肝炎疫苗基于胞壁酰二肽(英文名Muramyl-dipeptide，简写为MDP)免疫佐剂的作用，胞壁酰二肽可有效地激活T细胞，产生较强的体液免疫，在试验动物中能诱生高水平的抗-HBs。采用此种特定类型的免疫佐剂可以进行各种类型HBV感染的免疫治疗及对免疫抑制药物使用者进行有效的免疫，可将目前较难治疗的无症状HBV表面抗原(HBsAg)携带者转阴并出现抗-HBs。疫苗中加入MDP可诱导机体产生高水平的特异性免疫应答，
本发明中使用的乙型肝炎表面抗原为基因工程重组抗原或其片段或含preS1/Pre S2成分的抗原，而不是来源于乙型肝炎病人血浆的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或CHO细胞表达的基因工程表面抗原由226个氨基酸组成。重组酵母菌或CHO细胞表达的HBsAg均可形成22nm颗粒，已用于人群免疫十余年，均表现出良好的预防乙型肝炎病毒感染的效果。
本发明的乙型肝炎疫苗每剂中各主成分的含量范围如下：MDP 5～200μg、HBsAg 5～20μg、铝佐剂(按铝离子计算)0.25～1.20mg。
优选的范围如下：
MDP 10～150μg、HBsAg 10～100μg、铝佐剂(按铝离子计算)0.5～1.0mg。
最优选的范围如下：
MDP 25～75μg、HBsAg 25～75μg、铝佐剂(按铝离子计算)0.5～1.0mg。
以上说述每剂是指每一疫苗制剂，如每一注射针剂，或每支注射剂，或每次使用量的注射用药剂。
本发明的疫苗使用方法与现有的乙型肝炎疫苗使用方法相同。
本发明的乙型肝炎疫苗可以通过以下方法制备：
组成：
胞壁酰二肽(MDP)或其衍生物
乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)。
氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂
制备：
乙型肝炎病毒表面抗原中加入铝佐剂，混匀后，加入MDP或其衍生物溶液，混匀，即得疫苗液，该疫苗液经过分装可制成单位剂量的注射用的疫苗制剂。
本发明的疫苗制剂中还可含有其它可提高机体免疫的人体或微生物蛋白质、多糖或小分子化合物。
本发明的疫苗制剂可作为成人、肾透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治疗的药物。也可作为慢性乙型肝炎病人的免疫治疗的药物。
本发明的疫苗还可与其他含铝佐剂的疫苗制剂组成联合疫苗。
本发明的乙型肝炎疫苗与现有乙型肝炎疫苗的不同之处在于，加入了免疫增强剂MDP，将MDP加入到疫苗中，可有效的刺激机体产生高水平体液免疫及细胞免疫，该疫苗将会给慢性乙型肝炎的治疗带来光明的前景。
动物实验的结果表明，本发明疫苗明显优于现有的乙型肝炎疫苗。应用于人体后可大辐度的提高人体抗乙型肝炎病毒的体液免疫/细胞免疫，可用于慢性乙型肝炎病人的治疗。
动物试验表明该新型乙型肝炎疫苗是安全的，对试验动物无可见的毒性。可有效的刺激动物产生高滴度的特异性抗体。
本发明的乙型肝炎疫苗采用的配方，可诱导机体产生较强的免疫反应。该疫苗可用于成人、其它类型乙型肝炎疫苗免疫失败者、肾透析病人、器官移植病人的免疫，以及慢性乙型肝炎病人的免疫治疗。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1乙型肝炎疫苗注射剂的制备方法
原料及来源：
胞壁酰二肽(MDP)：用纯水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。
CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)，112μg/ml，为华北制药股份有限公司产品。
磷酸铝佐剂：1.0mg/ml(按铝离子计算)。
疫苗的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原9.0ml于一无菌玻璃瓶内，加入磷酸铝佐剂10ml，充分混匀后，加入MDP溶液1.0ml，混匀后放置于2-8℃。配成20ml疫苗溶液，所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50μg、铝佐剂0.5mg(按铝离子计算)、MDP 100μg，该溶液分装后，制成20瓶每瓶1ml的疫苗注射剂。实施例2乙型肝炎疫苗注射剂的制备方法
原料及来源：
胞壁酰二肽(MDP)：用纯水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。
CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)，112μg/ml，为华北制药股份有限公司产品。
氢氧化铝佐剂：1.0mg/ml(按铝离子计算)。
疫苗的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原9.0ml于一无菌玻璃瓶内，加入氢氧化铝佐剂10ml，充分混匀后，加入MDP溶液1.0ml，混匀后放置于2-8℃。配成20ml疫苗溶液，所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50μg、铝佐剂0.5mg(按铝离子计算)、MDP 100μg，该溶液分装后，制成20瓶每瓶1ml的疫苗注射剂。
实施例3对本发明的疫苗和其他疫苗进行了比较研究，实验如下：
制备疫苗的原料及来源如下：
胞壁酰二肽(MDP)：用纯水配制成2mg/ml，以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。
单磷脂A(MPL)：购自美国SIGMA公司。用纯水配制成2mg/ml，超声波处理后以0.22μm的除菌滤膜过滤除菌，冻存于-20℃。
