CN1200732C - 聚乳酸－聚乙二醇共聚物为佐剂的乙肝疫苗 - Google Patents

Abstract

一种具有预防和治疗作用的乙型肝炎疫苗，它含有包被乙型肝炎表面抗原的，做为佐剂的聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球，其中保被的乙型肝炎表面抗原与所述的聚合物的比例为1.5%～3%(重量%)。可以向疫苗中加入未包被的乙型肝炎表面抗原，加入量为0～40μg/0.2～1毫升疫苗。

Description

聚乳酸-聚乙二醇共聚物为佐剂的乙肝疫苗

我国是乙型肝炎高发区，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者高达1亿之多，现患慢性乙型肝炎已达2000万人，严重威胁着人民健康和民族身体素质。目前有多种治疗乙型肝炎的药品，但尚无令人满意的特效药，急待研究适合于我国国情的、廉价、有效、使用方便的药物。酵母重组乙型肝炎疫苗是广泛使用的具有显著预防效果的制品，目前国内外学者已在研究将乙型肝炎疫苗用于治疗慢性乙型肝炎患者。我国正在生产酿酒酵母和CHO细胞重组的乙肝疫苗，并且进一步研制和开发了另一种酵母重组疫苗(汉逊酵母表达)，实验证明该疫苗可诱导较好的体液免疫(抗-HBsAg)和细胞免疫，而且对HBsAg和HBeAg双阳性母亲生下的新生儿出生后在24小时内按当时、一个月、六个月间隔免疫接种三针10μg疫苗后保护效果高达95％，即所谓母婴传播阻断率很高。这说明以氢氧化铝为佐剂的现行疫苗在围产期接种后仍能消除新生儿已感染的乙肝病毒，因此从这一点来说乙肝疫苗对乙型肝炎有一定的治疗作用。

现有技术中只有铝盐为唯一准许用于人类的佐剂。该佐剂具有成本低、可大规模生产等优点，然而大量研究表明铝佐剂在提高疫苗的体液免疫水平(抗体滴度)的同时，抑制了细胞免疫活性。体液免疫主要是通过B细胞介导的免疫反应，可消除细胞外的病原体和毒素，主要起预防作用；细胞免疫-T细胞介导的免疫反应对胞内感染的病原体和毒素有一定的清除能力，具有一定的治疗作用。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含新型佐剂的乙型肝炎疫苗，该疫苗可能具有治疗乙型肝炎的用途。

本发明的另一目的在于提供一种制备本发明所述的疫苗的方法。

在本发明中，采用的佐剂是聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)，它是一种可生物降解的、生物相容性优良的高分子聚合物。根据实验证明，把乙肝表面抗原包被在PELA内部制备成微球，使用该微球和未包被HbsAg以适当的比例混合，能够制成一种新的疫苗，该疫苗可提高哺乳动物包括人的免疫体液免疫和细胞免疫水平，此外，PELA微球具备一定的缓释效果。因此，以PELA为佐剂的乙肝疫苗在预防上可能会减少免疫接种次数，并且可能增加新生儿出生后接种时间的灵活性，更有希望在临床上起到较好的治疗效果。此疫苗可作为冻干制剂和液体制剂，后者需要加上氨基酸或明胶保护剂，使疫苗便于保存及效期得以延长。

具体讲，本发明的技术方案是以下面所述的方法来实现的。可以见得，本发明涉及一种乙型肝炎疫苗，包括：

粒径为0.5～5微米的包被乙型肝炎表面抗原的聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球，其中被保被的乙型肝炎表面抗原与所述的聚合物的比例为1.5％～3％(重量％)。换言之，0.2～1毫升的疫苗中包被在微球中的乙型肝炎表面抗原的含量为1～40μg。

可以向上述的0.2～1毫升的疫苗中加入0～40μg的未包被(或相对于包被的抗原而言称游离的)的乙型肝炎表面抗原。即每人份的上述疫苗中未包被的乙型肝炎表面抗原的最大加入量为40μg。

本文中所述的0.2～1毫升的疫苗事实上是与现有技术人员公知的每人份的疫苗使用剂量相当。另外，本领域技术人员熟知在制备疫苗的过程中，疫苗中含有乙肝表面抗原的剂量是可以在熟知的范围内进行浓缩或稀释等等调整，以期达到接种人员实际使用的剂量。

本发明还涉及制备本发明的乙型肝炎疫苗的方法，该方法包括：

(1)用聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包被HBsAg制成0.5～5微米的微球，其中被包被的乙型肝炎表面抗原与所述的聚合物的比例为1.5％～3％(重量％)，制成冻干制剂；

(2)将冻干制剂用生理盐水悬浮，调成含有1～40μg/0.2～1毫升乙型肝炎表面抗原微球悬液。

根据本发明，可以向上述的微球悬液中加入游离的乙型肝炎表面抗原0～40μg(pH7.2-7.4)，制得乙型肝炎疫苗。

为了清楚理解本发明，以下将结合附图和实施例进一步说明之，但是以下的实施例并非限定本发明。

附图说明

图1为：

ConA诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验结果图

其中，A 1.HBsAg(不含alum)免疫，2.PELA包裹HbsAg免疫，3.PELA免疫，4.HBsAg(含alum)免疫，5.对照组BSI＝ConA刺激孔的cpm/无ConA刺激孔的cpm

图2为：

LPS诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验结果图

其中，SI＝LPS刺激孔的cpm/无LPS刺激孔的cpm。

SI＝cpm of tube with ConA/cpm of tube without ConA。

图3为：

不同制剂诱导小鼠的迟发性超敏反应结果图

其中，A 1.对照，2.PELA包裹的HBsAg，3.HBsAg(含alum)，4.HBsAg(不含alum)，5.PELA。柱黑部分为平均值，虚线部分为MEAN+/-1.0SD。

B差值＝攻击后足垫厚度-攻击前足垫厚度。

^*P＜0.05与对照组比较。

实施例1

采用溶剂蒸发技术将4.20mgHBsAg包裹于205.64mgPELA中，用蒸馏水洗涤3次后，制成5微米含有乙肝表面抗原的微球。

将制备好的所述微球疫苗悬浮于12ml生理盐水中，得一微球悬液，取0.5ml微球悬液，用1～3毫升二氯甲烷萃取后，采用Lowry法测定该微球悬液的蛋白浓度为217μg/ml(即微球中HBsAg的浓度)，此微球中的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的含量为10633μg/ml。

取浓度为217μg/ml的微球悬液139μl，滴加2mg/mlHBsAg7.5μl，再加入753.5μl的生理盐水，配成微球加游离HBsAg的悬浮液，其pH值为7.2，即制成乙型肝炎疫苗。该疫苗中微球中的HBsAg浓度为33.33μg/ml，游离HBsAg的浓度为16.67μg/ml。

实施例2

采用溶剂蒸发技术将15mgHBsAg包被在585mgPELA中，用蒸馏水洗涤3次后，制成0.5微米的含有乙肝表面抗原的微球。

将制备好的所述微球悬浮于12ml生理盐水中，得一微球悬液，即制得乙型肝炎疫苗。

取0.5ml微球悬液，用3毫升二氯甲烷萃取后，采用Lowry法测定该微球悬液的蛋白浓度为996μg/ml(即微球中HBsAg的浓度)，此微球中的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的含量为38844μg/ml。

实施例3

取浓度为217μg/ml的微球悬液139μl，滴加20μg/ml含铝盐的HBsAg750μl，再加入11μl的生理盐水，配成微球加含铝盐的HBsAg的悬浮液，得一疫苗，其中该疫苗中的HBsAg浓度为33.33μg/ml，含铝盐的HBsAg的浓度为16.67μg/ml，铝盐(AL(OH)₃)的浓度为1.04mg/mL。

实施例4

取浓度为217μg/ml的微球悬液208μl，滴加20μg/ml含铝盐的HBsAg1500μl，再加入92μl的生理盐水，配成微球疫苗加含铝盐的HbsAg的悬浮液，其中微球疫苗中的HBsAg浓度为50μg/ml，含铝盐的HbsAg的浓度为33.33μg/ml，铝盐(AL(OH)₃)的浓度为2.08mg/mL。