CHO细胞表达乙型肝炎病毒表面抗原(CHOHB)，100μg/ml，为华北制药股份有限公司产品。
酵母表达的乙型肝炎表面抗原(YHB)，200μg/ml，北京天坛生物制品股份有限公司产品。
氢氧化铝佐剂：1.0mg/ml(按铝离子计算)。
磷酸铝佐剂：1.0mg/ml(按铝离子计算)。
本发明的疫苗(表中的H4，见表1)的制备方法：取CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原2.0ml于一无菌玻璃瓶内，加入磷酸铝佐剂10ml，充分混匀后，加入MDP溶液0.2ml及磷酸盐缓冲液8.0ml，混匀后放置于2-8℃。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原10μg、铝佐剂0.5mg(按铝离子计算)、MDP20μg。
其他各对照组疫苗的配方如下(表1)，制备方法同上。
表1、动物实验用乙型肝炎疫苗的配制
| 组别 | YHB(200μg/ml) | CHOHB(100μg/ml) | Al(OH)3(1mg/ml) | AlPO3(1mg/ml) | MDP(2mg/ml) | MPL(2mg/ml) | PB(ml) | 合计(ml) |
| H1 | 1.0 | 10.0 | 0.2 | 0.2 | 8.6 | 20.0 | ||
| H2 | 2.0 | 10.0 | 8.0 | 20.0 | ||||
| H3 | 2.0 | 10.0 | 8.0 | 20.0 | ||||
| H4 | 2.0 | 10.0 | 0.2 | 7.8 | 20.0 | |||
| H5 | 2.0 | 10.0 | 0.2 | 0.2 | 7.6 | 20.0 | ||
| N | 10.0 | 10.0 | 20.0 |
对比实验的方法：
动物免疫：雌性SPF级BALB/c小鼠，体重16～18克，每组8只。于第0、21天腹腔免疫，免疫剂量0.1ml，第1次免疫后20天采集血液0.1ml，第28天自心脏采集全血，分离血清，测定前冻存于-20℃。
鼠抗-HBs测定：抗-HBs EIA定量测定试剂盒购自北京万泰生物工程有限公司。为双抗原夹心法测定抗-HBs滴度的试剂盒。以1∶25倍稀释的铝佐剂组鼠血清A450/650值的平均值的2.1倍作为(Cut off)界值，同时以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs定量测定标准品制作标准曲线，待检血清A450/650值高于界值的计算血清抗-HBs含量。各组实验动物血清抗-HBs的几何平均滴度见表2。
表2、不同佐剂乙型肝炎疫苗免疫BALB/c小鼠后
血清抗-HBs的几何平均滴度(GMT，mIU/ml)
| 组别 | 动物只数 | 第1次免后20天 | 第2次免疫 | ||
| GMT | SD | GMT | SD | ||
| H1 | 8 | 324 | 4.88 | 45899 | 2.82 |
| H2 | 8 | 367 | 4.12 | 34072 | 3.77 |
| H3 | 8 | 1027 | 2.18 | 30388 | 2.31 |
| H4 | 8 | 4072 | 2.80 | 410380 | 3.11 |
| H5 | 8 | 2250 | 1.63 | 111955 | 3.05 |
第1次免疫后20天，统计学检验表明H4组的抗-HBs GMT明显高于H1、H2、H3组，H5组的抗-HBs GMT明显高于H1、H2组，H4与H5组相比，抗-HBsGMT的差异无显著性。
第2次免疫后7天(即第1次免疫后28天)，统计学检验表明H4组的抗-HBsGMT明显高于H1、H2、H3、H5组，H5组的抗-HBs GMT显著高于H3组。H4组的GMT分别为H2、H3组12倍和13.5倍。
Claims (10)
1、一种乙型肝炎疫苗制剂，其特征在于，含有乙型肝炎病毒表面抗原，铝佐剂和胞壁酰二肽或其衍生物。
2、权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，其中的乙型肝炎表面抗原为基因重组乙型肝炎表面抗原或其片段或含pre S1/Pre S2成分的抗原。
3、权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，其中的胞壁酰二肽衍生物是指具有和胞壁酰二肽结构相似，具有免疫佐剂作用的物质。
4、权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，其中的铝佐剂是氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂。
5、权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，每剂中含有胞壁酰二肽5-200μg，乙型肝炎病毒表面抗原5-120μg，铝佐剂(以铝离子的量计算)0.25～1.2mg。
6、权利要求1的疫苗制剂，其特征在于，制剂中还含有其它可提高机体免疫的人体或微生物蛋白质、多糖或小分子化合物。
7、用权利要求1的疫苗制剂制备一种可用于成人、肾透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治疗的药物。
8、用权利要求1的疫苗制剂制备用于慢性乙型肝炎病人的免疫治疗的药物。
9、一种联合疫苗，其特征在于，该疫苗是由权利要求1的疫苗制剂与其他含铝佐剂的疫苗制剂组成的。
10、权利要求1的疫苗制剂的制备方法，其特征在于，将乙型肝炎病毒表面抗原，铝佐剂和胞壁酰二肽或其衍生物混合。
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