实验例1

取实施例1得到的疫苗悬浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中疫苗中HBsAg含量为2μg/只，未包被的HBsAg含量为1μg/只，PELA的含量为98μg/只。

实验例2

取此经实施例2得到的疫苗皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量为3μg/只，游离HBsAg含量为2μg/只，PELA的含量为148μg/只。

实验例3

取实施例3制得的疫苗悬浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量为2μg/只，游离HbsAg含量为1μg/只，PELA的含量为98μg/只，铝盐的含量为62.4μg/只，此组作为对照组。

实验例4

取经实施例4制得的疫苗悬浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量为3μg/只，游离HBsAg含量为2μg/只，PELA的含量为148μg/只，铝盐的含量为124.8μg/只，此组作为对照组。

同时设立微球疫苗、游离HBsAg、以铝盐为佐剂的HBsAg作为对照组，这几组对照组中的HbsAg免疫小鼠的量为3μg/只或5μg/只。

检测以上几组的体液免疫效果及细胞免疫的效果，体液免疫的效果包括：不同佐剂与乙肝表面抗原(HBsAg)配比免疫小鼠一个月后抗HBsAg的水平；细胞免疫的效果包括：免疫小鼠的脾细胞体外经HBsAg刺激对T细胞增殖的影响、LPS诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验、ConA诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验、不同制剂诱导小鼠的迟发型超敏反应、不同制剂诱导小鼠后的脾脏重量指数。

下表1显示不同佐剂与乙肝表面抗原(HBsAg)配比免疫小鼠一个月后体液免疫的效果

表1

免疫类型         HBsAg        抗-HBsAg(cpm)       S/N                 血清抗体

                                                                      阳转

                 (μg/mouse)  ( X±SD)                            No.       ％

AL(OH)₃-HBsAg   3            7622.71±5047.32    20.11±13.31    9/10      90

AL(OH)₃-HBsAg   5            7318.99±5628.17    19.31±14.8     10/10     100

                                                  5

PELA-HbsAg       3            2690.44±3889.82    7.10±10.26     4/10      40

PELA-HbsAg       5            5956.63±5065.68    15.71±13.3     8/10      80

                                                  6

PELA-HBsAg+      3            16583.72±5024.59   43.76±13.2     10/10     100

HBsAg                                             5

PELA-HBsAg+      5            17149.73±5747.71   45.23±15.1     9/9       100

HBsAg                                             6

PELA-HBsAg+      3            437.98±266.87      1.15±0.70      2/10      20

AL(OH)₃

PELA-HBsAg+      5            334.15±223.39      0.88±0.60      1/10      10

AL(OH)₃

PELA-HBsAg+      3            10433.58±7061.86   27.52±18.6     9/10      90

AL(OH)₃-HBsAg                                    3

PELA-HBsAg+      5            9648.77±8600.04    25.45±22.6     8/10      80

AL(OH)₃-HBsAg                                     9

注：将不同制剂皮下免疫小鼠，一个月后采血，分离血清，用放免试剂盒检测

实验例5

ConA诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验

试验方法：

用PELA包裹的HBsAg、HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)、PELA皮下免疫小鼠(Balb/c，♀，8-10周)，分别于第5日、10日、15日、20日、25日处死，制备脾悬液，于96孔培养板上每孔加入200μl该悬液(2×10⁶个细胞·ml^-1)和20μlConA，ConA的终浓度为5μg·ml^-1对照孔用完全培养基代替ConA，试验和对照均设3个平行孔。培养板置37℃、5％CO₂条件下培养72小时，培养终止前6小时，加入³H-TDR，每孔1μCi。收获细胞，用β液闪计数仪测cpm值。

数据处理和结果判定：

采用方差分析进行数据统计，加ConA的cpm值/不加ConA的cpm值表示刺激指数(SI)，受试组的SI显著高于对照组的SI，即可判定其结果阳性。

结论：

从5个天数来看，PELA包裹的HBsAg免疫小鼠后，对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应在第25天时SI最高，且显著高于对照组及其它制剂组，说明PELA包裹的HBsAg对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖反应有加强作用，即对T细胞的增殖有加强作用。同时，随着天数的增加，此种制剂对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖反应有逐渐增强的作用，而HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)并无此作用，说明其具备一定的缓释作用。

其结果见图1。

实验例6 LPS诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验

以实验例5相同的方法实施本实施例，得出的结果见图2。

参照图2可得出以下结论：

1.对于LPS的反应性，PELA包裹的HBsAg随天数的增加，有增加的趋势，并且在第25天时达到最高，与其它组比较均有显著性差异，说明其对B细胞的增殖有加强作用。

2.对于LPS的反应性，PELA在第10天、15天、20天的SI均较高，与其它组比较均有显著性差异，说明单纯佐剂对B细胞的增殖有增强作用。

实验例7

免疫小鼠的脾细胞体外经HBsAg刺激对T细胞增殖的影响

本试验方法同ConA诱导不同制剂免疫小鼠脾细胞的体外增殖试验(实验例5)相同

表2

                                     HBsAg

                 medium         50μg/ml              30μg/ml          5μg/ml

n                (cpm)

                                cpm        SI         cpm      SI       cpm      SI

正常动物         838±93        274±70    0.3        266±9   0.3      374±66  0.4

HBsAg(含alum)    542±232       673±217   1.2        472±144 0.9      406±22  0.7

PELA包被HBsAg    388±62        1802±1038 4.6^*      605±41  1.6      664±57  1.7

HBsAg(不含alum)  622±242       315±139   0.5        338±153 0.5      402±86  0.6

表中SI＝HBsAg刺激孔的cpm/无HBsAg刺激孔的cpm

    *SI＞2.1为阳性

通过表2可以得出以下结论：

PELA包裹的HBsAg免疫小鼠后，体外用HBsAg刺激后T细胞增殖增强，说明此制剂对T细胞的增殖、活化有加强作用。

实验例8不同制剂诱导小鼠的迟发型超敏反应

试验方法：

分别用PELA包裹的HBsAg、HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)、PELA皮下免疫小鼠(Balb/c，♀，8-10周)(每只5μg)，2周后腹腔免疫绵羊红细胞(SRBC约1×10⁸)，4天后测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射SRBC(约1×10⁸)，注射后24小时分别测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。

数据处理和结果判定：

采用方差分析进行数据统计，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试组的差值显著高于对照组的差值，即可判定该项试验结果阳性。

结论：

以PELA为佐剂的HBsAg、PELA免疫小鼠后的迟发型超敏反应显著优于对照组(正常小鼠)及以alum为佐剂HBsAg、HBsAg(不含alum)，说明PELA对SRBC所引起的迟发型超敏反应有增强作用，而迟发型超敏反应是由T_DTH细胞引起的，所以PELA对T_DTH细胞的功能有增强作用。其详细结果见图3。

Claims (4)

1、一种乙型肝炎疫苗，它含有粒径为0.5～5微米包被乙型肝炎表面抗原的聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球，其中包被的乙型肝炎表面抗原与所述的聚合物的比例为1.5～3重量％，其特征在于所述的疫苗含有未包被乙型肝炎表面抗原。

2、如权利要求1所述的乙型肝炎疫苗，其特征在于向所述的疫苗中加入未包被乙型肝炎表面抗原的量为1～40μg/0.2～1毫升疫苗。

3、一种制备乙型肝炎疫苗的方法，该方法包括：

(1)用聚乳酸-聚乙二醇共聚物包被乙型肝炎表面抗原制成粒径为0.5～5微米的微球，其中被包被的乙型肝炎表面抗原与所述的聚合物的比例为1.5～3重量％，制成冻干制剂；

(2)将冻干制剂用生理盐水悬浮成微球悬液，在所述的悬液中加入未包被的乙型肝炎表面抗原，制成使所述的悬液中含有1～40μg/0.2～1毫升的未包被的乙型肝炎表面抗原的微球悬液，制得乙型肝炎疫苗。

4、如权利要求1所述的乙肝疫苗在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

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